1.1.3. TROISIEME RAYON
Dans ce rayon, s'effectue la préparation des milieux de
cultures (gélose au sang, BCP, BGA, CHAPMAN,
Mac Conkey, Mueller Hinton.etc.).
LES MILIEUX DE CULTURES
Le bactériologiste utilise des milieux de culture pour
isoler les bactéries du milieu qui les contient, les identifier,
étudier leurs propriétés et, éventuellement les
conserver.
Les milieux de culture utilisés peuvent être obtenus
de différentes façons. Ils peuvent être:
- Achetés, conditionnés,
prêts à l'emploi. Cette solution même si elle est
onéreuse est valable que pour les laboratoires ayant une consommation
limitée et régulière de milieux d'usage courant. Elle
s'impose le plus souvent pour certains milieux dont la préparation est
délicate et complexe.
- Préparés à partir des
différents ingrédients entrant dans leur formule. La formule d'un
milieu ressemble un peu à une recette de cuisine, chaque détail
de son exécution doit être respecté.
- Préparés à partir de
milieux secs déshydratés. Cette technique permet de concilier une
préparation simple, rapide, pratiquement sans risque d'erreurs et un
prix de revient relativement bas.
- Préparés, juste au moment de
l'utilisation sous leur forme définitive. Certains milieux exigent,
juste avant leur emploi, l'addition de substances périssables, d'autres,
un conditionnement n'autorisant qu'un court délai de conservation,
etc.
- Préparation classique d'un
milieu
Avant d'entreprendre la préparation d'un milieu, le
technicien se fera un devoir de se renseigner sur l'utilisation à
laquelle il est destiné. Il est d'ailleurs souhaitable de pouvoir lui
présenter un tube ou un flacon témoin provenant d'une
précédente fabrication et l'aspect (ou les différents
aspects) du milieu après un développement bactérien.
a) Lecture et interprétation de la formule de
préparation
> Rassembler les différents constituants.
> Vérifier qu'aucun oubli n'a été commis
et que la nature et la qualité des produits ont bien été
respectées.
b) Pesée des différents constituants
> On pèse le plus souvent à 0,1 g
près sauf pour certains corps chimiques qui entrent en très
faible quantité dans la composition de milieux spéciaux et pour
lesquels une précision de l'ordre de 0,0001 g peut être
exigée.
c) Dissolution
> Suivant la quantité de milieu à
préparer, prendre un grand bécher
> Mesurer la quantité d'eau nécessaire et, si
la dissolution doit se faire à chaud, la porter à la
température désirée.
> Ajouter les ingrédients dans l'ordre
indiqué.
> Agiter jusqu'à dissolution complète des
constituants.
d) Ajustement Du PH
Un milieu de culture est le plus souvent neutre ou très
légèrement basique, exceptionnellement il peut être
franchement alcalin ou acide. De toute façon, il est essentiel que la
mesure de cette acidité, neutralité ou alcalinité soit
effectuée correctement. Cette mesure correspond à la
concentration en ions hydrogène du milieu autrement dit au pH.
L'échelle des valeurs du pH s'étend de 1 (mesure
extrême de l'acidité) à 14 (mesure
extrême de l'alcalinité).
En bactériologie, on peut se contenter d'une
évaluation approximative de la mesure du PH par colorimétrie :
> On ajoute au milieu une substance colorée dite
« indicateur de pH » ; ces substances ont la
propriété de changer de teinte pour une certaine
valeur du pH appelée : zone de virage.
> Les indicateurs de pH les plus utilisés en biologie
sont ceux dont la zone de virage se situe
aux environs de la neutralité :
- Le bleu de bromothymol qui vire du jaune (acidité pH 6)
au vert (neutralité) puis au bleu (alcalinité pH 7,8).
- Le rouge de phénol qui vire du jaune (acidité)
à l'orangé (neutralité pH 7) puis au rouge carmin
(alcalinité pH 8).
> Si le pH est inférieur au pH désiré
(donc trop acide), on ajoute quelques gouttes de soude diluées (environ
au 1/100), on mélange, on vérifie le nouveau pH, on recommence
l'opération si nécessaire;
> Si le pH est supérieur au pH désiré
(donc trop alcalin), on ajoute quelques gouttes d'acide chlorhydrique
dilué (environ au 1/20), on mélange, on vérifie.
e) Filtration
> La filtration du milieu préparé n'est pas
systématique, elle ne sera envisagée que si le milieu est
trouble. Elle est effectuée sur de grands filtres plissés en
papier à gros grains ou sur filtre millipore.
> Beaucoup de milieux se solidifient en refroidissant
(milieux gélosés), leur filtration doit être
effectuée dans des entonnoirs chauffants, ou dans une cuve de
l'autoclave non fermé par exemple.
> On peut effectuer la filtration avant l'ajout de l'agar-agar
et avant l'autoclavage, ce qui évite l'utilisation de matériel
chauffant.
f) Répartition
Les milieux sont les plus souvent répartis avant leur
stérilisation, cette répartition est effectuée, suivant
l'équipement du laboratoire, à l'aide:
- D'un grand entonnoir en verre dont la tige est
prolongée par un tuyau de caoutchouc terminé par un embout de
verre. Une pince spéciale, dite pince de Mohr, placée au niveau
du tuyau permet de régler le débit.
- D'un répartiteur automatique, sorte de pompe aspirante
et refoulante qui, après réglage préalable, distribue
à un rythme régulier le volume désiré.
g) Stérilisation La
stérilisation est effectuée le plus souvent à l'autoclave
à 115 - 120 °C pendant 20min.
h) Après la stérilisation
Certains milieux gélosés doivent être mis
à refroidir en position inclinée de façon à obtenir
une pente après solidification.
> Poser dans ce cas le haut du tube encore chaud sur une
longue baguette de verre de gros
diamètre en veillant à ce que
le milieu gélosé n'arrive pas à plus de 2 à 3 cm du
bouchon.
> Les tubes de milieux de culture sont stockés en
position verticale dans un endroit frais et obscur.
· Voici quelques milieux de cultures utilisés le
plus souvent dans le laboratoire de bactériologie du C.H.U. de SBA :
· :. GELOSE CHAPMAN
Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, surtout
utilisé en microbiologie médicale, permettant la croissance des
germes halophiles. Parmi ces germes figurent au premier rang
les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les
Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de
rares bactéries à Gram négatif.
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La composition d'un milieu Chapman, en grammes par litre d'eau
distillée, est la suivante :
PRODUITS
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QUANTITE
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Peptones
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11.0 g
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Extrait de viande
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1.0 g
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Chlorure de sodium
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75 g
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mannitol
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10.0 g
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Rouge de phénol
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0.025 g
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agar
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15 g
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Eau distillée (qsp)
|
1000 ml
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Rouge de phénol
- Principe du milieu Chapman
Ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en
chlorure de sodium (75 g.L-1), ce qui permet un isolement
sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes
concentrations en NaCl.
On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au
jaune de l'indicateur coloré, le rouge de phénol, autour des
colonies.
- Technique
L'ensemencement doit être massif, en stries serrées
ou par inondation.
Ne pas sécher le milieu à l'étuve avant
l'ensemencement : la dessiccation du milieu pourrait entraîner une
augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop
inhibiteur.
- Lecture
L'utilisation du mannitol se traduira par
une acidification du milieu, provoquant le virage au jaune de l'indicateur de
pH. (Les colonies staph+ sont entourées d'une
auréole jaune).
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L'utilisation du mannitol est un
caractère discriminatif important dans le genre staphylococcus,
staphylococcus aureus étant mannitol+.
Ne pas confondre entre la pigmentation des colonies et le virage
de l'indicateur coloré, ainsi des colonies pigmentées en jaunes
et mannitol+ : forte suspicion de staph aureus.
NB : Le milieu Chapman permet la sélection des
staphylococcus et une orientation pour l'identification de
l'espèce S. aureus. Mais il s'agit que d'un test de
présomption et une confirmation par des tests plus spécifiques
(Coagulase, ADNase...) reste obligatoire.
·:. MILIEU MAC CONKEY
Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles
Gram- Salmonella et Shigella ainsi que des
bactéries coliformes dans les eaux, les produits alimentaires, les
produits pharmaceutiques et biologiques.
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La composition d'un milieu Mac Conkey en g/L d'eau
distillée avec un PH=7.1, est la suivante :
PRODUITS
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QUANTITE
|
Peptones
|
20
|
Lactose
|
10
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Sels Biliaires
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1.5
|
Cristal Violet
|
0.001
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Rouge Neutre
|
0.05
|
Chlorure De Sodium
|
5
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Agar
|
15
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Rouge neutre
- Principe du milieu Mac Conkey
Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore
Gram+, les sels biliaires et le cristal violet et un
critère de différenciation, le lactose dont l'utilisation est
révélé par l'indicateur coloré du milieu, le rouge
neutre. Il vire au rouge en milieu acide.
Si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le
milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du fait de l'acidification du
milieu.
- Ensemencement
> L'isolement se fait par la méthode des cadrans. >
Incuber 18 à 24 h à 37 °C.
- Lecture
Les Colonies rouges entourées d'un hâlo opaque de
la même couleur du à la précipitation des sels biliaires:
Lactose+ , et les Colonies jaunes ou
incolores : Lactose-
·:. GELOSE SS
La gélose SS est la gélose
Salmonella-Shigella qui est le milieu sélectif permettant
l'isolement d'entérobactéries pathogènes. Il est
très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les
selles et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car
trop sélectif.
Aspect du milieu avant
utilisation
|
Mode
d'ensemencement
|
Sélectivité / composition
|
Caractères
recherchés
|
Résultats
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|
- Isolement par la
méthode des cadrans.
- Incuber 18 à 24 h à
37°C.
|
-Le milieu contient
3 inhibiteurs : sels
biliaires,
vert
brillant, forte
concentration en
citrate de sodium
|
- Le milieu
contient du
lactose
pouvant
être
fermenté.
|
- colonies
rouges : lactose+
- colonies
incolores :
lactose-
- colonies à
|
|
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Mode d'ensemen-
cement
|
Sélectivité /
composition
|
Caractères
recherchés
|
Résultats
|
Isolement
18 à 24 h à 37°C
|
- Non selectif
- Dépourvu en
électrolyte
- Bromocrésol
pourpre
|
Espèces
n'appartenant
pas
aux
entérobactéries
Fermentation
du lactose
|
- Colonies bleues :
bactéries
lactose -
- Colonies jaunes :
bactéries lactose +
|
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- Ceux-ci empêchent la
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centre noir :
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pousser de toutes bactéries
|
|
H2S +
|
|
|
Gram+, et rendent
difficile la
croissance des
bactéries Gram-
autres
que Salmonella et
|
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Shigella.
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·:. MILIEU BCP
C'est un milieu utilisé pour la détection et
l'isolement des entérobacteriacées dans l'eau, les produits
alimentaires, l'urine et les selles
Ce milieu facilite la différenciation des colonies par
le caractère lactose. Il inhibe l'envahissement de la surface de la
boite par des nappes de Proteus car il ne contient pas d'électrolytes.
C'est un milieu non sélectif qui est utilisé
pour l'isolement de nombreuses espèces n'appartenant pas aux
entérobactéries.
C'est un milieu contenant une base nutritive ordinaire
permettant la pousser des bactéries non exigeantes. Il contient un
critère de différenciation : la fermentation du lactose
révélée par le virage en milieu acide de l'indicateur
coloré de pH, le bromocrésol pourpre.
Aspect du milieu avant
utilisation
Aspect du milieu
après
utilisation
·:. GELOSE AU SANG
C'est un milieu d'isolement enrichi sur lequel les
Streptocoques se développent bien. Il permet, la lecture du
caractère hémolytique. C'est un milieu riche
d'autant plus par la présence de sang.
Aspect du milieu avant utilisation
Aspect du milieu après utilisation
Mode d'ensemencement
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Caractères
recherchés
|
Résultats
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Isolement
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Hémolyse
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- Hémolyse â : zone
claire
d'hémolyse totale de
|
18 à 24 h à 37°C
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diamètre 3-4 mm entourant les colonies.
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- Hémolyse á : zone floue et
granuleuse, verdâtre de 1 à 2 mm de diamètre
|
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