Hépatite virale B: intérêt de l'utilisation des échantillons de sang séché dans l'extraction de l'ADN viral

ANNEXES

Annexe1 

FICHE D'ENQUETE

Numéro de la fiche :...............

1. Données épidémiologiques

Noms :.............................................Prénoms :..............................

Date de naissance :........................... Sexe : Masculin Féminin

Nationalité : congolaise Autres

Si autre Préciser :........................

Statut socio-économique :

Fonctionnaire Ouvrier Etudiant/élève Sans emploi Autre 

Si autres Préciser :....................

Adresse :................................. Téléphone :............................

Facteurs de risque :

Sexuel Toxicomane Transfusion  Transmission mère-enfant

Autre  Si autre Préciser :................................

2. Antécédents

Ictère : Oui Non

Vaccination contre l'hépatite B : Oui Non

3. Coïnfection : VIH VHD VHC Aucune

4. Marqueurs viraux

	Valeur	Date de réalisation
Ag HBs
Ag HBe
Ac anti HBs
Ac anti HBe

5. ADN TOTAL

Date	Techniques	Valeur

6. ADN VIRAL

Positif Négatif Inhibiteurs

Annexe 2 

PROTOCOLE DE DOSAGE DE L'Ag HBs PAR LE KIT MONOLISA HBs Ag Ultra

1. Matériel nécessaire

· Eau distillée ;

· Hypochloride de sodium (Eau de javel) et bicarbonate de soude ;

· Pipettes automatiques ou semi automatiques réglables ou fixes, pouvant distribuer 50 ul, 100 ul, 1000 ul et 10ml ;

· Eprouvettes graduées de 100 ml et 1000 ml ;

· Conteneur de déchets contaminés ;

· Bain-marie ou incubateur sec pouvant être thermostable à 37°C#177;1°C ;

· Système de lavage automatique ou semi automatique pour microplaque ;

· Appareil de lecture pour microplaque équipé de filtres 450, 490 et 620-700nm,

· Papier absorbant.

2. Préparation des réactifs

2.1. Réactifs prêts à l'emploi

· Réactif 1 (R1) : Microplaque

· Réactif 3 (R3) : Contrôle négatif

· Réactif 4 (R4) : Contrôle positif

· Réactif 10 (R10) : Solution d'arrêt

2.2. Réactifs à reconstituer

· Réactif 2 (R2) : solution de lavage (concentration 20x) : diluer au 1/20^e la solution de lavage dans l'eau distillée. Préparer 800ml pour une microplaque de 12 barrettes.

· Conjugué (R6+R7) : Taper doucement le flacon du conjugué lyophilisé R7 sur la paillasse pour détacher toute substance pouvant adhérer au bouchon de caoutchouc. Ouvrir le flacon et y transvaser le contenu d'un flacon de diluant pour conjugué R6. Reboucher et laisser reposer 10 minutes en homogénéisant de temps en temps pour faciliter la dissolution.

· Solution de révélation enzymatique (R8+R9) : Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11^e (exemple : 1ml de réactif R9 dans 10ml de réactif R8). Cette solution reste stable 6 heures à l'obscurité. Homogénéiser.

3. Mode opératoire

· Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons

· Préparer la solution de lavage R2

· Préparer la solution du conjugué R6

· Sortir de l'emballage protecteur le cadre support et le nombre de barrettes nécessaires (R1).

· Distribuer dans les cupules dans l'ordre suivant :

Ø Cupules A1, B1, C1 et D1 : 100 ul de contrôle négatif (R3)

Ø Cupule E1 : 100 ul de contrôle positif (R4)

Ø Cupule F1 : 100 ul de l'échantillon témoin pour la validation du dépôt des échantillons et du conjugué.

Ø Cupules G1, H1,... : 100 ul d'échantillons à tester.

· Secouer la solution du conjugué avant l'utilisation. Homogénéiser. Distribuer rapidement 50 ul de la solution reconstituée de conjugué R6+R7 dans toutes les cupules. Homogénéiser le mélange réactionnel

· Recouvrir d'un film adhésif et incuber pendant 1 heure et 30 minutes à 37#177;1°C.

· Retirer le film adhésif, aspirer le contenu de chaque cupule et laver au moins 5 fois. Veillez à ce que le volume résiduel n'excède pas 10 ul (éventuellement, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant).

· Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 ul de la solution de révélation de l'activité enzymatique (R8+R9). Laisser la réaction se développer è l'obscurité pendant 30 #177; 5 minutes à température ambiante (18 à 30°C). lors de cette incubation ne pas utiliser de film adhésif.

· Ajouter 100 ul de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation. Homogénéiser le mélange réactionnel.

· Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt avant la lecture et dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

· S'assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d'identification des plaques et des échantillons.

UNIVERSITE MARIEN NGOUABI --------------------------------- FACULTE DES SCIENCES DE LA SANTE ----------------------------------

REPUBLIQUE DU CONGO Unité* Travail* Progrès -------------------

251673600

Année académique : 2007-2008 N° d'ordre : 783

THESE

POUR L'OBTENTION DU DOCTORAT EN MEDECINE

(DIPLÔME D'ETAT)

THEME:

HEPATITE VIRALE B:

INTERET DE L'UTILISATION DES ECHANTILLONS DE SANG SECHE DANS L'EXTRACTION DE L'ADN VIRAL.

Impétrant : Séraphin NYENYELI TWAGIRIMANA

Vu, bon pour soutenir Vu, bon pour imprimer

Le directeur de Thèse Le Doyen

Professeur Jean-Rosaire IBARA Professeur Ange Antoine ABENA