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Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

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par Ludovic Carlier
Université de Rouen - Doctorat de biologie structurale 2006
  

sommaire suivant

UNIVERSITE DE ROUEN

Ecole Doctorale Normande Chimie-Biologie

THESE

présentée par

Ludovic Carlier

pour obtenir le titre de

Docteur de l'Université de Rouen

Spécialité : Biologie Structurale et Fonctionnelle

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale

&

Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17

humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

Soutenue le 10 Juillet 2006 devant le jury : Président Patrice LEROUGE

Rapporteur Constantin T. CRAESCU Rapporteur Jean-Pierre SIMORRE Examinateur Bernard GILQUIN Examinateur Laure GUILHAUDIS Directeur de Thèse Daniel DAVOUST

préparée au Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire de

l'Equipe de Chimie Organique et Biologie Structurale (CNRS UMR 6014, IFRMP 23)

A la mémoire de ma belle-maman,

Belle tu l'as été, quand tu m'as élevé comme ton propre fils, Belle tu l'es restée, lorsque tu as fait face avec courage à la maladie, et Belle, tu le seras toujours dans le coeur de tes enfants.

« Rêve de grandes choses, cela te permettra

au moins d'en faire de toutes petites » Jules Renard (1864-1910)

Remerciements

Je tiens en premier lieu à remercier le Docteur Constantin Craescu, Directeur de Recherche à l'Institut Curie de l'Université d'Orsay, et le Docteur Jean-Pierre Simorre, Directeur de Recherche à l'Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel de l'Université

de Grenoble, pour l'honneur qu'ils me font en acceptant de juger ce travail. Je voudrais également remercier le Professeur Patrice Lerouge, du Laboratoire de Structure/fonctions des glucides de l'Université de Rouen, et le Docteur Bernard Gilquin, du Département d'Ingénierie et d'Etude des Protéines du CEA de Saclay, de participer à ce jury.

Voici donc le moment tant attendu des remerciements... Après quatre années de thèse

où se sont alternés « des hauts » et « des bas », il est temps pour moi de confirmer une rumeur de plus en plus persistante : ces quatre années de doctorat, et les deux sujets sur lesquels je me suis penché, n'ont pas eu raison de ma passion pour la recherche qui en sort bien plus ravivée. Alors, je le dis haut et fort : « la recherche, c'est formidable ! », même si (ma famille et mes proches en conviendront) cette passion demande parfois quelques sacrifices. J'ai eu la chance d'avoir été accueilli dans pas moins de 4 laboratoires durant cette thèse, et d'avoir côtoyé des chercheurs de différents horizons qui m'ont énormément appris, tant sur le plan scientifique, que sur le plan humain. A moi à présent de remercier toutes les personnes qui m'ont aidées, de près ou de loin, à obtenir les résultats présentés dans ce manuscrit. J'espère ne pas en oublier !!!

J'exprime toute ma reconnaissance au Professeur Daniel Davoust, Directeur de l'Equipe de Chimie organique et Biologie Structurale de l'Université de Rouen, pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et m'avoir permis de réaliser cette thèse. Je vous remercie de

la confiance que vous m'avez accordée depuis le premier apprentissage que j'ai effectué dans votre laboratoire de RMN dans le cadre d'un stage de maîtrise de chimie, il y a déjà quelques années...

J'exprime mes profonds remerciements aux Docteurs Laure Guilhaudis et Isabelle Milazzo pour avoir encadré ce travail de thèse. Merci d'avoir partagé vos connaissances scientifiques avec un « zouave » de mon espèce. La qualité de vos rapports humains, le suivi constant de ce travail, et l'émulation scientifique dont vous avez fait part, ont largement contribué à la réussite de cette thèse : « chapeaux bas !!! ».

Que les rencontres furent nombreuses et enrichissantes au cours de ces quatre années! Des médecins aux modélistes, en passant par les généticiens, les biochimistes, et bien sûr les RMNistes, vous m'avez formé à différentes techniques dans vos laboratoires respectifs, et transmis un savoir extraordinaire à travers de nombreuses discussions, qui se sont parfois prolongées au-delà des heures réglementaires autour d'un petit verre sur une terrasse...

? Au Laboratoire de Génétique Moléculaire de l'EMI 9906 (INSERM U614) :

J'adresse mes remerciements au Professeur Thierry Frébourg pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et intégré à son équipe pendant les huit premiers mois de cette thèse. Je remercie également le Docteur Dominique Campion pour l'intérêt qu'il a porté à mon travail.

Un grand merci à Hélène Jacquet-Delmulle pour m'avoir introduit dans l'univers de

la proline déshydrogénase et de la schizophrénie. Ton aide et ton initiation à la biologie moléculaire m'ont été très précieux ! Merci également à Grégory Raux d'avoir construit le premier vecteur de surexpression de PRODH même si, à priori, nous n'avons pas la même vision de la recherche et des relations humaines.

Je tiens à remercier très chaleureusement le Docteur Chahrazed El Hamel qui m'a prise sous son aile pendant mon séjour dans ce laboratoire. Je souhaite te témoigner toute mon admiration pour l'étendue de tes connaissances, la qualité de ton encadrement, et l'immense gentillesse qui te caractérise.

Un grand merci à Cécile, Magalie, Nathalie, Jackie, Audrey, Olivier, Anne, et Isabelle pour votre amitié et votre précieuse aide. Courage Olivier, tu vas y arriver !!!

? Au Laboratoire de Marquage des Protéines du CEA de Saclay :

Difficile d'écrire ces quelques lignes sans une certaine émotion car mon passage au LMP a été l'occasion de rencontrer des personnes plus formidables les unes que les autres. Mes remerciements s'adressent tout d'abord au Docteur Roger Genet, responsable de cette équipe, qui m'a accueilli avec sympathie et enthousiasme avant de partir vers des fonctions ministérielles.

J'exprime ma profonde reconnaissance aux Docteurs Muriel Gondry et Sandrine

Braud, les « deux femmes de ma thèse ». Je ne te remercierai jamais assez Muriel pour tout

ce que tu as fait pour moi : ton écoute et tes encouragements m'ont redonné confiance lorsque le moral n'y était plus. Tu m'as énormément appris dans le domaine de la protéine recombinante que tu compares si joliment à de la « cuisine » ! Un grand merci également à

ma p'tite mamie Braud qui m'a encadré avec tout le sérieux et la rigueur qu'on lui connaît. J'ai eu la chance de découvrir la femme formidable qui se cachait au fond de la « working girl », et ça vaut le détour !!! (comme quoi il ne faut jamais se fier aux apparences).

Mon passage au LMP n'aurait pas été si plaisant sans la présence inattendue d'un fan club de groupies présidé par Rachel Amouroux et Muriel Bahut. Merci beaucoup Rachel, alias « super boomeuse », pour ton amitié et ton soutien. Tu voulais du rêve, je t'ai offert un

Mc Do, que souhaiter de mieux ??? Grâce à toi, je me souviendrais longtemps de ce chef- d'oeuvre du cinéma américain intitulé « independence day »... Merci ma p'tite Muriel, alias

« Mu-Mux », pour ta bonne humeur, ta joie de vivre, tes fous rires communicatifs, et ton accent du sud qui te va si bien. Je remercie Marie Courçon et Cédric Masson pour leur aide précieuse et leur sympathie de tous les instants. Je salue également Cathy, Marianne, Mireille, Carine, Jean, Christine, et Jean-Baptiste, ainsi que les vigiles de la FLS avec qui j'ai eu l'occasion de partager quelques courses-poursuites (qui a dit que la recherche n'était pas sportive ?).

? Au Laboratoire de Structure des Protéines du CEA de Saclay :

J'exprime ma profonde reconnaissance aux Docteurs Bernard Gilquin, Sophie Zinn-Justin, et Joël Couprie pour m'avoir permis de travailler sur la protéine KIN17. Avoir été encadré par vous trois est pour moi une véritable chance, tant sur le plan scientifique, que sur

le plan humain. Merci beaucoup Joël d'avoir élargi mon horizon à la RMN 3D et d'avoir répondu à mes nombreuses questions avec gentillesse et disponibilité. Un immense merci au Monsieur Modélisation Moléculaire du LSP, en la personne de Bernard Gilquin, pour ses longues discussions passionnées sur le programme d'attribution automatique des nOe. Quel

bel outil ! Je reste assurément votre premier fan ! Merci beaucoup Sophie de m'avoir guidé dans la rédaction de ce manuscrit : tu as éclairé ma lanterne à de nombreuses reprises !

Je salue également tous les étudiants et post-docs du LSP que j'ai eu l'occasion de côtoyer en commençant par Albane le Maire qui a finie par ne plus confondre mon prénom après 12 mois de collaboration !!! Plus sérieusement, merci Albane de m'avoir accepté sur KIN17 et pour le temps que tu m'as consacré. Spéciale dédicace à Sandrine Caputo : tiens tiens, un Winged Helix peut en cacher un autre... Je te remercie chaleureusement pour

ton aide spontanée, ton extrême gentillesse, et pour m'avoir offert deux nuits dans le New York parisien. Merci également à Gaëlle, Cédric, Nathalie, et Virginie avec qui j'ai partagé de belles discussions.

? Au Laboratoire de Résonance Magnétique Nucléaire de l'Université de Rouen

J'en reviens finalement à mon laboratoire d'accueil qui a également été le théâtre de très jolies rencontres. J'adresse mes profonds remerciements aux Docteurs Hassan Oulyadi et Eric Condamine qui m'ont beaucoup appris dans le domaine de la RMN haute résolution, et pas seulement des macromolécules biologiques ! Merci au Docteur Gaël Coadou, le « nouveau venu », pour ses conseils frais et dynamiques.

Un grand merci à Nicole Roussel, véritable pièce maîtresse de ce labo, qui s'occupe si bien de « ses petits étudiants » avec une immense, que dis-je ? Une péninsule de gentillesse.

Je remercie également toutes les « vieilles canailles » avec qui j'ai passé de très bons moments pendant ces quatre années. Aux anciens pour commencer : Karine courchay, merci

de m'avoir fait découvrir des endroits chaleureux avec de la musique ringarde remixée et des lumières de toutes les couleurs. A Michel Auvray, alias « michou », l'homme le plus extraordinaire que j'ai rencontré dans un labo ! Merci d'avoir réinventé la recherche : si le CNAM en recrute encore deux comme toi, alors il peut mettre la clef sous la porte, mais il en sortira humainement grandi !!! A Didier Rivière, alias le « créolais », merci pour les belles parties de tennis, et comme l'a souligné « michou », pour ta vision optimiste de la recherche...

A Pedro Lameiras, le footballeur portugais le plus parisien, un immense merci pour avoir partagé tes connaissances de la RMN avec autant de générosité, et pour ton amitié qui m'a beaucoup touchée. A Franck Paté : qui aurait cru, lorsque nous pratiquions le tarot intensif pendant les cours de philo en terminale, que nous arriverions à ce niveau d'étude ? (surtout ne

le dis à personne, ce sera notre secret). A Anne Lautrette, j'ai une révélation à te faire : je déteste ton café ! Quoi qu'il en soit, merci beaucoup pour ta sympathie même si au début ce n'était pas gagné ! A Romain Thuau, mon technicien supérieur préféré, sans aucun doute le chercheur au plus grand coeur que je connaisse. Merci ma poule pour ton amitié sans calcul.

Je te souhaite tous mes voeux de bonheur avec la belle Nadège que je salue au passage.

Je tiens également à exprimer toute ma sympathie aux membres du Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bio-Organique pour leur gentillesse et leurs conseils judicieux : le Professeur Catherine Lange, les Docteurs Marie Hubert-Roux, Corinne Loutelier-Bourhis, et Héléne Lavanant, ainsi qu'Albert Marcual. Je salue également les joyeux étudiants de ce laboratoire : Julie Hardouin, Delphine Oursel, Thomas Vincent (félicitations pour cet heureux événement), et le non moins gigantesque Romain Dolé, alias « p'tit bouchon », qui gagne à être connu et reconnu !

Enfin, je ne pouvais terminer ces remerciements sans témoigner ma profonde reconnaissance à mes plus fidèles proches qui m'ont énormément soutenus pendant ces quatre années de thèse. Un grand merci à Sammy, Aurélie, Frédo, Greg, et mon p'tit TD pour vos nombreux encouragements et votre amitié.

MERCI A TOUS !!!

TABLE DES MATIERES

ABREVIATIONS ..................................................................................................................... 1

PREAMBULE .......................................................................................................................... 3

PREMIERE PARTIE .............................................................................................................. 9

PRODUCTION DE DOMAINES RECOMBINANTS PRODH EN

VUE DE L'ANALYSE STRUCTURALE

CHAPITRE I : INTRODUCTION ....................................................................................... 11

1 CONTEXTE BIOLOGIQUE ................................................................................................. 13

1.1 Le catabolisme de la proline ................................................................................................ 13

1.2 Hypothèses sur les partenaires biologiques de PRODH chez les organismes eucaryotes .. 16

1.3 Modèle de régulation du catabolisme de la proline chez la bactérie E. coli ....................... 17

1.4 Les troubles de l'activité de PRODH chez les eucaryotes supérieurs ................................. 21

1.5 Conclusions.......................................................................................................................... 23

2 STRATEGIE D'ETUDE STRUCTURALE DE PRODH HUMAINE PAR RMN............................... 24

2.1 Analyse bio-informatique préliminaire ................................................................................ 24

2.2 Démarche entreprise............................................................................................................ 27

CHAPITRE II : EXPRESSION DES PROTEINES PRODH SAUVAGE ET MATURE CHEZ E. COLI......................................................................................... 29

1 PRODUCTION DE PRODH SAUVAGE ................................................................................. 31

1.1 Caractérisation de l'expression et de la solubilité de la protéine hétérologue ................... 31

1.2 Optimisation de paramètres d'expression et d'extraction ................................................... 33

2 PREDICTION DU PEPTIDE SIGNAL DE LA SEQUENCE PRODH HUMAINE ............................. 34

2.1 Les messages d'adressage mitochondrial ............................................................................ 34

2.2 Résultats de la prédiction..................................................................................................... 35

3 PRODUCTION DE LA PROTEINE MATURE PRO564 ............................................................ 37

4 CONCLUSIONS ............................................................................................................... 38

5 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................ 40

5.1 Création des plasmides d'expression................................................................................... 40

5.2 Production, extraction, et analyse de PRODH et PRO564 ................................................. 42

CHAPITRE III : ETUDE BIO-INFORMATIQUE : SELECTION DE 3 DOMAINES PRODH..................................................................................................... 45

1 DESCRIPTION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE PRODH DE E. COLI .................................. 47

2 CARACTERISATION DE L'ORGANISATION DE PRODH HUMAINE....................................... 49

2.1 Report de la structure secondaire de PutA669 sur l'alignement initial .............................. 49

2.2 Organisation de PRODH humaine ...................................................................................... 49

3 SELECTION DES 3 DOMAINES A EXPRIMER ..................................................................... 55

4 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................ 57

4.1 Recherche d'homologie de séquence ................................................................................... 57

4.2 Alignements de séquences et prédictions structurales ......................................................... 57

CHAPITRE IV : EXPRESSION DE 4 PROTEINES PRODH DANS LE CADRE D'UN PROGRAMME DE PRODUCTION..................................................... 59

1 STRATEGIE DE PRODUCTION DES 4 PROTEINES PRODH ................................................... 61

1.1 Stratégie générale ................................................................................................................ 61

1.2 Stratégie de construction des vecteurs d'expression ........................................................... 63

1.3 Criblage des conditions d'expression en microplaques....................................................... 64

1.4 Production à grande échelle et obtention de la protéine d'intérêt ...................................... 65

2 PRODUCTION DES 4 DOMAINES PRODH .......................................................................... 68

2.1 Bilan du criblage des conditions d'expression en microplaques ......................................... 68

2.2 Production, purification, et obtention des protéines d'intérêt ............................................. 69

3 CONCLUSIONS ............................................................................................................... 82

4 MATERIELS ET METHODES ............................................................................................ 83

4.1 Production à grande échelle et extraction des protéines ..................................................... 83

4.2 Purification des protéines de fusion et des protéines d'intérêt ............................................ 84

4.3 Clivage du partenaire de fusion par la protéase TEV ......................................................... 85

CHAPITRE V : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES................................................... 87

SECONDE PARTIE .............................................................................................................. 93

CARACTERISATION DE LA REGION 51-160 DE LA

PROTEINE KIN17 HUMAINE PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE

CHAPITRE I : INTRODUCTION ....................................................................................... 95

1 GENERALITES SUR LE MAINTIEN DE L'INTEGRITE DU GENOME ...................................... 97

1.1 Les dommages de l'ADN...................................................................................................... 97

1.2 Les systèmes mis en jeu ........................................................................................................ 99

1.3 Les voies de réparation des lésions de l'ADN ..................................................................... 99

2 LA PROTEINE KIN17 ................................................................................................... 101

2.1 Les propriétes de la protéine KIN17 .................................................................................. 101

2.2 Organisation des domaines structuraux de KIN17 ............................................................ 103

3 CONCLUSIONS ............................................................................................................. 107

CHAPITRE II : PRODUCTION ET ANALYSES PRELIMINAIRES DU DOMAINE K2 DE LA PROTEINE HUMAINE KIN17........................................ 109

1 PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR L'ANALYSE RMN ........................................ 111

1.1 Sélection et optimisation du système d'expression ............................................................ 111

1.2 Obtention de K2 simplement marquée 15N et doublement marquée 15N / 13C .................... 115

2 CARACTERISATIONS PRELIMINAIRES ........................................................................... 122

2.1 Caractérisation de la séquence primaire et contrôle du marquage................................... 122

2.2 Caractérisation de l'état oligomérique .............................................................................. 123

2.3 Caractérisation de la structure secondaire et tertiaire...................................................... 124

2.4 Etude préliminaire par Résonance Magnétique Nucléaire................................................ 126

3 CONCLUSIONS ............................................................................................................. 131

CHAPITRE III : STRATEGIE D'ETUDE PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE DU DOMAINE K2.......................................... 133

1 METHODE D'ATTRIBUTION DES RAIES DE RESONANCE ................................................ 137

1.1 Attribution des carbones de la chaîne principale et des 13Câ............................................. 138

1.2 Attribution des protons 1Há et 1Hâ ...................................................................................... 143

1.3 Attribution des chaînes latérales........................................................................................ 145

2 DETERMINATION DE LA TOPOLOGIE ET RECUEIL DES CONTRAINTES STRUCTURALES ... 146

2.1 L'effet Overhauser nucléaire ............................................................................................. 147

2.2 Détermination de la structure secondaire et de la topologie............................................. 149

2.3 Recueil des contraintes structurales .................................................................................. 153

3 MODELISATION MOLECULAIRE SOUS CONTRAINTES RMN ......................................... 155

3.1 Principe de la mécanique moléculaire adaptée aux systèmes biologiques........................ 155

3.2 Le logiciel CNS .................................................................................................................. 160

3.3 Le programme d'attribution automatique des pics nOe du LSP........................................ 166

CHAPITRE IV : CARACTERISATION STRUCTURALE DU DOMAINE K2 PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE .............................. 181

1 DETERMINATION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE K2 DE KIN17 HUMAINE ................ 183

1.1 Attribution des raies de résonance..................................................................................... 183

1.2 Détermination de la topologie du domaine K2 .................................................................. 192

1.3 Calcul de la structure par Modélisation Moléculaire sous contraintes RMN ................... 199

2 DESCRIPTION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE K2....................................................... 204

2.1 Structure secondaire .......................................................................................................... 204

2.2 Les éléments qui composent le coeur hydrophobe .............................................................. 205

2.3 La boucle entre les hélices H2 et H3 ................................................................................. 206

2.4 L'hélice C-terminale H4 .................................................................................................... 208

CHAPITRE V : RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE : QUEL EST LE ROLE DU DOMAINE K2 DE KIN17 HUMAINE ? ............................................ 211

1 LE DOMAINE K2 DE KIN17 ADOPTE UN REPLIEMENT DE TYPE WINGED HELIX ............. 213

2 LE MOTIF WINGED HELIX DE KIN17 EST-IL CAPABLE DE LIER L'ADN OU L'ARN ? ........ 216

2.1 Approche structurale ......................................................................................................... 217

2.2 Approche fonctionnelle ...................................................................................................... 227

3 LE MOTIF WINGED HELIX DE K2 PRESENTE UNE SURFACE ULTRA CONSERVEE.............. 229

4 CARACTERISATION DE LA POSITION DU MOTIF PREDIT EN « DOIGT DE ZINC » AUTOUR DU DOMAINE WINGED HELIX ............................................................................................. 232

4.1 Stratégie employée ............................................................................................................. 233

4.2 Préparation de l'échantillon de protéine K3 simplement marquée 15N ............................. 233

4.3 Résultats de la cartographie des variations de déplacement chimique ............................. 234

CHAPITRE VI : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................... 239

ANNEXE : CRIBLAGE DES CONDITIONS D'EXPRESSION DES PROTEINES PROENTIER, PROCATAL, PROTER, ET PROINSER ........................ 247

1 MATERIELS ET METHODES .......................................................................................... 249

1.1 Construction des plasmides d'expression par recombinaison homologue ........................ 249

1.2 Criblage des conditions d'expression en microplaques..................................................... 253

2 RESULTATS ................................................................................................................. 254

2.1 Le domaine PROcatal ........................................................................................................ 254

2.2 Le domaine PROentier....................................................................................................... 256

2.3 Le domaine PROter............................................................................................................ 258

2.4 Le domaine PROinser ........................................................................................................ 260

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................... 263

ABREVIATIONS

1D, 2D, 3D, 4D Expérience RMN à une, deux, trois, ou quatre dimension(s)

3PM Programme de Production et Marquage des Protéines

ADN Acide DésoxyriboNucléique

ADNc Acide DésoxyriboNucléique complémentaire

Ampi Ampicilline

ARN Acide RiboNucléique

ARNm Acide RiboNucléique messager

ATP Adenosine TriPhosphate

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate

BER Base Excision Repair

CAM ChlorAMphénicol

CNS Cristallography and NMR System

COSY COrrelation SpectroscopY

CSD Chemical Shift Deviation (déplacement chimique secondaire)

DC Dichroïsme Circulaire

DNase Désoxyribonucléase

DO Densité Optique

DTT 1,4-DiThioTréitol

EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique

ESI ElectroSpray Ionization

FAD Flavine Adénine Dinucléotide

FADH2 Flavine Adénine Dinucléotide réduit

FMN Flavine MonoNucléotide

GABA Acide gamma amino-butyrique

HCA Hydrophobic Cluster Analysis

HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence spectroscopy

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

HR Homologous Recombinaison

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy

IMAC Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

INEPT Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfert

IPTG IsoPropyl -D ThioGalactopyranoside

IR Radiations ionisantes

1

ITD-MS Ion Trap Detector-Mass Spectroscopy

LB Luria-Bertani

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

MMR MisMatch Repair

MMS Methyl Methane Sulfonate

NAD+ Nicotinamide Adénine Dinucléotide

NADH Nicotinamide Adénine Dinucléotide réduit

NADP+ Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NADPH Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate réduit

NBT Nitro Blue Tetrazolium

NER Nucleotide Excision Repair NHEJ Non Homologous End Joining nOe nuclear Overhauser effect

NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

PBS Phosphate Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction PMSF PhenylMethylSulfonyl Fluoride PRODH PROline DésHydrogénase

PVDF PolyVinylidine DiFluoride

P5C Pyrroline-5-Carboxylate

P5CDH Pyrroline-5-Carboxylate DésHydrogénase

RMN Résonance Magnétique Nucléaire RMSD Root Mean Square Deviation RNase Ribonucléase

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SMART Simple Modular Architecture Research Tool

TCEP Tris((2-CarboxyEthyl)Phosphine)

TEV Tobacco Etch Virus

TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY

TRIS Tris(hydroxyméthyl) amino méthane

TSP 3-(TriméthylSilyl)[2,2,3,3-2H4] Propionate

TST Tris Saline Tween

UV Ultraviolet

E. coli Escherichia coli

2

Préambule

Préambule

Les protéines sont des polymères d'acides aminés qui, avec l'eau, représentent les

composants principaux des organismes vivants. A l'image de l'ADN, support de l'information génétique et de l'hérédité, elles peuvent être considérées comme les molécules fondamentales de la vie. Cependant, à la différence des acides nucléiques qui sont à l'origine

de leur synthèse, les protéines se caractérisent par une diversité fonctionnelle immense associée à une diversité structurale considérable. Bien que les êtres vivants n'utilisent qu'une vingtaine d'acides aminés différents pour composer les protéines, la grande diversité structurale de ces macromolécules s'explique par la variabilité de l'enchaînement des acides aminés dans la séquence primaire, qui guide véritablement la nature du repliement. Avec l'essor de la biologie structurale, il est aujourd'hui communément admis que la fonction d'une protéine est intimement liée d'une part, à sa structure tridimensionnelle, c'est-à-dire à l'organisation de ses atomes dans l'espace, et d'autre part, à sa dynamique intra-moléculaire, c'est-à-dire à l'amplitude des mouvements de ses atomes. A l'heure où la caractérisation des fonctions des protéines encodées par les génomes constitue un défi majeur de l'ère post- génomique, la détermination de la structure tridimensionnelle des protéines à l'échelle de l'atome représente donc un enjeu considérable dans l'optique d'identifier et de comprendre leur(s) fonction(s). Cette approche, appelée « étude structurale », a pour objet d'apporter des informations sur les relations structure-activité, et structure-dynamique-activité, et ainsi d'améliorer la compréhension des bases moléculaires du rôle de ces molécules. Une telle étude peut avoir deux objectifs différents :

- Dans le cas de protéines de fonction inconnue, la connaissance de la structure tridimensionnelle va permettre, par comparaison avec celles dont le repliement est proche, de proposer une ou plusieurs activités pour la biomolécule étudiée.

- Lorsque la fonction est connue, l'objectif est d'identifier les éléments de structure ou

les acides aminés essentiels à l'activité dans le but de caractériser les mécanismes réactionnels spécifiques de la fonction. Ceci peut être initié, par exemple, en comparant les structures native et mutée (induisant une modification de l'activité) d'une même protéine, ou en identifiant les sites d'interaction avec des partenaires biologiques potentiels (ligand, substrat, cofacteur, partenaire protéique...).

C'est dans cette double optique que nous avons entrepris l'étude structurale de deux protéines humaines : la protéine mitochondriale proline déshydrogénase (PRODH) qui fait

l'objet de la première partie de ce manuscrit, et la protéine nucléaire KIN17 qui fait l'objet de

la seconde partie.

A ce jour, il existe plusieurs techniques qui offrent la possibilité de caractériser la structure tridimensionnelle d'une protéine. Cependant, seules la cristallographie des rayons X

et la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) en solution permettent d'atteindre une résolution de l'ordre de l'Angström qui est nécessaire pour comprendre le fonctionnement d'objets moléculaires aussi petits que les protéines. Quelle que soit la technique utilisée, la RMN ou la cristallographie, le préliminaire à une étude structurale est l'obtention d'une quantité importante de la protéine à étudier (~ 1 umole dans 500 uL, c'est-à-dire ~ 15 mg pour une protéine de 15 kDa) sous forme soluble, pure, et stable. Ces critères constituent véritablement les exigences inhérentes à l'analyse structurale. A l'heure actuelle, trois méthodes permettent potentiellement de remplir ces conditions : la protéine peut être directement extraite de son organisme naturel, synthétisée chimiquement, ou surexprimée sous forme recombinante dans un organisme hôte. Cependant, les quantités obtenues par extraction sont souvent insuffisantes, et la synthèse chimique devient difficilement réalisable pour des polypeptides de plus de 50 acides aminés. Pour ces raisons, la surexpression dans un système recombinant est de loin la technique la plus utilisée, d'autant plus qu'elle permet de réaliser des marquages isotopiques indispensables à l'étude d'une protéine de taille élevée

(> 10 kDa) par RMN.

Les organismes de surexpression les plus courants sont les bactéries, les levures, et les cellules d'insectes (baculovirus). Pour des raisons essentiellement liées à sa facilité d'utilisation, et à sa capacité à produire des quantités importantes de protéine marquée, la bactérie Escherichia coli est le système le plus communément utilisé. C'est pourquoi, nous avons entrepris de surexprimer des domaines protéiques de PRODH et KIN17 chez cet hôte bactérien. Cependant, bien que la protéine d'intérêt soit produite in vivo, il n'est pas garanti qu'elle adopte un repliement stable et biologiquement actif. En d'autres termes, le comportement d'une protéine exogène exprimée dans un organisme recombinant n'est pas prévisible, et la préparation de l'échantillon, véritable étape limitante de l'étude structurale, peut demander de longues étapes d'optimisation, qui, dans certains cas, peuvent se solder par

un échec. Ainsi, dans le cadre de ce travail de thèse, de grandes difficultés ont été rencontrées

pour préparer les échantillons de protéines PRODH, ce qui n'a pas été le cas avec la protéine

KIN17 où la réussite de cette première étape majeure a permis d'envisager une caractérisation

structurale par RMN. Par conséquent, ce manuscrit est organisé en deux parties distinctes.

La première partie, consacrée à la proline déshydrogénase PRODH, présente conjointement les différentes stratégies que nous avons employées pour surexprimer des protéines et domaines structuraux PRODH chez E. coli en vue de l'analyse structurale, ainsi que les résultats de la production et de l'optimisation de l'expression de ces protéines. Le problème de la délimitation des domaines structuraux sera notamment évoqué. Ce travail a été réalisé dans le cadre d'une collaboration avec le Laboratoire de Génétique Moléculaire de l'EMI 9906 de la Faculté de Médecine-Pharmacie de Rouen, et le Laboratoire de Marquage des Protéines du CEA de Saclay. Les objectifs de cette étude seront préalablement abordés

après avoir présenté l'intérêt biologique suscité par la proline déshydrogénase PRODH.

Dans la seconde partie de ce manuscrit, je présenterai l'étude structurale du domaine

K2 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire qui a été entreprise dans le cadre d'une collaboration avec le Laboratoire de Structure des Protéines du CEA de Saclay. Dans un premier chapitre, j'introduirai de manière simplifiée et succincte le contexte biologique de la protéine KIN17, puis les objectifs de ce travail seront exposés. Les premiers résultats de l'étude expérimentale, à savoir la préparation des échantillons de protéine marquée 15N et 15N / 13C pour l'analyse par RMN, ainsi que les analyses préliminaires, seront présentés dans le second chapitre. Dans le troisième chapitre, sera détaillé l'ensemble des méthodologies de RMN et modélisation moléculaire utilisées dans cette étude. Les résultats

de la caractérisation structurale proprement dite, c'est-à-dire l'attribution des raies de résonance du domaine K2, la détermination de la topologie de la protéine, le recueil des contraintes expérimentales, et le calcul de la structure par Modélisation Moléculaire, seront décrits dans le chapitre 4. Les relations structure-activité du domaine K2 de la protéine KIN17 humaine seront finalement discutées dans le chapitre 5.

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