Aspects génétiques et moléculaires de la réponse générale aux stress chez Escherichia coli : le régulon RpoS

MEMOIRE BIBLIOGRAPHIQUE

ASPECT GÉNÉTIQUES ET MOLÉCULAIRES DE LA RÉPONSE GÉNÉRALE AUX STRESS CHEZ Escherichia coli : LE RÉGULON RPOS

Master 1 BCGMP

DUFOUR Virginie

Année 2006/2007

TABLE DES MATIÈRES

INTRODUCTION

I) IDENTIFICATION DES GÈNES RÉGULÉS PAR RPOS

Matériels et méthodes

Résultats et discussion

II) CARACTÉRISATION DES PROMOTEURS DU RÉGULON RPOS

Matériels et méthodes

Résultats et discussion

Un promoteur consensus ?

Mécanismes moléculaires de la sélectivité ó70/óS.

CONCLUSION 

BIBLIOGRAPHIE

ANNEXES

Introduction :

Chez les bactéries, le coeur de l'ARN polymérase est unique mais une sous-unité, le facteur sigma, responsable de la reconnaissance des promoteurs et de la formation du complexe ouvert, est présente en différents exemplaires. Ces facteurs jouent un rôle majeur dans la régulation de l'expression des gènes. Chez Escherichia coli, au moins sept facteurs ó ont été identifiés. Ces sous-unités permettent chacune la transcription directe d'un groupe de gènes spécifiques, possédant un promoteur qu'elles sont capables de reconnaître. Le facteur ó « d'entretien cellulaire » de E. coli est nommé ó70, mais ce facteur peut être partiellement remplacé en conditions de stress par le facteur ó alternatif óS (ou RpoS), principalement exprimé en phase stationnaire et en situation de stress (carences, hyperosmolarité, choc acide, températures extrêmes). Il s'agit d'un cas intéressant car certains promoteurs reconnus par ó70 sont aussi reconnus par óS, alors que les autres sous-unités ó ne reconnaissent que les promoteurs qui leur sont spécifiques. Il est aussi connu que l'ARN polymérase holoenzyme contenant óS (abrégé EóS) contrôle directement ou indirectement l'expression de très nombreux gènes : et est donc considéré comme le régulateur maître de la réponse aux stress chez E. Coli, et comme un objet d'étude majeur. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003 ; 2.WEBER, et al, 2005 )

Cependant, de nombreuses questions se posent : combien de gènes sont sous le contrôle de óS? Quelles sont les fonctions physiologiques des produits de ces gènes ? Peut on caractériser un profil commun à ces gènes ? (un promoteur óS consensus?)  L'expression de ces gènes est elle simplement proportionnelle à la concentration cellulaire de RpoS? Qu'est ce qui permet à óS de reconnaitre les promoteurs de ó70 et comment se fait le choix? (2. WEBER, et al, 2005 ; 8. HENGGE-ARONIS, 2002) Les réponses aux signaux externes nécessitent l'intégration de nombreux signaux complexes : RpoS est la clé de la réponse à de nombreux stress, mais comment les signaux sont intégré, et qu'est ce qui régule l'expression de RpoS ? En effet sa quantité (de forme active) augmente grandement durant la phase stationnaire. Il semble être soumis à de nombreuses régulations, intervenant à tous les niveaux : transcription, traduction, protéolyse et activité. Particulièrement, il semble régulé de manière transcriptionnelle par CRP-AMPc et de manière post-transcriptionnelle par de petits ARN régulateurs, par exemple DsrA. D'autres facteurs influenceraient RpoS, comme la protéine histone-like H-NS, les ARN6s, qui en mimant la structure des promoteurs reconnus par óS le séquestrent, ou le régulateur traductionnel global Hfq. (Revues : 8. HENGGE-ARONIS, 2002, 9. REPOILA, MAJDALANI, GOTTESMAN, 2003, Articles : 10. HIRSCH, ELLIOTT, 2005 et 11. LEASE, et al, 2004)

I) Identification des gènes régulés par RpoS

L'approche la plus ancienne visant à déterminer quels gènes sont sous le contrôle de RpoS consisterait à cribler une banque de bactéries contenant des fusions lacZ aléatoires en y mutant le gène rpoS. Les fusions lacZ sont une bonne méthode de mesure de l'expression des gènes puisque la â-galactosidase est stable et très facile à doser, et particulièrement pour l'étude des gènes en phase stationnaire, où la stabilité des ARN et protéines étudiés est inconnue. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)

Une approche plus récente et plus globale est celle des puces à ADN, comparant le transcriptome de bactéries possédant ou non un gène rpoS fonctionnel soumises à des stress. On observera donc des profils d'expression différents, correspondant aux gènes régulés directement ou indirectement par óS. (2. WEBER, et al, 2005)

Matériels et méthodes

Souches bactériennes et conditions de croissance (pour l'études des fusions lacZ). Les auteurs (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) ont utilisé des souches dérivées de K12 : HS1002-HS1100 (ÄlacU169) et portant des fusions lacZ aléatoires construites comme indiqué par Schellhorn et al., 1998, cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004), GC122 (ÄlacU169 rpoS::Tn10, Schellhorn et al., 1988, cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004). HS1002-HS1100 (les souches de la banque de fusions lacZ) ont été conjuguées avec une GC122 Hfr (rpoS::Tn10 est transféré quelques minutes après l'origine de transfert). L'allèle sauvage de rpoS est inactivé par recombinaison homologue de rpoS::Tn10 chez les souches portant les fusions : cette recombinaison est sélectionnée par une diminution de la coloration bleutée des cellules sur LB lactose + Xgal, et la dépendance à óS des gènes affectés par la fusion a été vérifiée par complémentation avec le plasmide pMMkatF3, portant l'allèle sauvage de rpoS (Muvey et al. 1988). (figure 1)

Test enzymatique. L'activité â-galactosidase a été testé avec de l'ONPG (o-nitrophényl-â-D-galactopyranoside), et calculée ainsi : (1000 x DO_420nm)/(temps d'incubation en minutes x volume en mL x DO_600nm). (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) Le test a été effectué sur des cellules en phase stationnaire ou exponentielle.

Identification des gènes en fusion avec lacZ. Les zones proximales à l'insertion de lacZ ont été séquencées comme indiqué par Roy et al., 1995, (cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) et identifiées grâce au logiciel BLASTN. Les fonctions de ces gènes ont été prédites grâce aux logiciel SWISSPROT. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)

Souches bactériennes et conditions de croissance (pour les puces à ADN). Les auteurs (2. WEBER, et al, 2005) ont utilisé un dérivé de la souche MC4100, portant la mutation rpoS::Tn10 ou non (souches MC4100 et RH90). Les souches sont cultivées en LB (milieu de Luria Bertani) à 37°C sous agitation. Pour l'expérience de choc hyperosmotique, on transfère les cellules en milieu minimum M9 avec glycérol (0,4%) pendant au moins 3 générations avant d'ajouter du NaCl à 0,3M. Pour l'expérience de choc acide (chute du pH), on cultive les cellules pendant au moins 4 générations en LB avant d'ajouter 170mM d'acide 4-morpholine-methasulfonique (MES), ce qui acidifie le milieu à pH=5. Les croissances sont mesurées par densité optique à 578nm. (2. WEBER, et al, 2005)

Origine des puces à ADN de E. coli K12. Les puces génomiques ont été fabriquées en spottant avec un robot des produits de PCR obtenus avec des amorces permettant l'extension d'ORF (cadres de lectures). On obtient donc toutes les ORF doubles brins du génome. (détails de la procédure utilisée : Polen et al., 2006, cité par 2. WEBER, et al, 2005)

Préparation de L'ARN et marquage des ADNc. Les bactéries recueillies ont été cultivées selon trois conditions différentes, qui permettent une forte production de RpoS et une forte induction des gènes contrôlés par RpoS : (i) durant la transition entre la phase exponentielle et stationnaire de croissance en LB (DO_578nm=4.0),(ii) 20 minutes après ajout de 0.3M de NaCl (ajouté à DO_578nm=0.3) en milieu M9+glycérol 0.4%, et (iii) 40 min après chute du pH à 5 en LB (ajout de MES à DO_578nm=0.4). Les cellules sont centrifugées 2 min à 4500g à 4°C, et le culot est resuspendu dans 700ìL de tampon RLT (RNeasy, QIAGEN, Allemagne) et lysées par choc grâce à un appareil de lyse à microbilles (Mini-Bead Beater, Biospec products). Après centrifugation, 500ìL d'éthanol est ajouté au lysat, et le lysat est séparé en 2 lots. Les ARN totaux sont extraits sur colonne RNeasy (QIAGEN) selon les instructions du fabriquant. Les ARN isolés sont traités à la DNAse I (pour éliminer l'ADN qui pourrait contaminer la solution) pendant 20min à 37°C, puis incubés à 70°C pendant 10min pour inactiver la DNAse I, et enfin extraits avec de l'alcool phénol-chlorformisoamyl et de l'alcool chloroformisoamyl, puis par précipitation à l'éthanol. (Polen et al., 2006, cité par 2. WEBER, et al, 2005) Des quantités équivalentes d'ARN de chaque lots ont été utilisés pour générer des ADNc marqués au Cy3-dUTP et au Cy5-dUTP comme décrit par Polen et al., 2006. (cité par 2. WEBER, et al, 2005)

Expérimentation avec les puces à ADN et analyse des résultats. L'hybridation sur les puces est réalisées comme indiquée par Polen et al., 2006, (cité par 2. WEBER, et al, 2005) et la fluorescence à 532nm (Cy3-dUTP) et à 635nm (Cy5-dUTP) a été déterminée avec le scanner GenePix 4000 (Axon Inc.) et analysée avec le logiciel GenePixPro 3.0. Chaque expérience a été réalisée en triplicat. Les gènes ont été considéré comme s'exprimant différentiellement si (i) le ration signal/bruit excédait 3, (ii) le signal été présent sur au moins 2 des triplicats, (iii) un test de Student montre que le taux d'ARN relatif aux contrôles (ADN génomique) est significatif, (iv) les taux moyens de variation étaient supérieurs à 3 sur chaque réplicat. Les gènes ont été regroupés en groupes fonctionnelles à l'aide des logiciels GenProtEC (http://genprotect.mbl.edu), MEME (http://meme.sdsc.edu) et BioProspector (http://robotics.standford.edu/~xliu/BioProspector/) (Liu et al., 2001, cité par 2. WEBER, et al, 2005).

Résultats et discussion

L'étude du régulon óS basée sur les fusions transcriptionnelles avec le gène rapporteur lacZ a permis l'identification de 48 fusions régulées par óS. De nombreuses fusions correspondaient à des opérons, les auteurs (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) considèrent que le nombre de gènes régulés par RpoS découverts dans cette étude est d'environ 80, car si une fusion avec un gène au sein d'un opéron montre une dépendance à óS, c'est que le promoteur des gènes de l'opéron entier est reconnu par RpoS, et donc tous les gènes de l'opéron sont sous sa dépendance. Ces gènes n'avaient pas été auparavant identifiés comme faisant partie du régulon RpoS (anciennement considéré comme comprenant environ 100 gènes), ce qui porte le nombre de gènes exprimés par EóS à approximativement 200. Les auteurs ont quantifié cette variabilité d'expression en comparant les activités â-galactosidase de souches rpoS⁺ ou rpoS^- portant la même fusion. 80% des fusions présentaient une expression variant au moins d'un facteur 5 en présence ou non de RpoS en phase stationnaire. Toutes les souches étudiées présentaient une dépendance d'expression du gène fusionné à óS aussi bien en milieu riche qu'en milieu minimum, sauf la souche comprenant une fusion sur le gène argH-oxyR, qui n'est dépendante de óS qu'en milieu riche : ces gènes présenteraient une dépendance à óS différente selon les conditions extérieures. Toutes les souches montraient une activation par RpoS spécifique de la phase stationnaire, mais certaines conservaient une expression basale en phase exponentielle, ce qui s'explique par le fait que certains promoteurs de ó70 sont aussi reconnus par óS. (table 1)

Pour identifier les gènes régulés par óS, les auteurs (2. WEBER, et al, 2005) ont comparé les transcriptomes des souches rpoS⁺ et rpoS::Tn10 de MC4100. Les trois conditions d'expérimentation (phase stationnaire, choc hyperosmotique et choc acide à pH=5) ont été utilisées afin d'identifier le plus grand nombre possible de gènes. 481 gènes (annexes pages 14, 15 et 16) s'exprimant au moins 2 fois plus chez la souche rpoS⁺ que chez la souche mutante (leur expression est donc activée par óS), et 95 gènes s'exprimant au moins 2 fois plus chez la souche mutante que chez la souche rpoS⁺ (dont l'expression est donc réprimée en présence de óS, cette répression sera discutée ultérieurement) ont été identifiés dans au moins une condition expérimentale. 140 des gènes activés par óS le sont dans les 3 conditions testées. Les 341 autres ne sont activés que sous une ou deux conditions, particulièrement 186 gènes qui ne s'expriment différentiellement que dans le cas du choc hyperosmotique. (figure 2) Ceci indique que l'expression des gènes contrôlés par RpoS ne suit pas toujours simplement les variations d'expression de RpoS lui-même, c'est-à-dire que l'expression de certains gènes du régulon semble dépendre du signal externe, et donc pourrait être aussi régulés par d'autres facteurs. Il est possible que ces gènes ne puissent être dépendant de óS pour leur expression qu'en présence d'autres régulateurs. Par conséquent, les données de cette expérience indiquent que le régulon RpoS s'étendrait à environ 10% des gènes d'E. coli, et serait soumis à des régulations internes.

Les gènes régulés par óS sont souvent répartis un peu partout sur le chromosome, mais on peut tout de même définir certains clusters : par exemple, une région de 91kb à 79.3min, comprenant 29 gènes contrôlés par óS, dont des gènes codant pour des régulateurs ou des gènes impliqués dans la résistance au stress acide. Un autre exemple est un cluster de 13kb comprenant l'opéron csiD-ygaF-gabDTP. Cet opéron est intéressant car il présente une régulation différentielle selon les conditions, comme déterminé par Metzner, Germer, et Hengge (référence 1., 2004). (figures 3 et 4) Il été déterminé les fonctions physiologiques des gènes régulés par óS identifiés par cette étude. (pour 57% d'entre eux des annotations fonctionnelles existent). (figure 5) 8% des gènes identifiés comme dépendants de óS dans les 3 conditions produisent des protéines régulatrices, 14% sont des transporteurs ou des protéines membranaires ( les trafics membranaires et réorganisation de la membrane plasmique sont importants pour la réponse à certains stress, comme le stress osmotique ou les chocs acides), 19% sont des gènes impliqués dans le métabolisme (glycolyse, fermentation, respiration anaérobie, transport d'électrons, cycle des pentoses phosphate), et 11% des gènes de réponse à différents stress. (2. WEBER, et al, 2005)

Les fonctions physiologiques de gènes identifiés par ces deux approches sont semblables. Il est à noter que l'étude par puces à ADN montre de meilleurs résultats : en effet, les techniques de préparation des fusions lacZ et de sélection des fusions óS-dépendantes ont pour effet de ne pas prendre en compte des gènes régulés par óS. La méthode de préparation des souches portant les fusions risque de ne pas concerner tous les gènes du régulon, et comme il a été vu que certains gènes n'étaient dépendants de RpoS pour leur expression que sous certaines conditions, le fait de n'avoir effectué le criblage qu'en phase stationnaire a exclu tous les gènes qui sont régulés par RpoS dans d'autres conditions, comme les 181 gènes ne s'exprimant différentiellement qu'en conditions de choc hyperosmotique. L'approche « puce à ADN » procure des données permettant la vérification in vivo par fusion avec un gène rapporteur de la dépendance à RpoS des 481 gènes identifiés.

Les régulations différentes des gènes du régulon RpoS selon les conditions, ou les inhibitions d'expression de gènes en présence de RpoS peuvent s'expliquer en partie par le fait que de nombreux gènes régulés pas óS sont des protéines régulatrices : une partie des gènes s'exprimant différentiellement identifiés grâces aux puces à ADN sont donc indirectement dépendants de RpoS. Les gènes apparaissant réprimés le sont sûrement par des répresseurs dont l'expression est elle directement contrôlée par EóS.

II) Caractérisation des promoteurs du régulon RpoS

Le facteur óS reconnait in vitro des séquences -10 presques identiques à celles du facteur ó70 (CTATA(c/a)T pour EóS, et TATAAT pour EóS, Tanaka et al., 1993, cité par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003), ce qui peut s'expliquer par une similarité importante des « DNA Binding domaine » des deux facteurs ó (Lonetto et al., 1992, cité par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003). Cependant, le facteur óS est aussi capable de reconnaitre des promoteurs qui lui sont spécifique et ne reconnait pas certains promoteurs spécifiques à ó70. Cette reconnaissance spécifique est importante pour la compréhension des phénomènes de régulations dépendants de RpoS. On peut expliquer de plusieurs manières la reconnaissance d'un promoteur par óS : par une spécificité de séquence du promoteur (auquel cas ó70 ne pourrai pas reconnaitre le même promoteur), par la nécessité d'une protéine régulatrice supplémentaire indispensable à la reconnaissance d'un promoteur donné par óS, ou par des facteurs intracellulaires, comme le degré de compaction de l'ADN, l'alarmone ppGpp, la concentration élévée en sels (Hengge-Aronis 1998 et 2002, Ishihama, 2000, Vicente et al. 1999, cités par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003).

Des études ont été menées afin de définir par biologie moléculaire une séquence consensus pour les promoteurs reconnus exclusivement par óS, mais aussi pour déterminer quelles étaient les bases moléculaire de la reconnaissance des promoteurs par óS et ó70.

Lacour, Kolb, et Landini (2003, référence 5.) ont étudié l'importance des nucléotides dans la région -10 du promoteur du gène aidB, impliqué dans la réponse aux agents alkylants de l'ADN. Ce gène est régulé par la protéine Ada (Volkert et al., 1986), qui, sous sa forme méthylée, peut activer la transcription par Eó70 et EóS, mais en l'absence de Ada, l'expression de aidB est strictement dépendante de EóS (in vitro, Eó70 se fixe au promoteur PaidB en raison de l'excès d'ARN polymérase Eó70 mais est incapable de former le complexe ouvert et donc d'activer la transcription, et EóS peut activer la transcription in vitro sans protéine annexe). Ce promoteur (PaidB) est donc un modèle potentiel d'étude des promoteurs exclusifs de óS ne nécessitant pas l'intervention d'une autre protéine. Dans d'autres études, 7. CHECROUN, et al, 2004, et 6. LACOUR, et al, 2004 ont déterminé quelles étaient les caratéristiques de DNA Binding Domaine de óS et de ó70 qui étaient impliqués dans cette sélectivité.

Matériels et méthodes

Souches et plasmides. Les souches utilisées par LACOUR, KOLB, LANDINI(référence 5., 2003), et LACOUR, et al, (référence 6. 2004), sont MV1161 et son dérivé rpoS^- MV2792 (souches dérivées de K12). Ces souches ont été transformées par le plasmide pRS1274, portant une fusion lacZ sous le contrôle d'un promoteur PaidB sauvage ou mutant (dont PaidB_(C12T)). (figure 6) Les mutants de PaidB ont été produits par PCR avec des amorces permettant la substitution contrôlée de certains nucléotides, et insérés dans le plasmide pRS1274 (pour la transcription in vivo) ou pJCD01 (pour la transcription in vitro), grâce aux sites de restriction BamHI-EcoRI. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, et 6. LACOUR, et al, 2004)

Les souches utilisées par 7. CHECROUN, et al, 2004 sont de nombreux dérivés de MC4100 mutées sur rpoS (Diaz et al.1991, cité par 7. CHECROUN, et al, 2004) et portant différentes mutations sur le promoteur du gène osmEP (obtenues de la même manière que les mutants PaidB, fig 7) en fusion avec lacZ. Les souches sont transformées par le plasmide pBDArpoS décrit ci-dessous, et sont cultivées en LB avant d'être déposées sur milieu de MacConkey (colonies rouges si lac+)

Obtention de facteurs sigma mutants. Les protéines ó70 mutés et taggés 12-Histidine ont été obtenues en mutant directement le gène RpoD (codant ó70) sur le plasmide pET-21ó grâce au kit QuickChange (Strategene). Les mutations effectuées donnent pour phénotype ó70_(Q437H), ó70_(T440I) et ó70_(T440E). Les óS mutants ont été obtenus par amplification PCR du plasmide pBADrpoS (contenant rpoS sous contrôle du promoteur araB) avec amorces permettant l'introduction contrôlées de mutations. Ces mutations ont été localisées dans les régions 2 et 4 de óS grâce au choix des primers (6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004). Les mutants óS étudiés par 6. Lacour et al., 2004 portent les acides aminés Q152A et E155A.

Transcription In Vivo. Les bactéries ont été cultivées une nuit en LB à 37°C, puis les cultures ont été diluées à DO_600nm=0.02 pour réduire l'activité â-galactosidase. L'activité â-galactosidase a été mesurée comme indiqué précédement, et comparée à celle mesurée chez une souche transformée par un plasmide pRS1274 sans promoteur (contrôle). (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Purification des facteurs ó et de l'ARN polymérase coeur, reconsitution de l'holoenzyme. Les protéines ont été purifiées selon le protocole décrit par Tanaka et al., 1995 et Gribskov et al., 1983 (cités par 5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003). L'holoenzyme (EóS ou Eó70) a été reconstituée par incubation de l'enzyme coeur avec soit óS soit ó70 au ratio 1:4 pendant 30 min à 37°C. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Transcription In Vitro. L'expérience de transcription unique a été réalisée dans un tampon K-glu200 avec le plasmide pJCD01 (3nM) surenroulé portant soit le PaidB sauvage soit un des mutants créés, et l'holoenzyme EóS(50nM) ou Eó70(100nM), ainsi que les dNTP (500ìM) dont du [á³²P]UTP et incubés 15min à 37°C. La réaction a été arrêtée par addition de 10ìL de tampon (formamide, EDTA, xylène cyanol et bleu de bromophénol). Après chauffage à 65°C, les échantillons ont été déposés sur un gel de polyacrylamide de séquençage à 7%. La quantification des produits de transcription a été réalisée avec un PhosphorImager et normalisée à la production standart d'ARN. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, 6. LACOUR, et al, 2004, et 7. CHECROUN, et al, 2004)

Gel Retard. L'holoenzyme reconstituée Eó70 ou EóS (5 à 50 nM) et des fragments d'ADN de 180pb correspondants aux promoteurs (1nM) ont été incubés pendant 16min à 37°C, puis déposés sur une gel de polyacrylamide non dénaturant à 5%. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003, et 6. LACOUR, et al, 2004)

Dosage â-galactosidase. La mesure de l'activité â-galactosidase a été effectuée comme indiqué précédement, en absence d'arabinose. (7. CHECROUN, et al, 2004)

Résultats et discussion

Un promoteur consensus ? Les auteurs Lacour, Kolb, et Landini (référence 5., 2003) ont choisi de focaliser les mutations du promoteur PaidB sur quatres éléments : (i) un dinucléotide TG, typique des promoteurs ó70-dépendants à boîte -10 étendue, mais ici à une position unusuelle (-16/-15 au lieu de -13/-12, cette position ne permet pas la transcription par Eó70), (ii) le résidu -13C (Eó70 a besoin absolument d'un T à cette position), (iii) le résidu -12C, premier nucléotide de l'hexamère -10, (iv) enfin, le -6A a été muté en T car un T à cette position semble conservé dans les autres promoteurs óS-dépendants. Globalement, il a été montré grâce au gel retard que EóS (l'ARN polymérase chargée du facteur sigma S) a plus d'affinité pour PaidB que Eó70. In vivo, il a été confirmé l'incapacité de Eó70 à activer la transcription si le dinucléotide TG est en position -16/-15 au lieu de -13/-12, alors que EóS en est capable : il est suggéré que ceci est dû à la flexibilité du domaine 2.5 (reconnaissance de la boîte -10) de óS. La substitution ou délétion du C en -13 a pour effet la perte de spécificité de la reconnaissance du promoteur par óS. Particulièrement, la substitution du C en G favorise grandement la reconnaissance par ó70. On en conclue que ce nucléotide -13C aide beaucoup à la fixation et à la formation du complexe ouvert par EóS, ce qui confirme des observations effectuées sur d'autres promoteurs de gènes du régulon RpoS. La substitution du -6A n'a eu aucun effet sur la transcription de aidB, ce qui prouve que les nucléotides apparaissant conservés dans les analyses in silico des promoteurs n'ont pas toujours de signification physiologique, ou alors ce nucléotide a une importance chez d'autres promoteurs mais n'a pas de rôle à jouer chez PaidB. La substitution du C en -12 en T améliore grandement la transcription par Eó70 (quasi nulle si le nucléotide -12 est un C) : la sélectivité de EóS est perdue si cette position est occupée par un T. Les auteurs ont étudiés les promoteurs de 57 autres gènes dépendants à óS, et on constaté que 33% d'entre eux avaient autre chose qu'un T à cette position (dont 16% de C). Des expériences complémentaire de mutagénèse sur certains de ces promoteurs leur on permis de déterminer deux classes de promoteurs óS-dépendants : ceux qui possèdent autre chose qu'un T en -12, et qui sont strictement dépendants de óS sans nécessiter de facteurs additionnels, et ceux qui peuvent être reconnus par ó70, possédants toujours un T en premier position de l'hexamère, et pour lesquels la sélectivité ó70/óS dépend d'un autre facteur (protéine additionnelle).

Les expériences de transcription in vitro confirment parfaitement ces observations, à la différence que l'excès d'holoenzyme peut parfois forcer la fixation sur le promoteur, les résultats ne sont donc pas du même ordre. Ces expériences ont donc permis de déterminer l'importance physiologique de la conservation de certains nucléotides des promoteurs óS dépendants. Les auteurs proposent alors un nouveau consensus pour les promoteurs strictement dépendants de RpoS : TG(N)_0-2CCATA(a/c)T, opposée à TGGTATAAT, séquence optimale pour la reconnaissance par Eó70. Un recherche dans la base de donnée Colibri montre que cette séquence est retrouvée dans les 200pb précédent 14 ORF ou opérons en plus de aidB.

La sélectivité sans facteurs additionnels peut alors être expliquée par une tolérance accrue de óS aux divergence de la séquence -10 des promoteurs par rapport à ó70 : ó70 ne supporte pas la substitution du T en -12, et ne peut pas permettre la formation du complexe ouvert si le dinucléotide TG n'est pas en position -13/-12. óS lui peut reconnaitre les promoteurs divergeants sur ces points, avec (dans le cas du TG) ou sans (dans le cas du -12T) l'aide de protéines additionnelles. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003).

Mécanismes moléculaires de la sélectivité ó70/óS. Le gène osmEP dépend de ó70 en phase stationnaire, et de óS en phase exponentielle, et de mutants de ce promoteurs ont été isolés. Parmi eux, osmEP13T, qui possède un T à la place du C normalement présent en -13. Ce mutants et d'autre mutants de osmEP (comme osmEP32G) ont été utilisés par Checroun et al (référence 7., 2004) pour identifier de mutants de RpoS supprimant ces mutations, afin de caractériser les interactions promoteur-acides aminés impliquées dans la sélectivité de óS. Le criblage est effectué sur milieu MacConkey : les colonies rouges (lac+) portent un óS capable de transcrire le gène rapporteur sous contrôle d'un promoteur osmEP muté. Les mutants suppresseurs obtenus sont indiqué table 2. Les mutations supresseurs n'affectent que trois acides aminés : Q152, E155 et R299, qui appartiennent aux régions 2.4 (Q152 et E155), correspondant à la zone impliquée dans la reconnaissance de la boîte -10 chez ó70, et 4.2 (R299) semblable à la zone impliquée dans la reconnaissance de la boîte -35 chez ó70. Ces acides aminés correspondent aux Q437, T440 et R584 chez ó70. (figure 8) Les activités de transcription des promoteurs mutants par ces óS mutants ont été mesurées (figure 9). Des homologues de óS chez 21 autres bactéries Gram- portent les même acides aminés à ces mêmes positions. Il résulte de cette étude que R299 interagit avec la guanine du dinucléotide CG en position -31, mais cette interaction ne semble qu'amélorier la reconnaissance du promoteur. En effet, de nombreux promoteurs óS dépendants sont pourvus de boîte -35 très dégénénées ou n'en ont pas (Espinosa-Urgel et al. 1996, cité par 7. CHECROUN, et al, 2004). De plus, il est démontré que ce sont les acides aminés Q152 et E155 qui procurent la capacité à óS de reconnaitre les C en position -13, comme le montre la supression de la mutation osmEP13C par le mutant rpoS Q152R. Des données structurales sur l'analogue de óS chez Thermus aquaticus montre que les équivalents de ces deux acides aminés appartiennent à deux á-hélices formant une pince sur le grand sillon au niveau des nucléotides -12/-13, ce qui expliquera leur rôle majeur dans la reconnaissance de ces nucléotides (Protein Data Bank).

Une autre étude semblable, menée par Lacour, et al (référence 6, 2004), utilisant le promoteur PaidB (sauvage ou portant une substitution du -12C en T), visait à identifier des mutants de ó70 capable de transcrire ce promoteur. (figure 10) Il en a été conclu que les facteurs ó70 mutés Q437H et T440E étaient capables de former un complexe ouvert compétent avec le promoteur PaidB qui porte un C en -13, mais conservait une infériorité par rapport à óS vis-à-vis de l'affinité et de l'efficacité de transcription. La grande spécificité de óS pour les promoteurs comprenant ce nucléotide et sa capacité à les transcrire efficacement dépend donc en majeure partie de ces deux nucléotides.

Conclusion :

Le régulon RpoS, de part son recouvrement partiel avec le régulon ó70, et le fait qu'il comprenne de nombreuses protéines régulatrices, certaines ayant même pour cible des protéines du régulon RpoS, possède une architecture très complexe, et dynamique puisque cette architecture elle-même est soumise à régulation. (2. WEBER, et al, 2005) Le régulon RpoS recoupe également ceux d'autres régulateurs globaux, comme la protéine Lrp, ou CRP-AMPc, lui-même régulateur de RpoS. Ce dynamisme permet un intégration fine des signaux externes et une adaptation précise de la réponse physiologique par une régulation génétique globale. La compréhension accrue de ce mécanisme est importante puisqu'elle permettra de mieux comprendre les états physiologiques des bactéries, pour des applications dans la recherche fondamentale, l'industrie ou encore la médecine. Par exemple, chez E. coli, l'expression de RpoS ne semble pas dépendre d'une perception de signaux de quorum sensing externes (elle ne possède pas de système de quorum sensing mais est capable de percevoir ceux des autres espèces), qu'en est-il chez d'autres espèces ? (8. HENGGE-ARONIS, 2002)

De nombreuses questions restent à élucider : ici il n'a été traité que de E. coli, et des études sont menées sur le genre Salmonella et sur Thermus Aquaticus, mais pour l'instant presque rien n'est connu sur un grand nombre de procaryotes d'intérêt publique.

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Annexes :

Ratios d'expression des gènes contrôlés par óS identifiés par puces à ADN. (2. WEBER, et al. 2005)









Figure 1. Crible génétique utilisé pour identifier la dépendance à RpoS de gènes en fusion avec lacZ. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)

Table 1. Gènes régulées par RpoS identifiés grâce aux fusions lacZ, et leurs fonction physiologiques. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)





Figure 2. Répartition des fonctions des gènes régulés par RpoS identifiés grâce aux puces à ADN. (2. WEBER, et al, 2005)



Figure 3. Le cluster csiD-ygaF-gabDTP, situé à environ 79min sur le chromosome de E. coli. En noir, les gènes régulés par RpoS dans les trois conditions, hachurés : les gènes présentant une régulation par RpoS seulement dans une ou deux conditions. (2. WEBER, et al, 2005)



Figure 4. Régulations de l'opéron csiD-ygaF-gabDTP. (1. METZNER, GERMER, HENGGE, 2004)



Figure 5. Fonctions physiologiques des gènes identifiés par puces à ADN. (2. WEBER, et al, 2005)



Figure 6. Le promoteur PaidB. En italique et avec astérisques, les nucléotides ciblés pour la mutagénèse. (5. LACOUR, KOLB, LANDINI, 2003)



Figure 7. Le promoteur osmEP et les mutants utilisés. (7. CHECROUN, et al, 2004)

Table 2. Mutants RpoS supresseurs obtenus après criblage. (7. CHECROUN, et al, 2004)







Figure 8. Organisation en domaines des protéines ó70 et óS. (A) Organisation générale et indication des zones soumises à la mutagénèse. (B) Alignement des domaines 2.4 de ó70 et óS. La région 2.4 de ó70 est encadrée. (C) Alignement des domaines 4.2 de ó70 et óS, la région 4.2 de ó70 est encadrée. (7. CHECROUN, et al, 2004)



Figure 9. Effets des mutations de RpoS affectant Q152 et E155 sur la transcription de promoteurs osmE sauvages. Mesure des activités â-galactosidase des fusions effectuées. (7. CHECROUN, et al, 2004)



Figure 10. Quantification de la transcription de aidB (ration expression/expression du contrôle), exprimée en pourcentages de l'activité observée avec Eó70 sauvage. En blanc : PaidB sauvage, en noir, PaidB_C12T. (6. LACOUR, et al. 2004)

L'étude des mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse aux stress chez les bactéries a de grand intérêts dans les domaines de la recherche fondamentale, médicale, agro-alimentaire et industrielle. Chez Escherichia coli, l'eubactérie la plus étudiée, l'acteur majeur de cette réponse est le facteur sigma alternatif RpoS (óS), une des sept sous unité de l'ARN polymérase responsable de la reconnaissance des promoteurs et de l'initiation de la transcription. Le régulon RpoS est large et complexe, en partie parcequ'il recoupe le régulon de ó70, le facteur sigma principal, responsable de l'entretien cellulaire. Le présent rapport compile des études visant à caractériser le régulon RpoS, tant au niveau des gènes qui en font partie qu'au niveau des mécanismes génétiques et protéiques de la sélectivité RpoS/ó70.