5.2) Production, extraction, et analyse de PRODH et
PRO564
5.2.1) Surexpression des protéines
recombinantes
Les différents tests de surexpression des
protéines PRODH sauvage et PRO564 ont été
réalisés en utilisant le protocole décrit
ci-après. Certains paramètres ont fait l'objet d'une
optimisation et sont discutés dans les paragraphes 1.2 et 3.
Pour chaque production, l'ensemencement initial des
boîtes de pétri est effectué à partir des
stocks glycérol de bactéries conservés à
-80°C. Plusieurs colonies BL21 transformées par le vecteur
pREP-4 et un plasmide pQE-31 contenant un des gènes
d'intérêt sont étalées sur boite LB/agar contenant
50 ug/mL d'ampicilline et 30 ug/mL de kanamycine. Après une nuit
d'incubation à 37°C, une colonie isolée est mise en
préculture dans un falcon
de 12 mL contenant 5 mL de milieu LB, 100 ug/mL
d'ampicilline, et 30 ug/mL de kanamycine. L'ensemble est incubé
à 37°C pendant 3 heures sous une agitation de 250 rpm.
La croissance bactérienne est suivie par mesure de la DO
à 600 nm. Une culture de 30 mL de milieu LB contenant la même
concentration d'antibiotiques est introduite dans un erlenmeyer
de 300 mL, puis ensemencée avec un volume de
préculture de manière à obtenir une DO initiale
égale à 0.05. Cette culture est ensuite placée à
37°C sous une agitation de 250 rpm. L'expression des protéines
recombinantes est induite par ajout de 1mM d'IPTG dans les
milieux de culture lorsque la DO mesurée à 600 nm
atteint 0.5. La culture est alors poursuivie
pendant 3 heures à 37°C sous une agitation de 250
rpm. A l'issu de ce délai, la croissance
bactérienne est stoppée en introduisant les
erlenmeyers dans la glace.
5.2.2) Extraction des protéines
hétérogènes
La lyse des cellules bactériennes et l'extraction
des protéines sont réalisées de la manière
suivante. Les bactéries sont récoltées par centrifugation
à 6000xg pendant 20 minutes
à 4°C. Après élimination des
surnageants, les culots bactériens sont resuspendus dans 3 mL
d'un tampon contenant, 50 mM de phosphate (pH=7.1), 500 mM de
NaCl, et 2 mM d'EDTA.
La rupture des membranes bactériennes est
initiée en introduisant du lysozyme à une concentration
finale de 100 ug/mL. Le mélange est laissé sur glace pendant 15
minutes puis porté à 37°C pendant 10 minutes. 5 mM de MgCl2,
10 ug/mL de DNase I, et 50 ug/mL de RNase sont ensuite introduits dans le but
de dégrader l'ADN et l'ARN libérés dans le lysat.
L'ensemble est incubé à température ambiante pendant 10
minutes avant d'être soumis à 2 cycles de sonication afin de
compléter la lyse des membranes. Les fractions soluble et
insoluble sont séparées par centrifugation à 14000xg
pendant 45 minutes à 4°C. Il est à noter que l'utilisation
de DNase I, qui digère l'ADN endogène visqueux de E.
coli, permet d'éviter d'entraîner des protéines
solubles qui accrocheraient cet ADN dans la fraction des protéines
insolubles. Le culot contenant le matériel insoluble est
resuspendu avec 3 mL de tampon dénaturant composé de 50
mM de phosphate (pH=7.1), 500 mM de NaCl, et 8 M d'urée.
L'urée est un puissant chaotrope qui permet de dénaturer et
solubiliser les corps d'inclusion. L'ensemble est mis sous agitation
à 4°C pendant 6 heures, puis de nouveau centrifugé
à
14000xg pendant 45 minutes à 4°C. La
fraction soluble de cette seconde centrifugation contenant les corps
d'inclusion dénaturés est appelée « fraction
urée 8M ». Le culot final est finalement repris avec 3 mL de SDS
2%, un détergent anionique dénaturant très puissant.
5.2.3) Analyse de l'expression des protéines
recombinantes
Une fois la totalité des fractions de
centrifugation collectées, les surnageants des fractions soluble et
« urée 8M » sont aliquotés, congelés dans
l'azote liquide, puis stockés à -
80°C. La préparation des échantillons
pour l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE se déroule
de la manière suivante. 30 uL de chaque aliquot sont
prélevés, puis mélangés avec 30
uL de « bleu de charge » (0.2 mM de Tris-HCl, 40 % de
glycérol, 2.6 % de SDS, 2.6 % de â- mercaptoéthanol, et
0.05 % de bleu de Coomassie G-250). Les échantillons ainsi
préparés
sont chauffés à 95°C pendant 5 minutes, puis
centrifugés 1 minute à 6000xg. Environ 15 uL
de ce mélange sont finalement prélevés et
déposés sur gels de polyacrylamide pour l'analyse
SDS-PAGE.
Les échantillons analysés par Western-blot
sont préparés de la même manière et sont dans
un premier temps soumis à une analyse SDS-PAGE. Une fois
séparées sur gel de polyacrylamide, les bandes
protéiques sont transférées sur membrane de PVDF
avec un appareil de transfert semi sec. La membrane est ensuite
incubée à 37°C pendant une heure avec une solution saline
contenant l'anticorps anti-6xHis greffé à la phosphatase
alcaline (Sigma). La révélation des protéines qui
possèdent une étiquette 6xHis est finalement menée
en déposant la membrane dans une solution contenant
le substrat BCIP/NBT. Ce substrat interagit de manière directe
avec la phosphatase alcaline, ce qui induit une coloration des
bandes protéiques fixées par l'anticorps
anti-6xHis.
Chapitre 3 : Etude bio-informatique : sélection de
3 domaines PRODH
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