Memoire Online - Mise en évidence d'échangeurs

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Stage effectué à l'Institut des Cordeliers, Laboratoire de physiologie et endo-
crinologie cellulaire et moléculaire rénale, INSERM U356
Dire cteur: Profe sseur Michel PAILLARD

*L e rein*	.4
Structure et fonctions	.4
Glomérule	.6
Tubule rénal	7
Tubule proximal	.7
Tubule intermédiaire	7
Anse de Henle	7
Tubule distal	.8
Tubule contourné distal	.9
Tubule connecteur et collecteur initial.	.9
Canaux collecteurs	10
Canal collecteur cortical	10
Canal collecteur médullaire externe	10
Canal collecteur médullaire interne	11
Le système à contre-courant.	.11

Introduction	.12
La microperfusion in vitro	.13
Résumé	.13
Les avantages et les limites de la méthode.	14
Le matériel et méthodes	14
Protocole	16
Résultats	.18
Discussion	.20

Mise en évidence et caractérisation d'échangeurs Cl-/HCO3- sur les vésicules

des membranes plasmiques luminales et basolatérales.	.21
Résumé	.21
Les avantages et les limites de la méthode	.21
Méthode	.22
Les mesures des transports ioniques	.22
La filtration rapide	.23
Résultats	.23
Interpretation des résultats	.24

Le rein

Structure et fonctions

Le rôle du rein est de maintenir stable la composition du milieu intérieur. On pourrait même dire que la composition de ce milieu n'est pas déterminée par ce qu'on mange mais par ce que le rein retient et élimine. En filtrant le sang pour le libérer des produits du métabolisme tout en empêchant une trop grande fuite d'eau et d'ions de l'organisme, le rein joue un rôle très important dans le système de régulation de la composition du milieu intérieur. Il assure, donc, de bonnes conditions pour le fonctionnement des autres organes.

Les reins sont entourés d'une fine capsule protectrice fibreuse. Leur forme rappelle celle d'un haricot. Sur la coupe transversale du rein on distingue trois zones: à l'extérieur le cortex qui entoure la médullaire de laquelle se dégage le calice regroupant l'ensemble des tubes collecteurs par lesquels s'écoule l'urine définitive.

La majorité des études a été faite sur des reins animaux, plus faciles à obtenir donc mieux connus. Le rein humain a une médullaire composé de 4 à 18 cônes ou pyramides de Malphigi tandis que le rein du rat correspondrait à un rein formé par une seule pyramide de Malphigi et par le cortex qui l'entoure; le rein de ce type est dit unipapillaire. Du pourtour des pyramides vers la périphérie du cortex qui les entoure s'étendent les rayons médullaires. Le parenchyme cortical situé entre les rayons médullaires forme le labyrinthe.

Le rein humain est composé d'environ 1 300 000 unités fonctionnelles, ou néphrons. Les néphrons sont enrobés de tissu interstitiel où cheminent vaisseaux et nerfs. Chaque néphron est com-

posé d'un glomérule et d'un tubule qui lui fait suite. Le tubule urinifère comporte chez les ^mammifères au moins 12 segments successifs différents morphologiquement et fonctionnellement: Partie proximale qui comprend le tubule proximal avec ces trois segments ( S1,S2,S3 ).

Partie intermédiaire comprend la branche fine descendante et la branche fine ascendante de l'anse de Henle.

Partie distale comprend la branche large ascendante médullaire et corticale de l'anse de Henle, le tubule contourné distal et les canaux collecteurs ( avec successivement le tubule connecteur, le canal collecteur cortical, le canal collecteur médullaire externe et le canal collecteur médullaire interne ).

Figure 2. Répartition et segmentation de deux types de néphrons: superficiel ou cortical à anse de Henle courte, profond ou juxtamédullaire à anse de Henle longue.

De plus les néphrons se repartissent en trois groupes en fonction de l'emplacement de leur glomérule. On a donc des néphrons superficiels, corticaux moyens et juxtamédullaires. Cette classification se fait selon la position du glomérule et la profondeur de l'anse de Henle. Il n'est pas moins vrai que cette classification reste schématique car les néphrons quelle que soit la situation de leur glomérule, peuvent avoir une anse de Henle courte ou longue.

Ces différents segments des néphrons occupent une place particulière dans le lobe rénal.

Dans le labyrinthe on trouve les glomérules. Les tubes contournés proximaux et distaux se trouvent autour et au-dessus du glomérule dont ils sont issus.

Les rayons médullaires contiennent la partie initiale des tubes droits proximaux, la partie terminale des tubes droits distaux des néphrons superficiels et moyens et le canal collecteur cortical.

Les tubes droits proximaux et distaux des néphrons se trouvent dans la couche externe médullaire.

La portion descendante des tubes intermédiaires, la partie initiale des tubes droits distaux se trouvent dans la couche interne de la médullaire externe.

La médullaire interne contient les tubes de Bellini ( canaux collecteurs ), la partie fine descendante et ascendantes tubes intermédiaires des néphrons à anse longue.

Les canaux collecteurs traversent tout le lobe rénal. Dans la zone des rayons médullaires le tube contourné distal se jette dans un tube collecteur qui, traversant la medulla, rejoint la papille.

Glomérule

Le glomérule ( ou corpuscule rénal ) est une sphère de diamètre de 150 à 250 um qui possède un pôle vasculaire où pénètre l'artériole afférente et sort l'artériole efférente, et un pôle urinaire d'où sort le tube contourné proximal. Le glomérule filtre le plasma sanguin. Le produit de cette filtration, l'urine primitive contient peu de protéines car la barrière glomerulaire est sélectivement imperméable aux grosses molécules. Dans l'urine primitive la concentration en molécules dont le poids est inférieur à 50 kDa¹ et en ions est identique à celle du sang ( à l'équilibre de Donnan près² ) , elle ne contient de grandes molécules ( >68 kDa ) qu'en quantités infinitésimales.

Figure3: Disposition schématique du glomérule rénal. 1, la macula densa 2, l'artériole afférente 3, le mésangium extraglomérulaire 4, la capsule de Bowman

5, Trois lobules du flocculus sont schématisées: 6, dans le lobule de gauche est représenté le mésangium intraglomérulaire 7, le lobule du centre représente le trajet

2 Équilibre de Donnan: répartition inégale des ions diffu de p t et d' t d'une m mb n rai d p és c

Tubule rénal

Le tubule rénal fait suite au glomérule, son rôle est de réabsorber la majeure partie de l'eau et des substances dissoutes de manière adaptée au maintien de la composition du milieu intérieur. Ainsi, l'urine primitive est concentrée: un énorme gaspillage est évité.

Le glomérule filtre quelques 180 L d'eau par 24 h. Seulement 1 à 2 L d'urine seront excrétées. Il en est de même pour les 25 000 mmol de sodium dont plus de 99% seront restituées à l'organisme.

Le tubule rénal doit aussi permettre l'élimination des produits de dégradation du métabolisme et éventuellement de substances étrangères à l'organisme, par exemple, en limitant leur réabsorption.

Le tubule rénal est constitué d'une couche de cellules épithéliales reposant sur une lame basale. Les différences dans la structure correspondent à des différences fonctionnelles des différents segments du tubule rénal.

Tubule proximal

Le tubule proximal réabsorbe les substances dissoutes ultrafiltrées par le glomérule ( électrolytes tels que sodium, potassium, chlore, bicarbonate, phosphate, mais aussi substances organiques telles que acides aminés, glucose, certains acides organiques du cycle de Krebs, etc. ). Il réabsorbe, par les phénomènes d'endocytose, les protéines qui ont traversé la membrane glomérulaire en faible quantité.

Il doit également favoriser l'élimination de produits de dégradation du métabolisme, en limitant leur réabsorption tubulaire ou en les sécrétant.

Aussi le tubule proximal synthétise et secrète le principal métabolite actif de la vitamine D la 1 ,25(OH2)D3 ⁽³⁾,ce qui constitue la fonction endocrine du tubule proximal du rein.

L'anse de Henle comporte trois segments: la branche fine descendante, ascendante et la branche large ascendante. Les branches fines sont situées dans la partie interne de la médullaire externe et dans médullaire externe du rein.

Les branches fines descendantes courtes de l'anse de Henle sont constituées de cellules épithèliales plates reliées entre elles par des jonctions serrées profondes. Ces caractéristiques structu-

rales concordent avec les caractéristiques fonctionnelles de la branche fine descendante des ^néphrons superficiels. Cet épithélium est très perméable à l'eau et relativement peu perméable aux

solutés. L'urine pourrait, en principe, y être concentrée uniquement par la sortie d'eau dans la médullaire externe hypertonique.

Les branches fines descendantes des anses longues sont plus complexes. On y distingue une partie supérieure situé dans la médullaire externe et s'avançant plus ou moins profondément dans la médullaire interne en fonction de la longueur de l'anse et une partie inférieure, terminant la branche fine descendante. De plus, d'importantes différences entre les espèces ont été constatées:

- dans les espèces à haut pouvoir de concentration de l'urine ( rat, hamster, souris ... ) les cellules épithéliales sont hautes, riches en mitochondries et ont des microvillosités apicales. Cet épithélium est très perméable à l'eau et assez perméable aux cations ( sodium, potassium, ammonium ). De cette façon il est probable que l'équilibre osmotique entre le fluide tubulaire et l'interstitium médullaire hypertonique se produise aussi bien par sortie d'eau que par entrée des solutés.

- dans les espèces à faible pouvoir de concentration ( lapin, singe et l'homme ) l'épithélium est plat et peu différencié. La perméabilité à l'eau y est assez élevée et les perméabilités aux solutés sont faibles, comparables à celles des anses courtes.

Enfin, la partie inférieure des branches fines descendantes des anses longues ont, quelque soit l'espèce, un épithélium plat, la perméabilité à l'eau y est forte et la perméabilité aux solutés y est faible ( sauf pour l'urée ).

Les résultats obtenus par la microponction directe de la papille chez le rat montrent qu'il se produit dans la branche fine descendante:

Tubule distal

Tubule connecteur et collecteur initial

Les cellules principales sont responsables du transport du sodium, se potassium et d'eau. Elles ont une activité de la Na⁺/K⁺ ATPase basolatérale importante qui maintient une concentration intracellulaire de sodium basse et de potassium élevée.

Il existe deux types de cellules intercalaires. Les cellules intercalaires du type A sécrètent les protons du côté luminal et absorbent permettent ainsi la réabsorption du bicarbonate présent dans le fluide luminal. Les cellules intercalaires du type B ont une polarité inversée, elles ont une sécrétion basolatérale de protons et une sécrétion luminale de bicarbonate.

Ce segment est également composé de deux types de cellules: les cellules principales, dont l'ultrastructure est proche de celle des cellules principales du canal collecteur cortical, et les cellules intercalaires. Les cellules intercalaires sont de type A, c'est-à-dire sécrétrices de protons, les cellules de type B étant rares dans ce segment.

En fait, on peut distinguer deux segments dans le canal collecteur médullaire externe. Un segment externe situé dans la couche externe de la médullaire externe et un segment interne situé dans la couche interne de la médullaire externe.

Ce segment fait suite au canal collecteur cortical. Il est constitué de cellules principales (60 à 70% ) et de cellules intercalaires de type A ( 30 à 40% ). La membrane basolatérale des cellules

principales contient une forte conductance au potassium. Leur membrane luminale contient une forte conductance au sodium qui peut être inhibé par l'amiloride et une plus faible conductance au potassium. Ces cellules ressemblent fonctionnellement aux cellules principales du canal collecteur cortical et il est probable qu'elles puissent absorber activement le sodium et sécréter le potassium.

Ce segment est aussi composé de deux types cellulaires mais leur proportion varie selon l'espèce. Les cellules principales de la partie interne du canal collecteur médullaire externe sont fonctionnellement très différentes des cellules principales des segments précédents: leur membrane ba-

solatérale présente une forte conductance presque exclusivement au chlore et leur membrane ^luminale est imperméable aux ions Na⁺, K⁺, Cl^-. Elles possèdent également un contretransport HCO3^-/ Cl^- basolatéral et peuvent activement sécréter des protons.

Ce segment joue un rôle majeur dans la concentration de l'urine en état d'antidiurèse et dans l'acidification finale de l'urine. Il est également capable d'absorber activement le sodium et d'établir des gradients transépithéliaux de sodium importants. On distingue dans ce segment deux types cellulaires, les cellules principales et les cellules intercalaires. Chez certaines espèces les cellules intercalaires sont très peu représentées et parfois même inexistantes. L'ultrastructure des cellules principales du canal collecteur médullaire interne est proche de celle des cellules principales des segments d'amont. De plus, la taille des cellules augmente progressivement ( d'un facteur 3 à 10 selon les espèces ) jusqu'à la papille. ( Ce segment a été relativement peu étudié in vitro, il n'est pas possible dans l'état actuel des connaissances d'indiquer un schéma précis des mécanismes de transports transmembranaires des cellules du canal collecteur médullaire interne.)

L'organisation architecturale du néphron permet la régulation indépendante de l'excrétion de l'eau et des substances dissoutes. Ainsi le rein peut répondre à des situations aussi extrêmes que l'état diurétique et l'état antidiurétique. Ceci est possible grâce au système à contre-courant stimulant les échanges entre le liquide tubulaire et l'interstitium. L'architecture particulière du néphron permet l'établissement d'un gradient cortico-papillaire interstitiel croissant du cortex vers la medulla. C'est l'existence de ce gradient osmotique cortico-papillaire interstitiel qui constitue un élément majeur du pouvoir de concentration de l'urine par le rein et qui lui permet soit d'éliminer la charge osmotique quotidienne dans une grande quantité d'eau lorsque les apports hydriques sont importants, soit de l'éliminer dans une très faible quantité d'eau lorsque les apports hydriques sont faibles.

La branche large ascendante, mécanismes des transports ioniques

Introduction

Comme il a été dit précédemment, la branche ascendante large est le premier segment du néphron distal. Elle est située dans la médullaire externe et dans le cortex. Le rôle de la branche large ascendante est de réabsorber le NaCl, le NaHCO3, le calcium et le magnésium. Elle participe ainsi à la régulation du bilan de ces différentes substances. La branche large ascendante joue un rôle important dans le processus de dilution de l'urine en état de diurèse aqueuse⁴. Lorsque les apports hydriques sont importants, il est indispensable que l'excès d'eau soit éliminé sans modifier l'excrétion des autres solutés ( NaCl, K⁺ ... ) . Cependant en situation de restriction hydrique, l'urine émise doit être concentrée ( état d'antidiurèse ) grâce à une réabsorption d'eau pure. La branche large ascendante contribue à ces fonctions en absorbant du NaCl qui, accumulé dans l'interstitium par contre-courant, va contribuer à la constitution du gradient osmotique. Cette réabsorption de NaCl, du fait de la faible perméabilité à l'eau, permet de diminuer l'osmolarité du fluide tubulaire. Un fluide hypotonique au plasma est délivré au tube distal. L'ADH⁵, en modulant la perméabilité à l'eau du canal collecteur, règle l'équilibre osmotique entre l'interstitium et la lumière du canal collecteur et ainsi la réabsorption d'eau dans ce segment. En l'absence d'ADH, la perméabilité à l'eau est faible, l'urine est hypotonique, la diurèse élevé. En présence d'ADH l'osmolarité de l'urine est élevé, la diurèse est faible.

La branche large ascendante réabsorbe le chlorure de sodium à un débit très élevé. Le plus important système de transport actif de la branche large ascendante est la pompe Na⁺/K⁺ ATPase présente dans la membrane basolatérale. L'activité de cette pompe maintient une concentration intracellulaire de sodium basse et de potassium élevée. Du côte apical le cotransport électroneutre 1Na⁺/1K⁺(NH4⁺)/2Cl^- assure la majeure partie du transport du NaCl. Les inhibiteurs spécifiques de cette protéine sont le furosémide et le bumétanide. Ce cotransport est secondairement activé par la concentration de sodium intracellulaire basse qui est établie par l'activité la Na⁺/K⁺-ATPase basolatérale. La réabsorption du NaCl dans la branche large ascendante permet une accumulation de solutés dans l'interstitium ce qui contribue à créer un gradient osmotique croissant du cortex vers la papille.

Une fonction importante des cellules de la branche large ascendante médullaire est d'absorber en quantités importantes l'ion bicarbonate. Cette réabsorption contribue également à la régulation du pH de l'interstitium qui contrôle l'acidification finale de l'urine par le biais des cellules du

4 Si la sécrétion d'ADH est supprimée (par exemple par des apports hydriques importants qui tendent à diminuer l'osmolarité sérique), la réabsorption d'eau sera supprimée et le rein excrétera beaucoup d'urine ( par exemple 15 L par 24 h) de faible

osmolarité (50 mOsm/L). On a alors une dilution maximale de l'urine et on parle de diurèse aqueuse.

Si au contraire la sécrétion d'ADH est stimulée de façon maximale (par exemple par une déshydratation qui tendrait à augmenter l'osmolarité sérique), la réabsorption d'eau sera stimulée et le rein excrétera peu d'urine (p. ex. 0,6 L/24 h) d'osmolarité élevée (1250 mOsm/L). On a alors une concentration maximale de l'urine et on parle d'antidiurèse.

canal collecteur médullaire. Il est admis que la réabsorption des HCO3^- à travers la membrane apicale se fait essentiellement via un échangeur Na⁺/H⁺ mais la voie d'efflux basolatérale n'est pas connue.

Enfin, les cellules de la branche large ascendante réabsorbent, grâce au cotransport Na⁺/K⁺ (NH4+)/2Cl-, la majorité du NH4⁺ ( qui est transporté à la place de K⁺ ), produit par la cellule du tubule proximal. En s'accumulant dans l'interstitium, le NH3 par le système de concentration à contre-courant peut diffuser dans la lumière du canal collecteur médullaire et permettre une sécrétion élevée d'H⁺ dans le canal collecteur médullaire externe et, donc, une acidification efficace de l'urine définitive.

Figure 4. Modèle classique des transferts de solutés dans la branche ascendante large de Henle.

De ce modèle, on pourrait conclure que les différentes fonctions, la régulation du bilan d'eau et de l'état acide-base, sont dépendantes. Cependant, les cellules de la branche large ascendante sont capables d'absorber une grande quantité de Na⁺ et de Cl^- sans modification notable de l'état acide-base, c'est à dire sans modification apparente des réabsorptions de HCO3 et NH4⁺. Cette observation a amené à supposer l'existence d'un échangeur Cl^-/HCO3^- sur la membrane apicale. Deux équipes de l'unité INSERM U 356, celle de R-A. Podevin et celle de P. Houillier travaillent sur ce sujet en utilisant deux techniques d'approche différentes mais complémentaires. La technique de microperfusion in vitro est utilisé par P. Houillier. L'équipe de R-A. Podevin utilise les vésicules de membranes plasmiques luminales et basolatérales, hautement purifiées et séparées simultanément.

La technique de la microperfusion in vitro est faite sur des segments de tubule isolés du rein.

Lorsque, par la microdissection, le tubule est extrait du rein, il est fixé sur un dispositif permettant d'isoler le milieu intratubulaire du milieu extratubulaire, et de faire s'écouler par le tubule un liquide de composition connue. Il est possible de recueillir le liquide sortant du tubule à l'autre extrémité. La composition exacte de ce liquide peut être déterminée. Il est donc possible, en comparant la composition du liquide "de perfusion" et du liquide collecté, d'en déduire le flux de transport transépithèlial de différents solutés. Cette analyse peut être couplée avec les mesures du potentiel transépithèlial et/ou avec la technique de la fluorescence intracellulaire ( permettant de me-surer le pH intracellulaire ). Ainsi les renseignements plus complets sur les transporteurs ioniques peuvent être obtenus.

Cette méthode est utilisée pour étudier précisément les activités de transport de certains segments du néphron. Contrairement aux techniques in vivo ( microperfusion et microponction ), les conditions expérimentales sont parfaitement contrôlables car le tubule n'est plus soumis aux différentes influences complexes, en particulier hormonales. L'importance de cette technique réside dans le fait qu'il est possible de mesurer sur un même tubule simultanément le flux ionique, la différence de potentiel transépithèliale et, dans certaines conditions, le potentiel transmembranaire des cellules et la conductance de l'épithélium. Il est ainsi possible d'étudier et de définir la régulation des mécanismes impliqués dans les transports tubulaires rénaux et, de ce fait la régulation de la composition du milieu intérieur.

Cependant le fait que cette méthode utilise un segment isolé in vitro représente une limite. En effet, dans le rein, de nombreuses fonctions demandent une action coordonnée de différents segments et sont soumis aux influences des hormones.

Un microscope inversé est indispensable. Sa construction ( la source lumineuse est au des-sous de la chambre de perfusion et l'objectif est au-dessus ) permet de travailler sur un tubule en suspension et facilite l'accès des pipettes.

La chambre de perfusion ( plaque en matière plastique ) permet de garder le tubule dans un bain, et loge l'électrode et le thermomètre.

Le système de microperfusion est composé de deux blocs, l'un assurant la perfusion et l'autre la collection.

de façon qu'on puisse les déplacer les unes par rapport aux autres à l'aide de moteurs.

La pipette de soutien est connectée à une seringue ce qui permet d'aspirer le tubule et d'immobiliser ainsi une de ses extrémités.

La pipette de perfusion se trouve à l'intérieur de la pipette de soutien. Étant très fine, on la fait rentrer à l'intérieur du tubule lorsqu'il est maintenu par la pipette de soutien afin de faire s'écouler le liquide de perfusion par la lumière du tubule.

La pipette d'échange arrive jusqu'à la partie large de la pipette de perfusion et permet un changement rapide de liquide de perfusion.

La pipette de Sylgard est la plus grande, elle contient les autres pipettes. On la remplit de liquide de Sylgard pour assurer l'étanchéité une fois que le tubule est perfusé. De plus le liquide de Sylgard est un liquide diélectrique ce qui permet les mesures du potentiel transépithèlial.

B. Le système de collection : est composé de trois pipettes montées de la même façon que celles du système de perfusion.

La pipette soutien-collection ressemble à la soutien-perfusion, elle est également connectée à une seringue permettant de placer le tubule à l'intérieur de la pipette et de l'immobiliser.

La pipette de Sylgard identique à la Sylgard-perfusion; l'importance de l'étanchéité y est encore plus grande que du coté de la pipette de perfusion.

La pipette de collection très fine, amovible; a une constriction à proximité de l'ouverture ce qui permet de faire des prélèvements ayant toujours un volume identique. Ceci permet de calculer le débit, tout simplement en mesurant le temps nécessaire pour que ce volume se remplisse.

Sur les deux systèmes c'est la pipette de soutien qui est fixe, les deux autres peuvent coulis-

ser, donc s'éloigner ou s'approcher de celle-ci. Dans le système de perfusion la pipette de perfusion et la pipette échange sont solidaires.

Les mesures du potentiel transépithèlial

La chambre de perfusion est construite de telle façon qu'elle puisse loger une électrode qui reste constamment en contact avec le bain dans le-quel est plongé le tubule. Cette électrode me-sure le potentiel extratubulaire. Une autre électrode est en contact avec le liquide de perfusion, elle mesure, donc, le potentiel intratubulaire. Un dispositif relié à ces deux électrodes permet la mesure de différence de ces deux potentiels, ce qui donne la valeur de la différence des potentiels électriques transépithèliaux.

Avant que la tubule soit perfusé, on plonge la pipette de perfusion dans le bain et on me-sure le potentiel "à vide". Ceci nous permet de régler le zéro électrique.

On dépose de petites quantités de la solution à titrer sous une couche d'huile saturée en eau. Cette précaution doit être prise car les solutions manipulées peuvent avoir des concentrations très faibles ( de l'ordre de 1 0^-4M) donc toute évaporation est susceptible de modifier sensiblement la concentration. A l'aide d'une micropipette on dépose de petites gouttes ( 10^-3ì L ) sur une plaque d'argent. Grâce à une constriction à l'extrémité de la pipette les gouttes déposées ont un volume reproductible à #177;3%. Ensuite une électrode est plongée dans la microgoutte. Cette électrode est relié par un pont agar à une solution de NaNO3 (1 M) qui à son tour est relié par un autre pont agar à une solution d'AgNO3 (1M) dans laquelle plonge un fil d'argent relié au titrateur. L'autre borne du titrateur est reliée à la plaque d'argent sur laquelle est posée la goutte. Lorsqu'on établit un courant les ions Ag⁺ sont libérés de la plaque d'argent et ils réagissent avec les ions Cl^- présents dans la goutte. Les molécules d'AgCl précipitent. Grâce aux deux électrodes on peut enregistrer

une baisse de potentiel. Si on inclut un condensateur dans le circuit et si on le charge lors de la ^titration, la charge de ce condensateur est proportionnelle à la quantité du courant qui est passé dans

Pour obtenir les valeurs de concentration du liquide collecté on dépose d'abord des gouttes de la gamme de la façon décrite. On utilise trois solutions 50, 100 et 150 mM. Lorsqu'on titre ces trois solutions, les résultats obtenus peuvent être placés sur une droite pour laquelle on connaît la concentration en NaCl et la charge du condensateur correspondante pour trois points. Les concentrations inconnues des gouttes déposées à partir du liquide collecté sont déterminées par rapport à ces trois points.

Protocole

Uniquement les rats de la souche Sprague Dawley sont utilisés, ainsi on essaye de contourner un des grands problèmes dans l'expérimentation en biologie; comme jamais deux êtres vivants ne sont identiques il est impossible de répéter la même expérience dans exactement les mêmes conditions. En prenant des animaux d'une même souche stable et établie on travaille autant que

possible dans des conditions semblables. Pour cette même raison on n'utilise que des rats mâles, car leurs taux hormonaux sont relativement stables tandis que ceux d'une femelle varient en cours du cycle.

Les rats sont élevés en milieu stérile et sont soumis à un régime alimentaire standard stérile, ils ont libre accès à l'eau et ne sont sortis de l'enceinte stérile que peu avant l'expérience. Ceci a pour but d'éviter au maximum le développement d'une fibrose interstitielle. Pour éviter l'accumulation du collagène dans l'interstitium qui survient avec l'âge on utilise uniquement de jeunes rats pesant de 60 à 80 g. Ces précautions ont pour but de faciliter la microdissection.

Lorsque toutes les préparations ont été faites, on injecte au rat par voie péritonéale 2 mg de furosémide (Lasilix) qui est un inhibiteur de transporteur NaiK⁺/2Cl^- qui se trouve sur la membrane apicale de la branche large ascendante. Ce transporteur est électriquement neutre⁶ et secondairement activé. Il est activé par le gradient produit par l'action de la Na⁺/K⁺-ATPase. Lorsque le transporteur Na/K/2Cl est inhibé, la concentration en Na⁺ dans le cytosol baisse considérablement jusqu'à inhiber le fonctionnement de la Na⁺/K⁺-ATPase par défaut de substrat. Or comme la Na⁺/K⁺-ATPase est un des principaux consommateurs de l'énergie dans la cellule, lorsque l'activité de ce transporteur est réduite la consommation énergétique de la cellule est également réduite. Ceci nous permet de maintenir les tubules plus longtemps en vie pendant la dissection.

Dix minutes après l'injection de Lasilix on injecte, toujours par la voie intrapéritonéale, un anesthésique ( Pentobarbital de sodium à 50 mg/kg ). Lorsque le rat est complètement insensible à la douleur et inconscient, on ouvre le péritoine et on y verse du Ringer froid. Les reins sont rapidement prélevés et constamment gardés dans du Ringer glacé. Pour préparer la microdissection on enlève la capsule et on découpe des tranches coronales de moins de 1 mm d'épaisseur.

La microdissection s'effectue sous une loupe binoculaire ( 25 ) dans une boîte de Pétri remplie du Ringer réfrigéré, maintenu à 4°C. Pour isoler un seul tubule on écarte le tissu, avec des pinces fines, en commençant toujours par la medulla. Assez souvent quelques tubules isolés se dé-

tachent, on les sectionne à l'aide d'une aiguille fine et on transfère le tubule avec très peu de ^liquide dans la chambre de perfusion. Pour éviter que les tissus adhèrent aux parois de la boîte de

Pétri on ajoute une petite quantité de BSA ( bovine serum albumin ) dans le bain de dissection. On considère généralement que la viabilité des tubules ne dépasse pas 30 min., au-delà le risque que le tubule meure rapidement au cours de la perfusion est trop grand; donc si après 30 min. de dissection aucun tubule n'est isolé, la dissection est interrompue et un autre rat est sacrifié.

Dans la chambre de perfusion le tubule est d'abord examiné à fort grossissement pour déceler d'éventuelles discontinuités dans l'épithélium ou des opacités anormales. Toute irrégularité peut être le signe d'une rupture de la membrane basale ou de la mort des cellules épithéliales qui a pu survenir lors de la dissection. Tout tubule suspect de traumatisme est écarté.

Lorsque le tubule est dans la chambre de perfusion on approche la pipette de soutien-perfusion et par une légère aspiration on engage une de ses extrémités à l'intérieur de la pipette. Ensuite on introduit la pipette de perfusion à l'intérieur du tubule. L'autre extrémité du tubule est aspirée avec précaution dans la pipette soutien-collection. Les deux pipettes de Sylgard sont avancées pour recouvrir les deux extrémités du tubule avec le liquide de Sylgard; ainsi le milieu intratubullaire est complètement isolé du bain, on est sûr que le liquide collecté est bien celui provenant du tubule. Un montage relié à la pipette de soutien-perfusion fournit une pression hydrostatique assurant un écoulement régulier du liquide de perfusion à travers le tubule. On règle cette pression hydrostatique de façon que le débit d'écoulement du liquide dans le tubule soit de l'ordre de 4 à

Le liquide de bain qui a été aspiré dans la pipette soutien-collection lors de la mise en position du tubule doit être enlevé avant qu'on commence la collection. L'extrémité de la pipette soutien-collection est remplie de l'huile saturée en eau; ainsi, lorsque le liquide collecté rentre dans la pipette de soutien, son niveau est facilement repérable grâce au ménisque séparant l'huile et le collectât. Lors des prélèvements, on mesure le temps nécessaire pour le remplissage de la pipette de collection ( dont le volume est connu ), ce sont des périodes et elles ne sont pas toutes identiques car le débit peut varier au cours du temps.

Lorsqu'on veut changer la composition du perfusât, la pipette d'échange nous permet de changer le liquide dans la pipette de perfusion sans déranger le fonctionnement du tubule. Il faut attendre quelques minutes pour que le système se stabilise et la collection de deuxième perfusât peut commencer. Cela nous permet d'effectuer plusieurs observations ( le comportement du tubule en présence de différents perfusâts ) sur le même tubule.

Résultats

Les premières expériences consistaient à perfuser un tubule d'abord avec du Ringer ne contenant aucun inhibiteur ni hormone ( Témoin ) puis le liquide de perfusion est remplacé par du Ringer dans lequel on ajoute du barium ( 10 mM ). Dans le troisième perfusât il y a du barium (10 mM ) et on ajoute également de l'arginine vasopressine ( AVP )⁷ dans le Ringer-bain ( 10^-9 M ). Selon les connaissances actuelles sur les transporteurs membranaires dans la branche large ascendante on s'attend à voir une baisse de flux transépithèlial de chlore lorsqu'on passe de premier perfusât au deuxième. Ceci s'explique par le fait que les canaux sélectifs au potassium sont inhibés par la barium. Comme la concentration de potassium dans le perfusât est initialement basse, et comme il n'y a pas de rétrodiffusion de K⁺ à travers la membrane luminale, l'échangeur Na⁺/K⁺ (NH4⁺)/2Cl^- est inhibé par manque de substrat. Ces résultats sont cohérents avec les connaissances actuelles sur les transporteurs membranaires. Cependant, lorsqu'on perfuse le même tubule avec du Ringer au quel on a ajouté du Barium, en le plongeant dans un bain auquel on a ajouté de l'AVP on observe que le transport du chlore augmente.

L'AVP est une hormone pour laquelle il a été démontré qu'elle stimule l'absorption de NaCl dans la branche large ascendante. Or comme le liquide de perfusion contient du barium le transport de chlore devrait rester inhibé malgré l'action d'AVP. Si l'échangeur Na⁺/K⁺/2Cl^- est le seul transporteur de chlore ce transport serait interrompu tant que les canaux à potassium restent inhibés par le barium. Le rétablissement du transport transépithèlial a conduit à supposer l'existence d'un autre système de transport de chlore sur la membrane luminale de la branche large ascendante. D'autres recherches⁸ ont démontré l'existence d'une protéine sur la membrane luminale et basolatérale des cellules épithéliales de la branche large ascendante dont le rôle serait le transport de chlore et de bicarbonate. Si l'activité de cet échangeur est suffisamment importante, elle suffirait à expliquer la reprise du transport du chlore, car c'est l'échangeur Cl^-/HCO3^- qui serait stimulé par l'AVP, les canaux K⁺restant inhibés par barium. Il reste, cependant, à démontrer que l'échangeur Cl^-/HCO3^- joue réellement un rôle dans la branche large ascendante. Afin de démontrer ceci, un deuxième protocole à été mis au point.

Le segment du tubule est perfusé avec trois perfusâts différents. Le premier contient du barium, le deuxième et le troisième du barium et du 4,4'-diisothiocyanatestilbène-2,2'-disulfonate ( DIDS ). Lorsqu'on perfuse avec le troisième perfusât on ajoute de l'AVP dans le bain. Le DIDS est un inhibiteur de tous les transporteurs d'anions. Il inhibe, ainsi, l'échangeur Cl^-/HCO3^-; ceci a été démontré sur d'autres segments. Cet échangeur est déjà connu; le premier avait été observé dans les érythrocytes. La présence du barium doit maintenir les canaux K⁺,et par conséquent les transporteurs Na+/K+/2Cl-, inhibés; donc si un transport de chlore est perceptible, il est forcement dû à d'autres mécanismes de transport que l'échangeur Na+/K+/2Cl-. Lorsqu'on ajoute du DIDS on note que le transport de chlore est quasiment nul ( ou certainement considérablement réduit ) ce qui nous permet de conclure que c'est bien le Cl^-/HCO3^- qui est responsable de ce transport. Lorsqu'on ajoute de l'AVP on n'observe aucune augmentation du transport de chlore ce qui veut dire ou que tous les transporteurs de chlore ont été inhibés, l'un par le barium, l'autre par DIDS.

8 Il s'agit de résultats de l'équipe de R.A. Podevin qui ont démontré l'existence de ce transporteur sur les deux membranes de la branche large ascendante. L'expérience de P. Houillier vise à démontrer que cette protéine joue un rôle non négligeable dans les transports transépithèliaux dans la branche large ascendante

Figure 10. Les résultats montrant l'évolution du transport du chlore et du potentiel transépithèlial en présence du barium, du barium + dids et du barium+dids+avp

Discussion

L'objectif de ce travail est de démontrer que les échangeurs Cl^-/HCO3^- présents dans la branche large ascendante médullaire de l'anse de Henle du rat jouent un rôle important dans le transport de chlore. La technique de microperfusion in vitro est la seule qui permette de mesurer le flux transépithèlial d'un soluté dans des conditions différentes. Cette technique prend beaucoup de temps car il faut effectuer un nombre important de manipulations pour avoir un nombre suffisant de manipulations complètes; il arrive souvent qu'une manipulation soit interrompue à cause de la mort prématurée du tubule et que ses résultats ne soient pas exploitables. Jusqu'à la fin de mon stage, seulement trois manipulations complètes ont été obtenues, donc les explications données dans cet exposé doivent être prises en tant qu'hypothèses car il faudrait au moins cinq manipulations cohérentes pour confirmer ces hypothèses. Néanmoins les données obtenues suggèrent que le transporteur Cl^-/HCO3^- apical joue un rôle important dans le transport de chlore dans la branche large ascendante indépendant du cotransport Na+/K+(NH4+)/2Cl-. Ainsi l'opération couplée de l'échangeur Cl^-/HCO3^- avec l'échangeur Na⁺/H⁺ représente un modèle permettant d'expliquer la régulation indépendante de la réabsorption de NaCl et de la réabsorption de NH4⁺, et donc de réguler séparément l'excrétion rénale d'acide et la concentration des urines.

Mise en évidence et caractérisation d'échangeurs Cl-/HCO3- sur les vésicules des membranes plasmiques luminales et basolatérales

La branche ascendante large de Henle réabsorbe une proportion significative (environ 20%) de bicarbonate filtré par le glomérule. Les mécanismes impliqués dans cette réabsorption dans la partie médullaire de ce segment tubulaire sont seulement partiellement connus: c'est un échangeur Na⁺/H⁺ de type NHE3 qui est responsable de la sécrétion luminale de protons. En revanche, la voie d'efflux basolatérale de HCO3^- reste indéterminée. Les expériences en cours dans l'équipe de R-A Podevin ont déjà permis de démonter l'existence d'échangeurs anioniques de type Cl^-/HCO3^-, présents sur les deux types de membrane plasmique, luminale et basolatérale, des cellules épithèliales de la branche large ascendante du rat. L'approche expérimentale repose sur la préparation simultanée de vésicules de membranes plasmiques hautement purifiées, orientées dans le sens physiologique.

Les avantages et les limites de la méthode

Le principal avantage de cette méthode est de permettre l'étude séparée des membranes luminales et basolatérales de l'épithélium de la branche large ascendante médullaire, dans des ^conditions qui permettent, contrairement aux modèles utilisant des systèmes intacts (suspensions et

cultures cellulaires, tubules) de contrôler les caractéristiques du milieu intravésiculaire et extravésiculaire. Ainsi, il est possible d'inactiver certains systèmes de transport qui pourraient interférer avec l'activité du transporteur étudié. On peut utiliser, par exemple, des milieux sans NaCl, pour inactiver les échangeurs Na⁺/H⁺. Les transporteurs peuvent être localisés fonctionnellement par l'étude des transports (technique de filtration rapide) mais également par des techniques d'immunoempreinte qui permettent d'identifier les différentes isoformes des protéines de transport sur chaque membrane.

Dans le cas pré sent, des isoformes distinctes d'échangeurs anioniques ( AE ) ont été identifiées sur les membranes basolatérales et luminales : la membrane basolatérale contient un polypeptide de 165 kDa de type AE2 ainsi que plusieurs polypeptides de poids moléculaire proches de 100 kDa de type AE1, tandis que la membrane luminale contient uniquement un polypeptide de type AE1, dont la migration sur le gel diffère légèrement des échangeurs anioniques de type AE1 basolatéraux, suggérant la possibilité d'une isoforme spécifique.

Les expériences actuelles visent à différencier les isoformes présentes aux deux pôles de la cellule à l'aide des caractéristiques fonctionnelles : ainsi, il a pu être démontré une sensibilité différente au DIDS, un inhibiteur des échangeurs anioniques, puisque la valeur d'IC50⁹ est d'environ 3 uM pour les vésicules membranaires basolatérales et 15 uM pour les vésicules membranaires luminales. L'expérience suivie au cours du stage visait à déterminer une sensibilité différente des échangeurs au pH intra vésiculaire.

Méthode

Dix rats mâles Sprague-Dawley à jeun depuis 12 heures, de 250 à 300 g, sont sacrifiés après anesthésie par injection intra-peritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital de sodium, pour la préparation des suspensions de tubules de la branche ascendante large médullaire comme cela est déjà décrit (ref. 8 ). En résumé, les reins prélevés à 4°C sont décapsulés, et tranchés dans le plan sagittal. Les tranches sont transférées rapidement dans une solution de Hancks¹⁰ glacée, puis la bande interne de la médullaire externe (caractérisée par sa coloration rouge) est disséquée sous microscope binoculaire. Les fragments obtenus sont soumis à un traitement à la collagénase (40 mg/100 ml), afin de digérer les segments tubulaires les moins résistants à la collagénase (partie descendante de l'anse de Henle, tubule collecteur) , pour ne

laisser intact que les segments de la branche large ascendante médullaire qui seront récupérés par centrifugation à basse vitesse. Cette suspension tubulaire, est rincée deux fois dans une solution tampon de saccharose 250 mM, pH 7.4 contenant un inhibiteur des protéases (ABSF). Les tubules ainsi traités sont alors homogénéisés à l'aide d'un Dounce puis d'un Waring Blendor à la vitesse maximale pendant une minute afin de rompre les cellules. L'homogénat obtenu est constitué d'un mélange de membranes et différents organites. L'ajout de CaCl2 au mélange (concentration finale de 10 mM) permet de complexer l'ensemble des membranes sauf les membranes luminales. Après 20 minutes d'incubation à froid avec le CaCl2, les membranes luminales sont isolées par centrifugation (6000 g pendant 15 minutes) des autres membranes, intracellulaires et basolatérales, qui vont sédimenter ( P1 ). Le surnageant ( S1 ) contenant les membranes luminales est centrifugé à 48000 g pendant 8 minutes et le surnageant obtenu ( S2' ) est centrifugé à 400 000 g pendant 60 minutes. Le dépôt obtenu est composé à plus de 95% de membranes apicales.

Les membranes basolatérales sont isolées à partir du P1 par centrifugation (3300 g pendant 15 minutes) dans une solution d'EGTA (qui permet d'éliminer le surplus de Ca²⁺). Cette centrifugation permet de sédimenter les membranes intracellulaires, tandis que le surnageant (S2 ) est centrifugé à 48 000 g pendant 25 minutes pour obtenir un culot enrichi en membranes basolatérales. Ce culot (P3) est homogénéisé, repris dans 6 ml de la solution tampon de saccharose, puis déposé sur un gradient discontinu de saccharose ( on utilise les solutions de 44, 52 et 65% ). Une ultracentrifugation (250 000 g pendant 50 minutes) permet de séparer sur le gradients plusieurs bandes : la deuxième bande, composée de membranes basolatérales à plus de 95%, est reprise à la pipette pasteur, et soumise à une ultracentrifugation finale permettant de sédimenter la préparation des membranes basolatérales qui est reprise dans un faible volume de milieu expérimental. La composition du milieu de reprise détermine donc le milieu intravésiculaire pour les études du transport transmembranaire.

10 Solution physiologique tampon dont la composition est: ( en mM ) 112 NaCl; 5,4 KCl; 25 NaHCO3; 0,3 Na2HPO4; 0,4 K2HPO4; 0,4 MgSO4; 1,2 CaCl2; 5 D-glucose; 5 alanine; 10 Tris/Hepes pH 7,4; 1 % albumine; et bullée avec 95% O2-5%

La filtration rapide

En créant un gradient sortant de HCO3^- dans un milieu ne contenant pas de Na⁺ ( pour inhiber la Na⁺/K⁺-ATPase et les échangeurs Na⁺/K⁺ ) on favorise l'entrée de ³⁶Cl^-,par l'échangeur Cl^-/ HCO3^-, à l'intérieur des vésicules. Et c'est le ³⁶Cl^-capturé dans les vésicules à différents temps et dans les différentes conditions qui permet de caractériser les transports ioniques sur la membrane luminale et basolatérale. L'échangeur Cl^-/HCO3^- peut être étudié également sous le mode d'échange ³⁶Cl^-/Cl^-.

Le principe de la mesure est le suivant: à T0 10uL de vésicules ( luminales ou basolatérales ) sont injectés dans le milieu expérimental contenant du ³⁶Cl^-qui va être transporté par l'échangeur Cl^-/HCO3^- et s'accumuler dans les vésicules. Le transport est arrêté 9 secondes plus tard par l'ajout de 1.5 ml de solution STOP¹¹ glacé. Ce mélange est rapidement filtré sur un filtre en cellulose ( 0.45 um - donc retenant les vésicules ) puis rincé avec encore 15 ml de solution STOP glacé. Les filtres, sur lesquels sont retenues les vésicules contenant le 36Clcapturé, sont dissous dans 3 ml de scintillant et la radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur de particules â. Cette radioactivité reflète l'activité du transporteur du Cl^- dans les vésicules.

Les premières expériences effectuées avaient pour but de démontrer l'existence de échangeurs Cl^-/HCO3^- sur la membrane basolatérale et luminale et leur sensibilité au DIDS ( un inhibiteur puissant des échangeurs Cl^-/HCO3^- ). Il a été conclu à une sensibilité différente au DIDS pour les deux membranes (les valeurs d'IC50 étant de 3.2 #177; 0.94 uM pour les vésicules membranaires basolatérales et de 15.2 #177; 5.15 uM pour les vésicules membranaires luminales ).

La deuxième expérience visait à déterminer la dépendance de l'activité des échangeurs au différents pH intravésiculaires ( pHi ). Pour les deux membranes le transport a été étudié à pHi allant de 6,1 à 8, tandis que le pH extravésiculaire était constant à 5,5. Chaque me sure a été faite en

11 Solution STOP - 20 mM de Tris/Hepes pH 7.4 et une quantité du K-gluconate nécessaire pour maintenir l'osmolalité constante

présence et en absence du DIDS. La différence des transferts ioniques mesurés dans ces deux conditions permet d'estimer le transport ionique médié par l'échangeur Cl^-/HCO3^- seul ( transport inhibé par le DIDS ).

Figure 11: BLMV - Transport transmembranaire du chlore^* à travers la membrane basolatérale et

LMV - Transport transmembranaire du chlore^* à travers la membrane luminale mesuré dans les vésicules membranaires

Ä - transport dû aux transporteurs non inhibés par dids, il s'agit vraisemblablement du échangeur Cl-/HCO3 -

Les résultats obtenus montrent que le transporteur Cl^-/HCO3^- basolatéral est stimulé par des petites variations du pH intravésiculaire tandis que le transporteur Cl^-/HCO3^- luminal reste insensible aux variations du pHi¹².

Interpretation des résultats

Ces r?suétats d?montrent qu'une activit? d'?change Cl^-/HCO3^- est pr?sente sur les deux membranes, luminale et basolat?rale. L'?changeur Cl^-/HCO3^- basolat?ral est stimul? par l'augmentation du pH intrav?siculaire sugg?rant l'existence d'un site allost?riquë³. Des travaux compl?- mentaires ont permis de caract?riser les diff?rents isoformes: ainsi une isoforme de type AE-2 est pr?sente sur la membrane basolat?rale, alors qu'une isoforme du type AE- 1 est pr?sente sur les deux membranes mais il est beaucoup plus abondant sur le membrane basolat?rale.

Les donn?es d'exp?riences sur l'ovocyte de xenope confortent les conclusions des ?tudes fonctionnelles de l'exp?rience puisque on sait que l'isoforme AE 2 exprim? dans l'ovocyte de xenope est stimul?e par l'alcalose intracellulaire, contrairement ? l'isoforme AE 1.

Conclusion

Il est maintenant quasiment certain que le transporteur Cl^-/HCO3^- existe sur les membranes basolat?rale et luminale de la branche ascendante large. Il a ?galement ?t? d?montr? qu'il existe

12 sauf pour les pHi tr?s grands. Lesquels, de toutes fa?ons, ne sont pas observ?s dans les conditions physiologiques.

13 Site allost?rique - un site sensible ? la pr?sence d'un ligand ( ici protons ) modifiant l'activit? enzymatique de la prot?ine.

deux prot?ines effectuant cette fonction. Les travaux sur la caract?risation de ces deux prot?ines continuent.

Au moment de mon stage dans le laboratoire les r?sultats ne permettaient touj ours pas de

dire si le transporteur Cl^-/HCO3^- ?tait responsable du transport du Cl^- mis en ?vidence. En ce moment, le Professeur Houiller travaille en appliquant le mê?m protocole, mais c 'est le HCO3 - qui est dos?, et non le Cl^- comme dans l'exp?rience d?crite. La comparaison des r?sultats de ces deux exp?riences pourrait nous permettre d'attribuer ce transport au transporteur Cl^-/HCO3^-.

Le progr?s des connaissances sur le fonctionnement du rein demande de comprendre d'abord le fonctionnement des segments isol?s. C'est seulement ensuite, en examinant, ensemble, la situation spatiale des segments et leur fonctionnement individuel qu'on pourra ?lucider les diff?- rents aspects de leurs interactions ce qui nous permettra d'expliquer les modes de r?gulation de diff?rentes substances dans le rein.

Annexe 1. Composition des Ringers

Bibliographie

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