Memoire Online - Caractérisation biochimique et applications potentielles des glucosidases et de la a-galactosidase du suc digestif de la larve de rhynchophorus palmarum (curculionidae)

Tépu6lique de Cote d'Ivoire
Vnion- Oiscipline-Travail
alinistere de l'cEnseignement Supérieur et
de la ~echerche Scienti#ique

GMACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE
RRYNCROPROHIS~ 11 111 LCURCULIONIDAEI

M. DIE Kolli M rconi', M itre de conferences linhforsite d'Abobe-Adl me Ex min tour

M. KOUAME Lucien P trice, M itre de conferences linhiersite dAbobe-AM me Directeur de Those

RESUME

La larve de Rhynchophorus palmarum possède dans son tube digestif une variété d'activités osidasiques. Les activités á-glucosidasique, â-glucosidasique et â-galactosidasique sont les plus élevées. Elles sont l'oeuvre de 3 enzymes : une á-glucosidase, une â-glucosidase et une â-galactosidase. Ces biocatalyseurs sont acides, mésophiles et monomériques. Ils sont stables à 37 °C pendant au moins 120 min dans le tampon acétate 100 mM pH 5 ou 5,6. La â-glucosidase a une grande affinité pour le cellobiose et serait aussi impliquée dans la digestion des cellodextrines issues de la dégradation de la cellulose. Elle a une spécificité stricte vis-à-vis du résidu glucosyle et de l'anomerie â. Cette enzyme a une activité transférasique élevée par rapport à celle de la â-galactosidase. En effet, ce biocatalyseur spécifique du résidu galactosyle dégrade les disaccharides et les oligosaccharides provenant de l'hydrolyse des hémicelluloses et possédant des liaisons â(1,3), â(1,4) et â(1,6). Quant à l'á-glucosidase, elle reconnaît seulement le résidu glucosyle et est spécifique de la liaison osidique á(1-2) et á(1-4). C'est pourquoi, elle hydrolyse fortement le saccharose, le maltose et les oligosaccharides. Elle possède une activité transférasique supérieure à celles des sources enzymatiques conventionnelles.

Mots clés : larve, charançon, Rhynchophorus palmarum, á-glucosidase, âglucosidase, â-galactosidase, activité transférasique.

Ce travail a été réalisé en Côte d'Ivoire, à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé, dans le Laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments.

Je tiens à remercier le Professeur Patrice KOUAME, Doyen de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan), Directeur scientifique de ce travail, sans qui ce mémoire n'aurait jamais pu voir le jour. Il m'a fait bénéficier d'un cadre idéal de travail. Malgré ses nombreuses tâches universitaires, il n'a pas hésité à consacrer une partie de son temps à orienter et enrichir ce travail. Je dois dire que j'ai beaucoup appris auprès de lui. Qu'il trouve ici le témoignage de mon profond respect, de ma sincère admiration et de mon fidèle attachement;

Je remercie le Professeur AMANI N'guessan Georges, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour son appui à la recherche. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant de présider ce jury, malgré ses nombreuses occupations administratives et universitaires.

Je suis sensible à l'honneur que me fait le professeur DJE Koffi Marcellin, Président du conseil scientifique de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) en acceptant de faire partie de ce jury et l'assure de mes sincères remerciements. Sa présence dans ce jury montre une fois encore son amour pour le travail bien fait.

Je tiens à remercier le Professeur AKE Sévérin, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche Biosciences de l'Université de Cocody (Abidjan) pour sa contribution à l'amélioration de ce travail. C'est un réel plaisir pour moi de le retrouver comme membre de ce jury.

Je remercie le professeur Yao DATTE, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche Biosciences de l'Université de Cocody (Abidjan) pour la sollicitude qu'il m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être membre de ce jury.

Je remercie également le Professeur DJE Yao, Maître de conférences à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Nature et de l'Environnement de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour la sollicitude qu'il m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être rapporteur de cette thèse

Au Professeur Alphonse KAMENAN, Doyen honoraire de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) et Directeur du laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments, je lui exprime toute ma reconnaissance et ma gratitude pour tout ce qu'il a fait pour moi dans le cadre de ma formation universitaire.

Je voudrais remercier sincèrement du fond de mon coeur le Professeur Sébastien NIAMKE pour la sollicitude qu'il m'a témoigné.

Je n'oublie pas tous les enseignants-chercheurs et chercheurs de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé à qui je dis merci pour les encouragements et soutiens.

Je voudrais remercier également tous les membres de l'équipe "Biocatalyse" du Laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé qui ont participé activement à la réalisation de ce mémoire.

Mes vifs remerciements vont à toutes les personnes dont les compétences scientifiques et techniques m'ont aidé à réaliser ce travail.

Je te remercie pour la grande et solide confiance que tu as placée en moi. Aujourd'hui accepte cette thèse comme le couronnement de tous tes sacrifices.

Je te remercie infiniment pour les sacrifices énormes que tu as bien voulu consentir pour moi. Que le seigneur te garde longtemps en bonne santé sur cette terre. Ce travail n'est qu'un modeste témoignage de ton amour filial et de ma reconnaissance.

Je te dédie ce mémoire pour ton abnégation, ta patience et tes encouragements incessants. Ton soutien indéfectible m'a permis de réaliser ce travail dans les meilleures conditions. Je t'en suis reconnaissant. Je n'ai aucun mot pour traduire la profondeur de mes sentiments à ton égard.

1-2-Relation entre les glycosidases de mécanisme d'inversion de configuration anomérique hydrolysant les liaisons alpha et beta 10

1-3-Relation entre des alpha- et beta-glycosidases avec des mécanismes de configuration anomérique opposés . 10

2-5-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR 44
2-5-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

2-6-1- Détermination des poids moléculaires par gel filtration 45 2-6-2-Détermination des poids moléculaires par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS 46

I- RECHERCHE ET DETERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES D'HYDROLYSE DES GLYCOSIDASES DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 52

II-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE L'áGLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 60

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR 61
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur sur l'activité de transglucosylation .. 78
1-9-4-Influence de la concentration du donneur sur l'activité

III-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA â-GLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 86

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl-100 HR 86
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

1-9-2-Influence du temps d'incubation sur l'activité de transglucosylation 103

IV- PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA â-GALACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum .. 110

1-1-1-Chromatographie échangeuse d'anion sur gel de DEAE-Sepharose CL 6B 110 1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium 110

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl-100 HR 110
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

Figure 2 : Mécanisme d'inversion de configuration anomérique des glycosidases 9

Figure 3 : Mécanisme de rétention de configuration anomérique des glycosidases 9

Figure 4 : Similarités mécanistiques chez diverses familles de glycosidases . .. 11

Figure 5 : Similarités dans l'orientation des liaisons dans des enzymes de mécanismes opposés 11
Figure 6 : Structure tridimensionnelle de l'endocellulase (famille 5 des glycosidases) de

Thermus caldophilus (A) et de son site actif (B) liant le cellotétraose . 15
Figure 7 : Comparaison entre la structure d'une endoglucanase et celle d'une cellobiohydrolase de la famille GH7 21

Figure 9 : Activités á-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum 53

Figure 10 : Activités â-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus

Figure 11 : Activités endo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires du tube digestif et du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 55

Figure 12 : Profil chromatographique d'échange d'anion de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B 62

Figure 13 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 62

Figure 14 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B 63

Figure 15 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum. .... 65

Figure 16 : Détermination du pH optimum d'hydrolyse de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 67

Figure 17 : Stabilité au pH de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 67

Figure 18 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de l'a-glucosidase

Figure 19 : Inactivation thermique de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum à 37°C et à 45°C 69

Figure 20 : Dénaturation thermique de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 70

Figure 21 : Effet de la congélation sur de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de 70 Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à pH5,6 .

Figure 22 : Influence du pH sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'aglucosidase du suc digestif de la lave de Rhynchophorus palmarum . 79

Figure 23 : Influence du temps d'incubation sur les réactions de transglucosylation catalysées par l' a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus 79 palmarum

Figure 24 : Influence de la concentration de l'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 80

Figure 25 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase de suc digestif de la larve de 80
Rhynchophorus palmarum

Figure 26 : Profil chromatographique d'échange d'anion de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL 6B 87

Figure 27 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl-100 HR 87

Figure 28 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B . 88

Figure 29 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de la béta-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 90

Figure 30 : Déterminations du pH optimum d'hydrolyse de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 92

Figure 31 : Stabilité au pH de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 92

Figure 32 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de la â-glucosidase

Figure 33 : Inactivation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 94

Figure 34 : Dénaturation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 95

Figure 36 : Influence du pH sur la réaction de transglucosylation catalysée par la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 104

Figure 37 : Influence du temps d'incubation sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 104

Figure 38 : Influence de la concentration de l'accepteur (2-phényléthanol) sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 105

Figure 39 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle (cellobiose) sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 105

Figure 40 : Profil chromatographique d'échange d'anion de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B 111

Figure 41 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 111

Figure 42 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B 112

Figure 43 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de âmercaptoéthanol de â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 114

Figure 44 : Détermination du pH optimum d'hydrolyse de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 116

Figure 45 : Stabilité au pH de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 116

Figure 46 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de la â-galactosidase

Figure 47 : Inactivation thermique de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum à 37 °C et à 55 °C . . 118

Figure 48 : Dénaturation thermique de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 119

Figure 49 : Effet de la congélation de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à pH5,0 . 119

Figure 50 : Influence du pH sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-

galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum ... 128

Figure 51 : Influence du temps d'incubation sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 128

Figure 52 : Influence de la concentration de l'accepteur sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . . 129

Figure 53 : Influence de la concentration du donneur de galactosyle (lactose) sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 129

Tableau 1 : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases rangées en clans 16

Tableau 2 : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases non rangées en clans . 17

Tableau 4 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités a-exoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . .. 55

Tableau 5 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités â-exoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . .. 56

Tableau 6 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités endoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . 56

Tableau 7 : Bilan global de la purification de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 63

Tableau 8 : Poids moléculaires de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum . 65

Tableau 9 : Quelques propriétés physiques de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 71

Tableau 10 : Activité de l'a-glucosidase sur les p-nitrophényl-glycosides 73

Tableau 11 : Spécificité de substrat de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur les oligosaccharides et les polysaccharides ..... 74

Tableau 12 : Quelques paramètres cinétiques de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 76

Tableau 13 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de l'a-glucosidase du

Tableau 14 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 81

Tableau 15 : Bilan global de purification de la â-glucosidase du suc digestif de la larve

Tableau 16 : Poids moléculaires de la â-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum . 90

Tableau 17 : Quelques propriétés physiques de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 96

Tableau 18 : Activité de la â-glucosidase sur les p-nitrophényl-D-glycosides .. 98

Tableau 19 : Spécificité de substrat (oligosaccharides et polysaccharides) de la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 98

Tableau 20 : Quelques paramètres cinétiques de la â-glucosidase du suc digestif de la

Tableau 21 : Effet de quelques agents chimiques sur la â-glucosidase du suc digestif

Tableau 22 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation catalysées par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 106

Tableau 23 : Bilan global de la purification de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 112

Tableau 24 : Poids moléculaires et sous-unité de la â-galactosidase du suc digestif de

Tableau 25 : Quelques propriétés physiques de la â-galactosidase du suc digestif de la

Tableau 26 : Activité de la â-galactosidase sur les p-nitrophényl-D-glycosides 122

Tableau 27 : Spécificité de substrat (oligosaccharides et polysaccharides) de la â-

Tableau 28 : Quelques paramètres cinétiques de â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 124

Tableau 29 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de la â-galactosidase du

Tableau 30 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transgalactosylation catalysées par la â-galactosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 130

INTRODUCTION

Les glycosidases sont des biocatalyseurs de réactions biochimiques au sein des organismes vivants. Elles sont utilisées en biotechnologie pour catalyser les réactions de dépolymérisation des macromolécules et de synthèse à cause de leur spécificité et de leur efficacité (Potus et Drapon, 1997). Les glycosidases thermophiles et/ou thermostables sont devenues des enzymes pouvant donner une nouvelle dimension à la biocatalyse. Ainsi, leur utilisation a permis de réduire le risque de contamination en industrie laitière, notamment lors de la dégradation du lactose, et en alimentation animale au cours de l'hydrolyse des fibres (Bauer et al., 1996). En effet, une catalyse à haute température permet de détruire les microorganismes présents dans ces aliments. En industrie papetière, les xylanases thermophiles de Thermotoga sont utilisées pour hydrolyser le xylane afin de permettre la libération du tanin et de la lignine responsables de la coloration du papier. L'intervention de ces enzymes va donc permettre d'éviter l'emploi de l'acide chlorhydrique dans le blanchiment du papier et par conséquent d'éviter la pollution de l'environnement (Saul et al., 1995 ; Chen et al., 1997). Les enzymes thermophiles sont utilisées pour réduire la viscosité des polymères naturels. L'hémicellulase de T. neapolitina est capable de diminuer la viscosité d'une solution de galactomanane. Elles sont aussi utilisées dans la clarification des jus de fruits (Bauer et al., 1996). Ces glycosidases sont donc très importantes en biotechnologie. Mais, la plupart d'entre elles, distribuées dans le commerce, ne sont pas très stables et possèdent de larges spécificités.

La réaction de transglycosylation est une réaction de synthèse au cours de laquelle un ou plusieurs monomère(s) d'un substrat (donneur) est (sont) transféré (s) sur une molécule nucléophile (acceptrice) pour synthétiser un néoglycosyle conjugué (néoglycoconjugué). Elle peut se faire par divers procédés. Il y a :

-les procédés chimiques qui exigent des dispositions rigoureuses de protection et de déprotection (Kohki et al., 1995) ;

-la méthode chimio-enzymatique qui parait être le meilleur procédé car elle permet l'élimination des inconvénients dûs aux procédés chimiques et d'augmenter la quantité des substances néoformées (néoglycoconjugués);

-enfin, l'approche enzymatique qui est de plus en plus valorisée (Toone et al., 1989 ; Cote et Tao, 1990 ; Ishikawa et al., 1993) car elle permet de remédier à tous les problèmes

causés par les méthodes chimiques. Elle a consisté d'abord en l'utilisation de glycosyltranférases qui catalysent les transferts régiospécifiques et stéréospécifiques d'un monosaccharide à partir d'un substrat donneur (nucléotide glycosyle) vers un substrat accepteur. Contrairement à certaines enzymes, l'action des transférases est moins dépendante des conditions de la réaction. La spécificité et la sélectivité pour le substrat accepteur et les hauts rendements sont aussi des avantages pour ces catalyseurs. De telles applications nécessitent l'utilisation de substrats abondants et peu coûteux tels que le saccharose et l'amidon. Cependant, les glycosyltransférases qui peuvent utiliser les sucres simples comme donneurs sont limitées et il existe seulement quelques glycosyltransférases commerciales actuellement disponibles (Playne et Crittenden, 1996). Pour éviter ces problèmes, les glycosidases sont souvent préférées aux glycosyltransférases car, en plus de leur activité hydrolytique réversible, elles catalysent des réactions de transfert de glycosyles à des accepteurs autre que l'eau. Les avantages techniques de ces enzymes sont multiples. Elles savent comme les autres enzymes reconnaître les formes énantiomériques de molécules complexes et permettent de mettre au point de nouvelles voies de synthèse chirale industriellement compétitives (Cote et Tao, 1990 ; Ishikawa et al., 1993). Leur régiosélectivité permet également de supprimer de nombreuses étapes de protection/déprotection requises par les procédés chimiques. Le gain de productivité et de qualité est considérable, de même que la réduction des quantités de produits secondaires et de déchets, souvent toxiques, qu'il faut finalement éliminer à grands frais. Grâce à leur chémo-, régio- et énantio-spécificité, les enzymes donnent la possibilité d'améliorer à la fois la productivité, le bilan énergétique environnemental (Salvatore et al., 2001). C'est pourquoi, ces dernières années, la biocatalyse s'est vue totalement modernisée par des techniques sophistiquées de « criblage » et d'évolution dirigée des protéines. Celles-ci permettent de modifier les enzymes naturelles, dont les ressources sont extrêmement diverses, de manière à les adapter très précisément aux procédés industriels. En chimie industrielle, une croissance accélérée de la biocatalyse est observée, tout particulièrement dans des domaines comme la synthèse de produits pour la pharmacie (Ajisaka et al., 1987) et pour la cosmétique (Baldo et Roger, 2002). Aussi, ces enzymes sont-elles largement utilisées pour les préparations d'une grande variété de transglycosides. Dans la lutte contre le diabète, la recherche d'inhibiteurs de l'á-glucosidase représente une nouvelle approche dans la thérapeutique de cette maladie. Ainsi, en inhibant de façon compétitive et réversible les á-glucosidases intestinales, l'acarbose synthétisé réduit l'absorption digestive des carbohydrates (Hilmar, 1995). L'acarbose a donc la possibilité de ralentir ou de prévenir la survenue des complications

diabétiques. Ajisaka et al. (1987) ont synthétisé à partir du D-fructose à l'aide de la â-Dgalactosidase de la bactérie Escherichia coli, l'allolactose et le lactulose. Le lactulose est un disaccharide utilisé dans le traitement d'encéphalopathies, de la constipation et des salmonelloses. La galatosylation du D-xylose par une â-D-galactosidase donne un mélange de disaccharides â(1-4), â(1-3), â(1-2)-galactosyl-xylose (Aragon et al., 1996). Ces produits peuvent être utilisés pour l'évaluation de l'activité de la lactase intestinale in vitro, ce qui donne lieu à une nouvelle méthode de diagnostic de déficience en lactase. De plus, il est important de noter que ce procédé enzymatique est moins cher et moins risqué qu'une synthèse chimique de galacto-oligosaccharides impliquant sept étapes réactionnelles (RiveraSagredo et al., 1992). Malgré ces avantages, les rendements obtenus restent toujours faibles en milieu aqueux puisque les réactions catalysées par les glycosidases se déroulent toujours dans le sens de l'hydrolyse. Pour améliorer l'activité de transglycosylation des glycosidases, des dispositifs expérimentaux peuvent être envisagés comme par exemple, l'utilisation des systèmes réactionnels constitués de milieux aqueux-organiques (Finch et Yoon, 1997 ; Becker et Khul, 1999) comportant des concentrations élevées de l'accepteur de glycosyles autre que l'eau (Vulfson et al., 1990). L'utilisation des solvants organiques non aqueux n'ayant aucun effet de dénaturation sur l'enzyme permet d'améliorer le rendement de la transglycosylation. Par ailleurs, les rendements dépendent aussi de la nature et de l'origine de l'enzyme utilisée (Leparoux et al., 1994 ; Yoon et Ajisaka, 1996).

L'objectif général de ce travail a été de rechercher une nouvelle source originale de glycosidases avec des activités de transglycosylation élevées, une spécificité très stricte du résidu glycosyle douée d'une bonne stabilité. La source enzymatique retenue pour ce travail est la larve de Rhynchophorus palmarum. En effet, à cause de son équipement enzymatique, la larve de cet insecte est capable d'infester et de détruire rapidement le palmier Elaeis guineensis (Weissling et al., 1994). Les objectifs spécifiques ont consisté à faire l'inventaire des activités glycosidasiques, à déterminer les conditions optimales d'hydrolyse, à purifier à homogénéité électrophorétique les enzymes responsables de fortes activités hydrolytiques, à caractériser et à évaluer les potentialités transglycosidasiques de ces glycosidases.

Chapitre 1

I-Généralités sur le charançon

Le cycle de vie du Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) se décompose en 4 étapes comprenant l'oeuf, la larve, la nymphe et l'imago (le charançon adulte). Les oeufs sont pondus (207 en moyenne) dans les palmes, les blessures de palme et à la base des palmiers morts, par la femelle. Les oeufs pondus durent environ 3 jours avant d'éclore. Les larves issues de l'éclosion commencent à s'alimenter du tissu de palme (Hagley, 1965). Les larves ont un appétit de plus en plus grand. Elles s'alimentent principalement dans le tissu mou entourant le méristème apical. Celles qui sont mûres émigrent à la périphérie de la tige ou des pétioles et préparent un cocon de fibres de palme. Les larves de charançon sont crémeuses et de couleur jaunâtre. Elles ont une tête ronde. Leur masse peut atteindre environ 6 g. Après s'être entourées de cocons, les larves passent de l'étape prépulpale à l'étape pulpale. Quelques semaines après, un adulte émerge de l'étape pulpale et peut immédiatement se débarrasser de son cocon ou attendre dans le cocon plusieurs jours avant l'émergence. Le cycle de vie entier, de l'oeuf jusqu'à l'adulte, dure environ 84 jours. Les adultes peuvent vivre jusqu'à 26 semaines (Weissling et al., 1994). Ils sont devenus ainsi des insectes adultes très actifs. Lorsqu'ils ne volent pas à la recherche d'une palme, ils se cachent entre les bases des feuilles et des tiges de palmes saines pour

conserver l'eau dans leur corps (Weissling et Giblin-Davis, 1993). A l'âge adulte, le charançon change de couleur. Il passe du noir plein presque totalement au rouge (Fig. 1).

3- Dommages causés

Les mâles de Rhynchophorus palmarum(Curculionidae) sont des vecteurs de la maladie de l'anneau rouge (Gerber et Giblin, 1990). Cette maladie a un impact économique sur la culture des palmiers en Amérique du Sud et du Centre. Les symptômes de l'infestation du palmier par le charançon sont généralement associés à un déclin des jeunes parties des palmiers. Les vieilles parties du palmier commencent à tomber dès le début de l'infestation et s'effondrent rapidement. Quand l'infestation progresse, les dommages d'alimentation larvaire et la putréfaction associée sont si graves que l'intégrité de la couronne est compromise. La couronne du palmier finit par chuter. Cet état se nomme « cou sauté ». La détection de l'infestation par le charançon est tardive et le traitement aux premières heures de l'infestation peut être trop tardif pour sauver l'arbre (Weissling et al., 1994).

4-Equipement enzymatique de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Contrairement aux insectes tels que les termites Macrotermes belicosus (Matoub, 1993), M. subyalinus (Kouamé et al., 2006) et M. mulleri (Rouland, 1986), l'abeille Apis mellifera (Lee et al., 2001), la mouche Drosophilia melanogaster (Doane, 1969), la blatte Periplaneta americana (Kouamé et al., 2005a), etc., l'équipement enzymatique de la larve du Rhynchophorus palmarum n'a pas encore fait l'objet d'étude au moment où nous réalisons la présente recherche. Le palmier est une source important de carbohydrate au sein du quel se développe la larve de Rhynchophorus palmarum, les travaux de cette étude ont permis de faire pour la première fois un criblage des glycosidases de la larve de cet insecte.

Figure 1 : Cycle de vie du Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) (D'après Wattanapongsiri, 1966).

II-Glycosidases

Les glycosidases sont des enzymes qui hydrolysent les liaisons osidiques des glycosides afin de libérer le glucide et son substituant. Elles sont divisées en deux groupes :

Le mécanisme d'hydrolyse enzymatique des liaisons glycosidiques le plus commun s'opère par une catalyse au cours de laquelle une paire d'acide carboxylique intervient. Dans ce cas, un acide aminé joue le rôle du donneur de proton acide/base et l'autre agit en tant que base/nucléophile. Les glycosidases peuvent alors agir avec deux modes d'actions distincts proposés par Koshland et al. (1953). Il s'agit des mécanismes d'inversion (Fig. 2) et de rétention de configuration anomérique (Fig. 3). Ces deux mécanismes sont retrouvés majoritairement chez les glycosidases.

1-1-1-Inversion de configuration anomérique

Les enzymes qui libèrent un sucre de configuration opposée, agissent avec inversion de configuration anomérique (par simple substitution). Elles utilisent un mécanisme catalytique non-covalent pour exploiter la catalyse acido-basique générale.

Une molécule d'eau est activée par un acide carboxylique déprotonné (Asp ou Glu) de l'enzyme afin de générer un hydroxyle qui attaque le carbone anomérique. Selon ce mécanisme de type Sn2, il y a inversion de la configuration anomérique (Fig. 2) (Sinnott, 1990 ; Mccarter et Withers, 1994 ; Davies et Henrissat, 1995).

1-1-2-Rétention de configuration anomérique

Les enzymes agissant avec rétention de configuration anomérique, libèrent un produit dont la stéréochimie du carbone anomérique est la même que celle du substrat (après deux inversions successives). Dans ce cas, le nucléophile effectuant la première attaque sur le carbone anomérique est l'acide carboxylique déprotoné de l'enzyme (Asp ou Glu), formant un intermédiaire covalent. Par conséquent, le substituant du glucoside est relâché à cette première étape. Par la suite, un deuxième résidu acide active une molécule d'eau qui, en

attaquant le carbone anomérique, libère le glucide de l'enzyme. Deux étapes de type Sn2 se suivent donc, il y a rétention de la configuration du carbone anomérique (Fig. 3) (Sinnott, 1990 ; Mccarter et Withers, 1994 ; Davies et Henrissat, 1995).

1-1-3-Quelques cas particuliers

Il existe néanmoins quelques exemples de glycosidases possédant des mécanismes différents de ceux mentionnés ci-dessus. Il s'agit des cas particuliers où l'acide catalytique peut être remplacé par un phosphate inorganique. Différents groupes chimiques peuvent intervenir dans ce mécanisme et être à l'origine de la similarité de certaines glycosidases avec des enzymes présentant des activités apparemment très distinctes, comme par exemple : la maltose phosphorylase (EC 2.4.1.8, famille GH65), la sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7, famille GH13), ou la cellobiose phosphorylase (EC 2.4.1.20, famille GH94) (Vasella et al., 2002 ; Davies et al., 2003). Certaines glycosidases comme les myrosinases, les chitinases et les endoN-acétylglucosaminidases présentent un mécanisme moléculaire d'hydrolyse n'impliquant l'intervention que d'un seul acide aminé catalytique (Rye et Withers, 2000). D'autres impliquent des mécanismes d'oxydoréduction et/ou d'élimination (Yip et al., 2004).

Figure 2 : Mécanisme d'inversion de configuration anomérique des glycosidases (D'après Davies et Henrissat, 1995)

Figure 3 : Mécanisme de rétention de configuration anomérique des glycosidases (D'après Davies et Henrissat, 1995)

1-2-Relation entre les glycosidases de mécanisme d'inversion de configuration anomérique hydrolysant les liaisons alpha et beta

Au niveau moléculaire, les mécanismes d'inversion et de rétention de configuration anomérique font intervenir 4 états de transition possibles de type ion oxocarbonium (Vasella et al., 2002 ; Davies et al., 2003). Parmi les â-glycosidases de mécanisme de rétention de configuration anomérique, les conformères 4H3, ^2,5B et _B2,5 ont été observés respectivement chez les familles GH5 et GH7 (Sulzenbacher et al., 1996 ; Varrot et al., 2003), GH11 (Sabini et al., 1999) et enfin GH26 (Ducros et al., 2002). Pour les â-glycosidases de mécanisme d'inversion de configuration anomérique, c'est la transition en conformère de type 2,5B qui est observée chez les familles GH6, GH8 et GH48 (Guerin et al., 2002 ; Varrot et al., 2003). Chez les glycosidases agissant sur les liaisons â, ces complexes de Michaelis correspondent à des distorsions de la forme cyclique nécessaire pour amener la liaison glycosidique dans une position pseudo axiale (Stam et al., 2005). Cette orientation favorise une attaque nucléophile directe (Sulzenbacher et al., 1996). Il faut noter que de telles distorsions du cycle accompagnant la formation du complexe de Michaelis sont inutiles pour les glucoamylases et leurs homologues de la famille GH15 (Stam et al., 2005). En effet, la liaison glycosidique est déjà dans une position axiale facilitant l'attaque nucléophile (Aleshin et al., 1996). En fait, le mécanisme moléculaire d'inversion des glycosidases agissant sur des liaisons á- passe par une attaque nucléophile réalisée par une molécule d'eau (Stam et al., 2005). Cette molécule d'eau, préalablement activée par un résidu basique, va attaquer le carbone anomérique du glycoside non distordu, avec, dans le même temps, rupture de la liaison glycosidique axiale (Fig. 4) (Rye et Withers, 2000 ; Zechel et Withers, 2000 ; Vasella et al., 2002).

1-3-Relation entre des alpha- et beta-glycosidases avec des mécanismes de configuration anomérique opposés

Des similarités, telles que celles vues précédemment, nécessitent une distorsion du substrat dans le site actif d'une â-glycosidase, possédant un mécanisme d'inversion de configuration anomérique. Une telle distorsion place la liaison glucosidique dans une orientation axiale (Fig. 6) similaire à celle d'une liaison á dans le site actif d'une glycosidase avec un mécanisme d'inversion de configuration anomérique (Fig. 5) (Stam et al., 2005).

Figure 4 : Similarités des mécanismes chez diverses familles de glycosidases

(A) Mécanisme des GHs hydrolysant des liaisons á chez les familles GH15, GH37, GH63, GH78, GH92 et GH95. (B) Mécanisme des phosphorylases de la famille GH65. (C) Mécanisme des phosphorylases de la famille GH94 hydrolysant des liaisons â. (D) Mécanisme des enzymes des familles GH8, GH9 et GH48 hydrolysant des liaisons â (D'après Stam et al., 2005).

Figure 5 : Similarités dans l'orientation des liaisons dans des enzymes de mécanismes opposés

(A) Similarité entre l'étape de glycosylation des enzymes appartenant au clan GH-A et (B) le mécanisme à simple déplacement des â-amylases (D'après Stam et al., 2005).

Dans la nomenclature de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUB-MB) basée sur le type de réaction catalysée et la spécificité de substrat, les glycosidases possèdent un numéro du type EC 3.2.1.x. Les trois premiers chiffres indiquent qu'elles hydrolysent des liaisons O-glycosidiques, le dernier (x) est variable et dépend du substrat transformé (Placier, 1999). Cette classification systématique permet de nommer précisément la spécificité de substrat d'une enzyme et possède en outre, l'avantage de pouvoir classer rapidement une enzyme. Cependant, ce système ne tient pas compte des similarités de séquence protéique et donc de la structure tridimensionnelle. De plus, cette classification n'est pas systématique quant au mécanisme d'action des enzymes. Elle paraît mal adaptée aux glycosidases qui peuvent agir sur différents substrats et ne reflète pas les aspects structuraux des enzymes (Fourage, 2000). C'est notamment le cas de la â-glucosidase BglA, de Pyrococcus furiosus DSM 3638. Elle est annotée avec le numéro EC 3.2.1.21, on pourrait penser qu'elle n'a que cette activité, or elle montre des activités â-galactosidasique (EC 3.2.1.23) et â-xylosidasique (EC 3.2.1.37) (Kengen et al., 1993). Ou encore, il peut se trouver que deux numéros EC différents décrivent la même activité. C'est le cas des numéros EC 3.2.1.10 (oligo-1,6-glucosidase) et EC 3.2.1.70 (glucan 1,6-á-glucosidase). Sur le site de l'Enzyme Commission, la définition de ces deux activités est quasiment similaire. Ce qui est encore plus préoccupant, est le fait que plusieurs activités, qui sont pourtant connues depuis plusieurs années, n'ont aucun numéro EC associé, ou alors un numéro incomplet du type 3.2.1.-, où la spécificité n'est pas indiquée (Green et Karp, 2005). Ce fait révèle un manque de réactivité de l'Enzyme Commission face à la découverte de nouvelles activités. Devant cette situation, une autre classification a été proposée. Il s'agit de la classification structurale.

Les polysaccharides sont la principale forme de stockage de glucides, dont l'oxydation permet de récupérer de l'énergie. Ils entrent aussi dans la composition d'éléments de structures de la plupart des organismes : le peptidoglycane des bactéries, la carapace chitineuse des insectes, la paroi cellulaire des plantes, etc (Biely, 1985 ; Subramaniyan et Prema, 2000). Une hydrolyse sélective des liaisons glucosidiques est donc nécessaire pour récupérer l'énergie via différentes voies oxydatives et libérer des monomères pour construire

des parois cellulaires. Les enzymes qui modifient, créent ou lysent les liaisons glucosidiques des polysaccharides sont désignées sous le terme « Carbohydrate-Active Enzymes, ou CAZymes ». La diversité des carbohydrates entraîne donc une grande diversité chez les enzymes (glycosidases ou glycosides hydrolases, GH) dégradant les glucides par hydrolyse. Ces enzymes sont retrouvées chez des organismes provenant de tous les domaines : virus, bactéries, archéobactéries et eucaryotes, et sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques. Ces enzymes ont pendant leur évolution subi des mutations qui leur ont permis de se perfectionner et d'accroître leur spécificité de substrat et ainsi donner un avantage aux organismes qui les portent. De ce fait, les glycosidases couvrent un large panel de fonctions biologiques. Certaines enzymes des GHs présentent même des variations subtiles du mécanisme catalytique conduisant à des activités de type transglycosylase ou lyase, ce qui illustre l'extrême souplesse de leur reconnaissance de substrat et activité enzymatique (Stam, 2006). Les glycosidases sont les plus étudiées. Avec l'accumulation de séquences de ces enzymes, une nouvelle classification était incontournable car la diversité de propriétés et le comportement de certaines enzymes étaient inexplicables par rapport à la seule référence EC. Ces raisons ont amené Bernard Henrissat, à partir de 1989, à chercher une autre alternative pour classer ces enzymes selon des propriétés structurales qui leur sont propres. Il a donc créé une classification, basée sur la similarité de séquences en acides aminés, à partir d'analyses de clusters hydrophobes, ou `hydrophobic cluster analysis', HCA (Gaboriaud et al., 1987) de séquences protéiques de cellulases (Henrissat et al., 1989). Elle est basée sur la détection de segments structuraux constituant le coeur hydrophobe des protéines globulaires (Fig. 6). Grâce à cette approche, des similarités dans le repliement tridimensionnel peuvent être détectées entre des protéines possédant des identités de séquences très basses (< 20 %). Les séquences ayant une forte similarité entre elles ont été classées dans les mêmes familles. A l'origine, seules 6 familles de cellulases ont été créées et les informations étaient enregistrées sous un simple format tabulaire. En 1991, un effort a été fourni pour approfondir ce début de classification (Henrissat, 1991), car plusieurs des familles obtenues par similarité de séquence, présentaient des enzymes ayant des activités sur d'autres substrats que la cellulose (Stam, 2006). Cette classification diffère de la classification de l'IUB-MB par le fait que des enzymes de spécificité différente peuvent appartenir à la même famille. Elle permet de prendre en considération la structure tridimensionnelle ainsi que le mécanisme moléculaire d'action des glycosidases. Elles sont ainsi regroupées en familles (notées GH) en fonction des similarités dans leur séquence d'acides aminés. Certaines glycosidases sont multifonctionnelles. Elles contiennent des domaines catalytiques qui appartiennent à

différentes familles des glycosidases. Puisqu'il existe une relation directe entre similarités de séquence en acides aminés et similarités de repliement (Chothia et Lesk, 1986), il peut être admis que les membres d'une même famille possèdent des repliements similaires. Cette situation permet de prédire les structures tridimensionnelles générales des sites actifs des membres de chaque famille, si cette information est connue pour un ou plusieurs de ses représentants (Chothia et Lesk, 1986).

Le mécanisme d'action d'une enzyme étant dicté par la structure du site actif et par la position des différents groupes fonctionnels, le mécanisme et la stéréochimie de la réaction seront conservés dans une famille (exception faite de la famille GH4). Toutes les glycosidases agissent généralement par un mécanisme qui implique deux résidus importants. Chez ces enzymes, les acides aminés catalytiques sont le plus souvent des aspartates et/ou des glutamates (Tableaux I et II) (Davies et al., 1995).

Cet effort a abouti à la classification de 291 séquences en acides aminés en 35 familles de GHs différentes (Henrissat, 1991), dont plusieurs ont été déjà polyspécifiques. Cette courte liste de familles a été, par la suite, mise à jour plusieurs fois (Henrissat et Bairoch, 1993 ; Henrissat et Bairoch, 1996). A l'heure actuelle, 112 familles de glycosidases différentes sont répertoriées et peuvent être consultées sur internet ( http://afmb.cnrs-rs.fr/CAZY/org.html).

Par ailleurs, beaucoup de ces familles, présentant des similarités dans le repliement tridimensionnel des enzymes qu'elles contiennent, ont été regroupées pour former des clans ou super-familles (Henrissat et al., 1995). On dénombre actuellement 14 clans (Clan GH : Clan des GlycosylHydrolases) appelés A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M et N (Tableau I ). Quatre familles d'enzymes ont été supprimées, ce sont les familles 21, 40, 41 et 60. Certaines familles d'enzymes n'ont pas été rangées en clans ou dans des clans (Tableau II).

Des enzymes dont les structures ont été identifiées n'ont pas été à leur tour classées en familles. Réactualisée en permanence (Henrissat et Bairoch, 1993 ; Henrissat et al., 1996), la classification CAZy (Carbohydrate-Active enZymes) est maintenant étendue à d'autres classes d'enzymes actives sur les sucres qui sont les glycosyltransférases (91 familles), les polysaccharides lyases (18 familles), leurs modules non-catalytiques et les carbohydrates estérases (15 familles).

Figure 6 : Structure tridimensionnelle de l'endocellulase (famille 5 des glycosidases) de Thermus caldophilus (A) et de son site actif (B) liant le cellotétraose (D'après Kim et al., 2006)

Tableau I : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases rangées en clans

a = le premier groupement cité est le composé nucléophile/base, le second est celui du donneur de proton

Clan de glycosidases	Famille de glycosidases						Nombre de Mécanisme familles réactionnel		Acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique^a
GH-A	1, 2 , 5, 42, 50,	10, 51,	17, 53,	26, 59,	30, 35 72, 79,	39, 86.	17	rétention	Glu Glu
GH-B	7, 16						2	rétention	Glu Glu
GH-C	11, 12						2	rétention	Glu Glu
GH-D	27, 31,	36					3	rétention	Asp Asp
GH-E	33, 34,	83					3	rétention	Tyr+Glu non connu
GH-F	43, 62						2	inversion	non connu non connu
GH-G	37, 63						2	inversion	non connu non connu
GH-H	13, 70,	77					3	rétention	Asp Glu
GH-I	24, 46,	80					3	inversion	non connu ou Asp non connu ou Glu
GH-J	32, 68						2	rétention	Asp Glu
GH-K	18, 20,	85					3	rétention	oxygène carbonyle Glu
GH-L	15, 65						2	inversion	Glu ou phosphate Glu
GH-M	8, 48						2	inversion	Asp ou non connu Glu
GH-N	28, 49						2	inversion	Asp Asp

Tableau II : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases non rangées en clans

Les familles de protéines définies dans CAZy permettent d'avoir un certain pouvoir prédictif : le même repliement, le même mécanisme d'action, et les mêmes résidus catalytiques sont conservés à l'intérieur d'une même famille. Or depuis quelques années, l'équipe CAZy participe à des projets de séquençages de génomes, intervenant au niveau de l'identification et de l'annotation fonctionnelle des gènes de CAZymes (Stam, 2006).

Les centres de génomique sont conscients de l'accumulation d'erreurs et des limitations de la méthode « best BLAST hit ». Ils se tournent donc vers des équipes spécialisées capables d'apporter la meilleure annotation possible. Etant accessible en ligne depuis 8 ans, CAZy est devenue une des principales références en ce qui concerne les CAZymes. Bien que l'assignement d'une enzyme à une famille particulière permet de prédire plusieurs caractéristiques structurales et mécanistiques, il n'était pas toujours possible de fournir une prédiction précise sur la fonction de cette enzyme (Stam, 2006).

Pour répondre à ce problème et améliorer les procédures d'annotation de séquences génomiques, Stam et al. (2006) ont fourni un effort de division des familles de GHs en sousfamilles suivant l'idée communément acceptée que des enzymes possédant des séquences très similaires doivent partager des propriétés biochimiques très proches (Fig. 7). La famille GH 13, qui regroupe beaucoup de glycosidases a été subdivisée en 40 sous-familles (Tableau III) (Stam et al., 2006). Des á-amylases (EC 3.2.1.1) appartenant à cette même famille ont été rangées dans 13 sous familles qui sont GH13_1, GH13_2, GH13_5, GH13_6, GH13_7, GH13_15, GH13_19, GH13_24, GH13_27, GH13_28, GH13_32, GH13_36 et GH13_39. Quant aux á-glucosidases (EC 3.2.1.20), elles se retrouvent dans des sous familles différentes de celles des á-amylases. Il s'agit des sous-familles GH13_17, GH13_21, GH13_30 et GH13_40 (Tableau III).

Sous- familles	Numéros EC	Activités enzymatiques	Taxonomie
GH 13_1	3.2.1.1	á-amylase	Fungi
GH 13_2	3.2.1.1 2.4.1.19 3.2.1.133	á-amylase cyclodextrin glucanotransferase maltogenic á-amylase	Bacteria, Archaea
GH 13 _3	-	Activité inconnue	Bacteria, Archaea
GH 13_4	2.4.1.4 3.2.1.-	Amylosurase Sucrose hydrolase	Bacteria
GH 13_5	3.2.1.1	á-amylase	Bacteria, Eukaryota
GH 13_6	3.2.1.1	á-amylase	Bacteria, Viridiplantea
GH 13_7	3.2.1.1	á-amylase	Euryarchaeota
GH 13_8	2.4.1.8	1,4-á-glucan branching enzyme	Eukaryota, Bacteria
GH 13_9	2.4.1.8	1,4-á-glucan branching enzyme	Bacteria, Eukaryota, Archaea
GH 13_10	3.2.1.141	4-á-(1,4-á-glucano) trehalose trehalohydrolase	Bacteria, Archaea
GH 13_11	3.2.1.68	isoamylase	Bacteria, Archaea , Eukaryota
GH 13_12	3.2.1.41	pullulanase	Firmicutes
GH 13_13	3.2.1.41	pullulanase	Bacteria, Eukaryota
GH 13_14	3.2.1.41	pullulanase	Bacteria
GH 13_15	3.2.1.1	á-amylase	Metazoa, Bacteria
GH 13_16	5.4.99.16	malto á-glucosyltransférase	Bacteria, Archaea
GH 13_17	3.2.1.20	á-glucosidase	Metazoa
GH 13_18	2.4.1.7	sucrose phosphorylase	Bacteria
	3.2.1.1	á-amylase
GH 13_19	3.2.1.38	maltohexaose-forming á-amylase	Bacteria
	3.2.1.-	maltopentaose-forming á-amylase
	3.2.1.54	cyclomaltodextrinase
GH 13_20	3.2.1.133	maltogenic á-amylase	Bacteria
	3.2.1.135	neopullulanase
GH 13_21	3.2.1.20	á-glucosidase	Proteobacteria

Sous familles	Numéros EC	Activités enzymatiques	Taxonomie
			^Deinococcus- Thermus
GH13_22	2.4.1.183	a-1,3-glucan synthase	Fungi
GH13_23	nd	activité inconnue	Proteobacteria
GH13_24	3.2.1.1	a-amylase	Metazoa
GH13_25	3.2.1.33	amylo-a-1,6-glucvosidase	Eukaryota
GH13_26	5.4.99.15	(1,4)-a-glucan 1-a-glucosymutase	Bacteria, Archea, Eukaryota
GH13_27	3.2.1.1	a-amylase	Proteobacteria
GH13_28	3.2.1.1	a-amylase	Firmicutes, Actinobacteria
GH13_29	3.2.1.93	a-phosphotrehalase	Bacteria
GH13_30	3.2.1.20	a-glucosidase	Actinobacteria, Eukaryota
GH13_31	3.2.1.70 3.2.1.10	glucan1,6-a-glucosidase oligo-1.6-glucosidase	Bacteria
GH13_32	3.2.1.1	a-amylase	Bacteria
GH13_33	5.4.99.16	trehalose synthase	Bacteria
GH13_34		amino acid transproter	Eukaryota
GH13_35		amino acid transproter â-amylase	Eukaryota
GH13_36	3.2.1.1	a-amylase	Bacteria
GH13_37	nd	activité inconnue	Bacteria
GH13_38	nd	activité inconnue	Bacteria
GH13_39	3.2.1.1 3.2.1.41	a-amylase pullulanase	Bacteria
GH13_40	3.2.1.20	a-glucosidase	Eukaryota

Figure 7 : Comparaison entre la structure d'une endoglucanase et celle d'une cellobiohydrolase de la famille GH7. Structure d'une cellobiohydrolase (A), et d'une endoglucanase (B) de la famille GH7, représentative des sous-familles GH7_2 et GH7_1, respectivement (D'après Stam, 2006).

Les hélices á sont en violet, les feuillets â en jaune. La boucle supplémentaire présente chez les cellobiohydrolases est en rouge. Figure réalisée avec Rasmol (Sayle et Milner-White, 1995) à partir des structures PDB 1DYM et 7CEL 5

2-Réactions de synthèse

L'utilisation d'enzymes pour la synthèse de sucres complexes offre plusieurs avantages par rapport à la méthode chimique. Une catalyse très efficace peut être effectuée sans protection des groupements hydroxyles avec un large éventail possible de réactions régiospécifiques et stéréospécifiques. Ces réactions se faisant dans des conditions douces, les utilisations de solvants organiques et de produits chimiques dangereux peuvent être éliminées. La synthèse enzymatique d'oligosaccharides peut se faire à l'aide d'enzymes libres ou à l'aide d'enzymes immobilisées (Harju, 1987 ; Gekas et Lopez-Leiva, 1985). Il existe trois approches pour synthétiser des oligosaccharides à l'aide d'enzymes.

La première approche consiste à utiliser les glycosidases qui catalysent les réactions inverses de l'hydrolyse. Ces enzymes peuvent transférer la partie glycosylée d'un substrat à des accepteurs autres que l'eau. L'équilibre de la réaction favorise généralement l'hydrolyse. Pour accroître le rendement de synthèse des oses, diverses stratégies doivent donc être employées : une augmentation de la concentration du substrat, une diminution de l'eau ou une élimination du produit final. Par ce procédé, divers types d'oses ont été synthétisés. C'est le cas des gluco-oligosaccharides (Laroute et Willemot, 1992 ; Rastall et al., 1992 : Ajisaka et Fujimoto, 1990), des mannose-disaccharides (Johansson et al., 1986) et des galactooligosaccharides (Ajisaka et Fujimoto, 1990). Les inconvénients de l'utilisation des glycosidases dans la réaction de condensation entraînent un faible rendement de synthèse. Cette situation est causée par l'équilibre thermodynamique non favorable, l'obtention d'un mélange d'isomères difficiles à séparer, de longs temps de réaction et de hautes concentrations d'enzymes nécessaires à l'activité limitée des glycosidases dans des solutions concentrées de sucre (Monsan et al., 1989 ; Nilsson, 1988). Cependant, les glycosidases sont facilement disponibles et démontrent une excellente stabilité à la température.

La deuxième approche consiste en l'utilisation de glycosyltransférases qui catalysent les transferts régiospécifiques et stéréospécifiques d'un monosaccharide à partir d'un substrat donneur (nucléotide glycosyle) vers un substrat accepteur. Contrairement à certaines enzymes, l'action des transférases est moins dépendante des conditions de la réaction. La spécificité et la grande sélectivité pour le substrat accepteur et les hauts rendements sont aussi des avantages pour ces catalyseurs. De telles applications nécessitent l'utilisation de substrats abondants et peu coûteux tels que le saccharose et l'amidon. Cependant, les glycosyltransférases qui peuvent utiliser des sucres simples comme donneurs sont limitées et il n'existe seulement quelques glycosyltransférases commerciales actuellement disponibles.

La production industrielle enzymatique de cyclodextrines par la cyclodextrineglycosyltransférase (EC 2.4.1.19 ; CGTase) est un procédé actuellement utilisé qui fait appel à ce type de réaction. Les cyclodextrines sont particulièrement utilisées pour leur propriété stabilisante (Playne et Crittenden, 1996).

Enfin, la dernière approche utilise l'activité transférasique des glycosidases. Ces enzymes peuvent catalyser le transfert d'une partie chimique à un accepteur autre qu'une molécule d'eau. Le mécanisme de la réaction implique généralement une étape intermédiaire enzymesubstrat. L'efficacité de ce type de réaction peut être améliorée par plusieurs facteurs : l'utilisation d'une molécule acceptrice appropriée, l'augmentation de la concentration des donneurs et des accepteurs de glycosyles, la diminution de l'activité de l'eau et la récupération du produit final. Les glycosides ayant des aglycones aromatiques sont particulièrement utilisés comme donneurs de glycosyle à cause de leur haute réactivité (Fortun et Colas, 1991).

Les oligosaccharides naturels sont des composés de structures moléculaires diverses. Ils jouent des rôles biologiques variés tel que le processus de communication cellulaire en servant de site récepteur des bactéries et des particules virales. Les oligosaccharides des glycoprotéines sont aussi impliqués dans la stabilité des protéines et dans les mécanismes d'inversion tumorale (Wang et al., 1998).

Différents composés, suivant l'accepteur nucléophile utilisé, sont susceptibles d'être synthétisés par transglycosylation. Nunoura et al. (1996) ont montré que le fucosylglucose, synthétisé par transglycosylation, est un disaccharide exclusivement assimilé par les bifidobactéries. Il peut ainsi favoriser l'implantation de ces microorganismes dans la flore intestinale. Un autre oligosaccharide est l'objet de nombreuses études : Galá1-3Galâ1- 4GlcNAc. Ce trisaccharide est connu comme étant responsable du rejet hyper aigü de greffe lors de la transplantation d'un organe porcin à l'homme. En effet, environ 1 % des IgG humaines sont capables de reconnaître ce motif trisaccharidique. L'utilisation de gel d'affinité sur lequel se trouve greffé la partie terminale (Galá1-3Galâ) du trisaccharide pourra permettre de`'filtrer» le sang du receveur. Cette technique biologique est une approche pour diminuer le risque de rejet. Ce trisaccharide soluble est un excellent inhibiteur de la fixation des anticorps humains sur les cellules porcines. De nombreuses études en transglycosylation sont actuellement menées pour effectuer la synthèse de ce trisaccharide (Nilson, 1997).

Pour les réactions de transglycosylation, divers accepteurs de glycosyles sont utilisés. Les plus importants sont les alcools (Vanderjagt et al., 1994; Takegawa et al., 1993 ;

Kouamé, 2006), les sucres (Nilson et Scigelova, 1994 ), les acides aminés (Leparoux et al., 1994, 1996 ; Becker et Kuhl, 1999) et les nucléotides (Binder et al., 1995).

3-Propriétés de quelques glycosidases des insectes 3-1-Enzymes amylolytiques

3-1-1-Amylases

Trois enzymes sont capables de dégrader l'amidon et le glycogène. Il s'agit de l'áamylase, de la â-amylase et de la glucoamylase. L'á-amylase (EC 3.2.1.1) coupe la liaison osidique á (1?4) au hasard à l'intérieur de la chaîne á-glucane. Elle libère généralement de l'á-maltose et des á-maltodextrines limites. La â-amylase (EC 3.2.1.2) dégrade l'amidon ou le glycogène à partir de l'extrémité non réductrice pour donner essentiellement du â-maltose. Quant à la glucoamylase (EC 3.2.1.3), elle libère du glucose à partir de l'extrémité non réductrice de l'amidon et du glycogène. Ces différentes amylases peuvent être distinguées les unes des autres par l'identification de leurs produits d'hydrolyse (Robyt et French, 1967). Seule l'á-amylase a été mise en évidence chez les insectes. Les autres enzymes amylolytiques n'existent pas dans l'appareil digestif de ceux-ci. L'activité glucoamylasique mise en évidence la première fois chez les insectes par Terra et Jordão (1989) dans l'intestin moyen de la larve de Musca domestica a été par la suite révélée comme étant la résultante de l'action combinée d'une á-amylase et d'une á-glucosidase par les mêmes auteurs en 1991.

Les séquences en acides aminés des amylases des insectes Drosophila melanogaster (Boer et Hickey, 1986) et Tribolium castaneum (Hickey et al., 1987) sont connues. Elles ressemblent à celles des á-amylases déjà séquencées. Cette analogie structurale montre que ces enzymes proviendraient d'une même séquence ancestrale (Hickey et al., 1987). La plupart des amylases des insectes ont des masses moléculaires qui se situent entre 48 et 68 kDa (Baker, 1989, 1991 ; Kanekatsu, 1978). Les points isoélectriques sont acides et se situent entre 3,5 et 4. Les constantes de Michaelis et Menten déterminées lorsque l'amidon soluble est utilisé comme substrat ne dépassent pas 0,4 % (p /v). Les pH optima d'hydrolyse correspondent généralement aux pH des intestins moyens dans lesquels les amylases ont été isolées.

L'ion calcium active les amylases des insectes Sitophilus oryzae (Baker et Woo, 1985 ; Baker, 1987), S. granarius (Baker et Woo, 1985 ; Baker, 1987) et Rhyzopertha dominica

(Baker, 1991). Il reste cependant sans effet sur celles de Pheropsophus aequinoctialis (Ferreira et Terra, 1989), de Anagasta muehniella (Baker, 1989), de Erinnyis ello (Santos et Terra, 1985) et de Spodopera fugiperda (Ferreira et al., 1994). Cet ion peut affecter la thermostabilité de certaines amylases d'insectes. C'est le cas des amylases des espèces de Sitophilus (Baker, 1983) et de Bombyx mori (Kanekatsu, 1978). Il protège les amylases de Tenebrio molitor (Buonocore et al., 1976) et de Rhynchosciaria americana (Terra et al., 1977) contre l'inactivation thermique au cours de la dialyse contre le tampon. La plupart des amylases des insectes sont des enzymes calcium dépendantes (Thomas et al., 1971). La présence de chlorure et de certains anions dans le milieu réactionnel des amylases d'insectes entraîne un changement de pH optimum d'hydrolyse et des paramètres cinétiques de ces enzymes. Les premiers constats ont été faits chez les amylases des Hemiptera (Hori, 1972). Les ions chlorures augmentent 34 fois la vitesse maximale de la réaction mais n'affectent pas la constante de Michaelis-Menten de l'amylase de Rhynchosciaria americana. Ils entraînent un changement de pH optimum d'hydrolyse de cette enzyme passant de 6,8 à 8,0. Ce biocatalyseur est aussi activé par le bromure et le nitrate (Terra et al., 1977). Ce comportement cinétique est en accord avec celui des amylases des mammifères, ce qui suggère que ces enzymes ont des mécanismes d'action similaires qui se traduiraient par la modification de la conformation de l'enzyme suite au changement de l'état d'ionisation des résidus d'acides aminés impliqués dans la catalyse de ces enzymes. Ce changement induirait une augmentation des valeurs de pKa des groupes protonés, entraînant ainsi un changement du pH optimum d'hydrolyse de la réaction de l'enzyme et une augmentation de sa vitesse maximale (Wakim et al., 1969 ; Levitzki et Steer, 1974). D'autres exemples d'activation d'amylases d'insecte par les chlorures existent. C'est le cas des amylases de l'adulte de la larve de Phoracantha semipunctata (Weber et al., 1985) et de l'adulte de Drosophila melanogaster (Doane, 1969).

3-1-2-alpha-Glucosidases

Les á-glucosidases (EC 3.2.1.20) catalysent l'hydrolyse de la liaison glucosidique á (1-4) contenue dans les arylglucosides, les disaccharides et les oligosaccharides à partir de l'extrémité non réductrice. Elles sont généralement appelées maltases ou saccharases. En effet, une saccharase est une glycosidase qui hydrolyse le saccharose en glucose et fructose. Elle peut être donc une á-glucosidase ou une â-fructosidase. Le terme « saccharase » ne saurait désigner seulement l'á-glucosidase. Chez les champignons, la â-fructosidase est

appelée invertase. Ce terme est de nos jours utilisé pour désigner toutes les f3-fructosidases animales, végétales et microbiennes (Terra et Ferreira, 1994).

L'abeille adulte Apis mellifera contient dans son extrait brut enzymatique deux aglucosidases de masse moléculaires différentes (Huber et Mathison, 1976 ; Huber, 1975) tout comme l'adulte de la drosophile Drosophila melanogaster (Tanimura et al., 1979) et les larves de Saptotrigona bipunctata (Schumaker et al., 1993) et de Musca domestica (Terra et Jordão, 1989). Les masses moléculaires caractéristiques des deux á-glucosidases sont de 82 kDa et de 100 kDa. Celle de masse moléculaire de 82 kDa serait secrétée par les glandes hypopharingeales. Elle est fortement inhibée par le Tris et se retrouverait dans le miel (Huber et Mathison, 1976). Cette enzyme, dans l'estomac, convertit le saccharose du nectar en glucose et fructose (Barker et Lehner, 1972). Il s'agit d'une enzyme glycosylée dont le rapport acide aminé sucre est de 14 %. Les acides aminés constitutifs majeurs sont l'acide aspartique, le tryptophane et l'acide glutamique. Elle possède une activité transglucosidasique et une faible affinité pour le substrat chromogénique p-nitrophényl-a-D-glucopyranoside (Huber et Mathison, 1976). C'est une enzyme légèrement acide comme les a-glucosidases de Musca domestica (Terra et Jordão, 1989). Quant à l'a-glucosidase de masse moléculaire 100 kDa, elle présente quelques caractéristiques identiques à celles de masse moléculaire de 82 kDa. En effet, cette enzyme acide possède aussi une activité transglucosidasique. Elle est glycosylée et est inhibée par le Tris. Le rapport acide aminé sucre est de 5,4 %. Les acides aminés majeurs sont l'acide aspartique, l'alanine et la thréonine. Cette enzyme est localisée dans la partie abdominale de l'insecte (Huber, 1975). Son rôle physiologique est de dégrader les a-glucosides contenus dans l'intestin moyen comme les á-glucosidases de Drosophila melanogaster (Tanimura et al., 1979) et de Taumetapoea pityocampa (Pratviel-Sosa et al., 1987).

La membrane cellulaire de l'intestin moyen de l'insecte Dysdercus peruvianus contient une a-glucosidase glycosylée dont le pH optimum d'hydrolyse est de 5,0. L'enzyme présente des masses moléculaires très différentes selon les techniques de détermination. Les masses moléculaires déterminées sont de 61 kDa en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (conditions dénaturantes), de 120 kDa en gel filtration, de 30 kDa en ultracentrifugation et de 431 kDa en électrophorèse en conditions natives. Ces résultats suggèrent que cette a-glucosidase apparaît dimérique ou octamérique selon son milieu (Silva et Terra, 1995). Des comportements similaires ont été observés au niveau des a-glucosidases des intestins moyens de Erinnyis ello (Santos et Terra, 1986), de Pheropsophus acquinoctialis (Ferreira et Terra, 1989) et de Sitophilus zeamais (Baker, 1991). L'enzyme

est plus active sur le maltose que sur le saccharose. Elle n'hydrolyse pas le tréhalose. Cependant, elle préfère les maltodextrines de masses moléculaires inférieurs au maltotétraose (Silva et Terra, 1995). Ce comportement cinétique est contraire à ceux des á-glucosidases des insectes Sitophilus zeamais (Baker, 1991), Aedes aegypti (Marinotti et James, 1990) et Thaumetopoea pityocampa (Pratviel-Sosa et al., 1987). En effet, ces enzymes hydrolysent efficacement les maltooligosaccharides de masses moléculaires supérieurs à celui du maltopentose.

La larve de l'insecte Musca domestica contient trois á-glucosidases dont deux sont solubles et une liée à la membrane cellulaire de l'intestin moyen. Ces enzymes ont des pH optima très proches (6,3 ; 6,1 ; 6,6) et sont fortement inhibées par le Tris. Elles ont des masses moléculaires très différentes. Ainsi, l'á-glucosidase de masse moléculaire de 72,7 kDa et celle de la membrane cellulaire de l'intestin moyen (240 kDa) hydrolysent de façon préférentielle les maltooligosaccharides de masses moléculaires supérieurs à celui du maltotétraose. Cependant, celle de masse moléculaire de 330 kDa hydrolyse plus efficacement le maltose et le maltotriose que les autres maltodextrines (Terra et Jordão, 1989).

Les pH optima d'hydrolyse des á-glucosidases des insectes se situent généralement entre 5 et 6,5 à l'exception de celui de Rhodnius prolixus qui est de 4,5 (Terra et al., 1988).

3-2-Enzymes cellulolytiques

La sensibilité de la cellulose à l'hydrolyse enzymatique dépend de trois caractéristiques qui dérivent de l'état du substrat : le degré de polymérisation, le degré de cristallinité et la surface spécifique accessible aux enzymes (Sinitsyn et al., 1989). Chez les insectes, le broyage effectué par les mandibules et la grande alcalinité de l'intestin moyen de beaucoup d'espèces entraînent la levée de ces obstacles de digestion de la cellulose ingérée (Martin, 1991). La caractérisation des enzymes assurant la digestion de la cellulose est très complexe à cause de la diversité d'origine de celles présentes dans l'intestin des insectes. En effet, les enzymes des tubes digestifs ne sont pas toutes secrétées par les insectes eux-mêmes. La plupart d'entre elles sont produites par des microorganismes symbiotiques qui sont des protozoaires, des bactéries et des champignons (Martin, 1983).

Malgré le caractère homogène de la cellulose, plusieurs familles d'enzymes regroupées sous le terme de cellulases, interviennent dans sa dégradation. Ces enzymes sont secrétées sous la forme d'un complexe cellulasique qui renferme trois principaux types d'activités

enzymatiques que l'on différencie selon leur mode d'action et leur substrat préférentiel. Ce sont :

Les cellulases sont les enzymes qui hydrolysent la cellulose. Ce groupe de biocatalyseurs est constitué de l'endo-â-D-glucanase (1,4-â-glucane-4-glucanohydrolase EC 3.2.1.4) et de l'exo-â-D-glucanase (1,4-â-glucane-4-cellobiohydrolase EC 3.2.1.91). Les enzymes qui obéissent à un mécanisme endo sont celles qui hydrolysent les liaisons glucosidiques internes d'une chaîne de cellulose. Les liaisons internes étant plus accessibles dans les zones amorphes que dans les zones cristallines, la réactivité de la cellulose aux endoâ-D-glucanases évolue inversement à son indice de cristallinité. Les enzymes qui agissent selon un mécanisme exo sont celles qui attaquent la cellulose à partir de son extrémité non réductrice (Martin, 1983).

Les glandes salivaires et l'intestin postérieur du termite Macrotermes darwiniensis dégradent la carboxyméthylcellulose et la cellulose cristalline. L'hydrolyse du deuxième substrat cité produit des cellodextrines et du cellobiose tandis que l'intestin postérieur libère du glucose, du cellobiose et des cellodextrines (Veiver et al., 1982). Les intestins postérieur, moyen et antérieur du termite Nasutitermes exitiosus contiennent respectivement 19, 59 et 8 % d'activité cellulasique (O'brien et al., 1979). Beaucoup de cellulases d'insecte ont été purifiées et caractérisées. Le complexe cellulasique de la larve de l'insecte Ergates faber est constitué de trois enzymes nommées enzymes 1, 2 et 3. L'enzyme 1 a une masse moléculaire de 25 kDa et un pH optimum d'hydrolyse de 4,5. C'est une exo-â-D-glucanase. Les enzymes 2 et 3 ont les mêmes pH optima d'hydrolyse tandis que les masses moléculaires sont différentes (57 kDa et 70 kDa). L'enzyme 2 est une exo-â-D-glucanase tandis que l'enzyme 3 est capable d'hydrolyser une variété de substrat dont le cellobiose, la carboxyméthylcellulose et la cellulose microcristalline (Chararas et al., 1983). Une exo-â-D-1,4-glucanase a été purifiée à homogénéité électrophorétique sur gel de polyacrylamide à partir du champignon symbiotique du termite Macrotermes mulleri (Rouland et al., 1988). Cette enzyme a une masse moléculaire de 52 kDa et un pH optimum d'hydrolyse de 4,5. Elle est très active sur la

carboxyméthylcellulose et agit de façon synergique avec d'autres enzymes pour dégrader totalement la cellulose en glucose (Slaytor, 1992).

3-2-2-beta-Glucosidases

En se basant sur la spécificité de substrat, les â-glucosidases des insectes peuvent être subdivisées en trois classes : les classes 1, 2 et 3 (Terra et Ferreira, 1994).

La classe 1 regroupe les glycosyl-â-glycosidases et les aryl-â-glycosidases. Ce sont des enzymes capables d'hydrolyser aisément le cellobiose, le p-nitrophényl-â-Dglucopyranoside, le p-nitrophényl-â-D-galactopyranoside, le p-nitrophényl-â-Dfucopyranoside et le lactose (Terra et Ferreira, 1994). Les meilleures enzymes décrites appartenant à la classe 1 sont les â-glucosidases de Erinnyis ello (Santos et Terra, 1985) et de Rhynchosciara americana (Ferreira et Terra, 1983). La â-glucosidase de l'intestin moyen de Erinnyis ello hydrolyse le â-D-glucoside, le â-D-galactoside et le â-D-fucoside avec le même site actif. Celle de l'intestin moyen de l'insecte Rhynchosciara americana, contrairement aux autres â-glucosidases de l'intestin moyen des autres insectes, est intégrée dans la partie hydrophobe de la membrane cellulaire (Ferreira et Terra, 1983). Les propriétés cinétiques et le mécanisme réactionnel de cette enzyme sont similaires à ceux de la â-glucosidase de Erinnyis ello.

La classe 2 est composée uniquement des glycosyl-â-glycosidases c'est-à-dire des enzymes qui hydrolysent avec efficacité seulement le cellobiose et le lactose. Les âglucosidases des insectes adultes Abracris flavolineata (Marana et al., 1995) et Sitophilus oryzae (Baker et Woo, 1992) appartiennent à cette classe d'enzymes. Celle de Abracris flavolineata possède une masse moléculaire de 82 kDa et un pH optimum d'hydrolyse de 5,5 qui sont différents de ceux des â-glucosidases de la classe 2 des insectes adultes de Locusta migratoria et de Sitophilus oryzae. En effet, les â-glucosidases de ces insectes ont un même pH optimum d'hydrolyse (5,5). Les masses moléculaires sont respectivement de 110 kDa et 170 kDa (Baker et Woo, 1992).

Les â-glucosidases de la classe 3 sont celles qui sont capables de dégrader fortement le p-nitrophényl-â-D-glucopyranoside et les substrats similaires. La plupart de ces enzymes sont aussi actives sur le p-nitrophényl-â-D-galactopyranoside. Ces enzymes sont appelées alkyl ou aryl-â-glycosidases. Les insectes Abracris flavolineata (Marana et al., 1994), Sitophilus oryzae (Baker et Woo, 1992), Thaumetopoea pityoampa (Pratriel-Sosa et al., 1987), Diatraea saccharalis et Calliphora erythrocephala (Evans, 1956) en contiennent. Trois â-

glycosidases appelées J3Gly1, J3Gly 2 et J3Gly 3 ont été isolées de l'intestin moyen de l'insecte Diatraea saccharalis. Ces trois enzymes ont à peu près les mêmes masses moléculaires (58 ; 61 et 61 kDa), points isoélectriques (7,5 ; 7,4 et 7,4) et pH optima d'hydrolyse (6,7 6,3 et 7,2). Ces enzymes sont plus spécifiques les J3-glucosides qu'aux J3-galactosides et hydrolysent plus la liaison â-(1-3)glucosidique que les liaisons J3-(1-4) et J3-(1-6)glucosidiques. Le rôle physiologique des J3Gly1 et J3Gly 3 est d'assurer la digestion des oligo et disaccharides provenant de la dégradation des hémicelluloses tandis que celui de la J3Gly 2 est de dégrader les glycolipides. Les glandes salivaires de l'ouvrier du termite Macrotermes mulleri contiennent une J3-glucosidase acide de masse moléculaire de 120 kDa. C'est une protéine homodimérique (Rouland, 1986 ; Rouland et al., 1988) qui est différente de celles du termite Macrotermes subhyalinus qui ont été largement étudiées par Kouamé et al. (2005b). En effet, ces J3-glycosidases n'hydrolysent pas les saccharides tels que le mélibiose, le saccharose, le lactose, le xylobiose, le mélizitose, le stachyose, le raffinose, la laminarine, l'arabinogalactane, la carboxyméthylcellulose, l'inuline, le lichenane et l'amidon. Cependant, elles dégradent fortement le p-nitrophényl-J3-D-glucopyranoside, le p-nitrophényl-J3-Dfucopyranoside, le cellobiose et les cellodextrines. Le rôle physiologique de ces deux enzymes est d'assurer la digestion des oligo et disaccharides provenant de la dégradation des hémicelluloses et des celluloses.

En se référant aux spécificités de substrats, les enzymes des classes 1 et 2 hydrolysent avec efficacité le cellobiose et d'autres disaccharides. Ce sont de "vrai" â-glucosidases (E.C 3.2.1.21). Elles peuvent encore être appelées cellobiases. Les cellobiases sont des enzymes qui assurent la dégradation du cellobiose issu de la dégradation de la cellulose chez quelques insectes ayant une cellulase. Chez les insectes, la cellobiase est probablement aussi l'enzyme responsable de la finition de la dégradation de l'hémicellulose ou de la partie glucidique des glycoprotéines. Cette assertion est beaucoup plus soutenue par le fait que les enzymes de la classe 3 libèrent préférentiellement les monosaccharides liés à l'aglycone hydrophobique. Il est donc possible que leur substrat naturel soit les glycolipides tels que les glycosylcéramides. Les â-glucosidases de la classe 3 des insectes sont donc des glycosylcéramidases (EC 3.2.1.62) encore appelées phlozine hydrolases (Leese et Semenza, 1973). Des âglucosidases d'insectes de la classe 1 ayant les mêmes caractéristiques cinétiques que celles des classes 2 et 3 ont été observées chez les insectes Abracris flavolineata (Marana et al., 1995) et Sitophilus oryzae (Baker et Woo, 1992).

3-3-Enzymes hémicellulolytiques

Les hémicellulases sont les enzymes qui dégradent les polysaccharides du groupe des hemicelluloses (Dekker et Richards, 1976). Celles des insectes n'ont pas été beaucoup étudiées malgré la présence des hémicelluloses dans les aliments de ceux-ci (Terra et al. 1987).

3-3-1-Xylanases, laminarinases et lichenases

Dans le tube digestif de l'ouvrier du termite Macrotermes subhyalinus, il existe trois xylanases qui ont des masses moléculaires très voisines compris entre 60 et 66 kDa. Elles ont une activité hydrolytique maximale dans le tampon acétate aux pH compris entre 4,6-5,0 et aux températures se situant entre 55-66 °C. Ces enzymes sont dépourvues d'activité cellulasique et hydrolysent seulement le xylane non méthylé. Ce sont des endo-â-1,4-Dxylanases strictes (Faulet, 2006).

Deux laminarinases sont sécrétées par l'intestin moyen de la larve de Rhagium inquisitor. Seule la laminarinase 1 a été purifiée et caractérisée. Cette enzyme a une masse moléculaire compris entre 95-100 kDa et un pH optimum d'hydrolyse de 5,5. Il s'agit d'une endo- â-1,3-glucanase. L'enzyme est inactive sur le lichenane. L'activité lichenasique (endoâ-1,3;1,4-glucanase EC 3.2.1.73) a été mise en évidence chez Rhagium inquisitor (Chipoulet et Chararas, 1985).

3-3-2-beta-Galactosidases

glucosidasique qui les distingue des â-glucosidases et des glycosylcéramidases (Santos et Terra, 1985). Ces â-galactosidases ont été déjà mises en évidence dans les intestins moyens des adultes de Locusta migratoria, Abracris flavolineata et la larve de Tenebrio molitor (Patchett et al., 1987). Celles de Locusta migratoria et de Abracris flavolineata ont respectivement des pH optima d'hydrolyse de 5,5 et de 4,5. Les masses moléculaires sont de 65 kDa et de 72 kDa. Ces enzymes hydrolysent fortement le p-nitrophényl- â-D-galactoside et sont pratiquement inactives sur le lactose et les â-glucosides. Les substrats naturels de ces âgalactosidases sont des galactolipides (Harwood, 1980).

3-3-3-beta-Xylosidases

Très peu de travaux ont été effectués sur les â-xylosidases d'insecte. Kouamé (2006) a montré que l'ouvrier du termite Macrotermes subhyalinus possède dans son tube digestif, une â-xylosidase hétérodimérique, acide et thermophile très spécifique du résidu xylosyle. Cette enzyme est différente de celle de son champignon symbiotique Termitomyces sp. La âxylosidase de l'ouvrier du termite Macrotermes subhyalinus serait donc secrétée soit par le termite lui même soit par ses bactéries symbiotiques.

3-4-beta-Fructosidases

Les â-fructosidases ont été caractérisées à cause de leur action hydrolytique sur le saccharose et le raffinose. Dans les intestins moyens des insectes, la dégradation du saccharose est plus l'oeuvre des á-glucosidases que des â-fructosidases. Les biocatalyseurs tels que les â- fructosidases sont donc rares dans les tubes digestifs des insectes. Quelques unes ont été mises en évidence. Il s'agit des â-fructosidases de la mouche (Evans, 1956), de la blatte (Bank, 1963), de l'abeille (Chinnery, 1971) et du papillon (Burton et al., 1977). La mieux caractérisée d'entre elles est celle de l'insecte Erinnyis ello. En effet, l'intestin moyen de cet insecte (quel que soit le niveau d'évolution) contient une â-fructosidase dont le pH optimum d'hydrolyse et la masse moléculaire sont respectivement de 6,0 et de 78 kDa. Son rôle physiologique dans le tube digestif du lépidoptère est d'achever la dégradation du saccharose contenu dans les feuilles (pour la larve) ou dans le nectar (pour l'adulte) dont l'hydrolyse a été entamée par l'á-glucosidase du même milieu (Terra et al., 1987).

4-Applications industrielles de quelques glycosidases 4-1-beta-Galactosidase

4-1-1-Applications médicales

Dans le cas des intolérances aux disaccharides, l'hydrolyse du lactose est réalisée à l'aide de â-D-galactosidases ingérées et produites à l'échelle industrielle (â-D-galactosidases de Escherichia, de Aspergillus, etc.). Pour les autres déficiences impliquant les activités de

type â-D-galactosidasique, il existe quelques modèles d'animaux représentatifs de ces maladies. Dans le cas de la galactosialidose, Zhou et al. (1995) ont montré l'existence d'un modèle de souris. Pour la maladie de Krabbe, Duchen et al. (1980), ont décrit une leucodystrophie autosomale récessive chez la souris « Twitcher ». Cette souris est un modèle enzymatique pour la leucodystrophie des cellules globoïdes humaines (Kobayashi et al., 1980) comme le sont les maladies autosomales récessives chez le mouton. D'autre part, le chien (West Highland White terrier et le Cairn terrier) présente une forme naturelle de la maladie de Krabbe (Wenger et al., 1999). Ainsi, des tentatives de thérapies ont été faites à l'aide de ces modèles. O'brien et al. (1990) ont réalisé une transplantation de moelle épinière allogénique tôt dans la vie d'un chien atteint par une Gm1-gangliosidose. Malgré le succès de la greffe, aucun résultat positif n'a été observé. Hoogerbrugge et al. (1988) ont réalisé une transplantation de moelle épinière chez la souris « Twicher ». Bien qu'ils aient observé une augmentation de l'activité galactosylcéramidase, une augmentation de l'activité galactosylcéramidasique dans le système nerveux central et une augmentation de la durée de vie de 30 à 40 jours voire plus de 100 jours dans quelques cas, les résultats semblent peu convaincants. Krivit et al. (1998) ont rapporté leur expérience en utilisant la transplantation de lignées cellulaires allogéniques dans le traitement de la maladie de Krabbe. Les atteintes du système nerveux central ont pu être éliminées. Ainsi, malgré quelques réussites partielles aucune thérapie n'est actuellement possible. L'utilité de ces modèles reste évidente et renforcée avec la découverte d'une mutation induisant la leucodystrophie des cellules globoïdes chez le macaque (Luzi et al., 1997). L'existence de différences dans le développement du cerveau et des voies métaboliques entre les espèces rendent cependant plus difficiles les possibilités de traitement puisque le but ultime est une application sur les patients humains. Après tout, la « souris » n'est pas l'Homme (Suzuki et Mansson, 1998). Des diagnostiques in vitro sont proposés lorsque l'existence de la mutation est connue au sein de la famille ; l'avortement du foetus peut être envisagé, ces maladies lysosomales étant généralement mortelles.

4-1-2-Applications pharmaceutiques

Ajisaka et al. (1987) ont synthétisé à partir du D-fructose à l'aide de la â-Dgalactosidase de Escherichia coli, l'allolactose et le lactulose. Le lactulose est un disaccharide utilisé dans le traitement d'encéphalopathies, la constipation et les salmonelloses. Toujours dans le cas d'application pharmaceutique, les alcaloïdes d'ergots sont galactosylés à l'aide de â-D-galactosidase avec des rendements de 40 % (Kren et al.,

1992). La galactosylation du D-xylose par une â-D-galactosidase donne un mélange de disaccharides (â(1?4), â(1?3), â(1?2)-galactosyl-xylose) avec un rendement de 50 % (Aragon et al., 1996). Ces produits peuvent être utilisés pour l'évaluation de l'activité de la lactase intestinale in vivo, ce qui donne lieu à une nouvelle méthode de diagnostic de déficience en lactase. De plus, il est remarquable de noter que ce procédé enzymatique est moins cher et moins risqué qu'une synthèse chimique de galacto-oligoccharides impliquant sept étapes réactionnelles (Rivera-Sagredo et al., 1992).

4-1-3-Applications nutritionnelles

Les oligosaccharides à usage nutritionnel connaissent un développement important en raison de leurs aptitudes à favoriser la croissance de la flore bactérienne intestinale humaine ou animale. Au Japon, les galactooligosides sont utilisés dans la formulation de nombreux produits alimentaires (confiserie, gommes, boissons). Ces oligosides sont obtenus soit par extraction de sources végétales, soit par hydrolyse de polyosides, soit par synthèse enzymatique. On peut aussi produire des galactooligosaccharides à partir du lactose qui joue le rôle de donneur et d'accepteur de résidu â-D-galactosyle. Ainsi, Burvall et al. (1980) ontils synthétisé, à l'aide de la lactase de Saccharomyces lactif, le â-D-galactosyl(1-6) lactose, galactooligoside stimulant la croissance des bifidobactéries.

4-1-4-Applications en industrie agroalimentaire

La â-D-galactosidase peut nécessiter des purifications poussées et coûteuses mais elle présente l'avantage de réaliser des réactions spécifiques qui ne nécessitent pas l'utilisation de co-solvants organiques moins bien tolérés par les appareillages industriels. Les sources de âD-galactosidases utilisées en agroalimentaires sont très variées et incluent les plantes comme l'amande, la pêche, l'abricot, les champignons comme Aspergillus niger (Greenberg et Mahoney, 1981) les levures comme Saccharomyces lactis, les bactéries comme Escherichia coli et les organes d'animaux comme l'intestin et les tissus de peau (Cheetham, 1995 ; Law et Goodenough, 1995). Parmi les lactases, celles d'origine bactérienne ont donné lieu à des applications brevetées et notamment les enzymes extraites des microorganismes thermostables comme Streptomyces coelicolor (Collinge et al., 1974), Bacillus stearothermophilus (Fabricius, 1980), Bacillus circulans (Iiada et al., 1980) et plus

récemment avec Pyrococcus furiosus (Shimada et al., 1994). Chez les levures, la â-Dgalactosidase de Saccharomyces fragilis est la mieux caractérisée. Elle se développe bien sur le petit lait issu de la fabrication des fromages (Young et Healey, 1957).

4-2-Enzymes amylolytiques

Le terme de saccharification s'applique à l'opération d'hydrolyse permettant de transformer les maltodextrines en glucose et en petits oligosaccharides du type maltose et maltotriose par les enzymes amylolytiques. Selon le degré final d'hydrolyse, la dextrinisation conduit à des sirops de glucose et/ou de fructose (Buléon et al., 1990).

Les propriétés résultant de la structure d'oligomère de glucose (1 à 3 unités de glucose), telles que le pouvoir sucrant, le caractère plastifiant, le rôle de régulateur de pression osmotique et la fermentescibilité sont utilisées dans la conception de divers aliments (confiserie, pâtisserie, biscuiterie) et dans les industries de fermentation (brasserie, antibiotique) (Buléon et al., 1990). Ces mêmes propriétés interviennent dans l'industrie pharmaceutique comme excipient stabilisant ou précurseur de réactions chimiques et enzymatiques (vitamine C, D-mannitol hexanitrate). Elles interviennent aussi dans les industries pharmaceutiques et en cosmétologie en tant qu'émolliant, émulsifiant ou rétenteur d'eau. Le sorbitol est utilisé comme produit de base des pâtes et gels dentifrices. Il est aussi utilisé dans les industries chimiques comme plastifiant ou comme réactif polyalcool hexafonctionnel pour les réactions d'estérification (polyesters, esters d'acide gras) (Buléon et al., 1990).

4-2-2-Amélioration de la solubilité de l'amidon

La liquéfaction de l'amidon par les amylases conduit principalement aux maltodextrines qui correspondent à des oligosaccharides linéaires ou ramifiés de 5 à 10 unités glucose. Cette étape de dextrinisation vise principalement à améliorer le facteur solubilité des molécules natives d'amylose et d'amylopectine et à augmenter la solubilité des solutions obtenues aux températures modérées (60 °C) (Buléon et al., 1990). Ainsi, l'introduction d'enzymes amylolytiques dans les bouillies infantiles permet non seulement d'augmenter leurs densités énergétiques mais aussi de diminuer leurs viscosités (Bruyeron et al., 2006).

4-3-Enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques

Les applications industrielles des enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques sont multiples. Le complexe xylanolytique est utilisé dans les phénomènes de bioblanchiment de pâtes à papier, de biomécanique de pulpage et de biomodification des fibres. En effet, dans l'industrie papetière, la dégradation du xylane contenu dans les pâtes à papier par un complexe xylanolytique permet de libérer non seulement le xylose et les xylodextrines mais aussi le tanin et la lignine responsables de la coloration sombre du papier. Ce traitement enzymatique permet de blanchir les pâtes à papier et de réduire la consommation (Beq et al., 2001 ; Viikari et al., 1994) d'organochlorés dont le déversement dans la nature entraîne la pollution de l'environnement (Shoham et al. 1992 ; Sa-Pereira et al., 2003). Ces enzymes facilitent le processus de pulpage et permettent de réduire l'emploi de méthodes mécaniques de pulpage et par conséquent la consommation d'énergie (Bhat, 2000). Elles améliorent les propriétés de fibrillation et de drainage des pâtes, par conséquent l'amélioration de l'efficacité du traitement et de la rigidité du papier (Bhat, 2000). Dans l'industrie du textile, des tiges séchées de ramie (herbe ou gazon de Chine) sont incubées avec le complexe xylanolytique pour favoriser la libération de longues chaînes de fibre de cellulose. La xylanase du complexe xylanolytique utilisée en industrie papetière et textile doit être dépourvue de toute activité cellulasique afin d'éviter la dégradation de la cellulose (Csiszar et al., 2001 ; Bruhlmann et al., 2000). Elles réduisent ou remplacent les méthodes chimiques de rouissage du lin, du jute, du chanvre, etc. (Beq et al., 2001 ; Prade, 1995). En boulangerie et biscuiterie, la xylanase est utilisée pour améliorer les propriétés technologiques des pâtes de farines telles que la capacité de rétention de l'eau, l'élasticité et la consistance tout en permettant une meilleure panification et une amélioration de la texture, la structure et la couleur de la mie (Bhat, 2000 ; Maat et al., 1992). Les enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques sont employées en industrie des boissons (jus de fruits, nectars et purées, et vins) pour améliorer la macération, la clarification des jus, le rendement d'extraction, la filtration, la performance du processus et la qualité du production. Pour la production du jus de fruit, elles permettent de réduire la viscosité, le maintien en suspension des pulpes et la dissolution des précipités. En vinification, elles interviennent aussi pour accélérer le jutage (Larreta-Garde, 1997 ; Subramaniyan et Pema, 2002). Ces enzymes en association avec des protéases et d'autres enzymes, sont utilisées pour produire des suppléments diététiques ou pour améliorer la digestibilité (Polizeli et al., 2005). En effet, la dégradation enzymatique du xylane par le complexe

xylanolytique entraîne la libération du xylose. Le xylose est converti par hydrogénation catalytique en xylitol dont les applications sont nombreuses en diététique grâce à ses propriétés humectantes, édulcorantes et à son effet « rafraîchissant » (Parajo et al., 1998). Il est recommandé médicalement pour prévenir l'ostéoporose, certaines infections respiratoires, le désordre métabolique des lipides, les lésions rénales et parentérales (Larreta-Garde, 1997). Les enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques sont utilisées dans le traitement et le recyclage des déchets agricoles, dans la production des substances fermentescibles et de combustibles renouvelables (bioéthanol) (Mielenz, 2001 ; Saha, 2003). En effet, ces enzymes vont hydrolyser la cellulose et les hémicelluloses pour donner des sucres fermentescibles. Ces derniers, par bioconversion, vont être transformés en carburant ou comestibles.

Dans la nutrition animale (aliments pour monogastrique et ruminant), ces biocatalyseurs permettent de diminuer la quantité de polysaccharides non amylolytiques réduisant ainsi la viscosité intestinale et entraînant l'amélioration de l'utilisation des protéines et de l'amidon. Elles améliorent la performance de l'animal, augmente la digestibilité et la valeur nutritive d'aliments faiblement dégradables tels que l'orge et le blé (Mathlouthi et al., 2002, 2003).

Chapitre 2

I- Matériel

Les substrats [amidon soluble, oligosaccharides contenant le résidu galactosyle, pNPglycoside, pNP-â-N-acétyl-glucosaminide, pNP-â-N-acétyl-galactosaminide, carboxyméthylcellulose, maltodextrines, cellodextrines, saccharose, gentiobiose, sophorose, laminaribiose, cellobiose, tréhalose, nigérose, kojibiose, lactose, stachyose, mélibiose, mélizitose, cellulose microcristalline, cellulose triacétate microcristalline, pullulane, arabinogalactane, inuline] et les monosacharides [glucose et xylose] sont des produits chimiques provenant de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA).

Les produits de chromatographie [DEAE-Sepharose CL-6B, phényl-éthyl-â-Dgalactoside et Sephacryl S-100 HR] sont des produits chimiques provenant de PHARMACIALKB Biotech (Uppsala, Sweden).

Les produits pour l'électrophorèse [acrylamide, N,N'-méthylène-bis acrylamide, Tris, dodécyl sulfate de sodium, N,N,N',N'tétraméthyléthylènediamine (T.E.M.E.D), âmercaptoéthanol, glycérol, bromophénol, glycine, bleu de Coomassie R-250 et persulfate d'ammonium] ont été fourmis par BIO-RAD (Milan, Italy).

2-Origine du matériel biologique

Les larves de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) du palmier Elaeis guineensis ont été récoltées des palmiers déterrés ou abattus en voie de putréfaction du Campus de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan, Côte d'Ivoire).

II- Méthodes

La larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été rincée à l'eau distillée et essorée sur du papier filtre. Le tube digestif a été isolé du reste du corps dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v) à l'aide d'une pince puis vidé de son contenu. Le suc digestif ainsi obtenu a été dilué (1/1 ; v/v) dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v), puis centrifugé à 6000 trs/min pendant 30 min à 4 °C, à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée (UNICEN ALRESA). Le surnageant obtenu a été dilué (1/1 ; v/v) dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 et recentrifugé dans les mêmes conditions à 10000 trs/min. Le nouveau surnageant recueilli a constitué l'extrait brut enzymatique issu du suc digestif.

Le tube digestif, vidé de son contenu, a été abondamment lavé respectivement dans de l'eau distillée et dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v). Ensuite, il a été placé dans un récipient disposé dans un bac à glace tout comme les glandes salivaires qui ont soigneusement été isolées des têtes des larves. Ces différents tissus ont été ensuite broyés séparément dans une solution de chlorure de potassium (0,9 %, m/v) à l'aide d'un microbroyeur Ultra-turax (type T 25). Les broyats totaux ont été centrifugés à 10000 trs/min pendant 30 min à 4 °C, à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée (UNICEN ALRESA). Les surnageants obtenus ont été dilués (1/1 ; v/v) dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 et ont constitué les extraits bruts enzymatiques issus des tissus du tube digestif et des glandes salivaires de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae).

L'hydrolyse enzymatique des polysaccharides libère des sucres réducteurs qui peuvent être dosés selon la méthode de Bernfeld (1955) utilisant l'acide 3,5-dinitro-salycilique (DNS).

2-1-1- Préparation de la solution de DNS

Deux (2) g de DNS et 3,2 g de soude ont été dissous dans 70 ml d'eau distillée. Ensuite, 60 g de tartrate double de sodium-potassium ont été progressivement ajoutés à ce mélange sous chauffage et agitation. Le volume de ce mélange a été complété à 100 ml avec de l'eau distillée.

2-1-2- Technique de dosage

Dans les conditions standard, l'activité polysaccharidasique a été mesurée dans 0,8 ml de tampon acétate de sodium 100 mM pH 5,0 ou pH 5,6 contenant 1 % (m/v) de polysaccharide et 100 ul de solution enzymatique.

Le milieu réactionnel a été incubé à 37 °C pendant 30 min dans un bain-marie. Ensuite, 500 ul de solution de DNS y ont été ajoutés. Le mélange a été homogénéisé et chauffé au bain-marie bouillant pendant 5 min. La densité optique a été mesurée au spectrophotomètre à 540 nm contre un témoin contenant les réactifs à l'exception de la solution enzymatique. La quantité de sucres réducteurs libérés a été déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage réalisée dans les conditions expérimentales. L'activité enzymatique se définit comme étant la quantité d'enzyme catalysant l'hydrolyse d'une micromole de substrat par min dans les conditions standards. L'activité spécifique a été exprimée en unité enzymatique par mg de protéine (UE/mg).

2-2- Dosage de l'activité oligosaccharidasique

Certains oligosaccharides sous l'action des enzymes fournissent du glucose. La quantité de glucose libéré peut être dosée selon la méthode de Kunst et al. (1984) utilisant le réactif glucose oxydase-péroxydase.

2-2-1- Préparation du réactif glucose oxydase-péroxydase

Ce réactif a été constitué d'un mélange de deux solutions A et B préparées extemporanément. La solution A a été obtenue par dissolution de 0,6 mg de glucose oxydase et 0,24 mg de péroxydase dans 60 ml de tampon phosphate 100 mM pH 7,0. La solution B a

été constituée d'o-dianisidine (6,6 mg/ml) préparée dans 0,6 ml de tampon phosphate 100 mM pH 7,0.

2-2-2- Technique de dosage

Pour le dosage de l'activité oligosaccharidasique, l'essai standard contient 10 mM d'oligosaccharide et 50 ul de solution enzymatique dans un volume final de 250 ul de tampon acétate 100 mM pH 5,0 ou pH 5,6. Le mélange réactionnel a été incubé pendant 10 min à 37 °C. La réaction enzymatique est arrêtée par chauffage du milieu réactionnel pendant 5 min au bain marie bouillant. Trois (3 ml) du réactif glucose oxydase-péroxydase ont été ajoutés au milieu réactionnel pour doser la quantité de glucose libéré. Le nouveau mélange, bien homogénéisé, a été placé à l'obscurité (à la température ambiante) pendant 30 min. L'intensité de la coloration a été mesurée au spectrophotomètre à 436 nm contre un témoin ne contenant pas d'enzyme. Une courbe d'étalonnage obtenue dans les mêmes conditions a permis de convertir les densités optiques en micromoles de glucose.

Pour déterminer la quantité de xylose libérée dans le milieu réactionnel, la méthode chromatographique a été utilisée.

L'activité enzymatique se définit comme étant la quantité d'enzyme catalysant l'hydrolyse d'une micromole de substrat par min dans les conditions standards. L'activité spécifique a été exprimée en unité enzymatique par mg de protéine (UE/mg).

2-3- Dosage de l'activité pNP-glycosidasique

Dans les conditions standard, l'activité pNP-glycosidasique a été mesurée dans 275 ul de tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0 contenant 1,25 mM de pNP-glycoside et 50 ul de solution enzymatique. Le mélange réactionnel a été incubé dans un bain marie à 37 °C pendant 10 min. La réaction a été arrêtée par alcalinisation du milieu réactionnel avec 3 ml de carbonate de sodium 1 M. La quantité de p-nitrophénolate libéré a été mesurée au spectrophotomètre à 410 nm avec pour témoin une solution ne contenant pas d'enzyme. L'activité enzymatique a été exprimée en micromole de p-nitrophénolate libéré par min. L'activité spécifique est exprimée en unité enzymatique par mg de protéine (UE/mg).

2-4- Dosage des protéines

Deux méthodes ont été utilisées pour déterminer les teneurs en protéine. Il s'agit de celles décrites par Lowry et al. (1951) et Bradford (1976).

Les teneurs en protéine des solutions enzymatiques ont été dosées selon la méthode de Lowry et al. (1951). Les protéines réagissent avec le réactif de Folin-Ciocalteus (un mélange de tungstate et de molybdate de sodium en solution dans l'acide phosphorique et l'acide chlorhydrique) pour donner des complexes colorés. La couleur ainsi formée est due à la réaction du phosphomolybdate par la tyrosine et le tryptophane. L'intensité de la coloration dépend donc de la quantité d'acides aminés aromatiques présents et varie selon les protéines. Les densités optiques sont mesurées à 600 nm avec pour témoin une solution contenant tous les réactifs exceptées les protéines. Cette méthode permet de doser des concentrations de protéine qui varient de 5 à 100 ug.ml^-1 (Pelmont, 1995).

2-4-1-1- Réactif utilisés

Solution A : réactif de Folin-Ciocalteus dilué de moitié dans la soude 0,1N ;

Solution C1 : sulfate de cuivre (0,5 % , m/v) préparé dans de l'eau distillée ;

Solution C2 : tartrate double de sodium et de potassium (1% , m/v) préparé dans de l'eau distillée ;

Solution D : préparée extemporanément à partir de 100 ul de solution C1, 100 ul de solution C2 et 10 ml de solution B.

2-4-1-2- Technique de dosage

Deux cent (200) ul de préparation protéique ont été dilués dans 2 ml de solution D. Ensuite, 200 ul de solution A ont été ajoutés à ce mélange. Le milieu réactionnel a été agité et laissé reposer pendant 30 min à l'obscurité pour permettre le développement de la coloration. La densité optique de l'essai a été mesurée à 600 nm avec pour témoin une solution ne contenant pas de solution protéique. La densité optique obtenue a été ensuite convertie en mg

de protéine grâce à une droite d'étalonnage préparée dans les mêmes conditions. Le sérum albumine bovine a été utilisé comme protéine de référence.

La technique de Bradford (1976) a été utilisée pour doser les faibles quantités de protéine dans la solution enzymatique. Elle utilise du bleu de Coomassie G250 dont la forme leuco (brun orange) est convertie en forme bleue caractéristique du complexe formé entre les groupements NH3⁺ des protéines et ce réactif. Elle permet de doser des quantités de protéine de l'ordre du microgramme.

Le réactif de Bradford est un mélange homogène de bleu de Coomassie G 250 (0,060 g), d'acide perchlorique (3 g), de chlorure de sodium (2,92 g), et d'eau distillée psp (100 ml).

L'extrait protéique contenant une quantité de protéine comprise entre 2 à 25 ug a été dilué dans le réactif de Bradford selon le rapport (1:1, v/v). Après le mélange, l'intensité de la coloration a été déterminée au spectrophotomètre à 595 nm avec pour témoin une solution contenant tous les réactifs excepté l'extrait protéique. La droite d'étalonnage obtenue dans les mêmes conditions a permis de convertir la densité optique en quantité de protéine. Le sérum albumine bovine a été utilisé comme protéine de référence.

Trois enzymes ont été purifiées. Ce sont : l'á-glucosidase, la â-glucosidase et la âgalactosidase de la larve de charançon Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) du palmier Elaeis guinensis. Dans chacun des cas, la purification a été faite en trois étapes chromatographiques comportant une chromatographie échangeuse d'anion, un fractionnement sur gel d'exclusion moléculaire et une chromatographie d'interaction hydrophobe.

Le gel DEAE (diéthylaminoéthyle) Sepharose CL-6B est un échangeur anionique. Il a été coulé dans une colonne en verre (2,4 x 6,5 cm) et équilibré dans un tampon acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a été de 14 ml/h et maintenu constant par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique de type GILSON. Le gel est lavé avec 120 ml du même tampon. Les protéines retenues par le gel ont été décrochées par un gradient en palier croissant de KCl préparé dans le tampon acétate de sodium 100 mM pH 5,6. Des fractions de 4 ml sont collectées et les plus actives ont ensuite été « poolées » pour la suite de la purification.

2-5-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium

A l'extrait enzymatique obtenu après chromatographie sur DEAE Sepharose CL-6B, une quantité correspondante de sulfate d'ammonium a été lentement ajoutée selon la méthode de Dawson et al. (1969) sous agitation mécanique à 4 °C de sorte à obtenir une saturation à 80 %. Après 12 h de précipitation des protéines, ce mélange a été centrifugé à 6000 trs/min pendant 30 min à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée (UNICEN ALRESA). Le culot obtenu a été resuspendu dans 1 ml de tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0.

2-5-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR

Cette chromatographie permet la séparation des molécules en fonction de leur poids moléculaire et de leur volume hydrodynamique. Le gel Sephacryl S-100-HR permet de séparer les macromolécules globulaires ayant des poids moléculaires compris entre 10 et 100 kDa. Il a été coulé dans une colonne en verre (1,6 x 64 cm) et ensuite équilibré avec du tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0. Les protéines ont été éluées avec ce même tampon après le dépôt de l'extrait brut enzymatique (1 ml) issu de la précipitation au sulfate d'ammonium à 80 % de saturation. Le débit de la chromatographie a été de 15 ml/h et maintenu constant grâce à une pompe péristaltique de marque GILSON. Des fractions de 1 ml ont été collectées et les plus actives « poolées » pour la suite de la purification.

2-5-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B

La chromatographie d'interaction hydrophobe permet de séparer les molécules en fonction de leur hydrophobie et de leur caractère amphiphile. La colonne a un diamètre de 1,4 cm pour une hauteur de 5 cm. Le débit d'élution de 14 ml/h a été fixé par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique de marque GILSON. Des fractions de 1 ml ont été recueillies. La solution enzymatique, saturée avec du thiosulfate de sodium (1,7 M), a été déposée sur la colonne Phényl-Sepharose CL 4B préalablement équilibrée avec du tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0 contenant du thiosulfate de sodium 1,7 M. Après avoir lavé 3 fois la colonne avec ce même tampon, les protéines retenues ont été éluées par application d'un gradient en palier décroissant de thiosulfate de sodium (1,7 ; 1 ; 0,5 ; 0,3 ; 0,2 ; 0,1 ; 0 M ) préparé dans le tampon acétate 100 mM au pH optimum correspondant à chaque activité glycosidasique (pH 5,6 pour les activités á-glucosidasiques et â-galactosidasique et pH 5,0 pour l'activité â-glucosidasique). Dans chaque cas, les fractions les plus actives ont été « poolées». Les solutions obtenues contenant les enzymes purifiées à homogénéité électrophorétique ont été dialysées contre le tampon acétate 100 mM pH 5,6 ou pH 5,0 pendant plus de 12 h.

2-6-Détermination des propriétés moléculaires

Pour la détermination des masses moléculaires des glycosidases purifiées à homogénéité électrophorétique, des protéines de référence ont été utilisées. Ce sont : la âamylase (MM= 200 kDa), le sérum albumine bovine (MM= 66 kDa), l'ovalbumine (MM= 45 kDa) et le cytochrome C (MM= 12,4 kDa). Ces protéines ont été chargées séparément sur la colonne TSK (7,8 mm × 15 cm). La phase mobile utilisée a été le tampon acétate de sodium 100 mM contenant de l'azide de sodium (0,5 % , m/v). Le débit de la chromatographie a été de 30 ml/h. Il a été maintenu constant grâce à une pompe péristaltique de marque GILSON. Des fractions de 1 ml ont été collectées. Le temps d'élution de chaque protéine a été inscrit sur le chromatogramme. Connaissant les masses moléculaires des différentes protéines de

référence et leur temps d'élution, la courbe des masses moléculaires en fonction des temps d'élution a pu être tracée. Cette courbe d'étalonnage a permis de déterminer les masses moléculaires de l'á-glucosidase, de la â-glucosidase et de la â-galactosidase de la larve du charançon Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) connaissant leurs temps d'élution.

2-6-2- Détermination des masses moléculaires par électrophorèse

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyle sulfate de sodium (SDS-PAGE) a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970). Les enzymes, dans un tampon Tris-HCl 125 mM pH 6,8 contenant du SDS (10 %, m/v), du â-mercaptoéthanol (1 %, v/v), du glycérol (20 %, m/v) et du bleu de bromophénol (0,025 %, m/v), ont été dénaturées par un traitement thermique à l'eau bouillante (5 min). Dans ces conditions, les protéines se dissocient en leurs sous-unités en fixant de grandes quantités de détergent (environ 1,4 g de détergent par gramme de protéine), ce qui masque complètement la charge naturelle de la sous-unité protéique et lui confère une charge nette négative. Plus les molécules sont volumineuses, plus la charge en SDS est importante, ce qui signifie que la mobilité électrophorétique d'une molécule dépend de sa taille (poids moléculaire). L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) des trois enzymes purifiées à partir de la larve du charançon Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été réalisée sur des plaques de gel d'acrylamide (7 x 8 cm). L'épaisseur du gel a été de 1,5 mm. Il contient 12 % d'acrylamide, du tampon Tris-HCl 375 mM (pH 8,8) et du S.D.S (10 %, m/v). Une fois polymérisée, le gel a été transféré sur un dispositif HOEFFER SCIENTIFIC INSTRUMENT (Mighty Small II Unit) et refroidi par une circulation d'eau. L'électrophorèse a été réalisée avec un courant électrique de 15 mA dans le tampon de migration Tris (25 mM)/glycine (192 mM) contenant du S.D.S (0,1 %, m/v). Des marqueurs Bio-Rad de faibles poids moléculaires [Phosphorylase B (91.000 Da), le sérum albumine bovine (66 kDa), l'ovalbumine (49,9 kDa), l'anhydrase carbonique (35,1 kDa), l'inhibiteur trypsique de soja (28,4 kDa) et le lysozyme (20,8 kDa)] ont été utilisés.

Les protéines ont été révélées au nitrate d'argent (Blum et al., 1987) ou au bleu de Coomassie R-250, (0,1 % , m/v) ; solution contenant du méthanol (40 %, v/v) et de l'acide acétique (10 %, v/v). La décoloration a été réalisée par lavages successifs dans le mélange méthanol/ acide acétique/ glycérol/eau (20/7/3/70, v/v/v/v).

2-7- Influence du pH sur les activités glycosidasiques

Les pH optima d'hydrolyse des p-nitrophényl-glycosides ont été déterminés dans les tampons acétate 100 mM (pH 3,6 à 5,6) et phosphate 100 mM (pH 5,6 à 8,0). Les activités enzymatiques ont été déterminées dans les conditions standard.

2-7-2-Détermination de la stabilité au pH

La stabilité au pH des enzymes a été testée en préincubant chaque préparation enzymatique pendant 2 h à 37 °C dans les tampons acétate et phosphate 100 mM pour des valeurs de pH comprises entre 3,6 et 8,0. Les activités glycosidasiques ont été déterminées dans les conditions standard.

2-7-3-Influence de la force ionique

L'influence de la force ionique sur les activités des glycosidases a été mesurée dans les conditions standard. Les forces ioniques testées ont été celles des tampons acétate 20 mM, 50 mM et 100 mM contenant du KCl 300 mM.

2-8-Influence de la température sur les activités glycosidasiques

2-8-1-Détermination de la température optimale d'hydrolyse, du Q10 et de l'énergie d'activation

L'effet de la température sur les activités catalytiques des glycosidases a été déterminé à différentes températures (35 à 80 °C) dans le tampon acétate 100 mM pH 5 ou pH 5,6. Le Q10 a été déterminé entre 30 et 40 °C pour l'á-glucosidase et entre 40 et 50 °C pour la âgalactosidase et la â-glucosidase. Le graphe d'Arrhénius a été obtenu dans l'intervalle de 25- 40 °C pour l'á-glucosidase et 30-50 °C pour la â-glucosidase et la â-galactosidase.

2-8-2-Inactivation thermique

Pour évaluer le degré de stabilité de chaque enzyme, celle-ci a été pré-incubée à 37 °C ou à sa température optimale d'hydrolyse dans le tampon acétate 100 mM au pH optimum d'hydrolyse de l'enzyme étudiée. A chaque 10 min, une partie aliquote de 50 ul a été prélevée et refroidie à la température ambiante pendant 10 min. Elle a été utilisée pour le déclenchement de la réaction dans les conditions standard.

2-8-3-Dénaturation thermique

Les différentes solutions enzymatiques diluées dans un tampon acétate 100 mM (pH optimum d'hydrolyse de la glycosidase étudiée) ont été pré-incubées pendant 10 min aux températures allant de 30 à 80 °C, puis refroidies à la température ambiante. Les activités résiduelles ont été déterminées dans les conditions standard.

2-9-Détermination de quelques paramètres cinétiques

Pour la détermination des constantes de Michaelis et Menten (KM) et des vitesses maximales _(Vmax) des enzymes purifiées (á-glucosidase, â-glucosidase et â-galactosidase), la méthode de Lineweaver et Burk (1934) a été utilisée. Les concentrations des substrats chromophores p-nitrophényl-D-glycosides se sont situées entre 0,1 et 20 mM tandis que celles des di et oligosaccharides ont varié entre 0,1 et 20 mM. Les valeurs de KM et _Vmax obtenues ont permis de calculer les efficacités catalytiques _(KM/Vmax) des enzymes.

2-10-Actions des agents chimiques sur l'activité hydrolytique

L'enzyme a été pré-incubée pendant 10 min à 37 °C dans un milieu réactionnel de 175 ul de tampon acétate 100 mM (pH optimum d'hydrolyse de la glycosidase étudiée) contenant 1 mM ou 0,1 % (m/v) d'agent chimique. Après cette pré-incubation, 75 ul de pNP-gycoside 5 mM y ont été ajoutés pour une incubation de 10 min à 37 °C au bain marie. La réaction a été arrêtée par ajout de carbonate de sodium 1 M. L'intensité de la coloration du milieu réactionnel a été mesurée au spectrophotomètre à 410 nm par rapport à une solution témoin contenant tous les produits exceptée l'enzyme. Dans chaque cas, l'activité enzymatique a été exprimée en pourcentage de l'activité obtenue en l'absence de produits chimiques.

2-11-Réactions de transglycosylation

Les réactions de synthèse enzymatique de néoglycoconjugués ont été réalisées à 37 °C dans 2 ml d'un mélange réactionnel contenant du tampon acétate 100 mM ou phosphate 100 mM, et une quantité appropriée de solution enzymatique (12 UI), des concentrations variables de donneurs (50 à 800 mM) de glycosyle (maltose, saccharose, cellobiose et lactose) et d'accepteurs de glycosyle (25 à 600 mM) (phényléthanol). Les cinétiques de réactions de synthèse ont été suivies à différents temps entre 1 et 48 h par prélèvement de 0,2 ml de parties aliquotes. La réaction a été arrêtée par chauffage des parties aliquotes prélevées au bain-marie bouillant pendant 5 min.

2-11-2-Analyse chromatographe des produits de transglycosylation

Les parties aliquotes prélevées ont été filtrées sur une membrane hydrophile 0,2 um (Sartorius). Les produits issus des réactions de transglycosylation ont été analysés quantitativement et qualitativement par chromatographie liquide à haute performance (Spectra system) après injection de 20 ul du filtrat.

L'analyse des sucres a été réalisée grâce à un détecteur refractomètre et une colonne Supelcosyl LC-NH2 5 um (0,46 × 25 cm) de Supelco. La phase mobile a été un mélange acétronitrile/eau (75/25 ; v/v). Le débit d'écoulement a été maintenu à 0,75 ml/min. Le xylose est utilisé comme étalon interne. Quant aux hétérosides (néoglycoconjugués synthétisés), leur analyse a été suivie grâce à un détecteur (spectra system) UV à 257 nm. La phase mobile a été le mélange méthanol/eau (35/65, v/v). Un débit d'écoulement de 0,45 ml/min a été appliqué. La colonne utilisée a été l'Hypersil 5 um (0,46 × 25 cm) de Shandom. La tyrosine a été utilisée comme étalon interne.

2-11-3-Calcul du pourcentage de transglycosylation

La méthode de calcul du pourcentage de transglycosylation est celle décrite par Kouaméet al. (2005a). Elle est basée sur les schémas réactionnels de la figure 8. Le premier
monosaccharide X-OH libéré traduit l'activité totale de l'hydrolyse. Soient a, b et c les

concentrations molaires respectives du premier monosaccharide (X-O-H), du deuxième monosaccharide (Gly-OH) et du néoglycoconjugué (Gly-O-Z). On peut poser que a = b + c. Soit T, le pourcentage de transglycosylation :

X-O-H

Figure 8 : Schémas des réactions catalysées par les glycosidases (D'après Kouamé et al., 2006)

Chapitre 3

I- RECHERCHE ET DETERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES D'HYDROLYSE DES GLYCOSIDASES DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-Résultats

1-1-1-Activités exo-glycosidasiques

Les extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) ont possédé des activités exoglycosidasiques très variées. Les activités spécifiques les plus élevées se sont retrouvées dans le suc digestif (Fig. 9 et 10).

Ce sont les activités a-glucosidasique (0,49 UI/mg de protéine), f3-glucosidasique (0,69 UI/mg de protéine) et f3-galactosidasique (0,60 UI/mg de protéine). Les activités a-mannosidasique, a-xylosidasique, f3-mannosidasique, f3-fucosidasique et invertasique ont été faibles. Quant aux autres activités enzymatiques testées, elles ont été très faibles. Les extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du tube digestif n'ont pas présenté d'activité a-xylosidasique (Fig. 9 et 10).

Figure 9 : Activités á-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

	0,7
	0,7
	0,6
A ctivite specifique (UI/mg de profane)	0,5
	0,4
	0,3

	0,2
	0,1 0

Figure 10 : Activités â-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae).

1-1-2-Activités endo-glycosidasiques

Parmi les substrats testés, seuls la carboxyméthylcellulose et l'amidon ont été hydrolysés par le suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae). L'amidon a été aussi clivé par les glandes salivaires du même insecte. L'activité spécifique obtenue a été plus élevée que celle du suc digestif. Les tissus du tube digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) ont seulement dégradé la carboxyméthylcellulose. Cette activité spécifique a été très faible. Aucune activité xylanasique et pullulanasique n'a été détectée dans les extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestif (Fig. 11).

1-2- Températures et pH optima d'hydrolyse 1-2-1-Activités á-exo-glycosidasiques

Les pH optima d'hydrolyse des activités á-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du suc et du tube digestif de la larve de Rhyncophorus palmarum (Curculionidae) ont été dosés entre 4,6 et 6,0 et les températures optimales d'hydrolyse entre 40 et 55 °C (Tableau 4). Les á-exo-glycosidases des différents extraits bruts enzymatiques testés ont été acides et mésophiles.

1-2-2-Activités â-exo-glycosidasiques

Les activités â-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques du suc digestif, du tube digestif et des glandes salivaires de la larve de Rhyncophorus palmarum (Curculionidae) sont mésophiles et acides. Les pH optima se sont situés entre 4,0 et 5,6. Quant aux températures optimales d'hydrolyse, elles ont varié entre 45 et 55 °C (Tableau 5).

1-2-3-Activités endo-glycosidasiques

Les activités endo-glycosidasiques de la larve de Rhynchophorus palmarum (activités amylasique et cellulasique) ont toutes eu le même pH optimum (4,6) et la même température optimale (55 °C) (Tableau 6).

Figure 11 : Activités endo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires du tube digestif et du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Tableau 4 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités á-exoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Enzyme	Substrat	Glandes salivaires		Tube digestif		Suc digestif
	Substrat	Glandes salivaires		Tube digestif		Suc digestif
	(5 mM)
		T °C	pH	T°C	pH	T°C	pH
a-Arabinosidase	pNPaAra	50	5,0	50	5,0	50	5,0
a-Galactosidase	pNPaGal	45-50	5,0	50	5,0	50	5,0
a-Glucosidase	pNPaGlc	45-50	5,0	45	5,6	45	5,6
a-Fucosidase	pNPaFuc	50-55	5,6	55	6,0	55	6,0
a-Mannosidase	pNPaMan	50	4,0	40	4,0	40	4,0
a-Xylosidase	pNPaXyl	55	5,0-5,6	55	5,6	55	5,6

	(5 mM)
	(5 mM)	T °C	pH	T °C	pH	T °C	pH
f3-Arabinosidase	pNPf3Ara	45-50	5,0	55	5,0	55	5,0
f3-Galactosidase	pNPf3Gal	55	5,6	55	5,0	55	5,6
f3-Glucosidase	pNPf3Glc	45-50	5,0	50-55	5,6	50	5,6
f3-Fucosidase	pNPf3Fuc	55	5,6	55	4,0	55	4,0
f3-Mannosidase	pNPf3Man	45-50	5,0	50	4,6-5,0	45	4,6
f3-Xylosidase	pNPf3xyl	55	5,0-5,6	55	5,6	55	5,6

Tableau 6 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités endo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum

2-Discussion

L'étude de la dégradation des osides par le suc digestif, les broyats totaux des tissus du tube digestif et des glandes salivaires de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a montré que toutes les activités osidasiques présentes dans le suc digestif se sont retrouvées dans les extraits cellulaires des glandes salivaires et du tube digestif. Ce comportement enzymatique suggère que ces activités sont sécrétées par les glandes digestives ou par les microorganismes symbiotiques de cet insecte. Cette situation a été aussi observée chez les termites Macrotermes mulleri (Rouland, 1986) et M. bellicosus (Matoub, 1993). L'amidon est le polysaccharide le plus hydrolysé par les glandes salivaires et le suc digestif, ce qui montre que la (ou les) enzymes responsable (s) de cette activité hydrolytique est (sont) sécrétée (s) par les glandes salivaires pour être déversée (s) par la suite dans le suc digestif. Ce résultat laisse penser que celle-ci peut être sécrétée soit par les glandes digestives soit par les microorganismes présents dans le tube digestif de cette larve comme cela a été révélé chez les castes neutres du termite Macrotermes subhyalinus (Kouamé et al., 2005b) et M. bellicosus (Matoub, 1993). La présence de fortes activités amylolytiques dans le suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est en accord avec les résultats obtenus avec la plupart des coléoptères. En effet, ces insectes se nourrissent essentiellement d'aliments riches en amidon. Ce sont donc des coléoptères amylolytiques dont l'activité endoglycosidasique la plus élevée est l'a-amylase (Ishimoto et Katamura, 1989 ; Lemos et al., 1990 ; Grossi de Sa et Chrispeel, 1997 ; Silva et al., 1999 ; Titarenko et Chripeel, 2000 ; Cristofoletti et al., 2001 ; Silva et al., 2006).

L'hydrolyse du saccharose est assurée par deux types d'enzymes appelées aglucosidase et f3-fructosidase. Le suc digestif contient une forte activité a-glucosidasique qui prendrait une part active ou assurerait la dégradation de cette substance. Cette possibilité est en accord avec les travaux de Silva et al. (2004). En effet, selon ces auteurs, l'insecte Diatraea saccharalis assurerait la dégradation du saccharose par trois saccharose hydrolases dont une a-glucosidase (EC 3.2.1.20), une f3-fructosidase (EC 3.2.1.26) qui dégrade à la fois le saccharose, le raffinose et le fructosyl-trisaccharide isokestose et dont le substrat essentiel est le dernier cité et une saccharase qui n'agit seulement que sur le saccharose. Toutes ces enzymes sont sécrétées par les cellules de l'intestin moyen de l'insecte. Chez l'abeille européenne Apis mellifera, la dégradation du saccharose est assurée par une a-glucosidase (Nishimoto et al., 2001 ; Kubota et al., 2004).

Par rapport à l'amidon, la cellulose a été faiblement hydrolysée dans le suc digestif. Par contre, son activité hydrolytique a été trois fois supérieure à celle du tube digestif. Les glandes salivaires n'en possèdent pas. Ces résultats montrent que l'activité cellulasique de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) n'est pas sécrétée par les glandes salivaires de l'insecte. Elle peut être synthétisée soit par les tissus du tube digestif, soit par les tissus d'autres glandes, soit par des microorganismes contenus dans le suc digestif de l'animal. Quant à l'activité f3-glucosidasique synergique de celle de la cellulase pour dégrader la cellulose en glucose, son activité hydrolytique a été très élevée dans le suc digestif et faible dans les tissus des glandes salivaires et du tube digestif. Cette situation ne permet pas d'expliquer clairement la provenance de cette forte activité f3-glucosidasique. Est-elle d'origine microbienne comme cela a été évoqué par plusieurs auteurs chez les insectes ? En effet, chez ces derniers, la caractérisation des enzymes assurant la digestion de la cellulose est très complexe à cause de la diversité d'origine de celles présentes dans l'intestin des insectes. Les enzymes des tubes digestifs sont produites par des microorganismes symbiotiques (Martin, 1983 ; 1987) qui sont des protozoaires (Cleveland, 1923 ; Trager, 1932 et 1934 ; Yamin, 1978 ; Yamin et Trager, 1979), des bacteries (Beckwith et Rose, 1929 ; French et Bland, 1975) et des champions (Abo-khatwa, 1978 ; Martin et Martin, 1978 ; 1979 : Rouland et al., 1988). Une faible activité cellulasique pour une faible que l'activité f3- glucosidasique a été obtenue. Cette situation enzymatique laisse penser que la ou les enzyme (s) responsable (s) de l'activité f3-glucosidasique peut (peuvent) avoir d'autres rôles importants notamment dans la digestion des glycoprotéines, des glycolipides et des oligosaccharides résultant de la dégradation des hémicelluloses. L'activité f3-galactosidasique a aussi une origine difficile à définir à partir de notre travail. Elle a été très élevée alors que la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) ne consomme pas de lait dont le sucre essentiel est le lactose. Cette activité enzymatique pourrait donc avoir pour rôle la dégradation des oligosaccharides provenant de la digestion de certaines hémicelluloses tels que les galactanes et les arabino-galactanes.

Le suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) n'a pas hydrolysé le pullulane et le xylane, ce qui montre que cet insecte n'est pas xylanolytique comme certains insectes tels que les termites M. subhyalinus (Kouamé, 2006) et M. bellicosus (Matoub, 1993). Il a révélé la présence d'une activité a-xylosidasique qui n'a été sécrétée ni dans les glandes salivaires, ni dans les tissus du tube digestif. Cette activité peut avoir été produite par d'autres glandes digestives ou par des microorganismes symbiotiques.

Les températures et pH optima d'hydrolyse des glycosidases ont varié respectivement de 40-55 °C et de 4,0-5,6. Ce résultat suggère qu'il n'existe pas dans l'appareil digestif de la larve de glycosidases thermophiles. Ces enzymes sont toutes acides et mésophiles. Ce résultat est en accord avec ceux obtenus avec la blatte Periplaneta americana (Kouamé et al., 2005) et différents de ceux de M. bellicosus (Matoub, 1993) et de M. subhyalinus (Kouamé, 2006). En effet, chez les insectes, les enzymes responsables de la dégradation du xylane en xylobiose sont thermophiles et acides.

Conclusion

La larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) possède dans son suc digestif une variété de glycosidases acides et mésophiles sécrétées par les glandes digestives, par l'insecte lui-même ou par des microorganismes. Les activités enzymatiques les plus élevées sont celles des glucosidases et de la â-galactosidase. Les glandes salivaires sécrètent une forte activité amylasique.

Pour la suite de ce travail, les activités osidasiques les plus élevées dans le suc digestif seront purifiées et caractérisées afin de déterminer leur rôle précis dans le tube digestif et envisager leur éventuelle utilisation dans le domaine industriel.

II- PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE L'á-GLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-Résultats

La stratégie de purification utilisée pour isoler à homogénéité électrophorétique l'áglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae), a été la suivante :

- fractionnement de la solution enzymatique issue de la chromatographie échangeuse d'anion au sulfate d'ammonium ;

1-1-1- Chromatographie échangeuse d'anion sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B

L'extrait brut enzymatique résultant du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est un milieu visqueux contenant de nombreux pigments et est riche en activités glycosidasiques. La chromatographie échangeuse d'anion sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B a permis non seulement d'éliminer une bonne partie de ces pigments mais aussi de retenir une seule activité á-glucosidasique sur le gel de D.E.A.ESepharose CL-6B. Cette activité a été éluée à la concentration de 0,3 M de KCl (Fig. 12). L'activité spécifique de cette enzyme a été de 1,26 UE /mg. Le rendement et le facteur de purification ont été respectivement de 81,62 % et 2,57 (Tableau 7).

1-1-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium

Cette étape a permis d'améliorer le facteur de purification passant de 2,57 à 3,04. Le rendement obtenu est de 75,64 % (Tableau 7).

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR

Cette étape chromatographique a permis non seulement d'obtenir un seul pic d'activité á-glucosidasique mais aussi d'éliminer le reste des pigments contenus dans la solution enzymatique (Fig. 13). L'enzyme responsable de l'hydrolyse du p-nitrophényl-á-D-glucoside a une activité spécifique de 32,23 UE/mg de protéine. Le facteur de purification et le rendement ont été respectivement de 65,77 et 34,43 % (Tableau 7).

1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de Phényl Sepharose CL-4B

Cette étape de chromatographie a permis d'isoler une seule á-glucosidase (Fig. 14). Elle a été éluée par du thiosulfate de sodium 0,3 M préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Son activité spécifique a été de 94,16 UE/mg. Le facteur de purification et le rendement ont été respectivement de 20,12 et 19,18 % (Tableau 7).

Figure 12 : Profil chromatographique d'échange d'anion de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de D.E.A.ESepharose CL-6B

La colonne (2,4 × 6,5 cm) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a été de 14ml/ h. Les protéines retenues ont été décrochées par un gradient en palier croissant de KCl préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 4 ml ont été collectées.

Figure 13 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de Sephacryl S100 HR

La colonne (1,6 × 64 cm) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a été de 15ml /h. Les protéines ont été éluées par le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 1 ml ont été collectées.

Figure 14 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de PhénylSepharose CL-4B

La colonne (1,4 × 5cm) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 contenant du thiosulfate de sodium 1,7 mM. Le débit chromatographique a été de 14 ml/h. Les protéines retenues par le gel ont été décrochées par un gradient en palier décroissant de thiosulfate de sodium préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 1ml ont été collectées.

Tableau 7 : Bilan global de la purification de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Etape de purification	Activité totale (U.E.)	Protéine (mg)	Activité Spécifique (UE /mg)	Facteur de purification	Rendement (%)
Extrait brut enzymatique	28,08	57,36	0,49	1	100
D.E.A.E. Sepharose CL-6B	22,92	18,18	1,26	2,57	81,62
Précipitation au sulfate d'ammonium (80 % de saturation)	21, 24	14,24	1,49	3,04	75,64
Sephacryl S-100 HR	9, 67	0,3	32,23	65,77	34,43
Phényl-Sepharose CL-4B	5, 65	0,06	94,16	20,12	19,12

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de â-mercaptoéthanol a permis d'observer une seule bande protéique, traduisant une pureté satisfaisante de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) (Fig. 15).

1-3-Masses moléculaires de l'á-glucosidase

Les masses moléculaires de l'á-glucosidase déterminées en gel de filtration sur la colonne TSK et en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de âmercaptoéthanol ont été respectivement de 60 kDa et 55 kDa. Cette similarité de masse moléculaire montre que l'enzyme est monomérique (Tableau 8).

Figure 15 : á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) purifiée par électrophorèse

Gel de polyacrylamide en présence de SDS et de beta-mercapto-éthanol. Ligne 2, Protéines de référence. ligne 1, á-glucosidase.

Tableau 8 : Masses moléculaires de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-4-Influence du pH sur l'activité de l'á-glucosidase

L'á-glucosidase a présenté un maximum d'activité hydrolytique dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 (Tableau 9). Elle a conservé plus de 80 % de cette activité hydrolytique dans le domaine de pH allant de 5,0 à 6,0. Aux pH compris entre 7,6 et 8,0 ; l'enzyme a présenté une activité catalytique faible ne dépassant pas 35 % d'activité (Fig. 16).

1-4-2-Stabilité au pH

L'á-glucosidase a été stable pendant 2 h dans le tampon acétate 100 mM aux pH compris entre 4,0 et 5,6 (Fig. 17).

1-4-3-Influence de la force ionique du tampon

La force ionique du tampon n'a exercé aucune influence sur les valeurs des pH optima d'hydrolyse de l'á-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) (Tableau 9).

Figure 16 : pH optimum d'hydrolyse de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Le pH optimum d'hydrolyse du p-nitrophényl-á-glucoside a été déterminé dans les tampons acétate 100 mM (pH 3,6 à 5,6) et phosphate 100 mM (pH 5,6 à 8,0). L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 17 : Stabilité au pH de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

L'enzyme a été pré-incubée pendant 2 h à 37 °C dans les tampons acétate et phosphate 100 mM pour des valeurs de pH comprises entre 3,6 et 8,0. L'activité résiduelle a été déterminée dans les conditions standard.

1-5-Influence de la température sur l'á-glucosidase

L'a-glucosidase a eu une température optimale d'hydrolyse de 45 °C dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. De 30 à 50 °C, elle a conservé plus de 60 % de son activité hydrolytique (Fig. 18). Le _Q10 de l'a-glucosidase, déterminé entre 30 °C et 40 °C selon Arrhenius a été de 1,31. L'énergie d'activation (Ea) de l'a-glucosidase a été de 36,67 kJ/mole (Tableau 9).

1-5-2- Inactivation thermique

L'étude de l'inactivation thermique de l'a-glucosidase a permis de mettre en évidence une baisse importante de l'activité hydrolytique de cette enzyme à partir de la 40^ème min de pré-incubation dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 à 45 °C (Fig. 19). La demi-vie de cette enzyme à 45 °C a été de 50 min (Tableau 9). A 37 °C, l'a-glucosidase a conservé toute son activité hydrolytique dans le même tampon acétate 100 mM pH 5,6 pendant plus de 140 min soit plus de 2 h 30 min de temps de pré-incubation.

1-5-3-Dénaturation thermique

L'a-glucosidase a conservé 100 % de son activité hydrolytique aux températures comprises entre 30 et 45 °C dans les conditions expérimentales. Au-delà de 50 °C, la chute brutale de l'activité enzymatique traduit une importante dénaturation de l'a-glucosidase (Fig. 20).

1-5-4-Conservation au froid

Une conservation prolongée par congélation de l'a-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) contenue dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 n'a pas modifié l'activité de celle-ci, même au bout d'un an (Fig. 21).

Figure 18 : Température optimale d'hydrolyse de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

La température optimale d'hydrolyse du p-nitrophényl-á-glucoside a été déterminée à différentes températures (35 à 80 °C) dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 19 : Inactivation thermique de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) à 37 °C et à 45 °C

L'enzyme est pré-incubée aux températures de 37 et 45 °C pendant des temps compris entre 0 et 140 min. L'activité résiduelle a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 20 : Dénaturation thermique de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

L'enzyme a été pré-incubée pendant 10 min à des températures comprises entre 30 et 80 °C, puis refroidie à la température ambiante. L'activité résiduelle a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 21 : Effet de la congélation sur de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) dans le tampon acétate 100 mM à pH5,6

Tableau 9 : Quelques caractéristiques de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-6-Spécificité de substrat

La spécificité de substrat de l'á-glucosidase a été testée sur un grand nombre de pnitrophényl-glycosides. Seul le substrat pNP-á-D-glucopyranoside a été hydrolysé par l'enzyme. Ce biocatalyseur possède donc une spécificité stricte vis-à-vis du résidu glucosyle en position á (Tableau 10).

1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et polysaccharides

L'á-glucosidase n'a pas hydrolysé pas le xylobiose, le cellobiose, le lactose, le mélibiose, le mélizitose, l'arabino-galactane, la carboxyméthylcellulose, l'inuline, le xylane, le lichenane et l'amidon. Cependant, elle a dégradé les maltodextrines, le tréhalose, le kojibiose, le nigérose et le saccharose. Les maltodextines (sauf l'isomaltose), le kojibiose et le saccharose ont été les oligosaccharides les plus hydrolysés.

La vitesse d'hydrolyse des maltodextrines par l'á-glucosidase augmente lorsque la chaîne de glucose s'allonge jusqu'à 5 unités de glucose. Au-delà de 5 unités, la vitesse de la réaction diminue (Tableau 11).

Tableau 10 : Activité hydrolytique de l'á-glucosidase sur les p-nitrophényl-glycosides

Tableau 11 : Spécificité de substrat de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Maltoheptaose Glcá(1-4)Glcá(1-4)Glcá(1-4)Glcá(1-4) Glcá(1-4) Glcá(1-4)Glc 96

1-7-Paramètres cinétiques

Selon la représentation de Lineweaver et Burk (1934), la valeur de KM de l'áglucosidase obtenue avec le pNP-á-D-glucopyranoside a été de 0,30 mM tandis que la vitesse maximale _(Vmax) a été de 142,20 UE /mg de protéine. Avec le maltose, le saccharose et le kojibiose, les valeurs de KM ont été respectivement de 1,31 ; 0,42 et 0,57 mM, avec des vitesses maximales respectives de 48,23 ; 77,54 et 62,23 UE/mg de protéine. Les efficacités catalytiques _(Vmax/KM) des substrats naturels tels que le maltose, le kojibiose et le saccharose montrent que l'á-glucosidase a eu un meilleur pouvoir catalytique pour le saccharose (Tableau 12).

1-8-Action des agents chimiques

Les ions métalliques K⁺ et Na⁺ et le triton X-100 n'ont pas exercé d'effet sur l'áglucosidase. Tous les autres agents chimiques testés sont des inhibiteurs. Les ions métalliques Zn²⁺ et Cu²⁺ ont complètement inhibé l'activité de l'á-glucosidase. Le DTNB et l'ion Fe³⁺ ont fortement inhibé cette activité (Tableau 13).

Tableau 12 : Quelques paramètres cinétiques de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Tableau 13 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

	Agents chimiques	Concentration (mM ou %)	Activité relative (%)
	Témoin	1	100
	Ba²⁺	1	56
	Mg²⁺	1	76
	Mn²⁺	1	50
	Sr²⁺	1	81
	Ca²⁺	1	82
Ions	Cu²⁺	1	0
	Zn²⁺	1	0
	Na⁺	1	100
	K+	1	100
	EDTA	1	82
	Fe³⁺	1	7
	Tris	1	10
	â-mercaptoéthanol	0,1	86
Réducteurs	pCMB	0,1	73
	DTNB	0,1	2
	Triton X-100	0,1	100
	Tween 80	0,1	90
Détergents	SDS	0,1	44
	Urée	0,1	88
	Guanidine	0,1	78

1-9-Réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase

Les pH optima de transglucosylation de l'á-glucosidase lorsque le saccharose et le maltose ont été utilisés comme donneurs de glucosyle et le 2-phényléthanol comme accepteur de glucosyle ont été identiques. La valeur a été de 5,0 (Fig. 21).

1-9-2-Influence du temps d'incubation

Les pourcentages maxima de synthèse de phényléthylglucoside ont été obtenus en 12 h de réaction quel que soit le donneur de glucosyle utilisé. Les deux valeurs sont identiques (62 %). Après 12 h de réaction, les pourcentages de transglucosylation ont considérablement diminué (Fig. 22).

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur sur l'activité de transglucosylation

Les rendements d'activité de transglucosylation ont été meilleurs pour une concentration d'accepteur de 100 mM quel que soit le donneur utilisé. Entre 400 et 600 mM, les pourcentages de transglucosylation ont été très faibles. Il en a été de même pour les concentrations comprises entre 25 et 50 mM (Fig. 23).

L'ensemble des paramètres physico-chimiques des réactions catalysées par l'áglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est repris dans le tableau 14.

1-9-4-Influence de la concentration du donneur sur l'activité de transglucosylation

Le meilleur pourcentage de transglucosylation a été obtenu avec des concentrations de donneur de glucosyle de 400 mM. Au-delà de cette concentration, les pourcentages de transglucosylation ont considérablement diminué (Fig. 24).

Le Tableau 14 récapitule les donnés relatif à la détermination des conditions optimales de transglycosylation

Figure 22 : Influence du pH sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'áglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle : 2- phényléthanol 100 mM. Tampon acétate 100 mM (pH 3,6-5,4) phosphate 100 mM (pH 5,4-8). Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Figure 23 : Influence du temps d'incubation sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2 phényléthonal 100 mM. Tampon acétate 100 mM pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 0 à 36 h.

Figure 24 : Influence de la concentration de l'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) sur les réactions de transglucosylation catalysées par l' á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2- phényléthanol (100 à 600 mM). Tampon acétate 100 Mm pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Figure 25 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase de suc digestif de la larve Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : saccharose ou maltose (0 à 800 mM). Accepteur de glucosyle: 2- phényléthanol (100 à 600 mM). Tampon acétate 100 Mm pH 5,0. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 12 h.

Tableau 14 : Récapitulatif des conditions optimales des réactions de transglycosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) et le meilleur pourcentage de transglucosylation.

La purification à homogénéité électrophorétique de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) du palmier Elaeis guineensis a nécessité l'utilisation de trois étapes chromatographiques à basse pression. Ce sont les chromatographies d'échangeuse d'anion, d'exclusion moléculaire et d'interaction hydrophobe.

La courbe de variation d'activité en fonction de la température de l'enzyme purifiée a donné une température optimale d'hydrolyse de 45 °C indiquant que l'á-glucosidase est un biocatalyseur mésophile. Cette valeur de température optimale est identique à celle de l'áglucosidase du microorganisme Xanthophyllomyces dendrorhous (Marin et al., 2006) et différente de celles des á-glucosidases de la fraction insoluble du cristallin de bovin (50 °C) (Kamei et Fujiyama, 1995) et des microorganismes Candida albicans (37 °C) (TorreBouscoulet et al., 2004) et Thermomonospora curvata (54 °C) (Janda et al., 1997).

Le pH optimum d'hydrolyse de l'á-glucosidase est de 5,6. Il s'agit donc d'une enzyme acide. Lorsque ce pH optimum d'hydrolyse est comparé à ceux des á-glucosidases du muscle de lapin (pH 4,5) (Matsui et al., 1984), du foie du lapin (pH 4,7) (Onodera et al., 1989) et de Pichia pastoris (pH 3,5-4,5), cette enzyme parait moins acide mais elle est plus acide lorsqu'elle est comparée à ceux des á-glucosidases du tube digestif de l'insecte Rhynchosciara americana ( pH 6,0) (Terra et al., 1977), des organes reproducteurs et du plasma du taureau (6,5-7) (Jauhiainen et vanha-Perttula, 1985), des microorganismes Torulaspora pretoriensis YK-1 (pH 6,8) (Oda et al., 1993) et Thermotoga maritima (pH 7,5) (Raasch et al., 2000).

L'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est une protéine monomérique. Cette situation est identique à celles des áglucosidases de l'insecte Drosophila melanogaster (á-glucosidase II and III) (Tanimura et al., 1979), de l'abeille Apis mellifera (Nishimoto et al., 2001 ; Lee et al., 2001) et de l'intestin de rat (Sasajima et al., 1975), mais différente de celles des á-glucosidases du foie de porc (Tashiro et al., 1986), du cortex rénal de lapin (Pereira et sivakami, 1989) et du microorganisme Sulfolobus solfutaricus 98/2 (Suzuki et al., 1987 ; Nakao et al., 1994 ; Rolfsmeier et Blum, 1995) qui sont oligomériques.

L'á-glucosidase est inhibée par le DTNB et le pCMB, ce qui indique la présence de groupement(s) sulfhydryle(s) dans le site actif de l'enzyme. Ce résultat est en accord avec ceux trouvés par Sasajima et al. (1975) et Yoshiki et al. (2005) respectivement sur les á-

glucosidases de la muqueuse de l'intestin de rat et des grains de mil. Il est différent de celui de Prakash et al. (1983) avec l' a-glucosidase de l'intestin de pigeon.

L'a-glucosidase est inactive sur les polymères de poids moléculaires élevés comme le lichenane, le xylane, la carboxyméthylcellulose, l'inuline, l'amidon, l'arabino-galactane. Ce résultat a été déjà observé avec les a-glucosidases de la graine d'épinard Spinacia oleracea (Sugimoto et al., 1995), de Thermomonospora curvata (Janda et al., 1997), des champignons Aspergillus niger et A. oryzae (Kita et al., 1991). Cette enzyme ne possède aucune activité glycosidasique contaminante telles que les activités a-galactosidasique, a-fucosidasique, amanosidasique, a-arabinosidasique a-xylosidasique. Ce comportement cinétique montre que cette enzyme est hautement spécifique du résidu glucosyle. Elle hydrolyse de préférence les liaisons a-(1-2) et a-(1-4). La détermination des paramètres cinétiques a permis d'obtenir une constante de Michaelis-Menten de 0,30 mM lorsque le p-nitrophényl-a-D-glucopyranoside est utilisé comme substrat. Ce résultat est identique à celui rapporté par Kita et al. (1991), dont les travaux ont porté sur l'étude de la spécificité de l'a-glucosidase du champignon Aspergillus niger. Il est différent des études réalisées par Suzuki et al. (1997) sur l'aglucosidase de la bactérie Bacillus Thermoamylotiquefaciens dont la constante déterminée est de 0,56 mM. Les constantes de Michaelis Menten déterminées avec l'a-glucosidase de la larve de Rhynchopholorus palmarum (Curculionidae) utilisant comme substrat le saccharose, le maltose, et le kojibiose sont respectivement de 0,42 ; 1,31 et 0,57 mM. Ces valeurs sont plus faibles que celles des a-glucosidases du foie de rat (Lavrenova et Presnova, 1994), de l'insecte Drosophila melanogaster (Tanimura et al., 1979) et du muscle de lapin (Matsui et al., 1984). Les valeurs des efficacités catalytiques _(Vmax/KM) permettent de dire que l'enzyme purifiée hydrolyse efficacement le saccharose. Cette situation laisse penser que le rôle biologique principal de l'a-glucosidase la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est la dégradation du saccharose contenu dans la sève du palmier. Il s'agit d'une saccharase. En plus de cette action principale, l'a-glucosidase peut assurer efficacement la digestion du maltose et des maltodextrines (sauf l'isomaltose) qui sont des produits d'hydrolyse de l'amidon.

La capacité de l'a-glucosidase de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) à catalyser des réactions de transglucosylation a été testée. Le saccharose et le maltose ont été utilisés comme donneurs de glucosyle et le 2-phényléthanol comme accepteur de glucosyle.

L'intérêt du choix de ces substrats comme donneurs de glucosyle est dû à leur capacité à être
facilement hydrolysés par l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus

palmarum (Curculionidae). Quant à l'accepteur de glucosyle, il présente également des avantages. En effet, le phényléthanol est un composé insoluble dans l'eau. Cette propriété est caractéristique de la plupart des macromolécules naturelles. Les produits (phényléthylglucoside) des réactions de transglucosylation sont facilement quantifiables par absorbance UV. Pour cette facilité de détection, le phényléthanol a été déjà utilisé pour étudier les activités de transglycosylation de glycosidases du champignon Aspergillus oryzae (Fortun et Colas, 1991), de l'escargot géant Achatina achatina (Leparoux et al., 1997), de la bactérie Thermus thermophilus (Dion et al., 1999) et de Macrotermes subhyalinus (Kouamé et al., 2001, 2005a). Les conditions expérimentales de transglucosylation ont été optimisées au niveau de certains facteurs capables d'influencer le taux de transglucosylation. Le pH optimum de transglucosylation de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est de 5,0. Cette valeur est différente du pH optimum d'hydrolyse (5,6). Pour expliquer cette différence de pH, Huber et al. (1983) ont suggéré l'existence d'un groupement ionique avec une grande valeur de pKa au niveau du site actif, ce qui affecterait l'hydrolyse mais pas la transglycosylation. Aussi, cette différence pourrait-elle s'expliquer par le taux d'hydrolyse de la liaison glycosidique qui décroît avec une augmentation du pH de manière à induire le changement observé (Huber et al., 1983). Dans le cas de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae), la différence de pH optimum des réactions d'hydrolyse et de transglucosylation n'est pas significative, ce qui ne permet pas de conduire à des réactions de synthèse à cause de l'hydrolyse rapide des produits de transglucosylation formés. Ainsi, le taux de transglucosylation est plus important que celui de l'hydrolyse du produit formé. Le temps de réaction apparaît comme un paramètre important car certains produits formés durant les réactions de transglucosylation peuvent être utilisés comme substrats et être hydrolysés. Pour l'a-glucosidase étudiée, un taux maximum de transglucosylation a été obtenu dans un temps relativement court (environ 12 h) sans qu'il n'y ait eu hydrolyse des produits formés au cours de la transglucosylation. Apres 12 h de réaction, le pourcentage de transglucosylation a diminué. Le produit formé au cours de la réaction de transglucosylation pourrait être le phényléthyl-a-D-glucoside. Ce résultat suggère que l'a-glucosidase hydrolyse le produit formé par son extrémité non réducteur en libérant l'a-glucose. Ce comportement montre que l'a-glucosidase purifiée a opéré par rétention de configuration anomérique. Le taux de transglucosylation obtenu avec le 2-phényléthanol (62 %) est plus élevé que ceux rapportés dans la littérature avec les sources conventionnelles de glycosidases (E.coli, A. oryza).

Conclusion

La larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) possède dans son suc digestif une á-glucosidase acide mésophile qui a été purifiée à homogénéité électrophorétique. Cette enzyme semble être différente des á-glucosidases des autres sources enzymatiques jusque là rapportées par les travaux des différents auteurs lorsqu'on tient compte de la spécificité de substrat, des constantes de Michaelis et Menten et des activités transglucosidasiques élevées. Cette enzyme est une saccharase. Son rôle biologique principal dans le suc digestif de la larve est d'hydrolyser le saccharose. Cependant, elle dégrade efficacement le maltose et les maltodextrines. Cette enzyme pourrait être utilisée comme outil de choix dans l'analyse structurale des chaînes d'oligosaccharides, de polysaccharides, de glycoprotéines et de glycolipides. Elle peut aussi être utilisée pour la synthèse des glycoconjugués.

III- PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA â-GLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-Résultats

La stratégie de purification utilisée pour isoler à homogénéité électrophorétique la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est identique à celle décrite précédemment.

Cette étape chromatographique a permis non seulement d'éliminer une bonne partie des pigments mais aussi de retenir une seule activité â-glucosidasique sur le gel DEAESepharose CL 6B. Cette activité a été éluée à la concentration de 0,2 M de KCl (Fig. 26). L'activité spécifique de cette enzyme a été de 4,53 UE/mg. Le rendement et le facteur de purification ont été respectivement de 60,00 % et 6,56 % (Tableau 15).

1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium

Cette étape a permis d'améliorer le facteur de purification passant de 6,57 à 10,14. Le rendement obtenu a été de 38,77 % (Tableau 15).

Cette étape chromatographique a permis non seulement d'obtenir un seul pic d'activité â-glucosidasique mais aussi d'éliminer le reste des pigments contenus, dans la solution enzymatique (Fig. 27). L'enzyme responsable de l'hydrolyse du p-nitrophenyl-â-D-glucoside a eu une activité spécifique de 9,37 UE/mg de protéine. Le facteur de purification et le rendement ont été respectivement de 13,58 et 16,2 % (Tableau 15).

1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B

Une seule â-glucosidase a été isolée (Fig. 28). Elle a été éluée par le thiosulfate de sodium 0,2 M préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Son activité spécifique a été de 25,10 UE/mg. Le facteur de purification et le rendement ont été respectivement de 36,38 et 4,47 % (Tableau 15).

Figure 26 : Profil chromatographique d'échange d'anion de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de D.E.A.ESepharose CL 6B.

La colonne (2,4 x 6,5 cm) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a été de 14 ml/h. Les protéines retenues par le gel sont décrochées par un gradient en palier croissant de KCl préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 4 ml ont été collectées.

Figure 27 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de Sephacryl100 HR.

La colonne (1,6 x 64) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Le débit chromatographique a été de 15 ml/h. Les protéines ont été éluées par le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 1 ml ont été collectées.

Figure 28 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) sur gel de PhénylSepharose CL-4B

La colonne (1,4 x 5 cm) a été équilibrée dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6 contenant du thiosulfate de sodium 1,7 mM. Le débit chromatographique a été de 14 ml/h. les protéines retenues par le gel ont été décrochées par un gradient en palier décroissant de thiosulfate de sodium préparé dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. Des fractions de 1 ml ont été collectées.

Tableau 15 : Bilan global de purification de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Etape de purification	Activité totale (U.E.)	Protéine (mg)	Activité spécifique (U.E/mg)	Facteur de purification	Rendement (%)
Extrait brut enzymatique	39,30	57,36	0,69	1	100
D.E.A.E Sepharose CL-	22,40	4,15	4,53	6,56	60,00
6B
Précipitation au sulfate d'ammonium (80% de saturation)	15,24	0,75	7,00	10,14	38,77
Sephacryl S-100 HR	6,37	0,68	9,37	13,58	16,21
Phényl-Sepharose CL-4B	1,75	0,07	25,10	36,38	4,47

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de â-mercaptoéthanol a permis d'observer une seule bande protéique, traduisant une pureté satisfaisante de la â-glucosidase du suc digestif de la larve Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Les masses moléculaires de la â-glucosidase déterminées en gel de filtration sur la colonne TSK et en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de âmercapto-éthanol ont été respectivement de 60 et de 58 kDa. Cette similarité de masse moléculaire montre que l'enzyme est monomérique (Tableau 16).

Figure 29 : â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) purifiée par électrophorèse palmarum.

Tableau 16 : Masses moléculaires de la â-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Méthode de détermination de la masse moléculaire moléculaire sous-unité

La â-glucosidase a présenté son activité maximale dans le tampon acétate 100 mM pH 5,0 (Tableau 17). Elle a conservé plus de 70 % de son activité hydrolytique dans un domaine de pH allant de 4,6 à 6,0. Aux pH compris entre 6,6 et 8,0, l'enzyme a présenté une faible activité ne dépassant pas 40 % (Fig. 30).

La â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été stable pendant 2 h dans le tampon acétate 100 mM aux pH compris entre 5,0 et 6,0 (Fig. 31).

La force ionique n'a exercé aucune influence sur les valeurs des pH optima d'hydrolyse de la â-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) (Tableau 17).

Figure 30 : pH optimum d'hydrolyse de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae).

Le pH optimum d'hydrolyse du p-nitrophényl-â-D-glucoside a été déterminé dans les tampons acétate 100 mM (pH 3,6 à 5,6) et phosphate 100 mM (pH 5,6 à 8,0). L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 31 : Stabilité au pH de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

L'enzyme a été pré-incubée pendant 2 h à 37 °C dans les tampons acétate et phosphate 100 mM pour des valeurs de pH comprises entre 3,6 et 8,0. L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

1-5- Influence de la température sur la â-glucosidase

La â-glucosidase a eu une température optimale d'hydrolyse de 55 °C dans le tampon acétate 100 mM pH 5,0. Aux températures comprises entre 40 °C et 60 °C, elle a conservé plus de 60 % de son activité hydrolytique (Fig. 32). Le _Q10 de la â-glucosidase, déterminé selon Arrhenius entre 40 et 50 °C a été de 1,90. L'énergie d'activation (Ea) de l'enzyme a été de 68,77 Kj/mol (Tableau 17).

1-5-2-Inactivation thermique

A 55 °C, la â-glucosidase s'est rapidement dégradé. Son activité résiduelle a été de 50 % après 45 min de pré-incubation dans le tampon acétate 100 mM pH 5,0 (Tableau 17). En 2 h 20 min de pré-incubation dans ce même tampon, elle a totalement perdu son activité hydrolytique (Fig. 33). A 37 °C, la â-glucosidase a conservé toute son activité dans le même tampon pendant plus de 2 h de temps de pré-incubation.

1-5-3-Dénaturation thermique

La â-glucosidase a été stable entre 30 et 55 °C pendant 10 min de pré-incubation dans le tampon acétate 100 mM pH 5,0. Au-delà de 55 °C, l'activité a brutalement chuté pour traduire une importante dénaturation de la â-glucosidase (Fig. 34).

1-5-4-Conservation au froid

Une conservation prolongée par congélation de la â-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) contenu dans le tampon acétate 100 mM pH 5,0 n'a pas modifié l'activité hydrolytique du biocatalyseur pendant un an (Fig. 35).

	100
Activite relative (%)	80
	60
	40
	20 0

Figure 32 : Température optimale d'hydrolyse de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

La température optimale d'hydrolyse du p-nitrophényl-â-glucoside a été déterminée à différentes températures (35 à 80 °C) dans le tampon acétate 100 mM pH 5,6. L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 33 : Inactivation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

L'enzyme a été pré-incubée aux températures de 35 et 55 °C pendant des temps compris entre 0 et 140 min. L'activité enzymatique a été déterminée dans les conditions standard.

Figure 34 : Dénaturation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Figure 35 : Effet de la congélation de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) dans le tampon acétate 100 mM à pH 5,0

Tableau 17 : Quelques caractéristiques de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-6-Spécificité du substrat

La spécificité de substrat de la f3-glucosidase a été testée sur un grand nombre de pnitrophényl-D-glycosides. Elle n'a seulement hydrolysé que le pNP-f3-D-glucopyranoside. Ce biocatalyseur possède donc une spécificité stricte vis-à-vis du résidu glucosyle en position f3 (Tableau 18).

1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et polysaccharides

La vitesse d'hydrolyse de la f3-glucosidase augmente lorsque la chaîne de glucose des cellodextrines s'allonge jusqu'à 3 unités de glucose. Au-delà de 3 unités, la vitesse de la réaction diminue. Les liaisons f3(1-2), f3(1-3) et f3(1-6) ont été faiblement hydrolysées (Tableau 19). La f3-glucosidase n'a pas hydrolysé le lactose, le saccharose, le xylobiose et le maltose. Il en a été de même pour les polysaccharides tels que l'arabino-galactane, la carboxyméthylcellulose, l'inuline, le lichenane, la laminarine, le xylane et l'amidon

Tableau 18 : Activité hydrolytique de la fi-glucosidase sur les p-nitrophényl-D-glycosides Substrats Activité

Tableau 19 : Spécificité de substrat (oligosaccharides et polysaccharides) de la fglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Les valeurs de la constante de Michaelis-Menten (KM) et de la vitesse maximale (Vmax) d'hydrolyse de pNP-â-D-glucopyranoside ont été respectivement de 0,25 mM et de 62,20 UE/mg de protéine. Avec le cellobiose, les valeurs de KM et de _Vmax ont respectivement été de 0,31 mM et 43,23 UE/mg de protéine. L'efficacité catalytique donnée par le rapport Vmax/KM a été plus élevée avec le pNP-â-glucopyranoside qu'avec le cellobiose (Tableau 20).

Tableau 20 : Quelques paramètres cinétiques de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

1-8-Action des agents chimiques

Les ions métalliques K⁺ et Na⁺ ont exercé un léger effet activateur sur la âglucosidase, tandis que les agents chimiques Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺, DTNB (5,5-dithio-bis(2- nitrobenzoate)), pCMB (para-chloromercuribenzoate), EDTA et SDS ont inhibé son activité. Les ions divalents Ba²⁺, Mg²⁺, Sr²⁺, Ca²⁺ n'ont eu aucun effet sur la même activité enzymatique (Tableau 21).

Tableau 21 : Effet de quelques agents chimiques sur la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

	Agent chimique	Concentration (% ou mM)	Activité relative (%)
	Témoin	1	100
	Ba²⁺	1	100
	Mg²⁺	1	100
	Mn²⁺	1	100
	Sr²⁺	1	100
	Ca²⁺	1	100
Ions	Cu²⁺	1	13
	Zn²⁺	1	67
	Na⁺	1	110
	K+	1	119
	EDTA	1	82
	Fe³⁺	1	71
	Tris	1	100
	â-mercapto-éthanol	0,1	86
	pCMB	0,1	56
Réducteurs
	DTNB	0,1	8
	L-cystéine	0,1	95
	Triton X-100	0,1	100
	Tween 80	0,1	100
Détergents	SDS	0,1	58
	Urée	0,1	94
	Guanidine	0,1	100

1-9-Réactions de transglucosylation catalysées par la â-glucosidase 1-9-1-Influence du pH sur l'activité de transglucosylation

Lorsque le cellobiose et le 2-phényléthanol ont été utilisés respectivement comme donneur et accepteur de glucosyle dans la réaction de transglucosylation catalysée par la âglucosidase, le pH optimum a été de 6,6 (Fig. 36).

Le pourcentage maximum de synthèse du phényléthylglucoside a été obtenu en 16 h de réaction. Cette valeur a été de 20 %. Après 16 h de réaction, le pourcentage de transglucosylation a considérablement diminué pour atteindre 8 % (Fig. 37) en 36 h de réaction.

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur

Le meilleur pourcentage de transglucosylation a été obtenu pour une concentration d'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) de 100 mM lorsque la concentration du donneur de glucosyle (cellobiose) a été de 400 mM. Entre 0 et 50 mM, les pourcentages de transglucosylation ont été très faibles et n'ont pas dépassé 7 % (Fig. 38).

1-9-4-Influence de la concentration du donneur

Le meilleur pourcentage de transglucosylation a été obtenu avec une concentration de donneur de glucosyle de 400 mM. Au-delà de cette concentration, ce pourcentage a considérablement diminué pour atteindre 1 % à 800 mM (Fig. 39).

Le Tableau XXII récapitule les donnés relatif à la détermination des conditions optimales de transglycosylation.

Figure 36 : Influence du pH sur la réaction de transglucosylation catalysée par la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) Donneur de glucosyle : cellobiose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2-phényléthanol 100 mM. Tampon acétate 100 mM (pH 3,6-5,6) phosphate 100 mM (pH 5,6-8). Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 16 h.

Figure 37 : Influence du temps d'incubation sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae)

Donneur de glucosyle : cellobiose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2-phényléthanol 100 mM. Tampon phosphate 100 mM pH 6,6. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 16 h.

Donneurs de glucosyle : cellobiose 400 mM. Accepteur de glucosyle: 2-phényléthanol (0 à 600 mM). Tampon phosphate 100 mM pH 6,6. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 16 h.

Donneurs de glucosyle : cellobiose (0 à 800 mM). Accepteur de glucosyle: 2-phényléthanol 100 mM. Tampon phosphate 100 mM pH 6,6. Enzyme 12 UE. Temps d'incubation : 16 h.

Tableau 22 : Récapitulatif des conditions optimales des réactions de transglycosylation catalysées par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) et le meilleur pourcentage de transglucosylation.

2-Discussion

La â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) a été purifiée à homogénéité électrophorétique selon un protocole de purification comprenant trois étapes chromatographiques. Ce sont la chromatographie d'échange d'anion, la chromatographie sur gel filtration et la chromatographie d'interaction hydrophobe. Le facteur de purification obtenu à la fin de la purification de la â-glucosidase a été inférieur à ceux obtenus avec les â-glucosidases de la larve de Tenebrio molitor (Ferreira et al., 2001), des petites foreuses de la canne à sucre, Diatraea saccharalis (Azevedo et al., 2003) et des ouvriers du termite Macrotermes subhyalinus. Cependant, ce facteur de purification a été plus élevé que ceux des â-glucosidases de l'ouvrier du termite Macrotermes mulleri (Rouland et al., 1992), de la bactérie anaérobique intestinale humaine Fusobacterium K-60 (Park et al., 2001) et de la larve de lumen de Tenebrio molitor (Ferreira et al., 2003).

La similitude de poids moléculaire déterminés sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et beta-mercapto-éthanol et sur gel de filtration suggère que la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est monomérique comme celle du foie humain (Mutoh et al., 1988) et du microorganisme Thermus spIB-21 (Kang et al., 2005).

L'enzyme a été inhibée par le DTNB et le pCMB. Ceci peut s'expliquer par la présence de groupement(s) sulfhydryle(s) dans le site actif de l'enzyme. Des résultats identiques ont été rapportés par Ogawa (1990) et Taniguchi et Takano (2004) respectivement avec les â-glucosidases d'Actinidia chinensis, Leuconostoc mesenteroides et de l'intestin de tilapia.

L'étude de l'hydrolyse de différents glycosides a permis de tester leur capacité à servir comme substrat. Ainsi, la â-glucosidase du suc digestif de la larve de charançon Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) est restée inactive sur les polysaccharides tels que le lichenane, le xylane, la carboxylméthylcellulose, l'inuline, l'amidon, l'arabino-galactane et la laminarine. Aucune activité glycosidasique contaminante telles que les activités âgalactosidasique, â-fucosidasique, â-mannosidasique, â-arabinosidasique et â-xylosidasique n'a été signalée. Les seuls substrats qui ont été hydrolysés par l'enzyme sont le cellobiose, les cellodextrines, le sophorose, le gentiobiose et le p-nitrophényl-â-D-glucopyranoside. Ces résultats montrent que la â-glucosidase est une exoglucosidase avec une spécificité stricte pour la configuration anomérique â et du résidu glucosyle. Ce comportement semble refléter ceux des â-glucosidases des champignons microscopiques Sclerotium rolfsii (Shewale et

Sadana, 1981) et Aspergillus niger (Watanabe et al., 1992). Il est néanmoins différent de ceux trouvés chez la plupart des â-glucosidases des insectes.

La constante de Michaelis-Menten (KM) pour le cellobiose (un produit clé d'hydrolyse de la cellulose par l'exo- et l'endo-â-D-glucanase) est inférieure à celles rapportées dans la littérature (Sternberg et al., 1977 ; Workman et Day, 1982 ; Wase et al., 1985). La faible valeur de KM obtenue, suggère que cette enzyme purifiée a une grande affinité pour le cellobiose et pourrait être utilisée dans le processus de saccharification industrielle de la cellulose. Le rôle physiologique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) serait la digestion de di et d'oligo-saccharides issus de la dégradation de la cellulose ou de l'hémicellulose.

La capacité de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) à catalyser des réactions de transglucosylation a été testée avec le cellobiose et le 2-phényléthanol comme respectivement donneur et accepteur de glucosyle. Le 2-phényléthanol a été utilisée pour étudier les activités de transglycosylation de la âglucosidase d'Aspergillus oryzae (Fortun et Colas, 1991), d'Achatina achatina (Leparoux et al., 1997), de Thermus thermophilus (Dion et al., 1999) et de Macrotermes subhyalinus (Kouamé et al., 2001, 2005a, 2005b) en raison de la facile quantification par absorbance dans l'UV des produits de transglycosylation (phényléthylglycosides). Les conditions expérimentales ont été optimisées par rapport aux facteurs capables d'avoir une influence sur le taux de transglucosylation. La â-glucosidase a un pH optimum de transglucosylation (pH 6,6) différent de celui de la réaction d'hydrolyse (pH 5,0). Pour expliquer cette différence, Huber et al. (1983) ont suggéré qu'il existe un groupement avec une valeur de pKa élevée au niveau du site actif qui affecterait l'hydrolyse mais pas la transglycosylation. Une autre hypothèse serait que le taux d'hydrolyse de la liaison glycosidique décroît avec une augmentation du pH de manière à induire le changement observé (Huber et al., 1983). Dans le cas de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae), la variation observée entre les pH optima d'hydrolyse et la transglycosylation n'a pas été significative et n'a présenté aucune opportunité pour favoriser la réaction de synthèse sans une hydrolyse rapide des produits formés par transglucosylation. Après 16 h de réaction, les produits formés ont été hydrolysés par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae). L'enzyme ne reconnaissant que le résidu glucosyle et l'anomérie â, le produit formé au cours de la réaction de transglucosylation ne peut être que le phényléthyl-â-glucoside. Ce résultat suggère que la âglucosidase hydrolyse le cellobiose à partir de son extrémité non-réductrice pour libérer le â-

glucose. Ce mécanisme réactionnel indique que cette enzyme a opéré par mécanisme de rétention de configuration anomérique comme c'est le cas des enzymes appartenant aux familles 1 et 3 des glycosides hydrolases (Henrissat, 1991, 1998 ; Henrissat et Bairoch, 1993). Le rendement de transglucosylation (20 %) obtenus avec le 2-phényléthanol et le cellobiose comme respectivement accepteur et donneur de glucosyle est inférieur à ceux rapportés par certains auteurs sur d'autres sources de â-glucosidase (A.oryzae, E. coli).

Conclusion

En tenant compte de sa spécificité de substrat et de sa grande affinité pour le cellobiose, la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum (Curculionidae) semble être différente de celles des autres sources enzymatiques étudiées jusqu'ici. Le rôle physiologique de cette enzyme est la digestion du cellobiose et des cellodextrines issue de la dégradation de la cellulose et des hémicelluloses du palmier. L'enzyme pourrait être utilisée comme outil de choix dans l'analyse structurale des oligosaccharides, des polysaccharides, des glycoprotéines et des glycolipides.

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