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Tépu6lique de Cote d'Ivoire
Vnion-
Oiscipline-Travail
alinistere de l'cEnseignement Supérieur et
de
la ~echerche Scienti#ique
Université d'Abobo-Adjamé
Année
Universitaire
2008-2009
MESE
Pour I'obtention du grade de
Docteur
Numéro d'ordre
51
DE
L'UNIVERSITE D'ABOBO-ADJAME
EN SCIENCES ET TE
CHNOLOGIE DES ALIMENTS
Option : Biochimie et Technologie des
Aliments
Presentee par
YAM Assel T ll Dodd P trice
THEME :
CARACTERISATION !DOMINIQUE ET APPLICATIONS
POTENTIELLES DES CLUCOSIDASES ET DE LA 13-
GMACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE
DE
RRYNCROPROHIS~ 11 111 LCURCULIONIDAEI
Soutenue publiquement
le 29 juillet
2009
Bev n' le Jury :
M. AMANI N'guess n Georges, Prolossour linhforsite dAbobe-Adl me
Presiden%
M. AKE Seven, Prolossour Universite Coco* r ggetteur
M. T o DATIE, Prolossour Universite Coco* Ex min tour
M. DIE Kolli M rconi', M itre de conferences linhforsite
d'Abobe-Adl me Ex min tour
M. KOUAME Lucien P trice, M itre de conferences linhiersite
dAbobe-AM me Directeur de Those
RESUME
La larve de Rhynchophorus palmarum possède
dans son tube digestif une variété d'activités
osidasiques. Les activités á-glucosidasique,
â-glucosidasique et
â-galactosidasique sont les plus élevées.
Elles sont l'oeuvre de 3 enzymes : une á-glucosidase,
une â-glucosidase et une
â-galactosidase. Ces biocatalyseurs sont acides,
mésophiles et monomériques. Ils sont stables à 37 °C
pendant au moins 120 min dans le tampon acétate 100 mM pH 5 ou 5,6. La
â-glucosidase a une grande affinité pour le
cellobiose et serait aussi impliquée dans la digestion des
cellodextrines issues de la dégradation de la cellulose. Elle a une
spécificité stricte vis-à-vis du résidu glucosyle
et de l'anomerie â. Cette enzyme a une activité
transférasique élevée par rapport à celle de la
â-galactosidase. En effet, ce biocatalyseur
spécifique du résidu galactosyle dégrade les disaccharides
et les oligosaccharides provenant de l'hydrolyse des hémicelluloses et
possédant des liaisons â(1,3),
â(1,4) et â(1,6). Quant à
l'á-glucosidase, elle reconnaît seulement le
résidu glucosyle et est spécifique de la liaison osidique
á(1-2) et á(1-4). C'est
pourquoi, elle hydrolyse fortement le saccharose, le maltose et les
oligosaccharides. Elle possède une activité transférasique
supérieure à celles des sources enzymatiques conventionnelles.
Mots clés : larve, charançon,
Rhynchophorus palmarum, á-glucosidase,
âglucosidase, â-galactosidase,
activité transférasique.
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé en
Côte d'Ivoire, à l'Unité de Formation et de Recherche des
Sciences et Technologie des Aliments de l'Université
d'Abobo-Adjamé, dans le Laboratoire de Biochimie et Technologie des
Aliments.
Je tiens à remercier le Professeur Patrice
KOUAME, Doyen de l'Unité de Formation et de Recherche des
Sciences et Technologie des Aliments de l'Université
d'Abobo-Adjamé (Abidjan), Directeur scientifique de ce travail, sans qui
ce mémoire n'aurait jamais pu voir le jour. Il m'a fait
bénéficier d'un cadre idéal de travail. Malgré ses
nombreuses tâches universitaires, il n'a pas hésité
à consacrer une partie de son temps à orienter et enrichir ce
travail. Je dois dire que j'ai beaucoup appris auprès de lui. Qu'il
trouve ici le témoignage de mon profond respect, de ma sincère
admiration et de mon fidèle attachement;
Je remercie le Professeur AMANI N'guessan
Georges, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et
de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université
d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour son appui à la recherche. Je suis
particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant
de présider ce jury, malgré ses nombreuses occupations
administratives et universitaires.
Je suis sensible à l'honneur que me fait le professeur
DJE Koffi Marcellin, Président du conseil scientifique
de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des
Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) en
acceptant de faire partie de ce jury et l'assure de mes sincères
remerciements. Sa présence dans ce jury montre une fois encore son amour
pour le travail bien fait.
Je tiens à remercier le Professeur AKE
Sévérin, Professeur titulaire à l'Unité de
Formation et de Recherche Biosciences de l'Université de Cocody
(Abidjan) pour sa contribution à l'amélioration de ce travail.
C'est un réel plaisir pour moi de le retrouver comme membre de ce
jury.
Je remercie le professeur Yao DATTE,
Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche
Biosciences de l'Université de Cocody (Abidjan) pour la sollicitude
qu'il m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible
à l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être membre de ce
jury.
Je remercie également le Professeur DJE
Yao, Maître de conférences à l'Unité de
Formation et de Recherche des Sciences de la Nature et de l'Environnement de
l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour la sollicitude qu'il
m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible à
l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être rapporteur de cette
thèse
Au Professeur Alphonse KAMENAN, Doyen
honoraire de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et
Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan)
et Directeur du laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments, je lui
exprime toute ma reconnaissance et ma gratitude pour tout ce qu'il a fait pour
moi dans le cadre de ma formation universitaire.
Je voudrais remercier sincèrement du fond de mon coeur le
Professeur Sébastien NIAMKE pour la sollicitude qu'il
m'a témoigné.
Je n'oublie pas tous les enseignants-chercheurs et chercheurs
de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des
Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé à qui je
dis merci pour les encouragements et soutiens.
Je voudrais remercier également tous les membres de
l'équipe "Biocatalyse" du Laboratoire de Biochimie et Technologie des
Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé qui ont participé
activement à la réalisation de ce mémoire.
Mes vifs remerciements vont à toutes les personnes dont
les compétences scientifiques et techniques m'ont aidé à
réaliser ce travail.
DEDICACE
Je dédie ce travail scientifique à
:
-mon père,
Je te remercie pour la grande et solide confiance que tu as
placée en moi. Aujourd'hui accepte cette thèse comme le
couronnement de tous tes sacrifices.
-ma mère,
Je te remercie infiniment pour les sacrifices énormes
que tu as bien voulu consentir pour moi. Que le seigneur te garde longtemps en
bonne santé sur cette terre. Ce travail n'est qu'un modeste
témoignage de ton amour filial et de ma reconnaissance.
-ma fiancée,
Je te dédie ce mémoire pour ton
abnégation, ta patience et tes encouragements incessants. Ton soutien
indéfectible m'a permis de réaliser ce travail dans les
meilleures conditions. Je t'en suis reconnaissant. Je n'ai aucun mot pour
traduire la profondeur de mes sentiments à ton égard.
-mon fils,
Que ce travail soit un gage sincère de mon immense
amour.
-mes frères et soeurs,
En témoignage de mon profond amour.
-tous mes cousins et cousines,
Ce mémoire est le votre.
-ma grande famile,
Je remercie tout le monde pour les encouragements et
conseils.
-tous mes amis,
Je dis Merci pour leur soutien moral et encouragement.
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS II
DEDICACE III
TABLES DES MATIERES VI
LISTE DES FIGURES ... XII
LISTE DES TABLEAUX
XVII
ABREVIATION ET SYMBOLES .. XX
INTRODUCTION ..... 1
Chapitre 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 4
I-Généralités sur le
charançon 4
1- Systématique du charançon du palmier
4
2- Cycle de vie .. 4
3- Dommages causés . 5
II-Glycosidases . 7
1-Réaction d'hydrolyse 7
1-1-Mécanismes d'action 7
1-1-1-Inversion de configuration anomérique
7
1-1-2-Rétention de configuration anomérique
.. 7
1-1-3-Quelques cas particuliers .. 8
1-2-Relation entre les glycosidases de mécanisme
d'inversion de configuration anomérique hydrolysant les liaisons alpha
et beta 10
1-3-Relation entre des alpha- et beta-glycosidases avec
des mécanismes de configuration anomérique opposés .
10
1-4-Classifications des glycosidases 12
1-4-1-Classification traditionnelle 12
1-4-2-Classification structurale 12
1-4-2-1-Principe et classification 12
1-4-2-2-Division des familles des glycosides
hydrolases
en sous familles 18
2-Réactions de synthèses 22
3-Propriétés de quelques glycosidases des
insectes 24
3-1-Enzymes amylolytiques 24
3-1-1-Amylases 24
3-1-2-Alpha-glucosidases .. 25
3-2-Enzymes cellulolytiques 27
3-2-1-Cellulases 28
3-2-2-beta-Glucosidases 29
3-3-Enzymes hémicellulolytiques 31
3-3-1-Xylanases, laminarinases et lichenases
31
3-3-2-beta-Galactosidases 31
3-3-3-beta-Xylosidases 32
3-4-beta-Fructosidases 32
4-Applications industrielles de quelques glycosidases
32
4-1-beta-Galactosidases 32
4-1-1-Applications médicales .. 32
4-1-2-Applications pharmaceutiques 33
4-1-3-Applications nutritionnelles . 34
4-1-4-Applications en industrie agroalimentaire .
34
4-2-Enzymes amylolytiques 35
4-2-1-Production de sirop de glucose et de fructose
35
4-2-2-Amélioration de la solubilité de
l'amidon 35
4-3-Enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques
. 36
Chapitre 2 MATERIEL ET METHODES 38
I- Matériel 38
1-Provenance des produits chimiques 38
2- Origine du matériel biologique ..
38
II- Méthodes . 39
1-Préparation des extraits bruts enzymatiques
39
2-Techniques de dosage .. 39
2-1- Dosage de l'activité polysaccharidasique ..
39
2-1-1-Préparation de la solution de DNS
40
2-1-2- Techniques de dosage 40
2-2-Dosage de l'activité olisaccharidasique
40
2-2-1- Préparation du réactif glucose
oxydase-péroxydase 40
2-2-2- Technique de dosage 41
2-3- Dosage de l'activité
pNP-glycosidasique 41
2-4- Dosage des protéines 42
2-4-1- Méthode de Lowry et al. (1951)
42
2-4-1-1- Réactif utilisés . 42
2-4-1-2- Technique de dosage . 42
2-4-2- Méthode de Bradford (1976) 43
2-4-2-1- Réactif utilisés 43
2-4-2-2- Technique de dosage . 43
2-5- Purification des enzymes . 43
2-5-1- Chromatographie d'échange d'anion sur D.E.A
E
Sepharose CL-6B . 44
2-5-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium
44
2-5-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur
gel de Sephacryl S-100 HR 44
2-5-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe
sur gel de
Phényl-Sepharose CL-4B 45
2-6-Détermination des propriétés
moléculaires 45
2-6-1- Détermination des poids moléculaires
par gel filtration 45 2-6-2-Détermination des poids moléculaires
par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide
en présence de SDS 46
2-7- Influence du pH sur les activités
glycosidasiques . 47
2-7-1- Détermination du pH optimum d'hydrolyse .
47
2-7-2-Détermination de la stabilité au pH .
47
2-7-3-Influence de la force ionique 47
2-8-Influence de la température sur les
activités glycosidasiques 47
2-8-1-Détermination de la température
optimale
d'hydrolyse, du Q10 et de l'énergie d'activation
.. 47
2-8-2-Inactivation thermique . 48
2-8-3-Dénaturation thermique 48
2-9-Détermination de quelques paramètres
cinétiques 48
2-10-Actions des agents chimiques sur l'activité
hydrolytique 48
2-11-Réactions de transglycosylation
49
2-11-1-Milieu réactionnel 49
2-11-2-Analyse chromatographe des produits de
transglycosylation 49
2-11-3-Calcul du pourcentage de transglycosylation
49
Chapitre 3 RESULTATS ET DISCUSSION . 52
I- RECHERCHE ET DETERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES
D'HYDROLYSE DES GLYCOSIDASES DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum
52
1-Résultats 52
1-1-Activités glycosidasiques .. 52
1-1-1-Activités exo-glycosidasiques
52
1-1-2-Activités endo-glycosidasiques .
54
1-2-Détermination des températures et pH
optima d'hydrolyse 54
1-2-1-Activités á-exo-glycosidasiques
54
1-2-2-Activités â-exo-glycosidasiques
54
1-2-3-Activités endo-glycosidasiques
54
2-Discussion .. 57
Conclusion 59
II-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE
L'áGLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE
Rhynchophorus palmarum 60
1-Résultats 60
1-1- Stratégie de purification . 60
1-1-1- Chromatographie échangeuse d'anion sur gel
de
D.E.A.E-Sepharose CL-6B 60
1-1-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium
60
1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur
gel de Sephacryl S-100 HR 61
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe
sur gel de
Phényl- Sepharose CL-4B .. 61
1-2-Critère de pureté . 64
1-3-Poids moléculaires de l'á-glucosidase .
64
1-4-Influence du pH sur l'activité de
l'á-glucosidase 66
1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 66
1-4-2-Stabilité au pH 66
1-4-3-Influence de la force ionique du tampon .
66
1-5-Influence de la température sur
l'á-glucosidase 68
1-5-1- Température optimale d'hydrolyse,
énergie
d'activation et Q10 68
1-5-2- Inactivation thermique 68
1-5-3-Dénaturation thermique 68
1-5-4-Conservation au froid 72
1-6-Spécificité de substrat ..
72
1-6-1-Activité sur les
p-nitrophényl-D-glycosides . 72
1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et
polysaccharides 72
1-7-Paramètres cinétiques .. 75
1-8-Action des agents chimiques 75
1-9-Réactions de transglucosylation
catalysées par l'á-glucosidase 78
1-9-1-Influence du pH 78
1-9-2-Influence du temps d'incubation . 78
1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur sur
l'activité de transglucosylation .. 78
1-9-4-Influence de la
concentration du donneur sur l'activité
de transglucosylation .. 78
2- Discussion 82
Conclusion 85
III-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE
DE LA â-GLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus
palmarum 86
1-Résultats 86
1-1-Stratégie de purification 86
1-1-1-Chromatographie échangeuse d'anion sur gel
de
DEAE-Sepharose CL 6B 86
1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium
86
1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur
gel de Sephacryl-100 HR 86
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe
sur gel de
Phényl-Sepharose CL-4B 86
1-2-Critère de pureté 89
1
1-3-Poids moléculaires de la â-glucosidase
89
1-4-Influence du pH sur la â-glucosidase ..
91
1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 91
1-4-2-Stabilité au pH .. 91
1-4-3- Influence de la force ionique du tampon
91
1-5- Influence de la température sur la
â-glucosidase . 93
1-5-1-Température optimale d'hydrolyse,
énergie
d'activation et le Q10 93
1-5-2-Inactivation thermique . 93
1-5-3-Dénaturation thermique 93
1-5-4-Conservation au froid 93
1-6-Spécificité du substrat ..
97
1-6-1-Activité sur les
p-nitrophényl-D-glycosides 97
1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et
polysaccharides 97
1-7-Paramètres cinétiques .. 99
1-8-Action des agents chimiques 101
1-9-Réaction de transglucosylation
catalysée par la â-glucosidase 103
1-9-1-Influence du pH sur l'activité de
transglucosylation 103
1-9-2-Influence du temps d'incubation sur
l'activité de transglucosylation 103
1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur ..
103
1-9-4-Influence de la concentration du donneur .
103
2-Discussion .. 107
Conclusion 109
IV- PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE
LA â-GALACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus
palmarum .. 110
1-Résultats 110
1-1-Stratégie de purification 110
1-1-1-Chromatographie échangeuse d'anion sur gel
de DEAE-Sepharose CL 6B 110 1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium
110
1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur
gel de Sephacryl-100 HR 110
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe
sur gel de
Phényl-Sepharose CL-4B 110
1-2-Critère de pureté 113
1-3-Détermination des poids moléculaires de
la â-galactosidase 113
1-4-Influence du pH sur la â-galactosidase ..
115
1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 115
1-4-2-Stabilité au pH .. 115
1-4-3- Influence de la force ionique du tampon
115
1-5- Influence de la température sur la
â-galactosidase . 117
1-5-1-Température optimale d'hydrolyse,
énergie
d'activation et le Q10 117
1-5-2-Inactivation thermique . 117
1-5-3-Dénaturation thermique 117
1-5-4-Conservation au froid 117
1-6-Spécificité du substrat ..
121
1-6-1-Activité sur les
p-nitrophényl-D-glycosides 121
1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et
polysaccharides 121
1-7-Paramètres cinétiques ..
123
1-8-Action des agents chimiques 125
1-9-Réaction de transglucosylation
catalysée par la â-galactosidase 127
1-9-1-Influence du pH sur l'activité de
transglucosylation 127
1-9-2-Influence du temps d'incubation sur
l'activité de
transglucosylation 127
1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur .
127
1-9-4-Influence de la concentration du donneur .
127
2-Discussion . 131
Conclusion 133
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES 134
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES . 135
XII
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cycle de vie du charançon
Rhynchophorus palmarum 6
Figure 2 : Mécanisme d'inversion de configuration
anomérique des glycosidases 9
Figure 3 : Mécanisme de rétention de
configuration anomérique des glycosidases 9
Figure 4 : Similarités mécanistiques chez
diverses familles de glycosidases . .. 11
Figure 5 : Similarités dans l'orientation des
liaisons dans des enzymes de mécanismes opposés 11
Figure 6 :
Structure tridimensionnelle de l'endocellulase (famille 5 des glycosidases)
de
Thermus caldophilus (A) et de son site actif (B)
liant le cellotétraose . 15
Figure 7 : Comparaison entre la structure
d'une endoglucanase et celle d'une cellobiohydrolase de la famille GH7
21
Figure 8 : Schémas des réactions
catalysées par les glycosidases . 51
Figure 9 : Activités á-exo-glycosidasiques
des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc
digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum 53
Figure 10 : Activités â-exo-glycosidasiques
des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc
digestifs de la larve de Rhynchophorus
palmarum
53
Figure 11 : Activités endo-glycosidasiques des
extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires du tube digestif et du suc
digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 55
Figure 12 : Profil chromatographique d'échange
d'anion de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B 62
Figure 13 : Profil chromatographique d'exclusion
moléculaire de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 62
Figure 14 : Profil chromatographique d'interaction
hydrophobe de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B 63
Figure 15 : Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de
l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum. ....
65
Figure 16 : Détermination du pH optimum
d'hydrolyse de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum 67
Figure 17 : Stabilité au pH de l'a-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 67
Figure 18 : Détermination de la température
optimale d'hydrolyse de l'a-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
69
Figure 19 : Inactivation thermique de l'a-glucosidase du
suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum à 37°C
et à 45°C 69
Figure 20 : Dénaturation thermique de
l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
70
Figure 21 : Effet de la congélation sur de
l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de 70
Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à
pH5,6 .
Figure 22 : Influence du pH sur les réactions de
transglucosylation catalysées par l'aglucosidase du suc digestif de la
lave de Rhynchophorus palmarum . 79
Figure 23 : Influence du temps d'incubation sur les
réactions de transglucosylation catalysées par l' a-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus 79 palmarum
Figure 24 : Influence de la concentration de
l'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) sur les
réactions de transglucosylation catalysées par l'a-glucosidase du
suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 80
XIV
Figure 25 : Influence de la concentration du donneur de
glucosyle sur les réactions de transglucosylation catalysées par
l'á-glucosidase de suc digestif de la larve de 80
Rhynchophorus
palmarum
Figure 26 : Profil chromatographique d'échange
d'anion de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL 6B
87
Figure 27 : Profil chromatographique d'exclusion
moléculaire de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl-100 HR 87
Figure 28 : Profil chromatographique d'interaction
hydrophobe de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B .
88
Figure 29 : Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de la
béta-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum 90
Figure 30 : Déterminations du pH optimum
d'hydrolyse de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum 92
Figure 31 : Stabilité au pH de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 92
Figure 32 : Détermination de la température
optimale d'hydrolyse de la â-glucosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
94
Figure 33 : Inactivation thermique de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 94
Figure 34 : Dénaturation thermique de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 95
|
Figure 35 : Effet de la congélation de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
dans le tampon acétate 100 mM à pH5,0 .
|
95
|
Figure 36 : Influence du pH sur la réaction de
transglucosylation catalysée par la âglucosidase du suc digestif
de la larve de Rhynchophorus palmarum . 104
Figure 37 : Influence du temps d'incubation sur la
réaction de transglucosylation catalysée par la
â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
104
Figure 38 : Influence de la concentration de
l'accepteur (2-phényléthanol) sur la réaction de
transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif
de la larve de Rhynchophorus palmarum . 105
Figure 39 : Influence de la concentration du donneur
de glucosyle (cellobiose) sur la réaction de transglucosylation
catalysée par la â-glucosidase purifiée du suc digestif de
la larve de Rhynchophorus palmarum . 105
Figure 40 : Profil chromatographique d'échange
d'anion de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B
111
Figure 41 : Profil chromatographique d'exclusion
moléculaire de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 111
Figure 42 : Profil chromatographique d'interaction
hydrophobe de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B
112
Figure 43 : Electrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS et de âmercaptoéthanol de
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
114
Figure 44 : Détermination du pH optimum
d'hydrolyse de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum 116
Figure 45 : Stabilité au pH de la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 116
Figure 46 : Détermination de la température
optimale d'hydrolyse de la â-galactosidase
du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
.... 118
Figure 47 : Inactivation thermique de la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
à 37 °C et à 55 °C . . 118
Figure 48 : Dénaturation thermique de la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
119
Figure 49 : Effet de la congélation de la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
dans le tampon acétate 100 mM à pH5,0 . 119
Figure 50 : Influence du pH sur la réaction de
transgalactosylation catalysée par la â-
galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum ... 128
Figure 51 : Influence du temps d'incubation sur la
réaction de transgalactosylation catalysée par la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
128
Figure 52 : Influence de la concentration de
l'accepteur sur la réaction de transgalactosylation catalysée par
la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum . . 129
Figure 53 : Influence de la concentration du donneur
de galactosyle (lactose) sur la réaction de transgalactosylation
catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum 129
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Mécanismes réactionnels et
acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles
des glycosidases rangées en clans 16
Tableau 2 : Mécanismes réactionnels et
acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles
des glycosidases non rangées en clans . 17
Tableau 3a : Division de la famille GH13 en sous familles
19
Tableau 3b : Division de la famille GH13 en sous familles
20
Tableau 4 : Températures et pH optima
d'hydrolyse des activités a-exoglycosidasiques des extraits bruts
enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de
Rhynchophorus palmarum . .. 55
Tableau 5 : Températures et pH optima
d'hydrolyse des activités â-exoglycosidasiques des extraits bruts
enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de
Rhynchophorus palmarum . .. 56
Tableau 6 : Températures et pH optima
d'hydrolyse des activités endoglycosidasiques des extraits bruts
enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de
Rhynchophorus palmarum . 56
Tableau 7 : Bilan global de la purification de
l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 63
Tableau 8 : Poids moléculaires de l'a-glucosidase
du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum .
65
Tableau 9 : Quelques propriétés physiques
de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
71
Tableau 10 : Activité de l'a-glucosidase sur les
p-nitrophényl-glycosides 73
Tableau 11 : Spécificité de substrat de
l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
sur les oligosaccharides et les polysaccharides ..... 74
Tableau 12 : Quelques paramètres cinétiques
de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 76
Tableau 13 : Effet de quelques agents chimiques sur
l'activité de l'a-glucosidase du
suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 77
Tableau 14 : Récapitulatif des
paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation
catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum . 81
Tableau 15 : Bilan global de purification de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve
de Rhynchophorus palmarum 88
Tableau 16 : Poids moléculaires de la
â-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum
. 90
Tableau 17 : Quelques propriétés physiques
de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum . 96
Tableau 18 : Activité de la â-glucosidase
sur les p-nitrophényl-D-glycosides .. 98
Tableau 19 : Spécificité de substrat
(oligosaccharides et polysaccharides) de la âglucosidase du suc digestif
de la larve de Rhynchophorus palmarum 98
Tableau 20 : Quelques paramètres cinétiques
de la â-glucosidase du suc digestif de la
larve de Rhynchophorus palmarum .
100
Tableau 21 : Effet de quelques agents chimiques sur la
â-glucosidase du suc digestif
de la larve de Rhynchophorus palmarum . .
102
Tableau 22 : Récapitulatif des
paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation
catalysées par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum 106
Tableau 23 : Bilan global de la purification de la
â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 112
Tableau 24 : Poids moléculaires et
sous-unité de la â-galactosidase du suc digestif de
la larve de Rhynchophorus palmarum .
114
Tableau 25 : Quelques propriétés physiques
de la â-galactosidase du suc digestif de la
larve de Rhynchophorus palmarum . .
120
Tableau 26 : Activité de la â-galactosidase
sur les p-nitrophényl-D-glycosides 122
Tableau 27 : Spécificité de substrat
(oligosaccharides et polysaccharides) de la â-
galactosidase du suc digestif de la larve de
Rhynchophorus palmarum . 122
Tableau 28 : Quelques paramètres cinétiques
de â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus
palmarum 124
Tableau 29 : Effet de quelques agents chimiques sur
l'activité de la â-galactosidase du
suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
126
Tableau 30 : Récapitulatif des
paramètres physico-chimiques des réactions de
transgalactosylation catalysées par la â-galactosidase
purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum
. 130
SYMBOLES ET ABREVIATIONS
AMPc : adénosine monophosphate
cyclique
ATP : adénosine-5'- triphosphate
CCM : chromatographie sur couche mince
CLHP : chromatographie liquide haute
performance
CM : c arboxyméthyle
D.O : Absorbance
Da : dalton
DEAE : diéthylaminoéthyle
DTNB : acide
2,2'-dinitro-5,5'dithio-dibenzoïque
Ea : énergie d'activation
EC : enzyme commission
EDTA : éthylène diamine
tétra-acétate
kDa : kilodalton
kJ : kilojoule
KM : constante de Michaelis-Menten
M : molaire
mA : milliampère
nm : nanomètre
p/v : p oids/volume
pCMB :
para-chloromercuribenzoate de sodium
pH : potentiel d'hydrogène
pNP :
para-nitrophénol
pNPP : para-nitrophényl
phosphate
PP : pyrophosphate de sodium
R : constante des gaz parfaits
Rf : référence frontale
RMN : résonance magnétique
nucléaire
SAB : sérum albumine bovine
SDS : sodium dodécyle sulfate
PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SN1 : substitution nucléophile d'ordre
1
SN2 : substitution nucléophile d'ordre
2
Trs : tours
UE : unité enzymatique
UI : unité internationale
Vmax : vitesse maximale
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