Installation d'une unité de production de biofertilisants

II. La production des biofertilisants

II.1. Production des biofertilisants à base de Rhizobium II.1.1. Isolement du nodule frais

La première étape est l'isolement des nodules sur des racines fraîches des légumineuses sont cultivées sous serre puis nettoyées avec de l'eau du robinet pour enlever toutes les saletés et les particules organiques. Ensuite, les racines sont coupées à 2-3 mm de chaque côté des nodules et afin de ne pas les endommager, l'utilisation des pinces est conseillée (Burton, 1985 ; Beck et al., 1993). Ainsi, les nodules intacts sont immergés pendant 10 secondes dans de l'éthanol à 95% ou dans l'isopropanol afin de briser la tension de surface et d'éliminer les bulles d'air. Ce traitement est suivi par un trempage dans une solution d'hypochlorite de sodium à 2.5 % pendant 4-5 minutes (Burton, 1985).

Ces nodules peuvent être aussi stérilisés superficiellement par immersion dans de chlorure mercurique (HgC12) à 0, l % pendant 3 mn ou dans une solution de peroxyde d'hydrogène (3%) (Burton, 1985). Après stérilisation, i1s sont écrasés dans une goutte d'eau stérile. Ainsi, la suspension obtenue est étalée sur le milieu Yeast Extract Manitol (YEM) composé à base de mannitol et d'extrait de levure contenu dans des boites de Pétri (Yokoyama et al., 2006).

Enfin, l'ensemble est incubé à 25-28 ° C pendant 3 à 10 jours en fonction de l'espèce jusqu'à ce que des colonies apparaissent (Burton, 1985). L'isolat d'une seule colonie de rhizobium est ensuite purifié et confirmé comme Rhizobium en démontrant sa capacité à former des nodules sur une légumineuse hôte d'essai dans des conditions contrôlées (authentification des isolats) (Burton, 1985).

II.1.2. Production de bouillon de culture

Le but de cette étape réside dans l'obtention d'une forte densité de rhizobiums dans le bouillon de culture. Cette opération est favorisée par le faite que ces micro-organismes sont connus par leur capacité à être cultivés facilement dans un milieu liquide. En revanche, ce processus est influencé par plusieurs facteurs qui sont : le milieu de culture, la souche de rhizobium, la température et l'aération (Yokoyama et al., 2006).

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Il est très important d'indiquer que la stérilisation de l'ensemble de l'enceinte de croissance et du milieu ainsi que d'assurer l'inoculation du fermenteur avec la culture de Rhizobium dans un environnement stérile sont des précautions à ne pas négliger (Yokoyama et al., 2006).

Étant donné que les rhizobiums sont des bactéries aérobies, des longues expériences ont montré que ces derniers ont besoin de 5-10 litre d'air pour 1 litre de milieu de culture en une heure (Roughley ,1970). De plus, la température optimale de croissance rhizobienne est de 28 à 30°C (Patil et Alagawadi, 2010).

Le bouillon de culture doit contenir une source d'énergie qui peut être des sucres, des alcools ou certains acides. Ce milieu doit contenir aussi bien des facteurs de croissance que des vitamines. Cependant, certaines espèces peuvent produire leurs propres facteurs de croissance (Patil et Alagawadi, 2010).

Ainsi, la composition du bouillon en gramme par litre d'eau distillée est la suivante :

Tableau1 : La composition du milieu de culture YEM (Yokoyama et al., 2006)

Ingrédients	g l-1
K2HPO4	0.5
MgSO4.7H2O	0.1
NaCl	0.2
Mannitol	10.0
Extrait de levure	0.5

Toutefois, certains laboratoires utilisent le saccharose ou l'infusion de maïs, au lieu d'ajouter le mannitol. L'ensemble du mélange doit être maintenu à un pH de 6,4 (Hémissi Zaghdoudi, 2013).

Enfin, la culture est incubée à 30 #177; 2 ° C en culture submergée avec une agitation orbitale de 150 ppm (partie par million). Cette incubation demeure jusqu'à ce que la population de cellules soit maximale de 10¹⁰ à 10¹¹ ufc (unité formant une colonie) / ml. La culture obtenue est appelée culture démarreur (Yokoyama et al., 2006).

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Il reste à noter que le temps de reproduction varie en fonction des bactéries. Il est de 2 à 4 heures pour les bactéries dites « à croissance rapide » qui produisent généralement des colonies relativement grandes de 2 à 4 mm de diamètre en 3 à 5 jours et de 6 à 8 heures pour celles « à croissance lente » qui forment des colonies de 1mm de diamètre en 7 à 10 jours (Hémissi Zaghdoudi, 2013).