Memoire Online - Tests d'efficacité d'extraits d'huiles végétales sur Anopheles gambiae Giles et Culex quinquefasciatus Say résistants aux pyréthrinoà¯des

Président : Professeur Joachim D. GBENOU Membres : - Docteur Raphaël K. N'GUESSAN

Dédicaces

Remerciements

Le présent travail n'aurait pas connu son aboutissement sans l'aide de nombreuses personnes tant physiques que morales à qui j'exprime ici ma profonde reconnaissance. Je veux nommer :

- Le professeur Mohamed SOUMANOU responsable de l'Unité de Recherche en Génie Enzymatique et Alimentaire (URGEA) du Laboratoire d'Etude et de Recherche en Chimie Appliquée pour ses sages conseils et ses nombreuses orientations ;

- Le docteur Julien SEGBO Chef de Département de Génie de la Biologie et Humaine (GBH) pour ses conseils et son aide ;

- Monsieur Abou TOGOLA, entomologiste Chercheur à Africa Rice pour son ouverture et ses sages conseils ;

- Tout le personnel du laboratoire London School of Hygiene and Tropical Medicine (LSHTM) notamment Pélagie BOKO, Hermione ADJE, Hermione KOUDAKOSSI BOKO, Abibatou ODJO, Estelle VIGNINOU et Armand KLOTOE pour l'accueil et le soutien multiforme qu'elles m'ont accordés. L'ambiance m'est véritablement inoubliable. Soyez-en remercier ;

- Tout le personnel du CREC en particulier, messieurs Gil PADONOU, Anges YADOULETON, Olivier OUSSOU, Razaki OSSE, Rock AÏKPON, Roseric AZONDEKON, les responsables de l'insectarium : Saka ALABI, et ICHIAKA pour leur assistance et conseils ;

- Les étudiants de master en Entomologie Appliquée, Renaud, Virgile, Arthur, Ramziath, Roseline, et Kéfilath pour leur soutien moral ;

- Messieurs Fidèle ASSOGBA et Camille HOUNDJO, pour leur franche collaboration et leur aide pour les travaux d'extraction des différentes huiles végétales ;

- Madame AGBIZOUNON SILY Geneviève, pour tous les sacrifices consentis pour mon éducation ;

- Mes tantes Pascaline, Victoire et Marguerite AGBIZOUNON d'une part ; Lydia et Françoise TOUYABA d'autre part et leurs époux ; mes oncles Jean-Marie AGBIZOUNON, Paul AVOUTOU, Barthélemy TOUYABA et leurs épouses, pour leur amour, leur soutien matériel, financier et moral ;

- Mes frères et soeur Martial, Euloge, Fructueux, Olga, Jorès et Serge AGBIZOUNON pour le soutien inexprimable qu'ils m'ont toujours apporté. Retrouver ici le fruit de l'amour fraternel qui nous a toujours unis ;

- Les pères Serge Yvon HOUNSOU et Bruno HOUNKONNOU religieux caméliens, le frère Jean-Pierre HOUNDAGBA et l'abbé Christ HOUNMENOU pour leurs prières ;

- La famille TROUKOU pour leur générosité et leur amour. Ce travail est l'expression de ma profonde gratitude ;

- Messieurs Parfait DOVONOU, Gontran MEGNIGBETO, Symphorien AHOMONDJI et leurs épouses, Déo Gratias HOUNGNI, Maxime FAMONMY, Eric KOSSOU, Wilfrid BONOU et Boris CACHON pour les multiples conseils et soutien intellectuel ;

- Mes amis Suzanne HONVO, Adeline HOUNNOU, Anne-Marie AHANDESSI, Jean et Jeannine ABILE et tous les membres de la communauté Emmaüs de l'EPAC pour vos soutiens moral, spirituel et intellectuel ;

- Mes camarades de la 1^ére promotion d'obtention du diplôme d'ingénieur de conception en Génie de l'Environnement pour ses cinq (5) années bravées ensembles qui ont connu certainement des joies et des peines ;

- Tous les enseignants du Département de Génie de l'Environnement de l'EPAC pour leur contribution à mon éveil intellectuel ;

- la mémoire de Francine SOBABE, plus qu'une camarade, une soeur. Paix et repos éternel.

Hommages

+ Dr. Daniel CHOUGOUROU, Chef du département de Génie de l'Environnement (D.GEn) de l'EPAC, enseignant-chercheur à l'EPAC/UAC notre superviseur pour ses nombreux conseils, son engagement et sa détermination à notre égard pour la réalisation de ce modeste document ;

+ Dr. Raphaël N'GUESSAN, responsable du laboratoire de recherche de la London School of Hygiene and Tropical Medicine (LSHTM) sise au CREC pour nous avoir accepté dans son laboratoire et mis à notre disposition ses compétences scientifiques pour la réalisation de cette étude ;

+ Dr. Bienvenu TOLLO, chercheur au CREC pour ses sages conseils et ses diverses orientations ;

+ Prof. Martin AKOGBETO, Enseignant Chercheur à la FAST, Directeur du CREC, pour avoir accepté notre stage dans son centre pour la réalisation de cette étude ;

+ Prof. Mansourou MOUDACHIROU Enseignant Chercheur à la FAST, directeur du Laboratoire de pharmacognosie et d'extraction des huiles essentielles de l'ISBA, pour nous avoir autorisé à faire les extractions d'huiles végétales dans son laboratoire ;

+ Prof. Joachim GBENOU de la FAST, co-directeur du Laboratoire de pharmacognosie et d'extraction des huiles essentielles de l'ISBA, pour ses sages conseils et ses brillantes orientations pour l'extraction des huiles végétales ;

+ Jury pour avoir accepté juger de la qualité de ce modeste document scientifique.

Liste des tableaux

Tableau 2 : Présentation des espèces végétales d'étude Tableau 3 : Rendement d'extraction des huiles végétales Tableau 4 : Doses létales et ratio d'Azadirachta indica Tableau 5 : Doses létales et ratio du Ricinus communis Tableau 6 : Doses létales et ratio de Thevetia peruviana Tableau 7 : Doses létales et ratio du Jatropha curcas

Liste des figures

Figure 1 : Différences entre Anophelinae et Culicinae Figure 2 : Principales parties d'un moustique adulte Figure 3 : Schéma du système digestif d'un moustique Figure 4 : Cycle biologique d'un moustique

Figure 5 : Différences entre femelle et mâle du moustique à partir de la tête.

Figure 6 : Taux de survie de Anopheles gambiae kisumu après exposition par ingestion à 2% des huiles végétales

Figure 7 : Taux de survie de Culex quinquefasciatus après exposition par ingestion à 2% des huiles végétales

Figure 8 : Taux de mortalité de Anopheles gambiae après exposition aux huiles végétales par contact tarsique

Liste des photos

Photo 4 : Fruit en coupe longitudinale et graine séchée du T. peruviana (Pers.) K. Schum.

Photo 10 : Dispositif de récupération des huiles Photo 11 : Huiles végétales obtenues

Liste des sigles et abréviations

CAME : Centre d'Achat des Médicaments Essentiels CDMS : Centre de Documentation du Ministère de la Santé

CIRAD : Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le

D.GEn : Département de Génie de l'Environnement

J. curcas : Jatropha curcas

OCCGE : Organisation de Coopération et de Coordination pour la lutte contre les Grandes

VIH-SIDA : Virus Immunodéficience Humaine- Syndrome d'immunodéficience acquise

Résumé

Suite aux problèmes de résistance posés par certains insecticides de synthèse, la science est à la recherche d'autres produits naturels à caractère insecticide pour une meilleure éradication des maladies vectorielles en général et du paludisme en particulier. Pour cela, certaines plantes locales béninoises (Azadirachta indica, Jatropha curcas, Thevetia peruviana et Ricinus communis) soupçonnées pour leurs activités insecticides (biocides) ont été testées sur les moustiques. Extraite en laboratoire par la méthode soxhlet, ces huiles végétales ont été testée pour connaitre leurs effets biocides sur l'Anopheles gambiae (Giles) et Culex quinquefasciatus (Say).

Trois différents tests inspirés du protocole de l'OMS, les tests larvaires, les tests par ingestion et les tests en tube, ont été réalisés sur Anopheles gambiae Kisumu, Anopheles gambiae Ladji et Culex quiquefasciatus Ladji.

Les traitements larvaires ont révélé que les huiles végétales de Thevetia peruviana, Jatropha curcas et Azadirachta indica sont les plus efficaces avec des DL50 de 0,4% ; 0,2% et 0,1% respectives. La _DL50 du Ricinus communis, est plus élevée (1,2%).

Par ingestion, presque toutes les huiles se sont révélées efficaces à une dose de 2% avec 100% de mortalité entre 6 à 9 jours d'exposition. Seule l'huile végétale de Ricinus communis à la même dose (2%), génère encore 25% de survivants pour An. gambiae et 35% de survivants pour Cx. quinquefasciatus après 10 jours d'exposition.

Quant aux tests de sensibilité en cylindre, ils ont montré un effet de toxicité faible sur Anopheles gambiae Kisumu. Quelle que soit l'huile végétale testée les mortalités observées sont négligeables. 54% à la dose 250 mg/m² pour Thevetia peruviana a été la mortalité la plus élevée obtenue.

En conclusion, les huiles végétales de Thevetia peruviana, Jatropha curcas et Azadirachta indica disposent de propriété biocide et pourraient servir de pistes pour la lutte anti vectorielle.

Mots clés : Ricinus communis, Thevetia peruviana, Azadirachta indica, Jatropha curcas, DL50.

Abstract

The resistance to synthetic insecticide is a major threat to the control of vector-borne diseases, especially to the eradication of malaria. Seeking alternatives to the common insecticides is becoming more urgent. Our study has focused on the use of local plants such as Azadirachta indica, Jatropha curcas, Thevetia peruviana and Ricinus communis in order to control the development of mosquitoes. Therefore the efficacy of vegetable oil extracted from those plants by the Soxhlet method was tested against Anopheles gambiae (Giles) and Culex quinquefasciatus (Say). Three tests selected in accordance with WHO protocols were performed on females of Anopheles gambiae Kisumu, Anopheles gambiae Ladji and Culex quinquefasciatus Ladji: larvae, ingestion and cylinder tests.

The vegetable oils of Thevetia peruviana, Jatropha curcas and Azadirachta indica have shown a significant effect on larvae at 0.4%; 0.2% and 0.1% _LD50 respectively. The vegetable oil of Ricinus communis has been less efficient with a higher _LD50 (1.2%).

An ingestion dosage of 2% vegetable oil of Thevetia peruviana, Jatropha curcas and Azadirachta indica has induced 100% mortality of all mosquitoes between 6 to 9 days exposure while 25% (Anopheles gambiae Kisumu) and 35% (Culex quinquefasciatus Ladji) of females were still alive after 10 days when tested against Ricinus communis.

In the cylinder test, the vegetable oils have revealed low toxicity on Anopheles gambiae Kisumu with insignificant mortality: the highest mortality of 54.11% being observed at 250mg/m² of Thevetia peruviana.

The vegetable oils of Thevetia peruviana, Jatropha curcas and Azadirachta indica could become an important vector control tool because of their biocide proprieties.

Key words: Ricinus communis, Thevetia peruviana, Azadirachta indica, Jatropha curcas, LD50.

INTRODUCTION

Introduction

Les pays en développement doivent faire face au double enjeu de la croissance économique et de la santé des populations. L'économie béninoise étant essentiellement agricole, elle a besoin des hommes en bonne santé pour la promouvoir. Or, ces derniers sont exposés à diverses maladies d'origines vectorielles, dont le paludisme ; encore appelé malaria. Il constitue l'endémie première tuant plus d'un million de personnes par an dans le monde (OMS, 2008). L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), estime que 40% de l'humanité est exposé à la maladie, essentiellement dans les pays les plus pauvres. L'Afrique est durement touchée par ce fléau du fait que quatre-vingt-dix pour cent (90%) des décès dus au paludisme surviennent principalement en Afrique au sud du Sahara (IRD, 2009a) et plus de trois mille (3 000) enfants, surtout de moins de cinq ans en meurent tous les jours. Trois mille (3000) enfants dans une région déjà en proie au VIH-SIDA et à la tuberculose (OMS., 2008).

En République du Bénin, des six (6) maladies prioritaires (paludisme, rougeole, tétanos, poliomyélite, coqueluche, tuberculose pulmonaire), le paludisme est de loin la première cause des premières consultations avec 39,7% des motifs de recours aux soins et la première raison d'hospitalisation (24,7%) dans les structures sanitaires (PNLP, 2007a). Le paludisme est la plus importante cause de mortalité infantile, des accouchements prématurés et de nombreux cas d'absence sur les lieux de travail (Seïdou, 1987). Le nombre de personnes qui ont accès à des services de prévention et de traitement du paludisme est en constante augmentation, ce qui laisse augurer une baisse prochaine de la morbidité et la mortalité relatives au paludisme. La maladie du paludisme est transmise par les piqûres de moustiques infectés par des parasites de l'espèce Plasmodium. Il existe quatre types de plasmodium humain, mais le Plasmodium falciparum (Welch) est de loin le parasite le plus répandu et le plus

pathogénique (OMS., 2008). Comme l'indique le Rapport mondial sur le paludisme (OMS, 2009), il reste des défis à relever pour réduire la charge d'une maladie qui provoque encore un million de décès chaque année. Pour ce faire, des progrès ont été accomplis en matière de prévention et de traitement du paludisme.

Davantage de pays introduisent les derniers médicaments antipaludiques adoptés par l'OMS, les Combinaisons Thérapeutiques à base d'Artémisinine (CTA) (OMS., 2008) ; bon nombre de familles reçoivent des moustiquaires imprégnées d'Insecticides à Longue Durée d'action et plus d'un aussi pratique la pulvérisation intradomiciliaire dans le cadre de programmes novateurs (OMS & UNICEF., 2005 ; PNLP, 2007b). Malgré les lourds efforts matériels, financiers et humains consentis à travers les campagnes de sensibilisations, de préventions et d'éradications menées depuis les années cinquante, le paludisme demeure d'actualité. La persistance de la maladie dans nos régions provient de certains facteurs importants au nombre desquels : la résistance des anophèles vecteurs aux insecticides de synthèse (Djogbénou et al., 2008 ; IRD, 2009b); l'apparition dans certaines régions du monde, des souches de Plasmodium falciparum résistantes aux antipaludiques (IRD, 2009b) et l'existence du problème d'accès aux soins de santé primaires compte tenu de la cherté des produits antipaludiques synthétisés (OMS, 2008). Il urge donc d'envisager d'autres outils de luttes anti vectorielles. Au Bénin, la richesse de la flore et la connaissance des plantes médicinales sont susceptibles, comme ce fut le cas de l'artémisinine, d'ouvrir de nouvelles voies pour la recherche de nouveaux médicaments (Adjobimey et al., 2004) et de nouveaux biocides.

A l'instar des extraits de quatre plantes médicinales de la pharmacopée traditionnelle béninoise Argemone mexicana (L.), Cassia rotundifolia, actuellement appelé Chamaecrista rotuhdifolia(pers) (Greene) Phyllanthus

amarus (Schum & Thonn.) et de Thalia geniculata (L.) qui ont inhibé de façon significative la croissance de la souche chloroquino-sensible de Plasmodium falciparum (Adjobimey et al., 2004), il a été nécessaire d'étendre sur d'autres plantes béninoises locales dont les premiers tests de criblage ont prouvé dans certaines études des effets insecticides sur des larves d'Anopheles gambiae (Giles). Les extraits de plantes sont non bio-accumulables. Ils sont exploitables pour les populations et très efficaces sur les moustiques actuels (Howard et al., 2009). Ce qui justifie le bien fondé de la présente étude dont le thème s'intitule : «Tests d'efficacité d'extraits d'huiles végétales sur Anopheles gambiae (Giles) et Culex quinquefasciatus (Say) résistants aux pyréthrinoïdes».

1.1. Objectifs

L'objectif général de cette étude est de contribuer à développer un insecticide biologique efficace contre les moustiques quelque soit leur stade de développement.

- de tester la toxicité des extraits d'huiles végétales sur les larves d'Anopheles gambiae sensibles et résistants et Culex quinquefasciatus exhibant plusieurs mécanismes de résistance aux pyréthrinoïdes ;

- d'apprécier l'efficacité insecticide des huiles végétales extraites sur des moustiques Anopheles gambiae (Giles) et Culex quinquefasciatus (Say) ;

- de tester la toxicité par contact et par ingestion des huiles sur des adultes d'Anopheles gambiae et Culex quinquefasciatus ;

- de proposer des concentrations efficaces des huiles pour une lutte biologique, écologiquement durable contre les larves et les adultes de moustiques devenus résistants aux insecticides synthétiques.

1.2. Hypothèses

- Les extraits d'huiles végétales sont efficaces sur les larves de moustiques et permettent d'obtenir près de 100% de mortalité 24 heures après application.

- Les huiles végétales sont plus actives par contact que par ingestion sur les adultes.

CHAPITRE 1 :

GENERALITES

1. Généralités

1.1. Les moustiques

Dans le cadre de cette étude, selon la systématique qui s'occupe de la nomination des espèces, les moustiques appartiennent à la famille des Culicidae subdivisée en deux sous-familles :

Pour l'étude, deux espèces provenant des sous-familles ont été utilisées dont l'Anopheles gambiae dans la famille des Anophelinae et le Culex quiquefasciatus dans la famille des Culicinae (Harbach, 2007). Elles se différencient par la position à la phase aquatique (larvaire) et la position à la phase aérienne (adulte). Les femelles d'Anopheles adoptent la position oblique à leur support au repos, mais celles du genre Culex se tiennent parallèlement au support. (Figure 1)

Figure 1: Différences entre Anophelinae et Culicinae
Source: (OMS, 2003)

Les moustiques diffèrent des autres diptères, comme les mouches, par la présence de petites écailles sur la plupart des nervures des ailes. Le moustique adulte a le corps divisé en trois parties distinctes: la tête, le thorax et l'abdomen avec chacune, ses éléments constitutifs (Figure 2).

1.1.1.1. Phase aquatique

Quelques jours après la fécondation, suivant les espèces, les oeufs de diverses formes (fusiformes, allongés, renflés dans leur milieu et parfois munis de minuscules flotteurs latéraux) sont pondus par la femelle dans différents milieux. La ponte est souvent de l'ordre de 100 à 400 oeufs et le stade ovulaire dure deux (2) à trois (3) jours lorsque les conditions : température du milieu, pH

de l'eau, nature et abondance de la végétation aquatique de même que la faune associée (Kpondjo, 2008) sont favorables à l'éclosion ; celle-ci peut être retardée, en cas d'abaissement de la température par exemple. La taille d'un oeuf est d'environ 0,5 mm (Rodhain et Perez, 1985).

A maturité, les oeufs éclosent et donnent des larves de stade 1 (1 à 2 mm) qui, jusqu'au stade 4 (1,5 cm) se nourrissent de matières organiques, de microorganismes et même des proies vivantes (pour les espèces carnassières). Malgré leur évolution aquatique, les larves de moustiques ont une respiration aérienne qui se fait à l'aide de stigmates respiratoires ou d'un siphon (Rodhain et Perez., 1985). La larve de stade 4 est bien visible à l'oeil nu par sa taille. Elle a une tête, qui porte latéralement les taches oculaires et les deux antennes. Viennent ensuite le thorax et l'abdomen.

Au bout de six (6) à dix (10) jours et plus, selon la température de l'eau et la disponibilité en nourriture, la quatrième mue donne naissance à une nymphe: c'est la nymphose (Guillaumot, 2006). Généralement sous forme de virgule ou d'un point d'interrogation, la nymphe mobile ne se nourrit pas durant tout le stade nymphal (phase de métamorphose) qui dure un (1) à deux (2) jours. Elle remonte de temps à autre à la surface de l'eau pour respirer et plonge vers le fond, dès qu'elle est dérangée. A la fin de ce stade, la nymphe s'étire, son tégument se fend dorsalement et, très lentement, le moustique adulte (imago) s'extirpe de l'exuvie : c'est l'émergence, qui dure environ quinze (15) minutes au cours desquelles l'insecte se trouve exposé sans défense face à de nombreux prédateurs de surface (Rodhain et Perez, 1985).

1.1.1.2. Phase aérienne

Les sujets des deux (2) sexes s'accouplent en vol ou dans la végétation et ont une distance de vol de un (1) à deux (2) km. Grâce aux longs poils dressés sur leurs antennes, les mâles peuvent percevoir le bourdonnement produit par le battement rapide des ailes des femelles, qui s'approchent des essaims lors du vol nuptial. A ce moment, le mâle féconde la femelle en lui laissant un stock de sa semence. La femelle dotée d'un caractère particulier, celui du maintien en vie jusqu'à la mort des spermatozoïdes, conserve la semence du mâle dans une ampoule globulaire ou vésicule d'entreposage (spermatique). Elle ne s'accouple donc qu'une seule fois (Darriet, 1998).

Les adultes mâles et femelles se nourrissent de jus sucrés, de nectars et d'autres secrétions végétales. Pourtant, une fois fécondées, les femelles partent en quête d'un repas sanguin duquel, elles retirent les protéines et leurs acides aminés, nécessaires pour la maturation des oeufs. Ce repas sanguin prélevé sur un vertébré (mammifère, amphibien, oiseau), est ensuite digéré dans un endroit abrité (Guillaumot, 2006).

Dès que la femelle est gravide, elle se met en quête d'un gîte de ponte adéquat pour le développement de ses larves. La ponte a lieu généralement au crépuscule. Le gîte larvaire est une eau stagnante ou à faible courant, douce ou salée (Ayitchedji, 1990). Selon (Iroko, 1994), le sang, l'eau et une température d'au moins 18°C sont les trois conditions nécessaires, pour la reproduction et le développement de certains moustiques d'Afrique noire. Le cycle de développement du moustique est schématisé dans la figure à la page suivante (figure 3).

Pour les tests adultes, seule la femelle de chaque espèce a été utilisée. Les adultes mâles ne constituent pas des facteurs vectoriels de maladies car ils ne piquent pas. La trompe de la femelle sert non seulement à extraire le sang, elle permet aussi de tirer le sucre, tel que le nectar de fleurs, qui lui donnera l'énergie pour voler. Quant au mâle, il ne s'alimente pas de sang parce qu'il ne possède pas les stylets acérés pour percer la peau; il obtient son énergie en s'alimentant de sucre seulement.

Figure 4 : différences entre femelle et mâle du moustique à partir de la tête.

1.2. Les huiles végétales

Les huiles végétales sont des corps lipidiques extraits des graines ou des fruits oléagineux. Ce sont des molécules organiques insolubles dans l'eau et solubles dans les solvants organiques apolaires comme benzène, chloroforme, éther de pétrole, l'hexane, etc.

Elles sont caractérisées par la présence dans la molécule d'au-moins un acide gras ou chaîne grasse. Elles apportent à la fois vitamines, protéines, minéraux, acides gras essentiels, insaponifiables et autres substances organiques indispensables à l'élasticité et à la fermeté des tissus.

1.2.1 Caractéristiques chimiques des huiles végétales

Toutes les huiles végétales sont composées, en proportions variables, de trois

types d'acides gras : saturés, mono-insaturés et polyinsaturés. On les classe selon les acides gras prédominants. Pour cette étude, les huiles utilisées sont :

- l'huile d'Azadirachta indica ; - l'huile de Jatropha curcas L. ; - l'huile de Ricinus communis et, - l'huile de Thevetia peruviana.

Toutes les huiles végétales sont hydrophobes au naturel. Elles doivent être formulées avec des agents tensio-actifs appropriés afin de les émulsionner dans l'eau pour application.

1.2.2. Huile d'Azadirachta indica Juss.

Communément appelé Acacia d'Egypte, arbre à chapelets, Lilas des Indes (à ne

Originaire du sous-continent indien, les propriétés médicinales et insecticides de la plante sont connues depuis des millénaires (Mishra et al., 1995). Au début du XX^è siècle, il est introduit dans plusieurs pays en développement et particulièrement en Afrique. C'est ainsi qu'il est massivement planté au Bénin pour fixer le bord des routes et comme source de médicaments antipaludiques, mais surtout comme source de reboisement des zones arides. Le fruit est une drupe ovoïde, lisse de 1,5-1,8 x 1,2-1,4 cm, jaune à maturité, ne contenant généralement qu'une graine noyée dans une pulpe visqueuse et plus ou moins sucrée.

Photo1 : feuilles et fruits d'Azadirachta indica
Source : cliché AGBIZOUNON, 2010

Selon la croyance populaire dans plusieurs pays tropicaux, l'Azadirachta indica est fréquemment utilisée pour sa valeur médicinale. Différentes parties de la plante sont utilisées pour le traitement de diverses affections :

? Feuilles : paludisme, ictère, variole, stomatite, gastrite, asthénie et la lutte contre les vers intestinaux.

L'huile est généralement légère, amère et brune avec une odeur plutôt forte. Elle comporte principalement des triglycérides et de grandes quantités de triterpénoïdes composés, qui sont responsables du goût amer. (Mourguer, 1961).

L'huile de Neem contient également des stéroïdes (campestérol, beta sitostérol, stigmastérol) et une pléthore de triterpénoïdes dont l'Azadirachtin est le plus bien connu et étudié. La teneur en Azadirachtin de l'huile de Neem change de 300ppm à 2500ppm fini selon la technologie d'extraction et la qualité des graines de Neem écrasées.

Yikpotiin ou Gbaguidi kpotiin (Fon et Gun), Gboci ou Gbodogwi (Adja), Iyalode

ou Ewe ayaba (Yoruba) ; Olobontuje ou Kiti-kpo-kpo (Nago) et Babati en Mina, le Jatropha est aussi appelé pourghère ou pignon d'inde.

Il viendrait du Mexique ou des régions voisines d'Amérique centrale. Il est devenu une culture d'exportation au Cap-Vert, où il a été introduit par les navigateurs portugais, avant de se répandre dans toutes les régions tropicales et subtropicales puis dans le monde (Weiss, 1983). La plante est réputée comme toxique interne et vulnéraire externe. C'est donc avec précaution et sous surveillance qu'elle est prescrite en usage interne. Le fruit est de forme ovoïde,

plus ou moins trilobé ou anguleux, de 3,5 x 3 cm, de couleur verte devenant noirâtre à maturité (Stirpe, 1976).

Les huiles non conventionnelles extraites des graines mûres de Jatropha curcas récoltées dans huit localités du Bénin ont été étudiées par Kpoviessi et al. (2004). Les potentiels lipidiques varient entre 40 et 60 %. Toutes les localités présentent une huile liquide à température ambiante, de type insaturé et avec une prédominance des acides gras oléique (43-53 %), linoléique (20-32 %) et palmitique (13-15 %). La teneur en insaponifiables reste inférieure à 4 %, sauf à Bohicon (5,5 %) et Akiza (8,4 %) (Kpoviessi et al., 2004).

Une étude faite par Djènontin et al. (2006) sur la caractérisation physico-chimique de l'huile végétale extraite de graines de Jatropha curcas

(Euphorbiaceae) récoltées dans le sud du Bénin a permis de remarquer que les acides gras insaturés sont majoritaires avec la prédominance des acides oléique et linoléique (42,3 et 36,6% respectivement). L'étude de la fraction insaponifiable (0,8%p) a permis de révéler que l'huile de Jatropha curcas contient 130 mg/l00g de stérols (dont 86,1% de â-sitostérol) et 19,9 mg/l00g de tocophérols (dont 76,9% de y-tocophérol). Les phospholipides (0,6g/100g) ont été quantifiés sur la base de la teneur en phosphore. Ces données physicochimiques de l'huile ont été comparées à celles d'autres huiles végétales conventionnelles de grande consommation au Bénin (Kpoviessi et al., 2004).

1.2.3. Huile de Ricinus communis L.

Le ricin est doté d'une diversité de noms au plan local. Gogozokwinon ou Gogozoe ou encore Dagbazo en Fon, Myion Myion en Gun, Lapkalakpa, Adete Lara, Ilara en Yoruba et Nago, Kasuwe/Kawse en Mina, Dagbazama en Adja, Montiusu en Bariba, Kpiipi Koroobu en Waama.

Photo 3: Graines de ricin (décortiquées et enrobées)
Source : cliché AGBIZOUNON, 2010

L'huile de ricin est constituée majoritairement de triacylglycérol dont l'acide gras en C18 (insaturé et hydroxylé) : l'acide ricinoléique (Maroyi, 2007). L'huile de ricin se présente comme un liquide visqueux, incolore mais tendant parfois légèrement sur le jaune avec un très faible arôme.

C'est un purgatif drastique longtemps utilisé comme laxatif, mais c'est surtout une huile industrielle : lubrifiant des moteurs tournant à très haut régime,

matière première dans l'industrie des polymères (RILSAN) et source d'acide undécylénique (substance antifungique et industrielle) selon les données du site web : http://www.phytomania.com/ricin.htm.

- d'acides gras essentiels poly-insaturés (AGPI ou AGE) ou vitamine F : acide linoléique (oméga6 : 4,5%) ;

- d'acides gras mono-insaturés (AGMI) : acide ricinoléique (87,9%), acide oléique (3,9%) ;

- d'acides gras saturés (AGS) : acide palmitique (1.0%), acide stéarique (1,1%) (Maroyi, 2007).

Ces acides gras insaturés possèdent des propriétés reconnues dans le cosmétique. Ils nourrissent, protègent, adoucissent, assouplissent, régénèrent, redonnent éclat et souplesse et préservent d'un vieillissement prématuré de la peau.

1.2.4. Huile de Thevetia peruviana K. Schum

- Tantohu (Fon) ; Olomiojo (Yoruba et Nagot) ; Batonè (Bariba), le thevetia est connu sous deux formes diverses : la forme Thevetia neriifolia Juss. ex Steud. (1841) et le Cascabela thevetia (L.) Lippold (1980). Il est originaire d'Amérique Latine et est largement cultivé à travers les tropiques comme plante ornementale ( www.lesarbres.fr/thevetia.html consulté le 05/01/11).

Photo 4 : Graines de Thevetia, vue complète, transversale et graine séchée
Source : cliché AGBIZOUNON, 2010

Thevetia peruviana est utilisé à travers les tropiques comme plante médicinale, en dépit de sa toxicité. Une décoction d'écorce ou de feuilles est absorbée comme laxatif et comme émétique, et elle est réputée efficace pour soigner les fièvres intermittentes (Arbonnier, 2002).

L'huile extraite des graines a montré une forte action antibactérienne. Différents extraits de feuilles et extraits de graines ont montré un fort effet anti-appétitif sur les limaces et certains insectes dont les termites lorsque pulvérisés sur les cultures (Schmelzer et Gurib-Fakim, 2006).

Les graines contiennent 57À63% d'huile, qui après purification se compose principalement d'acide oléique (60%), d'acide palmitique (16%), d'acide stéarique (11%), d'acide linoléique (7%) et d'acide linoléique (5%). L'huile peut être détoxifiée et pourrait servir d'huile végétale à usage domestique (Schmelzer et Gurib-Fakim, 2006).

CHAPITRE 2 :

CADRE D'ETUDE

2. Cadre de l'Etude

Ce chapitre présente le site de prospection larvaire des moustiques et les laboratoires où les travaux d'expérimentation et d'extraction ont été réalisés.

2.1. Le site de prospection larvaire

Le site de Ladji, situé dans le 6^ème arrondissement de la ville de Cotonou a été le site privilégié de prospections larvaires.

Ce quartier de la capitale économique est situé aux abords du lac Nokoué. Ce site a été choisi pour deux raisons essentielles :

- abrite les An. gambiae et Culex quinquefasciatus fortement résistants aux pyréthrinoïdes (Corbel et al., 2007 ; N'Guessan et al., 2007 ; Dabire et al., 2008).

2.2. Laboratoires

- le laboratoire de Pharmacognosie et des Huiles Essentielles (LAPHE) du Professeur Mansourou Moudachirou sis à l'ISBA (Institut des Sciences Biomédicales Appliquées). Ce laboratoire s'occupe d'une part de l'extraction des huiles essentielles et végétales, et d'autre part de la détermination des composés chimiques des extraits.

- le Centre de Recherche Entomologique de Cotonou (CREC) qui dispose de plusieurs laboratoires dont celui de la LSHTM (London School of Hygiene and Tropicale Medicine) où s'est effectué notre stage. Ce laboratoire est dirigé par le Docteur Raphaël K. N'Guessan. Le CREC dispose aussi d'un insectarium où plusieurs

La photo ci-après montre les insectariums où sont élevés les larves et les adultes de moustiques.

CHAPITRE 3 :

MATERIEL ET METHODES

3. Matériel et Méthodes

3.1. Matériel végétal

Le matériel végétal est constitué des graines de Az. indica, Ri. communis, Th. peruviana et Ja. curcas. Les spécimens ont été identifiés à l'Herbier National du Bénin de l'Université d'Ab-Calavi. Lesdites graines ont été récoltées dans la période d'octobre 2009 à Août 2010 dans différentes localités et présentées dans le tableau 2.

3.2. Matériel animal

la souche sensible de référence est l'Anopheles gambiae Kisumu, originaire du Kenya. Cette souche est élevée à l'insectarium du CREC ; Anopheles gambiae Ladji, populations naturelles résistantes aux pyréthri-noïdes et DDT dont la fréquence allélique Kdr est supérieure 90% (Corbel et al., 2007 ; N'Guessan et al. 2007).

le Culex quinquefasciatus Ladji, multi-résistants aux pyréthrinoïdes, DDT, Organophosphorés et aux Carbamates (Corbel et al., 2007).

3.3. Matériel physique

3.3.1. Matériels d'extraction des huiles végétales :

Pour le broyage des amandes nous avons utilisé un broyeur de graine de marque Marlex (IS4250) (Photo 6).

L'extraction des huiles végétales a été faite avec le dispositif du Soxhlet (photo 8) et le dispositif d'évaporation d'un bain-marie + rotavapor (photo 9).

Dans le cas où l'huile s'extrait à froid, comme c'est le cas du Jatropha, les graines sont récoltées, décortiquées, triées, broyées et l'extraction faite à l'aide d'un pressoir de modèle 95ZX-10 d'une puissance de 7,5kw avec une production de 3 à 5 tonnes en 24h

3.3.2. Matériels pour l'élevage des larves et les adultes d'Anopheles gambiae (Giles) et de Culex quinquefasciatus (Say)

vement à nourrir les larves et les adultes des moustiques d'études ; w' Des bacs voilés de moustiquaire contenant l'eau pour l'élevage des

3.4. Méthodes

3.4.1. Méthode d'extraction des huiles végétales

La méthode Soxhlet est la méthode de référence utilisée pour l'extraction des huiles végétales à partir des amandes solides déshydratées. C'est une méthode gravimétrique, puisqu'on pèse l'échantillon au début et la matière grasse à la fin de l'extraction (Chandre, 1998).

3.4.1.1. Principe de la méthode par le Soxhlet

Les amandes solides préalablement séchées à la température ambiante au Laboratoire de Pharmacognosie et des Huiles Essentielles de l'ISBA sont pesées et placées dans une moulinette pour être broyées. L'échantillon broyé (broyat) est entassé dans une cartouche qui est déposée dans le soxhlet avec 1L de solvant pour chaque extraction. 75cl de solvant sont versés directement sur le broyat et les 25cl restants versés dans le ballon dans le quel sont déposés au préalable quelques grains de pierres ponces. Le tout est porté à ébullition dans le thermostat. L'ensemble est donc prêt pour l'extraction. Celle-ci a été réalisée à l'aide de l'éther de pétrole 60-80 à ébullition qui dissout graduellement l'huile

végétale. Le solvant contenant l'huile végétale retourne dans le ballon par déversements successifs causés par un effet de siphon dans le coude latéral. La matière grasse s'accumule dans le ballon jusqu'à ce que l'extraction soit complète. Une fois l'extraction terminée, l'éther de pétrole est évaporé, généralement sur un évaporateur rotatif.

L'huile de Jatropha curcas, a été obtenue par l'extraction à froid, c'est-à-dire par simple presse de l'amande.

3.4.1.2. Principe de la méthode d'extraction à froid

La matière végétale (graines) est récoltée, décortiquée, triée, broyée et pressée à

3.4.2. Méthode de dilution des huiles végétales

Les différentes dilutions ont été faites sur la base de la conservation de quantité de matière dans le solvant. On fait des dilutions successives dans l'éthanol pour les tests larvaires, dans l'acétone pour les tests en tubes OMS puis dans du jus sucré pour les tests d'ingestion.

Ainsi _ni=nf où (ni=ci×vi) représente la quantité de matière à l'état initial c'est-à-dire avant la dilution (huiles végétales pures) et (nf=cf×vf) représente celle à l'état final c'est-à-dire après la dilution (huiles végétales diluée) ce qui permettra de déduire le volume de l'huile végétale pure dans la solution diluée à l'aide de la formule suivante :

Ci = Concentration de l'huile végétale pure en pourcentage ; on suppose par convention que quand l'huile végétale est pure, sa concentration est égale à 100% donc 1

Vf = Volume final de la solution diluée en millilitre ; nous avons supposé qu'il est égal à 100ml pour toutes les dilutions.

3.4.3. Les Tests larvaires

Les tests ont consisté à évaluer la mortalité des larves d'Anopheles et Culex en présence des solutions diluées d'huiles végétales suivant une méthodologie inspirée du protocole de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2005). Des expériences préliminaires ont permis de retenir une gamme de concentrations devant servir aux tests proprement dits. Les expérimentations ont été réalisées dans des gobelets avec 20 larves de moustiques au 3^ème stade. Dans chaque gobelet a été versé, un mélange d'eau distillée et d'huile végétale. Le volume du mélange d'eau distillée additionnée avec de l'huile végétale est de 100ml par gobelet exception faite du contrôle qui ne contient uniquement que l'eau distillée et le solvant. Chaque expérience à été répétée 5 fois. Les différentes doses expérimentées sont les suivantes :

Thevetia peruviana: 0,125% ; 0,25% ; 0,5% ; 1% ; 2% ; 3% et 4% Azadirachta Indica : 0,0625% ; 0,125% ; 0,25% ; 0,5% et 1%

Le temps d'exposition des larves aux différentes concentrations est de 24h. Après 24h d'exposition, l'efficacité de chaque dose a été déterminée en relevant dans chaque gobelet le nombre de larves mortes.

3.4.2.1. Test en cage par ingestion

Cinquante à 60 moustiques femelles âgées de 3 jours ont été introduit à l'aide

d'un aspirateur dans une cage. Du coton imbibé d'un mélange de jus sucré et d'huile végétale est placé au dessus de la cage en fonction des doses désirées (Photo 12). Les morts sont comptés et retirés des cages tous les jours. Les doses appliquées sur les adultes en cage ont été :

Thevetia peruviana: 0,5% ; 1% ; 2% ; 3% et 4% Azadirachta Indica : 0,125% ; 0,25% ; 0,5% ; 1% et 2% Ricinus. Communis : 0,5% ; 1% ; 2% ; 4% et 6% Jatropha curcas : 0,125% ; 0,25% ; 0,5% ; 1% et 2%

Photo 12 : Disposition des cages lors des expérimentations
Source : cliché AGBIZOUNON, 2010

3.4.2.2. Test de sensibilité ou test en tubes OMS

L'imprégnation des papiers Whattman n°1 s'est fait selon le protocole adopté par N'Guessan et al., 2003, 2007 et Corbel et al., 2007. Quatre papiers de 12cm X 15cm sont imprégnés chacun de 2ml du mélange huile végétale + acétone + huile de silicone. Après séchage à la température ambiante pendant 24 heures, les papiers sont emballés dans de papier aluminium, puis conservés au réfrigérateur (OMS, 2009).

Environ 100 femelles âgées de 3 à 5 jours sont exposées pendant 1 heure dans les tubes tests contenant les papiers imprégnés. Pendant le temps d'exposition, on décompte, toutes les cinq minutes, le nombre de moustique ayant subit un effet KD (Knock Down) ; c'est-à-dire qui tombe sur le dos ou sur le côté. Après l'exposition les femelles sont transvasées dans les tubes d'observation et la mortalité est dénombrée 24h, 48h et 72h après. Les doses appliquées contre les adultes lors des tests OMS sont de 100mg/m², 250mg/m², 500mg/m² et 1000mg/m² pour toutes les huiles.

Photo 13 : Gobelets contenant les moustiques
Source : cliché AGBIZOUNON, 2010

3.5. Analyses statistiques

Les données des tests larvaires ont été analysées en utilisant la régression probit avec Polo-Plus (Polo-PC, LeOra Software, Berkeley, CA) ; les résultats des tests d'ingestion ont été analysées par le test de survie de Kaplan-Meier (STATA 9 software) et les données des tests de contact (ou tube OMS) ont été analysées suivant le test de Khi-Carré en utilisant le logiciel Minitab 14.

CHAPITRE 4 :

RESULTATS ET

DISCUSSIONS

4.1. Résultats

4.1.1. Rendement en huile végétale des graines étudiées selon la méthode

d'extraction

Les résultats obtenus à partir de l'extraction, ont montré que les graines étudiées ont des rendements en huiles végétales considérables (tableau 4).

Le rendement en huile le plus élevé est obtenu avec les graines de Thevetia peruviana à 68,4%. Le plus faible rendement obtenu avec Jatropha curcas est de 38,6%. Il est à observer que les deux euphorbiacées, Jatropha curcas et Ricinus communis, ont un rendement presque identique et inferieur à celui de Thevetia peruviana.

4.1.2. Efficacité des huiles végétales sur les larves

On observe une évolution du taux de mortalité en fonction des différentes doses appliquées.

4.1.2.1. Effet larvicide d'Azadirachta indica

L'effet larvicide des huiles végétales par rapport à Azadirachta indica a été évalué avec plusieurs paramètres dont :

- L'intervalle de confiance (IC) à 95%, c'est un intervalle de valeurs qui a 95% de chance de contenir la vraie valeur du paramètre estimé;

Le tableau 4 révèle qu'avec l'huile d'Azadirachta indica, la _DL50 chez An. gambiae Kisumu a été de 0,2% (IC=0,2-0,3), tandis qu'elle a été de 0,3% (0,20,3) pour la population résistante de An. gambiae Ladji ; avec un _RR50 estimé à 1,2 (IC=1,1-1,4). Ce qui suggère une sensibilité de la population résistante à cette huile.

De même, chez Cx. quinquefasciatus, la _DL50 a été de 0,3% (IC=0,2-0,3) avec un _RR50 estimé de 1,1 (IC=1,0-1,3) ce qui traduit une sensibilité des Cx. quinquefasciatus à la même huile végétale.

Tableau 4 : Doses létales _DL50^et_DL95 et Ratio de Résistance _RR50^et RR95 d'Azadirachta indica sur des larves L3 de An. gambiae Kisumu, An. gambiae Ladji et Cx. quiquefasciatus Ladji.

Souches

Pente
(E.S.)

DL50 (%)
(95% I.C.)

DL95 (%)
(95%I.C.)

RR50

(95% I.C.)

RR95

(95% I.C.)

An. gambiae Kisumu (s)

An. gambiae Ladji (kdr)

Cx. quinquefasciatus Ladji (Kdr, Acer-R)

4,0

(0,3)

3,0

(0,2)

3,2

(0,2)

0,2

(0,2 - 0,3)

0,3

(0,2 - 0,3)

0,3

(0,2 - 0,3)

0,6

(0,5 - 0,8)

1,1

(0,9 - 1,5)

0,9

(0,7 - 1,2)

1,2

(1,1 - 1,4)

1,1

(1,0 - 1,3)

1,7

(1,3 - 2,3)

1,4

(1,1 - 1,8)

I.C. = Intervalle de Confiance. E.S.= Erreur Standard. S= Sensible Kdr =Knock down resistant; Acer-R= Acétylcholinestérase-Résistant ; DL (exprimée en %) ; RR = DL résistant / DL sensible

4.1.2.2. Effet larvicide de Ricinus communis

Tableau 5 : Doses létales _DL50^et_DL95 et Ratio de Résistance _RR50^et_RR95 de Ricinus communis sur des larves L3 de An. gambiae Kisumu, An. gambiae Ladji et Cx. quiquefasciatus Ladji.

Souches

Pente
(E.S.)

DL50 (%)
(95% I.C.)

DL95 (%)
(95%I.C.)

RR50

(95% I.C.)

RR95

(95% I.C.)

An. gambiae Kisumu (s)

An. gambiae Ladji (kdr)

Cx. quinquefasciatus Ladji (Kdr, Acer-R)

3,2

(0,3)

3,1

(0,2)

2,7

(0,2)

1,2

(1,0 - 1,4)

1,2

(1,0 - 1,4)

1,1

(0,9 - 1,5)

3,8

(2,9 - 5,8)

4,1

(3,3 - 5,7)

4,7

(3,3 - 8,7)

1,0

(0,9 - 1,2)

1,0

(0,8 - 1,1)

1,1

(0,8 - 1,4)

1,2

(0,9 - 1,6)

I.C. : intervalle de confiance E.S.= Erreur Standard. S= Sensible Kdr = Knock down resistant Acer-R= Acétylcholinestérase-Résistant ; DL (exprimée en %) ; RR = DL résistant / DL sensible

De ce tableau 5 on retient que, pour l'huile végétale de Ricinus communis, la dose qui tue 50% des larves An. gambiae Kisumu et Ladji a été de 1,2% (IC=1,0-1,4), avec un _RR50 estimé de 1,0 (IC=0,9-1,2). Ce qui explique une sensibilité de la souche résistante vis-à-vis de l'huile testée. De même, la DL50 sur Cx. quinquefasciatus a été de 1,1% (IC=0,9-1,5) avec un _RR50 de 1,0 (IC=0,8-1,1).

4.1.2.3. Effet larvicide de Thevetia peruviana

Tableau 6 : Doses létales _DL50^et_DL95 et Ratio de Résistance _RR50^et_RR95 de Thevetia peruviana sur des larves L3 de An. gambiae Kisumu, An. gambiae Ladji et Cx. quiquefasciatus Ladji.

Souches

Pente
(E.S.)

DL50 (%)
(95% I.C.)

DL95 (%)
(95%I.C.)

RR50

(95% I.C.)

RR95

(95% I.C.)

An. gambiae Kisumu (s)

An. gambiae Ladji (kdr)

Cx quinquefasciatus
Ladji (Kdr, Acer-R)

2,1

(0,1)

2,2

(0,1)

1,8

(0,1)

0,4

(0,3 - 0,5)

0,5

(0,4 - 0,6)

0,6

(0,4 - 0,8)

2,6

(2,0 - 3,9)

2,9

(2,3 - 3,9)

4,6

(3,1 - 8,4)

1,2

(1,0 - 1,5)

1,3

(1,1 - 1,6)

1,1

(0,8 - 1,5)

1,7

(1,2 - 2,5)

I.C. : intervalle de confiance E.S.= Erreur Standard. S= Sensible Kdr = Knock down resistant; Acer-R= Acétylcholinestérase-Résistant ; DL (exprimée en %) ; RR = DL résistant / DL sensible

Le tableau 6, montre que pour tuer 50% des larves d'An. gambiae Kisumu, il a fallu une _DL50 de 0,4% (IC=0,3-0,5). Avec la population résistante de An. gambiae Ladji, elle a été de 0,5% (IC=0,4-0,6). Le _RR50 estimé a été de 1,2 (IC=1,0-1,5) ce qui démontre une sensibilité de la souche résistante à l'huile de Thevetia peruviana. En revanche, chez Cx. quinquefasciatus Ladji la _DL50 a été de 0,6% (IC=0,4 - 0,8) avec un _RR50 estimé qui a été de 1,3 (IC=1,1-1,6). Ce qui explique une sensibilité de la souche Cx. quinquefasciatus à cette huile.

4.1.2.4. Effet larvicide de Jatropa curcas

Tableau 7 : Doses létales _DL50^et_DL95 et Ratio de Résistance _RR50^et_RR95 de Jatropha curcas sur des larves L3 de An. gambiae Kisumu, An. gambiae Ladji et Cx. quiquefasciatus Ladji.

souches	Pente (E.S.)	DL50 (%) (95% I.C.)	DL95 (%) (95%I.C.)	RR50 (95% I.C.)	RR95 (95% I.C.)
An. gambiae	2,2	0,1	0,3	-	-
Kisumu (s)	(0,2)	(0,0 - 0,1)	(0,2 - 0,6)
An. gambiae Ladji	2,3	0,2	0,8	2,6	2,4
(kdr)	(0,2)	(0,1 - 0,2)	(0,6 - 1,3)	(2,1 - 3,2)	(1,7 - 3,5)
Cx quinquefasciatus	2,9	0,1	0,4	2,0	1,3
Ladji (Kdr, Acer-R)	(0,2)	(0,0 - 0,1)	(0,3 - 0,6)	(1,7 - 2,4)	(1,0 - 1,8)

I.C. : intervalle de confiance E.S.= Erreur Standard. S= Sensible Kdr = Knock down resistant;

Acer-R= Acétylcholinestérase-Résistant ; DL (exprimée en %) ; RR= DL résistant / DL sensible

L'effet toxique de l'huile de Jatropha curcas est mis en évidence dans le tableau 7. La _DL50 chez An. gambiae sensible a été de 0,1% (IC=0,0-0,1) tandis qu'elle a été de 0,2% (IC=0,1-0,2) chez la souche résistante d'An. gambiae Ladji. Le RR50 estimé a été de 2,6 (IC=2,1-3,2).

Ces résultats mettent en évidence une tolérance de la souche résistante à l'huile végétale de Jatropha curcas. De la même manière chez Cx. quinquefasciatus, une _DL50 de 0,1% (IC=0,0-0,1) a été obtenue avec un _RR50 de 2,0 (IC=1,7-2,4) ; ce qui implique la même tolérance de Cx. quinquefasciatus à cette huile végétale.

Des tableaux 4 à 7, on pourrait déduire que toutes les huiles végétales ont été efficaces sur les différentes souches de larves à l'exception de l'huile de Jatropha curcas pour laquelle les effets larvicides sont faibles.

4.1.3. Effet adulticide des huiles végétales sur An. gambiae Kisumu

Les taux de survie illustrés sur la figure 14 varient en fonction de l'huile végétale et du nombre de jours.

Toutes les huiles végétales testées entrainent des taux de survie variant de 100% à 0% entre le Jour zéro et le 10^è jour à l'exception du contrôle. Ce taux de survie est de 0% à partir du 5^è jour pour le Thevetia peruviana, 6^è jour pour le Jatropha curcas et l'Azadirachta indica et enfin au 9^è jour pour le Ricinus communis. L'analyse statistique des données de survie selon Kaplan-Meier a montré une survie dans le temps significativement plus élevé de Ricinus. communis par rapport à l'huile végétale de Thevetia peruviana (P<0,001) ; mais non significativement différente entre le Thevetia peruviana et l'Azadirachta indica (P>0,05). Le fort taux de survie a été obtenu avec l'huile de Ricinus communis.

Ces observations sont identiques avec les populations naturelles de Anopheles gambiae.

Figure 14 : Taux de survie de Anopheles gambiae kisumu après exposition par ingestion à 2% des huiles végétales de Ricinus communis, Jatropha curcas, Azadirachta indica, et Thevetia peruviana

4.1.4. Effet adulticide des huiles végétales sur Cx. quinquefasciatus

Les extraits d'huiles végétales ont eu un effet semblable sur les culex que sur les Anopheles gambiae. Mais ici, l'analyse des données selon Kaplan-Meier a montré une survie dans le temps hautement significative de l'huile de Ricinus communis par rapport à celle d'Azadirachta indica (P<0,001). Le taux de survie le plus élevé a été obtenu avec l'huile de Ricinus communis.

Figure 15 : Taux de survie de Culex quinquefasciatus Ladji après exposition par ingestion à 2% des huiles végétales de Ricinus communis, Jatropha curcas, Azadirachta indica, et Thevetia peruviana

4.1.5. Efficacité des tests adulticides par contact tarsique sur Kisumu

Les résultats des tests en cylindre, sont présentés sur la figure 16, traduisant la variation du taux de mortalité en fonction des différentes doses des huiles végétales.

La mortalité de An. gambiae exposé aux papiers imprégnés d'extrait d'huile végétale en tube est très faible quelque soit l'huile utilisé et ne dépasse pas 54,1% pour Thevetia peruviana à 250mg/m² au bout de 72h. Celle-ci est significativement différente des autres mortalités obtenues avec les doses

100mg/m² ; 500mg/m² et 1000mg/m² (P<0,05), 72h après l'installation de l'expérience.

Comparée entre elle, la mortalité de An. gambiae 72h après le début des expériences, n'a pas permis d'obtenir une différence significative entre les huiles (P>0,05).

L'action par contact des extraits d'huiles végétales est donc négligeable sur An. gambiae Kisumu.

Figure 16 : Taux de mortalité de Anopheles gambiae kisumu après exposition aux huiles végétales par contact tarsique

4.2. Discussions

Les rendements en huiles végétales obtenus à partir des graines d'études sont largement supérieurs ont confirmé les observations de Moudachirou et al., en 1999 et Ayedoun en 1995 et qui montrent qu'il pourrait y avoir une différence entre les deux types d'huiles en ce qui concerne le rendement. Le rendement en huile végétale de Azadirachta indica 41,36% similaire au rendement obtenu par Carlos et al., (2010) (39,7%) confirme la qualité de l'extraction. Il en est de même lorsqu'on compare le rendement en huile végétale de Thevetia peruviana obtenu par Schmelzer et al., (2006) et celui obtenu lors de nos extractions.

Le _RR50 sensiblement égal à 1(1,0-1,4) obtenus entre la souche de référence sensible Kisumu et celle des populations sauvages de An. gambiae et Cx. quinquefasciatus résistantes aux pyréthrinoïdes montre une sensibilité de ces populations à l'huile d'Azadirachta indica. La _DL50 évaluée dans le présent test s'est aussi révélé efficacité dans l'inhibition des larves de stade 3 d'An. gambiae stricto (Howard et al., 2009). Dans une étude précédente contre des larves de Culex sp. l'Azadirachta indica s'est montré efficace à la même dose de 0,3% avec des taux de mortalités de 100% (Scott et al., 2000). L'huile végétale de Azadirachta indica a donc un effet larvicide qui pourrait être utilisé pour contrôler les moustiques résistants y compris An. gambiae, principal vecteur du paludisme au Bénin. Quelle que soit l'huile végétale utilisée dans nos travaux, les _RR50 faibles ont été observés à l'exception de celle du Jatropha curcas (RR50=2,6). Ces huiles ont donc un potentiel dans le contrôle des populations résistantes de An. gambiae et Cx. quiquefasciatus évaluées.

Le _RR50 de 2,6 obtenu avec l'Huile Végétale du Jatropha curcas ne pourrait s'expliquer par une réelle résistance à cette huile mais plutôt par une tolérance due à l'expression naturelle d'enzyme de maintenance. Une hypothèse similaire a été formulée suite à un ratio de résistance similaire obtenu avec un insecticides alternatives aux pyréthrinoïdes tel que Chlorfenapyr (N'Guessan et al., 2007).

A Maroua, ville soudano-sahélienne du nord-Cameroun, il a été observé sur des populations résistantes de An. gambiae des niveaux de sensibilité similaires à ceux observés dans nos travaux sur les souches de Ladji (Baldet, 1995). Vu le développement de la résistance aux insecticides chimiques, nos huiles végétales constitueraient une alternative de lutte efficace, contre les An. gambiae et Cx. quinquefasciatus (Gomez et al., 1997, chandre et al., 1999).

On ne saurait parler de résistance de Cx. quinquefasciatus à ces huiles dans notre étude, car par ailleurs cette espèce à montrer des taux de résistance de 176 fois au DDT, 20,4 fois au perméthrine et 20 fois au Deltaméthrine ont été obtenues (Ouedraogo et al., 2005).

Il a été observé une faible toxicité par contact (taux de mortalité<35%) alors que l'action simultanée par contact et ingestion a été très marquée (taux de mortalité avoisinant 100% dès les premiers jours). Il semblerait que la voie par ingestion soit la plus toxique. Il n'est cependant pas à exclure qu'une synergie contact-ingestion se soit produit.

Les adultes des populations naturelles nourris au mélange du jus sucré et des huiles végétales (Az. Indica, Ja. curcars et Th. peruviana) mourant tous avant le 10^ème jour suggère que l'épandage de ces huiles pourrait écourter la survie de ces populations. Des taux de survie similaires ont été obtenus dans des travaux précédents évaluant de nouveaux insecticides synthétiques, tel que le chlorantraniliprole (Boko, 2009). La maturation du parasite du paludisme durant 8-12 jours chez An. gambiae (Detinova et al., 1964), la pulvérisation de ces huiles végétales éliminerait non seulement les larves mais aussi les adultes infectés du parasite du paludisme résistants aux insecticides synthétiques.

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES

Conclusion

Nos résultats bien que préliminaires, témoignent d'une bonne activité larvicide et par ingestion des extraits d'huiles végétales. Ainsi les huiles végétales de Thevetia peruviana, Jatropha curcas et Azadirachta indica constituent des larvicides prometteurs pour la lutte contre les moustiques sensibles et résistants aux insecticides synthétiques. L'effet toxique obtenu après ingestion de ces mêmes huiles suggère qu'on pourrait les utiliser comme un outil de lutte anti vectorielle efficace dans le management de la résistance des anophèles vecteurs du parasite du paludisme ainsi que dans le contrôle de Cx. quinquefasciatus nuisant et devenu résistant à toutes les formulations d'insecticides synthétiques couramment utilisés en santé publique.

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ANNEXES

Annexe1 : pressoir à huile

Annexe 2 : Schéma annoté d'un Soxhlet

TABLE DE MATIERES

3.3.2. Matériels pour l'élevage des larves et les adultes d'Anopheles gambiae et de Culex

4.1.1. Rendement en huile végétale des graines étudiées selon la méthode d'extraction 40