3.3.5 Analyse Statistique :
Les analyses statistiques ont été
réalisées à l'aide du programme informatique « MODDE
9.1 ». Ce dernier a permis d'établir le plan factoriel et
d'évaluer les effets de chaque paramètre
représenté.
4. Résultats et discussion
Les résultats sont séparés en deux grands
groupes :
28
- La première partie porte essentiellement sur la
préparation de l'échantillon. Elle aborde certains points,
notamment l'influence du type de broyage, de l'ajout d'un solvant ou de l'effet
« Salting-out ».
- La seconde partie s'axe essentiellement sur l'optimisation
des paramètres de l'appareillage «Headspace ». Dans
cette partie, les différents paramètres du « Headspace
» sont étudiés à l'aide d'un plan factoriel afin
de voir l'impact qu'a chacun d'eux sur les analyses. Les valeurs optimales sont
également déterminées pour les paramètres
influençant les résultats chromatographiques.
Pour l'entièreté des tests, le programme du GC
est resté le même comme décrit dans la section «
Matériel et méthodes » ; c'est pourquoi seuls les
paramètres du « Headspace » seront
précisés pour chacune des analyses.
4.1 Optimisation de la préparation de
l'échantillon
Les valeurs initiales des paramètres du «
Headspace » sont reprises ci-dessous (voir tableau 3).
|
Temps (min)
|
|
Equilibrage du vial
|
34
|
|
Pressurisation
|
1
|
|
Remplissage de la boucle
|
0,1
|
|
Equilibration de la boucle
|
0,05
|
|
Injection
|
1
|
|
Cycle GC
|
33,75
|
|
Mélange
|
1
|
|
Température (°C)
|
|
Vial
|
90
|
|
Boucle
|
100
|
|
Ligne de transfert
|
110
|
|
Pression (PSI)
|
|
Vial
|
15,50
|
|
Gaz porteur
|
21,3
|
Tableau 3 : Valeurs initiales des
paramètres du « Headspace ».
4.1.1 Comparaison des méthodes de broyage
L'échantillon a été broyé avant
chaque analyse afin d'obtenir une libération optimale des
composés volatils à partir de la poudre, rendue homogène.
Dans cette section, deux méthodes de broyages sont comparées ; le
broyage à l'aide d'un pilon et le cryobroyage. Une seule des
deux techniques sera sélectionnée pour la suite
des analyses.
Pour rappel, le cryobroyage permet d'obtenir une poudre d'une
fine granulométrie et d'une homogénéité
satisfaisante tout en préservant les composés instables et
fragiles présents dans la matière végétale (Anonyme
2012).
Afin d'évaluer l'éventuelle amélioration
que cette technique peut apporter à une analyse, une étude de
linéarité a été réalisée avec, d'une
part, la méthode de « cryobroyage » et, d'autre part, la
méthode classique avec broyage par pilon en verre. Pour chacune d'elles,
une série de 9 essais a été réalisée avec
trois groupes de masses différentes (3 essais par masse) à savoir
: 100, 200 et 300 mg. Les graphiques de l'aire de pics (en pA.s) en fonction de
la masse ont ensuite été tracés.
Sur ces graphiques, il apparaît clairement que l'aire
des pics évolue de manière nettement plus uniforme avec la
méthode du « cryobroyage » (figure 16 et 17).
60
50
Temps de rétention :
Surface du pic (pA.s)
40
30
20
R2 = 0.3287
R2 = 0.8786
10
R2 = 0.1971
0
R2 = 0.3133
1,191 1,379 4,263 13,624
29
0 50 100 150 200 250 300 350
Masse (mg)
Figure 16 : Linéarité de 4 pics
différents en fonction de la masse d'un échantillon d'Ocimum
centraliafricanum, broyage à l'aide d'une baguette en verre.
Températures « Headspace » : 90°C (vial) / 100
°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert), 3 essais par masse.
Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10
min, temps de pressurisation : 1,0 min
R2 = 0.9841
Temps de rétention :
1,191 1,379 4,263 13,624
R2 = 0.9033
R2 = 0.8621
R2 = 0.6467
|
Surface du pic (pA.s)
|
60 50 40 30 20 10 0
|
0 50 100 150 200 250 300 350
Masse (mg)
Figure 17 : Linéarité de 4 pics
différents en fonction de la masse d'un échantillon d'Ocimum
centraliafricanum à l'aide du cryobroyage. T° «
Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C
(ligne de transfert), 3 essais par masse. Pressurisation du vial : 15,5 PSI,
temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0
min
Les aires augmentent de manière nettement plus
linéaire, ce qui se traduit par des valeurs de « R2
» plus satisfaisantes (figure 18).
|
Valeur "R2"
|
1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0
|
|
pic 1,191 pic 1,379 pic 4,263 pic 13,624 pic 1,191 pic 1,379 pic
4,263 pic 13,624
|
30
pic
|
1,191
|
pic
1,379
|
pic
4,263
|
pic
13,624
|
pic
1,191
|
pic
1,379
|
pic
4,263
|
pic
13,624
|
Figure 18 : Valeurs des « R2
» obtenues pour chacune des deux méthodes de broyage et pour les 4
composés différents (3masses analysées en triplicate).
31
Le fait d'obtenir une poudre plus fine et plus homogène
permet donc une diffusion plus facile et moins aléatoire dans l'espace
de tête. Toutefois, il semble que l'aire du pic le plus retenu (avec le
T.R le plus élevé soit : 4,263 min) présente une valeur du
« R2 » encore faible soit : 0,6467.
Selon (Kolb and Ettre 2006), les composés
présentant un faible coefficient de partage ( qui implique une faible
affinité pour l'échantillon), sont les composés pour
lesquels l'augmentation du volume de l'échantillon aura un effet
significatif au niveau de l'aire du pic. A l'opposé des composés
caractérisés par une valeur élevée du coefficient
ne sont, eux, que peu ou pas influencé par la quantité
d'échantillon. Ceci confirme nos observations ; les composés les
plus volatils (avec les temps de rétention les plus faibles) varient
fortement avec le volume de l'échantillon à l'opposé des
composés présentant une faible volatilité.
4.1.2 Changement d'échantillon
Les prélèvements d'O. centraliafricanum
ayant été effectués il y a plusieurs mois, il est
fort probable que la teneur en composés volatils aie nettement
diminué au fil du temps. Les conditions de conservation n'étant
pas optimales, ceci explique peut-être la faible fréquence des
pics obtenus sur les chromatogrammes ainsi que leur faible intensité. La
solution serait peut-être de congeler les plantes directement
après leur prélèvement et de les conserver ainsi
jusqu'à l'étape de cryobroyage.
L'échantillon a donc été abandonné
et changé pour un basilic (O. basilicum) de la marque
Carrefour® qui a été séché et conservé
dans des conditions standardisées. Sur les chromatogrammes obtenus
(figure 19), l'intensité et le nombre de pics sont nettement plus
appréciables avec ce nouvel échantillon.
Signal (pA)
120
100
40
80
60
20
0
O. centraliafricanum
O. basilicum
32
0 5 10 15 20 25 30
Temps de rétention (min)
Figure 19 : Comparaison des chromatogrammes de
l'analyse d'Ocimum centraliafricanum et Ocimum basilicum
(Carrefour®). T° « Headspace » : 90°C
(vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert). Masse : 100 mg,
Cryobroyage. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la
boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min
| 
