Memoire Online - Diversités phénotypique et moléculaire des microsymbiotes du Sulla du nord (Hédysarum Coronarium L. ) et sélection de souches rhizobiales efficientes

THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES AGRONOMIQUES
Discipline: Sciences de la Production Végétale

DIVERSITES PHENOTYPIQUE ET MOLECULAIRE DES
MICROSYMBIOTES DU SULLA DU NORD (HEDYSARUM
CORONARIUM L.) ET SELECTION DE SOUCHES
RHIZOBIALES EFFICIENTES

DEDICACES

A la mémoire de mon cher et regretté papa à qui je dois persévérance et volonté,
acharnement et fierté,

à ma tendre maman qui m'a toujours aidée par sa présence, ses conseils et ses prières,
à mon cher époux pour ses encouragements, sa patience et sa compréhension,

à mon adorable petite Salma devant qui je me prosterne tant je l'ai privée de ma présence
pour être au laboratoire,

à mes chers beaux parents pour leur gentillesse, et leur infinie disponibilité toutes les fois que
j'ai eu besoin d'eux,

à mes frères et soeurs Sami, Akram, Sami, Ines et Emna qui ont tous été là pour moi,
à tous mes amis et mes collaborateurs,
à tous mes pairs, mes maîtres et mes professeurs

je dédie mon modeste travail qui, j'espère, trouvera bonne réception, fera honneur et donnera
plaisir à tous ceux qui le lisent, l'écoutent ou le discutent.

Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé en collaboration entre le Laboratoire de Productions fourragère et pastorale de l'Institut National Agronomique de Tunisie et le Laboratoire des Interactions Légumineuses Microorganismes du Centre de Biotechnologie de Borj Cédria.

Je remercie très fort tous ceux qui ont consenti pour moi temps et efforts pour que ce travail voie le jour.

Je commence par Mr Faysal Ben Jeddi, mon directeur de thèse : Maître de conférences et chef de Département ABV à l'INAT. A Si Faysal, je dois gratitude et respect, tant pour son encadrement, que pour son soutien tout au long de la réalisation de cette thèse.

Mes remerciements vont aussi à Mr Ridha Mhamdi, Professeur au CBBC qui m'a tendu la main à un moment difficile de l'élaboration de cette thèse. Grâce à ses conseils et son encadrement, j'ai pu finaliser et valoriser ce travail.

Je remercie également Mr Nétij Ben Mechlia, Professeur à l'INAT, pour avoir bien voulu chapeauter le jury de ma thèse.

Mes remerciements s'adressent aussi à Mr Bouaziz Sifi, Maître de recherche à l'INRAT, qui a aimablement accepté de juger ce travail.

Je suis très reconnaissante à Mr Moez Jebara Professeur au CBBC qui m'a aimablement accueillie dans le laboratoire et qui a en plus accepté de juger mon travail. Je profite de l'occasion pour exprimer ma reconnaissance au Professeur Jebara et à toute l'équipe du laboratoire LILM dont les remarques et suggestions ont été très utiles et judicieuses pour la finalisation de cette thèse.

Ma gratitude va à Mr Mustapha Sanaa, Maître de conférences à l'INAT, qui a participé par ses conseils pertinents à la correction de ce document. Ses remarques constructives m'ont été très utiles et très enrichissantes.

Je tire ma révérence à notre cher et respectueux maître le Professeur Mongi Zouaghi qui m'a guidée et encouragée dès mes premiers pas dans la recherche et qui a toujours trouvé les verbes et proverbes pour m'encourager.

Ma reconnaissance et mes vifs remerciements vont bien sûr à Mr Mahmoud Elyes Hamza Directeur de l'INAT ainsi qu'aux enseignants et personnel de l'INAT.

J'exprime ma grande reconnaissance à Mr Zribi Kais, Maître assistant au CBBC qui m'a aidée, conseillée et initiée dans le domaine de la Rhizobiologie.

Je n'oublie pas de remercier Professeur Aouani, qui a participé par son expérience dans le domaine de la microbiologie du sol, à m'orienter pour le choix du sujet de thèse.

Je me fais un grand plaisir de remercier Mr Salah Rezgui, Maître de conférences à l'INAT, qui a généreusement accepté de m'aider dans la réalisation des analyses statistiques.

Je n'oublie pas non plus de remercier ma chère amie Mme Sywar Haffani Ksontini, qui a également participé à la réalisation des analyses statistiques.

Je remercie sincèrement et profondément mes amis: Sabrine Saidi, Sabrine Chaibi, Leila, Olfa, Imène, Ines, Manèle, Yazid, Becem et Haythem ; ainsi que tout le personnel du Laboratoire des Interactions Légumineuses Microorganismes au CBBC Mme Monia, Mme Jamila, Melle Faten, Melle Sameh, Mr Fethi, Mr Naceur et tous ceux que j'ai oublié de citer. Je n'oublierais jamais le soutien moral et l'aide qui m'ont été apportés par ces amis et en particulier Mme Darine Trabelsi Hammami, Maître assistant au CBBC, qui m'a beaucoup aidée dans le travail de caractérisation moléculaire.

J'adresse mes vifs remerciements au personnel de la CCSPS en particulier Mme Imène Amri-Ben Jemiaa, Mme Hajer Mahfoudhi et Mr Abdelwahab Arbaoui qui m'ont aidée lors des travaux de collecte du matériel rhizobial. Je profite de l'occasion pour leur souhaiter du courage et du succès dans leurs carrières. J'exprime aussi ma reconnaissance à Mr Abdelaziz Baccari qui m'a en cadré et soutenue pendant mon expérience d'Ingénieur à la CCSPS ainsi qu'à Mr Mohamed Babba qui s'est toujours porté volontaire pour m'aider aussi bien en tant que responsable à la CCSPS qu'à la DGPA.

Je n'oublie pas de remercier profondément tout le personnel de la Direction des sols en particulier Mr Hamrouni et Mme Saida qui m'a toujours accueilli avec le sourire. Je remercie également Mme Kalthoum Sifaoui pour son sérieux et lui souhaite une bonne continuation dans ses travaux de recherche.

Je salue tout le personnel de la Direction Générale des Ressources Hydrauliques qui m'ont fourni les données météorologiques des stations de production de semences de sulla. Je suis sincèrement reconnaissante à l'association Abel Granier et en particulier Mme May Granier qui offre de son temps et de son énergie pour la réhabilitation des sols dégradés de la Tunisie.

Je n'oublie pas de remercier mes collègues, mes étudiants et tout le personnel de notre Laboratoire de Productions Fourragère et Pastorale de l'INAT en particulier Jabrane, si Salah et Salma. Je m'adresse à mes amis Sonia; Slim; Khalil; Amel; Rabeb; Sahari; khaoula; Sarra; Seif et tous ceux que j'ai oublié de citer et je leur souhaite à tous beaucoup de courage, de chance et de succès.

Sommaire

4. 2. 2. Evaluation de la diversité génétique des isolats de la collection par Rep-PCR 42

5. 2. Effet de l'inoculation rhizobiale sur la culture de sulla de 1ère année 101

Résumé

Dans le but de promouvoir la diversité des ressources génétiques rhizobiales spécifiques au sulla du nord (Hedysarum coronarium L.), une étude prospective a été entreprise dans 14 sites de production de semences de la Tunisie septentrionale. L'analyse de la croissance et de la production du sulla cultivé, a révélé une variabilité de comportement intra-spécifique qui dépend à la fois des paramètres édapho-climatiques, et de la population rhizobiale autochtones. L'exploration de l'état de la nodulation du sulla dans divers sites a révélé l'existence d'associations symbiotiques à haut pouvoir fixateur (Oued Zarga et Tunis) ou encore la défaillance de cette activité en raison de l'absence de souches rhizobiales spécifiques (Goubellat). L'isolement des bactéries des nodules de sulla a permis la constitution d'une collection de 45 isolats présentant un test de nodulation positif.

L'analyse de la diversité génotypique de ces souches par PCR/RFLP suivie du séquençage de l'ADNr 16S a révélé que 71 % des souches de la collection présentent une similarité à plus de 99% avec R. sullae souche IS 123^T. La caractérisation phénotypique par les tests de tolérance à des stress abiotiques (salinité, pH, sécheresse) a mis en évidence une limite de tolérance de ces souches variant respectivement de 150 à 700 mM pour le NaCl, de 9 à 10,5 pour le pH alcalin, et de -0,5 à -0,95 MPa pour la sécheresse simulée par le PEG 6000. L'évaluation de l'efficience symbiotique des isolats testés en association avec le sulla a permis d'identifier 19 souches particulièrement efficientes. Parmi ces dernières, HC5 et HC14, classées respectivement comme hautement et moyennement tolérantes au stress osmotique, ont été évaluées en pots à différents niveaux de stress hydrique en comparaison avec une souche sensible au stress osmotique (HC1). A 100% de la réserve utile (RU), l'inoculation du sulla par HC14 (200 mM NaCl et -0.9 MPa) a fournit le meilleur rendement en fourrage sec (4,75 g/plante). A 75 % RU et 50 % RU, HC14 a assuré des rendements similaires à ceux enregistrés avec la souche HC5 (400 mM NaCl et -0,95 MPa). En revanche, les plants de sulla inoculés avec HC1 (150 mM NaCl et -0,5 MPa) ont induit les plus faibles nodulations et rendements fourragers.

En plein champ et sous régime pluvial des deux sites expérimentaux Tunis et Goubellat, les souches rhizobiales HC5 et HC14 se sont montrées compétitives et efficientes. L'amélioration des rendements en protéines brutes au stade floraison du sulla inoculé par HC14 a varié de 40 à 277 % respectivement à Tunis et Goubellat.

Mots clés: Hedysarum coronarium L., Rhizobium sullae, Fixation de l'azote, Inoculation, Stress abiotique.

Summary

In order to promote the diversity of rhizobial genetic resources specific to sulla (Hedysarum coronarium L.), a prospective study was undertaken in 14 sites of seed production in northern Tunisia. The analysis of growth and production of cultivated sulla revealed variability of intra-specific behavior depends on both edapho-climatic parameters, and the indigenous rhizobial population. The exploration of sulla's nodulation in various sites unveiled the existence of symbiotic associations with high fixation (Oued Zarga and Tunis) or a failure of this activity due to the absence of specific rhizobial strains (Goubellat). Isolation of bacteria from sulla nodules has allowed the establishment of a collection of 45 isolates presenting a positive nodulation testing.

Analysis of the genotypic diversity of these strains by PCR/RFLP followed by the sequencing of the ADNr16S showed that 71% of strains have a similarity of more than 99% with R. sullae strain IS 123T. Phenotypic characterization by tests of tolerance to abiotic stress (salinity, pH, drought) revealed a tolerance limit varying respectively from 150 to700 mM for NaCl; 9 to10.5 for alkaline pH and -0,5 to -0,95 MPa for drought simulated by PEG 6000.

The assessment of symbiotic isolates efficiency tested with sulla has identified 19 strains particularly efficient. Among these, 2 strains HC5 and HC14, respectively classified as highly and moderately tolerant to osmotic stress, were evaluated in pots at different levels of water stress in comparison with sensitive strain (HC1). At 100% of useful reserves (UR), inoculated sulla with HC14 (200 mM NaCl and -0.9 MPa) has provided the best dry forage yield (4.75 g / plant). At 75% and 50% UR HC14 provided yields similar to those recorded with the strain HC5 (400 mM NaCl and -0.95 MPa). By contrast, plants inoculated with sulla HC1 (150 mM NaCl and -0.5 MPa) induced the lowest nodulation and forage yields.

In a non-irrigated field trial Tunis and Goubellat, rhizobial strains HC5 and HC14 provided competitive and efficient. The improvement yields of crude protein at flowering stage of sulla inoculated with HC14 ranged from 40 to 277% respectively in Tunis and Goubellat.

Keywords: Hedysarum coronarium L., Rhizobium sullae, Nitrogen fixation, Inoculation, Abiotic stress.

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Liste des tableaux

Tableau 1: Exportation des éléments majeurs N-P-K en kg par tonne de matière 8

Tableau 5: Quantités et réactifs utilisés pour l'amplification de l'ADNr 16S 44

Tableau 6 : Cycles de variation de la température au cours de l'amplification 45

Tableau 8: Caractéristiques pédoclimatiques des groupes spécifiques aux sites 57

Tableau 9: Variables quantitatives et qualitatives relatives à la culture du sulla 59

Tableau 11: Coefficients de corrélation entre les paramètres édapho-climatiques 64

Tableau 14: Origines géographiques et limites de tolérance au stress osmotique 78

Tableau 16: Séquençage du gène de l'ADNr 16S de quelques souches de la collection. 81

Tableau 17: Effets de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches 85

Tableau 18: Effet de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches 87

Tableau 19: Effets de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches 88

de la collection sur la production de biomasse sèche et la teneur en protéines brutes aériennes.

Tableau 20: Effet du stress hydrique sur la teneur en protéines brutes aériennes 97

Tableau 21: Effet de l'inoculation au champ du sulla avec les souches HC14, HC5 103

sur le nombre et le poids des nodules dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

Tableau 22: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ du sulla sur sa teneur 104

en protéines brutes aériennes dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

Tableau 23: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la croissance en hauteur, 105

la surface foliaire et la nodulation du sulla de 2^ème année au stade bouton floral.

Tableau 24: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur les biomasses sèche 106

aérienne et protéique du sulla de 1^ère et 2^ème année de culture dans les sites de Goubellat au stade bouton floral.

Liste des figures

Figure 2: Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place 17
d'une association symbiotique fixatrice de l'azote.

Figure 4 : Distribution géographique des sites de collecte des rhizobiums du sulla. 32

Figure 10 : Variation des pluviométries et des températures minimales et maximales 49

mensuelles durant la campagne agricole 2008-2009 dans les stations Tunis et Goubellat.

Figure 12: Dilution de la préculture rhizobiale et inoculation du sulla au champ. 52

Figure 18: Observation sous microscope (x 10³) des souches rhizobiales Gram^-. 67

Figure 24: Croissance des souches sur milieu YEM/RC solide enrichi en calcaire. 71

estimées par l'indice de Dice résultant de l'analyse par Rep-PCR des souches nodulant le sulla.

Figure 28: Amplification de l'ADNr 16S de quelques souches nodulant le sulla. 79

par RFLP de l'ADNr 16S obtenus pour quelques souches de la collection après digestion par les endo-nucléases MspI et NdeII.

Figure 31: Système racinaire d'un plant de sulla avec un amas nodulaire inefficient. 86

Figure 32: Rendement des protéines brutes fixées par le sulla cultivé en pot et inoculé 90 avec différentes souches rhizobiales.

Figure 33: Effet du stress hydrique sur le développement du sulla cultivé en pot. 92

Figure 34: Effet du stress hydrique sur la croissance du sulla cultivé en pot 93

Figure 35: Effet du stress hydrique sur la surface foliaire du du sulla cultivé en pot 94

Figure 37: Effet du stress hydrique sur la nodulation du sulla cultivé en pot 95

et inoculé par les souches HC5, HC14 et HC1 exprimée en poids sec nodulaire et nombre de nodules par plant .

Figure 38: Effet du stress hydrique sur la biomasse sèche aérienne du sulla 95

Figure 40: Effet du stress hydrique sur le rendement en protéines brutes fixées 97

Figure 41: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la croissance en hauteur 101

du sulla de 1^ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

Figure 43: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la surface foliaire 102

du sulla de 1ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

Figure 44: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la biomasse sèche aérienne 104

du sulla de 1^ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

Liste des abréviations

BSA: Biomasse sèche aérienne CE: Conductivité électrique ADV: Densité des adventices DMSO: Dimethyl Sulfoxide

P2O5 ass: Phosphore assimilable PB: Protéines brutes aériennes PCR: Polymerase Chain Reaction

PEG 6000: Polyethylene Glycol 6000 PGPB: plant growth promoting bacteria PMN: Poids Moyen d'un Nodule

Introduction

En Tunisie, l'amélioration de la production de protéines vertes devient une nécessité suite à l'accroissement des prix des matières premières, en particulier les tourteaux d'oléoprotéagineuses, destinées à l'alimentation des ruminants. Hedysarum coronarium L. est l'une des fabacées fourragères à promouvoir pour satisfaire une grande part des besoins protéiques des poly et monogastriques. De même, cette espèce intervient efficacement dans la fixation biologique des terres en pente (Slim et al., 2011), l'amélioration de la fertilité organominérale des sols, des rendements et valeur protéique des céréales (Ben Jeddi, 2005). En Tunisie, Le sulla s'étend sur une emblavure très aléatoire d'une année à l'autre, soit aux alentours de 4 000 ha. Mais, le programme stratégique de développement des fabacées en particuliers les fourragères prévoit son extension jusqu'à 21 000 ha en 2016 (DGPA, 2010).

Hedysarum coronarium L. bénéficie d'une fixation biologique de l'azote atmosphérique lorsque le microsymbiote spécifique est présent dans le sol. En conséquence, une autonomie de croissance est signalée dans des sols déficients en azote. Dans le cas contraire, l'inoculation est indispensable. Il a été rapporté que l'introduction de la culture de sulla en Australie a été obligatoirement accompagnée d'une inoculation en raison de l'absence de rhizobium spécifique (Casella et al., 1984). Au Maroc l'extension du sulla est entravée par des problèmes de nodulation observés aux champs dans différentes régions potentielles (Barnani, 1984; Thami-Alami et Mezni, 2000).

En Tunisie, Il a été souvent noté lors des prospections dans différentes régions du nord de la dorsale, une faiblesse de productivité de la culture de sulla attribuée à des échecs d'installation et de nodulation. Cet échec de fixation symbiotique de l'azote est souvent contré par un apport de fertilisant azoté (Dhane, 2001). Dans ces conditions, l'inoculation par des souches bactériennes efficientes devient indiscutable (El Amri, 2001).

L'étude de la diversité biologique de micro-organismes symbiotiques autochtones demeure une nécessité pour toute sélection de couples symbiotiques performants précédant toute nouvelle introduction.

Les facteurs environnementaux influencent la survie et la persistance des souches rhizobiales introduites (Zahran, 1999; Graham et Vance, 2003). En conséquence, le succès de l'inoculation exige que la souche sélectionnée soit hautement efficiente, compétitive pour la formation de nodosités vis-à-vis des populations natives, et bien adaptée aux conditions contraignantes de l'environnement (Catroux et al., 2001; Deaker et al., 2004).

Les objectifs fixés pour la réalisation de ce travail de recherche sont les suivants:

- exploration des interactions symbiotiques Rhizobium/Hedysarum coronarium L. dans les stations de multiplication de semences, et constitution d'une collection de symbiotes autochtones;

- caractérisation moléculaire et phénotypique des souches collectées, pour une évaluation de leurs diversités génétique et fonctionnelle et sélection des plus performantes pour des applications potentielles;

- sélection de souches rhizobiales adaptées à la contrainte hydrique en condition symbiotique avec le sulla; et

- évaluation de l'efficience symbiotique des souches sélectionnées au champ dans deux stations édaphoclimatiquement contrastées.

La première partie de la thèse est consacrée à une synthèse bibliographique dans laquelle sont traités trois principaux thèmes:

- le premier porte sur les fabacées et particulièrement les exigences naturelles, le potentiel fourrager, et les particularités environnementales de l'espèce Hedysarum Coronarium L.;

- le deuxième est consacré à la diversité des Rhizobiums et les principales techniques de caractérisations phénotypique et moléculaire déployées; et

- le dernier thème traite le processus de symbiose fixatrice de l'azote et les facteurs abiotiques influençant cette activité.

La partie méthodologique de cette recherche commence par la présentation des techniques utilisées pour la caractérisation agronomique du sulla dans les parcelles porte graines et la collecte de matériel rhizobial.

Puis, viennent les méthodes entreprises pour l'étude des diversités phénotypique et moléculaire des microsymbiotes du sulla. Enfin les souches les plus performantes et les mieux adaptées aux contraintes osmotiques sont testées; à travers l'évaluation des paramètres de croissance, de nodulation et de rendement; en conditions hydriques contrôlées et en plein champs.

Enfin, dans la dernière partie, sont présentés et discutés, les principaux facteurs responsables de la variation des rendements du sulla dans les parcelles prospectées. La diversité des isolats collectés est étudiée dans le but de sélectionner les souches les plus performantes.

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Les légumineuses

Les légumineuses ou Fabaceae sont classées parmi les Angiospermes, Eudicotylédones à gousses (Sprent, 1995). Il s'agit de la troisième plus grande famille des Angiospermes en nombre d'espèces après les Orchidaceae et les Asteraceae, avec 727 genres et près de 20 000 espèces (Cronk et al., 2006). Les espèces vont des herbes naines de l'Arctique et des montagnes aux immenses arbres des forêts tropicales (Judd et al., 2001). Les formes arborescentes prédominent les pays chauds tandis que les formes herbacées caractérisent les régions tempérées (Guignard et Dupont, 2005). En se basant sur la forme florale, cette famille est divisée en trois sous-familles, deux sont monophylétiques (Papilionoideae, Mimosoideae) et la troisième paraphylétique (Caesalpinoideae) (Guignard et Dupont, 2005). Elles constituent de loin le groupe le plus important de plantes participant à la fixation de l'azote avec des bactéries symbiotiques (Raven et al., 2000).

1. 1. Les Caesalpinoideae

Ce sont majoritairement des arbres ou des arbustes tropicaux ou subtropicaux. Leur fleur irrégulière possède 5 pétales non différenciés et des étamines visibles extérieurement (Judd et al., 2001).

1. 2. Les Mimosoideae

Ce sont pour la plupart des arbres tropicaux. Leurs fleurs sont régulières, petites, groupées souvent sous forme de pompons. Les étamines sont les parties les plus visibles de la fleur (Judd et al., 2001).

1. 3. Les Papilionoideae

Cette appellation est due à la forme de la corolle qui se présente sous forme de « papillon » (Guignard et Dupont, 2005). La sous-famille monophylétique des Papilionoideae renferme plus des deux tiers des espèces et inclut presque toutes les légumineuses économiquement importantes (Sprent, 1995). Elle est cosmopolite et compte 11300 espèces réparties en 440 genres regroupés en 31 tribus (Labat, 1996). Dans cette sous-famille, 97% des espèces examinées peuvent être nodulées (Sprent, 1995). La majorité des espèces sont herbacées; leur fleur est irrégulière composée de 5 pétales: un étendard, deux ailes et deux pétales partiellement fusionnés en une carène (Judy et al., 2001).

Les Papilionoideae sont utilisées pour la production des graines alimentaires comme le pois (Pisum sativum L.) et l'haricot (Phaseolus vulgaris L.); mais aussi pour l'alimentation du bétail, sous forme de fourrage tels que la luzerne (Medicago sativa L.) et le sulla (Hedysarum coronarium L.).

1. 4. Le sulla du nord : Hedysarum coronarium L.

1. 4. 1. Ecologie et distribution

Hedysarum coronarium L. (sulla) (Figure 1) est une fabacée fourragère endémique dans le bassin méditerranéen (Gutierrez-Mas, 1983). En Tunisie, cette espèce connue sous l'appellation sulla du nord est signalée sous des pluviométries variant de 300 à 1000 mm/an (Le Houerou, 1965). Ben Jeddi et Zouaghi (1995) ont signalé la présence du sulla du nord dans l'étage sub-humide et semi-aride supérieur au nord de la dorsale où la pluviométrie est variable entre 350 et 800 mm. A l'état spontané, le sulla est rencontré généralement sur les marnes et les terres argilo-calcaires et peut se trouver à des altitudes variables de 1000 à 2000 mètres (Bentham et Hooker, 1865; Lapeyronie, 1982). La culture de sulla est à éviter dans beaucoup de régions méditerranéennes où les températures sont inférieures à - 4°C (Martiniello et al., 2000) et il n'est conseillé que dans les zones où la température moyenne du mois le plus froid (janvier ou février) est supérieure à 3⁰C (Lapeyronie, 1982).

La dispersion naturelle des espèces signalées par Ballatore (1963) sur les cartes phytoécologiques de la Tunisie septentrionale est sensiblement réduite ces dernières années en raison de la sécheresse des années 2001 et 2002 et du surpâturage (Ben Jeddi, 2004).

Le sulla est cultivé au nord de la Tunisie depuis plus de 4 décennies où il a été introduit de l'Italie dans les régions de Béja, Mateur et Ain Draham (Trifi et al., 1989). Actuellement les superficies destinées à la culture de sulla avoisinent les 4000 ha, ce qui représente 5,64% des superficies cultivées en fourrages et 28,5 % des légumineuses fourragères. Cette superficie est en continuelle croissance et son extension est prévue jusqu'à 21 000 ha en 2016 (DGPA 2009).

1. 4. 2. Potentiel fourrager

Le sulla se caractérise par son haut potentiel de production de fourrage dans le bassin méditerranéen (Talamucci et al., 1998). Le Houerou (1965), obtenait en deuxième année jusqu'à 90 t/ha de matière verte de sulla coupé au stade floraison soit l'équivalent de 13 t/ha de matière sèche.

La recherche a permis depuis de sélectionner des génotypes à haut potentiel de production qui dépassent les 17 t/ha en Tunisie (Ben Jeddi et al., 1998) et 20 t/ha en Australie (Lloyd et al., 2003). Ces nouveaux génotypes se caractérisent par une excellente teneur en protéines estimée à 19% de la matière sèche (Ben Jeddi, 2005).

1. 4. 3. Intérêts environnementaux

En plus de son haut potentiel de production fourragère, le sulla offre la possibilité d'améliorer la teneur en matière organique et de maintenir une richesse en azote du sol (Douglas et al., 1985; Pinto et al.,1993; Stringi et al., 1998 ; Ben Jeddi ; 2005). Cette matière organique estimée entre 6 et 9 t/ha/an (Ben Jeddi, 1996), a un effet direct sur la stabilisation des agrégats du sol (Watt et al., 1993) et indirect sur la stimulation des activités microbiennes de la rhizosphère (Angers, 1989).

Grâce à son système racinaire puissant et pivotant, le sulla offre l'avantage de protéger le sol contre l'érosion (Watson, 1982) d'où l'intérêt de son installation dans les terrains marneux et accidentés très vulnérables à l'érosion (Zouaghi, 2001; Slim, 2004, Slim et al., 2011). En effet, l'installation du sulla en association avec l'atriplex (Atriplex halimus L.) pendant 4 ans dans un site calcaire marginal a permis d'améliorer la porosité du sol et de réduire les pertes de sol d'environ 7% comparativement à un sol qui a porté une culture de blé en continu (Chisci et al., 2001).

Cette plante est aussi très appréciée par les abeilles (Apis mellifera L.). L'installation de ruches d'abeilles (environ 15/ ha) permet, non seulement la production de miel (environ 28 kg/ha de miel), mais en plus l'accroissement de la production grainière grâce à la pollinisation entomophile (Rondia et al., 1985).

1. 4. 4. Exportation des éléments majeurs et fertilisation

La fertilisation du sulla en minéraux majeurs (N, P, K) est réalisée selon les exportations de la culture (Tableau 1) en ces éléments et leur disponibilité dans le sol.

Les besoins en azote de la culture de sulla sont importants comparativement au blé dur Triticum durum Desf., ainsi qu'à d'autres fabacées (Baccouche, 1998). Les origines de l'azote peuvent être principalement la minéralisation de la matière organique restituée au sol, la fixation symbiotique de l'azote atmosphérique (N2) et la fertilisation chimique (Sanaa, 1993).

Tableau 1: Exportation des éléments majeurs N-P-K en kg par tonne de matière produite (matière sèche fourragère, semences, pailles et fanes) par les différentes cultures (Baccouche, 1998).

Habituellement, le sulla cultivé ne reçoit pas d'apport d'azote minéral car cet élément est fourni par voie symbiotique. Selon Sulas (2009), 78,2 à 82,7 % des besoins en azote de cette plante proviennent de la fixation atmosphérique. Cette proportion peut dépasser 90% (Tibaoui, 1986; Ben Jeddi et al., 1989) dans le cas de présence de rhizobium spécifique efficient (Casella et al., 1984).

Concernant le phosphore, le sulla exporte en deux ans entre 200 et 250 kg de P205. Rondia et al. (1985) préconisent 150 kg/ha de super 45 la première année et 125 kg/ha la deuxième année apporté à la fin de la saison estivale (août - septembre). Quant au potassium, les exportations du sulla en cet élément sont comparables à celles de l'azote (Baccouche, 1998). Cette demande importante de potassium explique son bon comportement sur des sols marneux riches en cet élément (Semadeni, 1976). En absence d'analyse de sol, Rondia et al. (1985) a préconisé la dose de 100 kg/ha de sulfate de potasse apporté avant le semis.

2. La diversité des rhizobiums

2. 1. La rhizosphère

La rhizosphère est un environnement particulier où les flux de matières et d'énergie entre le sol et la plante sont particulièrement intenses (Lynch, 1990). La richesse de la rhizosphère en sucres, aminoacides, acides organiques, isoflavonoides, régulateurs de croissance et en enzymes libérées par la plante (Pierson et al., 2000), rend ce microenvironnement un site d'une remarquable activité biologique et d'une richesse naturelle en vers de terre, nématodes, protozoaires, champignons, algues et bactéries.

Ces êtres vivants, les microorganismes en particulier, sont requis dans le processus de décomposition et de recyclage des nutriments de la rhizosphère de la plante (Germida et al., 1998).

Les microorganismes rhizosphériques incluent les symbiotes (rhizobiums, actinobactéries et champignons mycorhiziens) et les saprophytes libres qui augmentent la disponibilité des nutriments et la synthèse de substances de croissance des plantes et/ou suppriment les pathogènes.

2. 2. Les rhizobiums

Les rhizobiums sont des bactéries du sol, appartenant à la famille des Rhizobiaceae, Gram négatif, strictement aérobies, possédant une forme de bâtonnets de 0,6 à 0,9 jnm de largeur et de 1,2 à 3 jnm de longueur et non sporulant (Jordan, 1984). Ce sont des bactéries mobiles grâce à un flagelle polaire ou subpolaire ou 2 à 6 flagelles péritriches (Werner, 1992). Leur croissance est optimale à une température de 28 °C et un pH entre 6 et 7 (Burton, 1985).

La taxonomie moderne (Tableau 2) des rhizobiums inclus les genres Rhizobium, Ensifer (Sinorhizobium), Mesorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Methylobacterium et Burkholderia (Jordan 1982; Dreyfus et al., 1988; De Lajudie et al., 1994; 1998a; 1998b; Jarvis et al., 1997 Sy et al., 2001; Martens et al., 2007, 2008; Van Berkum et al., 2006; Vinuesa et al., 2008; Rivas et al., 2009 Ribeiro et al., 2009) qui appartiennent à la sous classe des á protéobactéries. Grâce aux progrès technologiques utilisés en taxonomie qui se basent sur des critères morphologiques, physiologiques ainsi que sur l'analyse des séquences, d'autres genres appartenant aux â et ã protéobactéries ont été découverts (Chen et al., 2001; Moulin et al., 2001, Benhizia et al., 2004; Franche et al., 2009; Masson-Boivin et al., 2009).

Phaseolus Phaseolus Desmodium Sesbania Pisum Astragalus Phaseolus Lespedeza Medicago Phaseolus Pisum Hedysarum Medicago Phaseolus Amphicarpaea

van Berkum et al., 1998 Ramýrez-Bahena et al. , 2008 Ramýrez-Bahena et al., 2008

2. 3. Les microsymbiotes du sulla

Le premier isolement de bactéries à partir des nodules de sulla remonte au 19^ème siècle (Mottareale, 1898). Ces rhizobiums ont été étudiés et décrits dans plusieurs travaux de recherche et il a été recommandé de les nommer provisoirement Rhizobium hedysari (Casella et al., 1984; Selenska-Pobell et al., 1996; Toffanin et al., 1996). Par ailleurs des études plus approfondies sur l'identification des souches isolées à partir de nodules de Hedysarum coronarium ont montré qu'elles sont relatives à Rhizobium etli, Rhizobium leguminosarum et Sinorhizobium meliloti (Tighe et al., 1994). Avec le développement des techniques moléculaires, il y a eu une meilleure caractérisation des bactéries nodulant les légumineuses, en particulier la ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) de l'ADNr 16S et la comparaison des séquences de ADNr 16S; les bactéries nodulant le sulla ont par conséquent été baptisés R. sullae (Squartini et al., 2002).

D'autres études plus récentes ont mis en évidence que des bactéries du groupe Gamma protéobactéries peuvent également noduler les légumineuses en les isolant à partir des nodosités de Hedysarum (Benhizia et al., 2004).

Dernièrement, de nouvelles espèces de bactéries auxquelles on a attribué le nom Rhizobium alamii sp. Nov. ont été isolées à partir des racines de tournesol (Helianthus annuus L.) et des nodules de Medicago ruthenica L.. Ces espèces qui appartiennent à la lignée des alpha-protéobactéries sont génétiquement les plus proches de l'espèce R. sullae (Berge et al., 2009).

2. 4. Caractérisation des rhizobiums

Plusieurs études ont été réalisées par les microbiologistes pour évaluer la diversité des rhizobiums. Ces études ont permis l'analyse de différents traits phénotypiques et génétiques qui sont devenus par la suite une base de définition du concept de l'espèce (Jarvis, 1983; Zhang et al., 1991; Moreira et al., 1993; De Lajudie et al., 1994; Dupuy et al., 1994).

2. 4. 1. Caractérisation phénotypique

La caractérisation phénotypique classique des rhizobiums se base sur des critères morphologiques, symbiotiques, biochimiques, et physiologiques (Graham et al., 1991). Les critères morphologiques regroupent les caractéristiques de la cellule bactérienne (forme, nombre et type de flagelles, coloration Gram, présence d'endospores) et les caractéristiques de la colonie (couleur, dimension, forme).

Les critères symbiotiques indiquent la capacité infective, effective et compétitive d'une souche donnée.

Les critères biochimiques évaluent la présence et/ou l'activité de différentes enzymes telles que glutamate déshydrogénase, glucose 6-phosphate déshydrogénase, indole-phénol oxydase, nitrate réductase, uréase, adénylate kinase ainsi que d'autres enzymes impliqués dans les voies métaboliques d'assimilation des substrats carbonés.

Les critères physiologiques regroupent le taux de croissance de la bactérie sur le milieu YEM (Yeast Extract Mannitol) (Vincent, 1970), la capacité d'utiliser différents carbohydrates et différentes sources d'acides aminés, la tolérance à différentes concentrations en sels et aux variations du pH, la croissance à différentes températures, la résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds, etc...

2. 4. 1. 1. La croissance

Parmi les critères phénotypiques les plus importants dans la caractérisation des rhizobiums, figure la croissance dans le milieu YEM (Vincent, 1970). La première classification des bactéries symbiotiques fixatrices de l'azote en deux genres Rhizobium et Bradyrhizobium s'était basée sur ce critère (Jordan, 1982, 1984). En fait, les souches à croissance rapide du genre Rhizobium possèdent un temps de génération inférieur à 4 heures et forment des colonies circulaires convexes généralement translucides avec un diamètre de 2 à 4 mm après 3 à 5 jours sous des conditions optimales d'incubation. En revanche, les souches à croissance lente du genre Bradyrhizobium possèdent un temps de génération de 6 à 8 heures et forment des colonies circulaires convexes et rarement translucides avec un diamètre de 1 à 2 mm après 5 à 7 jours d'incubation.

2. 4. 1. 2. Les critères symbiotiques

Les propriétés symbiotiques ont longtemps été la base unique de la caractérisation des rhizobiums et de leur regroupement en « groupe d'inoculation » en fonction de la ou des légumineuses nodulées.

L'infectivité d'un rhizobium s'exprime par sa spécificité à travers sa capacité de noduler une ou plusieurs légumineuses hôtes. Elle peut être facilement évaluée par le dénombrement des nodosités formées.

L'efficience est la capacité de réduire efficacement l'azote atmosphérique en ammonium. Différentes techniques d'estimation de l'efficience sont disponibles. Trois sont les plus utilisées, la méthode Kjeldahl qui permet de mesurer l'azote total de la partie végétative de la plante, la méthode de l'activité réductrice de l'acétylène (ARA) qui permet d'évaluer l'activité de la nitrogénase par l'apport de l'acétylène comme substrat et par la mesure de l'éthylène dégagé comme produit de réduction final, la troisième méthode consiste à déterminer le poids sec de la partie végétative des plantes inoculées par la souche à tester comparativement au témoin non inoculé.

2. 4. 1. 3. Tolérance à la salinité

Les rhizobiums sont généralement plus tolérants aux stress comparativement à leurs plantes hôtes (Zahran et al., 2003; Vriezen et al., 2006, 2007) d'où l'intérêt de sélectionner des légumineuses pour des régions présentant des problèmes de salinité.

La gamme de tolérance au sel des rhizobiums est variable selon la souche et le type de sel (El Sheikh et al., 1989 a). Certaines sont inhibées par une concentration de 100 mM de NaCl, alors que les plus tolérantes peuvent survivre à des concentrations de 1700 mM de cet élément (Zahran et al., 1994). D'autres comme S. meliloti sont tolérants entre 300 et 700 mM NaCl (Mohammad et al., 1991; Muller et Pereira 1995), alors que Rhizobium leguminosarum tolère des variations entre 150 mM NaCl (Rai, 1983) et 350 mM NaCl (Breedveld et al., 1993). Le stress osmotique hydrique ou salin peut modifier la synthèse de certaines composantes cellulaires (protéines et lipopolysaccharides) des rhizobiums (Zahran et al., 1994). Dans ce sens, Shamseldin et a.,. (2006) ont noté, à 680 mM de NaCl, une expression différentielle des protéines cellulaires chez Rhizobium etli souche (EBRI 26).

2. 4. 1. 4. Tolérance au pH

Les rhizobiums sont en général neutrophiles mais leur réponse face à une fluctuation du pH varient d'une souche à une autre (Jordan, 1984; Glenn et Dilworth, 1994). Graham et Parker (1964) ont montré qu'un pH bas critique pour la croissance de Rhizobium japonicum et de Rhizobium lupini est compris entre 4 et 6.

Sinorhizobium meliloti a été rapporté être sensible au pH acide (Brockwell et al., 1991). Rhizobium tropici et Mesorhizobium loti sont considérées comme des souches très tolérantes à l'acidité (Graham et al., 1994).

Certaines souches rhizobiales peuvent même supporter un pH très bas de l'ordre de 3,5 (Yadav et Vyas, 1973). Les mécanismes d'adaptation physiologiques et biochimiques des rhizobiums en milieux acides sont nombreux (O'Hara et Glenn, 1994; Graham et al., 1994). Ces mécanismes incluent entre autre l'exclusion et l'expulsion des protons H⁺ (Chen et al., 1993a), la forte teneur en potassium et en glutamate du cytoplasme des cellules stressées (Aaron et Graham, 1991), le changement de la composition du LPS (Chen et al., 1993b), et l'accumulation de polyamines (Fujihara et Yoneyama, 1993).

L'alcalinité est moins néfaste pour la survie des rhizobiums. Jordan (1984) a montré que la majorité de ces bactéries peuvent tolérer des pH allant jusqu'à 9.

2. 4. 2. Caractérisation moléculaire des rhizobiums

Le génome des bactéries est constitué en plus de l'ADN chromosomique, d'ADN plasmidique qui peut constituer jusqu'à 50 % du génome entier. Les méthodes d'analyse impliquent par conséquent des gènes d'origine chromosomique et d'autres d'origine plasmidique comme les gènes symbiotiques dans le cas des rhizobiums.

Parmi les techniques de classification des bactéries qui visent l'ADN chromosomique, se trouvent le séquençage total du génome et la détermination du pourcentage d'homologie ADN/ADN.

La détermination du pourcentage d'homologie ADN/ADN par hybridation de l'ADN de souches à identifier avec l'ADN de souches de référence est reconnue comme la méthode standard pour identifier les espèces (Wayne et al., 1987). Sur la base de ce type d'analyse, le genre Mesorhizobium a été crée. Certaines espèces initialement classées dans le genre Rhizobium ont été renommées (Jarvis et al., 1997) et de nouvelles espèces ont été décrites dans le genre Rhizobium comme c'est le cas pour R. sullae (Squartini et al., 2002).

Le développement des techniques moléculaires a permis à travers les méthodes basées sur la Polymérase Chain Reaction (PCR) de caractériser des populations naturelles de rhizobiums et d'examiner les relations phylogénétiques entre les différents isolats.

Parmi ces méthodes, on site, la RFLP (restricion fragment length polymorphism) (Laguerre et al., 1996; Pobell et al., 1996) ou encore l'utilisation d'amorces dérivées de séquences palindromiques réputées très conservées chez les bactéries: séquences REP (repetitive extragenic palindromic) (De Bruijn, 1992).

La séquence la plus largement utilisée chez les rhizobiums est celle de l'ADNr 16S (Weisburg et al., 1991). L'utilisation de la variation de la séquence de l'ADNr 16S pour un but taxonomique suppose que l'évolution du génome progresse à un taux constant et que les gènes soient hérités de manière stricte d'une génération à une autre sans aucun transfert latéral. L'étude des gènes codant pour I'ADN ribosomique 16S a démontré la proximité phylogénétique entre les genres Rhizobium et Agrobacterium d'une part, et entre Bradyrhizobium, Rhodospeudomonas et Nitrobacter d'autre part (Willems et Collins, 1993 ; Yanagi et Yamasato, 1993; De Lajudie et al., 1994; Van Berkum et al., 1996).

La caractérisation des rhizobiums en se basant sur les critères génotypiques est maintenant couramment réalisable dans plusieurs laboratoires. Le choix des techniques dépend du nombre et du type de souches à étudier et du niveau de résolution désiré car chaque méthode a un pouvoir de résolution propre.

2. 5. Distribution des rhizobiums et choix des sites de collecte

La répartition des rhizobiums détermine le niveau de nodulation chez les fabacées. En effet, une même plante cultivée sur deux ou plusieurs sites géographiques ne piège pas les mêmes espèces de rhizobiums en raison de la variabilité de l'abondance rhizobiale. Cette variabilité pourrait être due à des facteurs biotiques et abiotiques caractéristiques des sites géographiques. Ce fait a déjà été démontré chez plusieurs espèces cultivées dans différentes régions du monde, tel que le Trifolium repens L. semé dans différents sols de l'Angleterre (Harrison et al., 1989).

Le choix des sites de collecte est un critère déterminant dans un travail de sélection puisqu'il conditionne les propriétés symbiotiques ainsi que le niveau de tolérance des rhizobiums aux facteurs environnementaux (salinité, température, stress hydrique). Dans ce sens, Pinto et al. (2004) ont noté un grand niveau de similarité entre les souches collectées en relation avec l'environnement.

L'adaptation des populations rhizobiales indigènes aux conditions environnementales locales offre de grands avantages pour la production d'inoculum. Cette adaptation des rhizobiums indigènes à divers milieux naturels est en même temps à l'origine d'un haut niveau de compétence saprophytique (Zengeni et al., 2006).

Zahran 2001 a rapporté que les rhizobiums isolés de légumineuses spontanées pouvaient tolérer des niveaux de stress plus importants que ceux issus de plantes cultivées.

D'autre part la sélection de souches rhizobiales est un moyen efficace pour l'évaluation de leurs efficience, compétitivité (Fettell et al., 1997; Young et al., 1998; Handley et al., 1999) et lien génétique (Coutinho, et al., 1999 et Saleena et al., 2001). Les signaux spécifiques (flavonoïdes) excrétés par les plantes exercent une pression sélective impliquant ainsi la réduction de la diversité microbienne et la sélection d'espèces ou de souches particulières (Bertrand et al., 2000; Ann et al., 2003).

Trabelsi et al. (2010) ont constaté une faible biodiversité rhizobiale dans des terres agricoles comparativement à des sols salins non cultivés. Abaidoo et al. (2007) ont quant à eux signalé un accroissement de la diversité rhizobiale corrélé à la fertilité des sols et à la diversification des plantes cultivées (Zengeni et al., 2006).

3. Symbiose Légumineuse/Rhizobium

La symbiose légumineuse/Rhizobium est un processus indispensable à la plante pour acquérir l'azote sous forme réduite, mais aussi aux rhizobiums pour obtenir les nutriments nécessaires à leur développement. Le végétal fournit des matières nutritives à la bactérie, celle-ci capte l'azote de l'air et le donne à son hôte (Raven et al., 2000).

Grâce à cette symbiose une importante économie d'engrais azotés peut être réalisée. A titre d'exemple, au Brésil l'inoculation du soja (Glycine max L.) aux champs fournit jusqu'à 300 kg N/ha, ce qui entraîne des économies d'engrais azotés estimés à 3 milliards de dollars (Santos et al., 2006).

3. 1. La nodulation

La nodulation est considérée comme la première caractéristique de l'association symbiotique qui est strictement contrôlée par des mécanismes d'autorégulation interne de la plante hôte (Figueiredo et al., 2008 b; Lohar et al., 2009).

3. 1. 1. Historique de la nodulation

La présence de nodosités chez les légumineuses est historiquement bien connue, mais leur origine était controversée. Woronin (1866) fut le premier à signaler l'observation des micro-organismes ressemblant aux bactéries dans les nodosités de Lupinus mutabilis.

Hellriegel et Wilfarth (1888) ont montré que la formation de nodosités est le résultat d'une infection externe chez les espèces de genres Lupinus, Phaseolus, Ornithopus, Vicia, et Trifolium. Beyerinck (1888) fourni la première preuve que les bactéries sont à l'origine de la formation de nodosités, en préparant des cultures pures d'organismes provenant de nodosités de Vicia faba L. et en infectant avec ces mêmes cultures des plants de fève cultivés sur un sol stérile (Beyerinck, 1888, 1890).

3. 1. 2. Les étapes de la nodulation

La formation des nodules est le résultat d'un dialogue moléculaire entre le microsymbiote et la plante hôte (Foucher et Kondorosi 2000; Limpens et Bisseling 2003) (Figure 2).

Figure 2: Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place d'une association symbiotique fixatrice de l'azote (Journet, 2004).

3. 1. 2. 1. Echange de signal d'infection

Le processus de nodulation commence par un échange de signaux entre la plante hôte et la bactérie. Les racines rejettent par leur métabolisme normal, des substances qui ont des effets attracteurs sur certains microorganismes du sol. Certaines d'entre elles appartiennent au groupe des flavonoïdes tels que les flavones, isoflavones, flavonone (Rasanen, 2002). Ce signal, une fois perçu par le rhizobium, induit la production de facteurs Nod (Oldroyd, 2001). Ceux-ci sont des signaux de nodulation ciblant le programme organogénétique de la plante (Patriarca et al., 2004).

3. 1. 2. 2. Infection

Les bactéries s'attachent aux racines par l'intermédiaire de la rhicadhésine ainsi que d'autres protéines spécifiques localisées à la surface des cellules (Dardanelli et al., 2003; Perry et al., 2004). Les facteurs Nod émis par les rhizobiums, induisent une dépolarisation de la membrane plasmique accompagnée d'une oscillation du flux de Ca²⁺. Cette étape se poursuit par une induction de l'expression de gènes spécifiques (Pelmont, 1995; Gage, 2004) et une modification de la croissance polaire des poils absorbants formant une structure dite en « crosse de berger» qui enferme les rhizobiums (Esseling et al., 2003).

L'infection qui s'accompagne d'une digestion de la paroi cellulaire du poil racinaire peut avoir lieu à travers les poils absorbants, les blessures, ou l'espace intercellulaire (Rasanen, 2002).

3. 1. 2. 3. Développement du nodule et maturation des bactéroïdes

Une fois que les parois des cellules de poils sont digérées, une structure tubulaire appelée le fil d'infection est formée. Elle se compose de cellules de la paroi nouvellement synthétisée qui formeront le matériel entourant le Rhizobium. Le centre du tube est une glycoprotéine contenant quelques produits bactériens et quelques glycoprotéines de la plante hôte (Gage, 2004).

Ces changements majeurs dans la forme des cellules et la croissance dirigée sont causées par des altérations significatives dans le cytosquelette de la plante. La dépolymérisation de l'actine est l'un des effets observés dans les poils absorbants suite à l'exposition au facteur Nod (Gage et Margolin, 2000).

Les bactéries prolifèrent à l'intérieur du cordon et vont se libérer dans le cytoplasme des cellules corticales, via ce cordon, provoquant ainsi l'apparition du méristème dont l'activité est à l'origine de la formation du nodule, dans laquelle les bacilles se différencient irréversiblement en bactéroïdes ou endosymbiose (Lindström et al., 2002).

Ces dernières, de forme irrégulière, ont un volume supérieur à celui des formes libres. Ils ne se divisent plus et ne synthétisent plus de protéines Nod, par contre les bactéroïdes se concentrent dans la production des nitrogénases indispensables à la fixation de l'azote atmosphérique.

Les bactéroïdes sont séparés du cytoplasme végétal par une membrane spéciale «péri bactéroïdes» ou membrane de séquestration servant de plaque d'échange entre les bactéries et les cellules de la plante hôte. Dans cette membrane les bactéries différenciées forment les bactéroïdes de fixation de l'azote (Pelmont, 1995; Corbière, 2002).

Le nodule prend forme avec la multiplication des cellules du cortex. Il se charge de pigments appelés leghémoglobine, synthétisés à l'intérieur du cytoplasme des cellules de la plante (Corbière, 2002). L'action de la leghémoglobine est de maintenir l'oxygène à faible concentration dans l'environnement de l'enzyme, compatible avec le fonctionnement de la fixation de l'azote (Rasanen, 2002; Simms et Taylor, 2002).Les gènes de leghémoglobine sont activés chez le soja, 7 à 8 jours après l'infection. La première augmentation réelle de la transcription commence dans les 4 jours apparents plus tard.

Le passage à l'état symbiotique s'accompagne d'une forte répression des gènes du métabolisme basal et d'une surexpression de ceux impliqués dans la fixation et l'assimilation de l'azote (Becker et al., 2004). Quelques rares cellules bactériennes quiescentes, de forme bacillaire, sont présentes dans le nodule; ce sont les cellules qui survivront et se multiplieront dans le sol après la mort de la plante. Elles pourront alors infecter les racines des plantes introduites dans le même site (Perry et al., 2004).

3. 1. 3. Morphologie des nodules

Dans la famille des légumineuses, la morphologie des nodules et le type de nodosité développée est déterminé par la plante hôte (Dart, 1975; Newcomb et al., 1979; Newcomb et Tandom, 1981). Deux types majeurs de nodosités (Figure 3) sont souvent distingués en se basant sur l'existence ou non du méristème persistant:

(i) Nodosités à forme indéterminée où l'activité méristématique se maintient. De nouvelles cellules apicales sont continuellement infectées. Cela résulte en une forme cylindrique de la nodosité. Ces nodosités sont connues chez les légumineuses des zones tempérées (sulla, pois, Vicia sp., Medicago sativa L., etc...).

(ii) Nodosités à croissance déterminée où l'activité méristématique cesse tôt. Les cellules infectées engendrent d'autres cellules infectées et la nodosité en grandissant par expansion acquiert une forme sphérique. Ce type de nodosité existe seulement chez les légumineuses des zones tropicales telles que le soja et le haricot (Hirsch et al., 2001).

Les deux types de nodosités partagent la même organisation générale se basant sur l'existence d'un tissu central entouré par plusieurs tissus périphériques. Le tissu central contient à la fois les cellules infectées par les rhizobiums et d'autres non. Les tissus périphériques sont formés essentiellement par un cortex interne et un autre externe séparés par l'endoderme nodulaire (Van de Wiel et al., 1990).

Un troisième type intermédiaire a été identifié chez les espèces du genre Lupinus et Sesbania (Sesbania rostrata Brem.). Les divisions cellulaires se font dans le cortex externe ou interne, conduisant à la formation de nodosités déterminées ou indéterminées (Hirsch et al., 2001).

Figure 3: Structure des nodules de légumineuses. A: nodule de type indéterminé. B: nodule de type déterminé. I: zone méristématique; II: zone d'infection; II-III: interzone II-III; IV: zone de sénescence. (Pawlowski et Bisseling, 1996).

3. 1. 4. Génétique de la nodulation

Lors de l'étape de la reconnaissance entre les rhizobiums et les plantes hôtes, les flavonoïdes induisent l'activation des gènes nod et la synthèse des lipo-chitooligosaccharides (LCOs) (Dénarié et al., 1996) émis par la bactérie qui sont à leur tour à l'origine de l'activation d'autres gènes végétaux ou bactériens (Bladrgroen et Spainkc, 1998).

Ces LCOs ont été nommés facteurs Nod et sont responsables de changements physique et physiologique chez la plante hôte, comme la déformation des racines, la division cellulaire et l'organisation du primordium nodulaire. Les gènes nod sont déterminants dans la spécificité de l'hôte (Denarié 1992; Geurts et al., 2005; Mulder et al., 2005; Chen et al., 2006). En effet, la longueur et la saturation de la chaîne de l'acide gras ainsi que les différents substituants greffés sur le squelette du LCO jouent un rôle crucial dans la spécificité entre la bactérie et la plante (Perret et al., 2000).

La plupart des gènes symbiotiques sont localisés sur des méga plasmides. Les grands plasmides ne soient pas transmissibles, mais ils sont en rapport avec d'autres plasmides très transmissibles (Hirsch et al., 2001).

Les gènes de rhizobium essentiels pour l'infection et la nodulation incluent les gènes nod (nod, nol, noe), les gènes hsn (gènes de nodulation spécifique de l'hôte) et d'autres gènes qui codent pour l'expression et la synthèse des molécules de structure de la surface bactérienne. Parmi ces gènes on note les gènes ndv responsables de la synthèse des â-glucans, les gènes exo responsables de la synthèse des exopolysaccharides, et les gènes lps responsables de la synthèse des lipopolysaccharides (LPS) (Broughton et al., 2000; Spaink, 2000, 1999).

Les gènes de nodulation ne sont exprimés que par l'action d'un activateur de transcription, le nod D. Ce dernier est exprimé de manière constitutive (Geurts et Bisseling, 2002), il est activé par des molécules produites par les plantes telles que les flavonoïdes (Spaink, 1987; Zuanazzi et al., 1998).

Les gènes nod ABCIJ sont des gènes communs très conservés chez les différentes espèces de Rhizobium. En ce qui concerne les composants de la surface cellulaire codés par les gènes ndv, exo et lps se trouvent les â-glucans, exopolysaccharides et lipopolysaccharides qui sont considérés comme d'importants facteurs dans l'efficacité symbiotique (Breedveld et Miller, 1998). Les â-glucans sont majoritairement des molécules du périplasme qui permettent la croissance des bactéries sous des conditions hypo-osmotiques (Pfeffer et al., 1994). Ils ont également un rôle spécifique dans l'interaction symbiotique (Breedveld et Miller, 1998). D'après Bhagwat et al. (1996), ces molécules jouent un rôle important dans la suppression du déclenchement du mécanisme de défense par les phytoalexines chez l'hôte.

3. 2. Spécificité symbiotique

L'association symbiotique est généralement très spécifique; chaque souche n'infecte qu'une espèce de plante ou une gamme très limitée d'hôtes (Pelmont, 1995). D'autres espèces ont un spectre plus large comme la souche Sinorhizobium sp. NGR 234 qui peut noduler 353 espèces de légumineuses appartenant à 112 genres différents et elle peut même noduler une plante non légumineuse: Parasponia andersonii Planch. (Pueppke et Broughton, 1999).

Cette spécificité serait contrôlée par les lectines de l'hôte qui reconnaissent certains glucides des capsules bactériennes (Larpent, 1985; Marie et al., 2001; Deakin and Broughton 2009). Les lipopolysaccahrides sont un des composés minoritaires de la membrane bactérienne externe qui jouent aussi un rôle important dans la spécificité rhizobiumslégumineuses (Jones et al., 2007).

Les lipopolysaccharides sont formés par trois constituants: (i) le lipide A, partie hydrophobe du LPS localisée dans la partie externe de la double couche membranaire; (ii) le core, un oligosaccharide dont la structure de base est similaire chez plusieurs rhizobiums; et (iii) l'antigène O, partie hydrophile qui constitue le composant le plus variable du LPS (Niehaus et al., 1998; Forsberg et Carlson, 1998). La présence ou l'absence de ce dernier composant engendre respectivement l'apparence de colonies bactériennes lisses S-LPS (smoot LPS) ou rugueuses R-LPS (rough LPS) (Lerouge et al., 2001).

Les associations entre la légumineuse et le Rhizobium sont généralement sélectives. Par exemple, Sinorhizobium meliloti peut s'associer efficacement avec les genres Medicago, Melilotus et Trigonella, alors que Bradyrhizobium japonicum est spécifique à Glycine max L..

Cette spécificité symbiotique est en relation avec la composition des exsudats racinaires qui est intimement liée à l'espèce, rendant la rhizosphère plus spécifique et favorable à ses partenaires symbiotiques (Sharma et al., 2004).

Cabrera et al. (1979) ont remarqué, à partir d'essais effectués sur plusieurs légumineuses, un grand niveau de spécificité d'hôte des rhizobiums isolés à partir de plantes de sulla. En effet, plusieurs travaux ont montré l'absence de la nodulation intervertie de Hedysarum coronarium L. et de Hedysarum flexuosum L., par des bactéries isolées de nodules de ces plantes (Glatzle et al., 1986; Kishinevsky et al., 1996; 2003). Dans le même sens, une nodulation croisée avec d'autres légumineuses tels que Trifolium repens L., Pisum sativum L., Vicia faba L., Glycine max L., ainsi que Cicer arietinum L. n'a pas été observée (Cabrera et al., 1979).

3. 3. Efficience symbiotique

L'efficience d'une souche est sa capacité à produire un nodule actif, donc fixateur d'azote.

Les souches infectives mais non effectives forment de petits nodules de couleur pâle, sans leghémoglobine. Cette leghémoglobine est le produit exclusif de la symbiose entre la bactérie et la plante et elle n'apparaît qu'au stade actif fixateur de la symbiose Rhizobium/légumineuse (Gobat et al., 1998).

Les échecs des cultures de légumineuses dans certaines régions sont souvent le résultat d'une insuffisance ou d'un manque d'efficience des souches de rhizobium. En effet, les souches natives sont généralement plus efficientes que les exogènes (Mezni et al., 2002).

Hagedon (1978) a trouvé que sur 400 souches de Rhizobium isolées des sols de l'Oregon (USA), seulement 15% avaient une efficience supérieure à 50 %. Amager (1974) a trouvé que le tiers des souches de Rhizobium léguminosarum isolées des sols français ont une efficience symbiotique faible à nulle sur Vicia faba L..

Les souches d'un même groupe de rhizobium peuvent toutefois se présenter avec une efficience variable pour différentes espèces de légumineuses appartenant au même genre (Cartoux et Lagacherie, 1977). En effet, une symbiose effective dépend en grande partie de l'interaction entre les génotypes de la plante et la souche de Rhizobium (Brockell et whalley, 1962). Kishinevsky et al. (2003) ont noté une nodulation inefficiente par des souches isolées depuis H. coronarium L. sur les racines de H. spinosissimum L..

L'inoculation est très efficace chez le sulla si l'espèce n'a pas été cultivée depuis longtemps sur la même parcelle (Robson 1991). Dans ce sens, Il a été rapporté qu'une faible fixation biologique de l'azote a été observée quand le sulla est installé dans des sites non conventionnels à l'espèce (Ewing et al., 2001). Selon Casella et al.(1984), l'introduction du sulla dans des pays tels que l'Australie, en dehors de la distribution naturelle du genre Hedysarum, doit être obligatoirement accompagnée d'une inoculation par des souches spécifiques pour favoriser la nodulation.

3. 4. Facteurs influençant la fixation symbiotique

Plusieurs facteurs tels que la composition physico-chimique du sol peuvent interférer avec les processus d'infection ou de nodulation, ou encore influencer l'activité fixatrice de l'azote après symbiose (Taq et al., 2004; Collavino et al., 2005; Kinkema et al., 2006).

3. 4. 1. Facteurs abiotiques

3. 4. 1. 1. Le pH du sol

Les pH extrêmes affectent les deux partenaires symbiotiques. La majorité des légumineuses nécessitent des pH neutres ou légèrement acides pour établir une symbiose efficiente dans le sol (Bordeleau et Prévost, 1994). L'acidité élevée du sol, influence la solubilité des éléments minéraux et provoque des troubles dans la nutrition minérale ce qui affecte d'une part le développement de la plante hôte, et d'autre part l'efficience des rhizobiums et engendre par conséquent une diminution de la nodulation (Munns, 1977). Alors que le pH alcalin du sol a un effet négatif sur la disponibilité de certains minéraux tels que le fer et le manganèse autant pour le rhizobium que pour la plante hôte (Bordeleau et Prévost, 1994).

3. 4. 1. 2. Le stress salin

En symbiose, le rhizobium est plus résistant à la salinité que son partenaire végétal (Zahran, 2001). La tolérance de la plante hôte constitue donc un facteur déterminant (Soussi et al., 1998).

La salinité affecte l'initiation, le développement et le fonctionnement des nodules, de même que la capacité photosynthétique des feuilles. Il s'avère que la FSN (Fixation Symbiotique de l'Azote) est plus affectée par le sel que la croissance des plantes (Rao et al., 2002). Généralement l'activité des nodules est plus touchée par le sel que la nodulation, mais l'étape la plus sensible à la présence du sel est le processus infectieux (Payakapong et al., 2006).

La symbiose rhizobium/sulla en condition saline est étroitement liée à la souche rhizobiale. Dans ce sens, Ghidhaoui et al. (2008) a noté qu'à 75 mM de NaCl, le sulla inoculé par la souche SLA améliore le nombre de nodules et la matière sèche aérienne respectivement de 5,82 et 11,93 % comparativement à celui inoculé par SMA.

3. 4. 1. 3. Le stress hydrique

Le stress hydrique affecte la fixation symbiotique de l'azote à différents niveaux:

(i) La formation et la croissance nodulaire; (ii) le métabolisme du carbone et de l'azote; (iii) l'activité de la nitrogénase; (iv) la perméabilité nodulaire à l'oxygène (Zahran et Sprent 1986; Aguirreolea et Sanchez-Dýaz 1989; Sadowsky 2005).

La sécheresse inhibe la nodulation et la fixation azotée même chez les plantes inoculées (Zablotowicz et al., 1981). En effet, il existe des taux d'humidité extrêmes tolérés au delà desquels le développement et la survie du rhizobium sont affectés (Vincent, 1982).

Parmi les signes d'adaptation au stress hydrique, certains auteurs tels que Saadallah et al. (2001) ont sélectionnés des lignées de haricot qui arrivent à maintenir une surface foliaire importante ainsi qu'un système racinaire abondant et efficace en condition de déficit hydrique. Guckert et Laperrière (1985) ont montré qu'il existe une relation linéaire entre le potentiel hydrique de base et l'activité de fixation de l'acétylène chez le Trifolium repens L., en soulignant la corrélation étroite existant entre l'alimentation en eau et la fixation de N2.

L'irrigation stimule la fixation symbiotique, surtout chez les plantes non fertilisées. D'un autre côté, la fixation de l'azote paraît très sensible à toute limitation de l'alimentation hydrique (Deschamps, 1985).

Selon Ben Taamallah (1998), une irrigation de complément, apporte des améliorations de production fourragère de 125 à 170 % selon l'origine des souches. Alors qu'en condition de pluviométrie limitante, l'inoculation par ces mêmes souches apporte des améliorations de production fourragère comparables entre 87 et 91 %.

3. 4. 2. Effet des techniques culturales sur la fixation symbiotique

Dans le cas des grandes cultures, l'usage des produits phytosanitaires de synthèse et les labours profonds et répétés, mais aussi la fertilisation, apparaissent comme des facteurs majeurs du déclin de la richesse spécifique et de l'abondance de nombreux organismes. (Aubertot et al., 2005; Tscharntke et al., 2007)

3. 4. 2. 1. Effet de la fertilisation chimique

La fertilisation chimique raisonnée des cultures se traduit par des effets généralement positifs sur l'abondance et la croissance des organismes vivants dans le sol et la végétation. D'un autre côté, celle-ci tend à diminuer la richesse spécifique de nombreux groupes (plantes, bactéries du sol, microarthropodes...) (Klimek et al., 2007).

Le phosphore améliore la fixation symbiotique de l'azote à travers l'augmentation de la nodulation (Tibaoui et Zouaghi, 1989). Une carence en cet élément induit non seulement une réduction de la croissance mais aussi un ensemble de modifications physiologiques et métaboliques caractérisées par une prolifération du système racinaire et une stimulation de l'activité des phosphatases acides (Li et al., 2002). Selon Christiansen et Graham (2002), la carence en phosphore affecte la croissance de la plante mais aussi l'activité nodulaire impliquant par conséquent la réduction de la fixation symbiotique de l'azote. D'après Aftab et al. (2010), l'apport de cet élément à la culture de soja améliore de 46 % l'efficacité symbiotique de Bradyrhizobium japonicum TAL 377. Dans le même sens, Cadisch et al.(1993) ont enregistré, suite à une augmentation de la fertilisation phosphatée de 5 à 75 kg/ha, une amélioration de 15 % de l'azote fixé par la voie symbiotique dans des cultures de Centrosema acutifolium Benth. et C. macrocarpum Benth.

Selon Zaidi et al.(2009) la libération d'acides organiques dans la rhizosphère par les microorganismes du sol est à l'origine de la solubilisation du phosphore minéral. Cet effet est d'autant plus efficace dans les sols basiques (Solano et al.,2008; Khan et al., 2010).

La fixation symbiotique est aussi affectée par la carence d'autres éléments tels que le fer ou encore le soufre. La fertilisation sulfurée stimule la fixation azotée chez la Luzerne et le pois (Zhao et al., 1999; Varin et al., 2009), alors qu'une carence en cet élément réduit la teneur en leghémoglobine dans les nodules du petit pois et de la luzerne (Scherer et al., 2008).

3. 4. 2. 2. Effet du travail du sol

La survie ainsi que le pouvoir infectif des rhizobiums sont largement affectés par les pratiques culturales puisqu'elles agissent indirectement sur les propriétés chimiques du sol (Slattery et al., 2001).

Ainsi, la mécanisation cause des perturbations qui sont la cause directe de l'oxydation rapide ainsi que de la décomposition de la matière organique du sol, engendrant une diminution du stock de carbone nécessaire à leur survie. Ces conditions occasionnent une vulnérabilité de ces microorganismes aux conditions externes (Coventry et al.,1985) et une diminution de leur diversité (Sturz et al., 1997).

3. 4. 2. 3. Effet des traitements phytosanitaires

L'usage d'herbicides affecte la fixation biologique de l'azote à travers les interactions produites entre les plantes et la communauté bactérienne, particulièrement les rhizobiums mais aussi les champignons (Fox, 2004). Il a été rapporté que l'application d'herbicides de type bentazone et MCPA (acide 4-chloro-2 methylphennoxyacetique) à Trifolium pratense L. a engendré une altération de la morphologie des racines ainsi qu'une réduction du nombre de nodules et de l'activité de la nitrogénase des plants (Lindström, 1985).

L'application de l'herbicide dinoseb (2-sec-butyl-4,6dintrophenol) à la même espèce a de même réduit significativement l'activité de la nitrogénase des plants (Lindström, 1985). Le traitement des souches rhizobiales isolées à partir des nodules issus de plants traités par dinoseb ont révélé une résistance à cet herbicide. Ces mêmes souches ont par ailleurs été incapables d'induire une symbiose efficiente avec leur plante hôte en condition de traitement avec le dinoseb à 200ug/ml. L'auteur a ainsi suggéré que l'application foliaire du dinoseb n'affecte pas directement les nodules mais indirectement la fixation symbiotique suite à l'altération du système photosynthétique de la plante. Un effet dépressif de l'application d'herbicides a été observé sur la croissance in vitro de Bradyrhizobium japonicum et sur la nodulation de la culture de haricot menée en condition contrôlée (Mallik et al., 1985 ; Mallik et al.,1993). L'application de 5 herbicides différents (sethoxydim, alachlor, fluazifop butyl et metalachlor) aux doses recommandées, sur une culture d'haricot, n'a nullement affecté sa fixation symbiotique et sa production des graines (Rennie et al.1984). Par contre, Isoi et al. (1990) ont noté un effet négatif de l'herbicide (paraquat) sur l'activité fixatrice de l'azote chez le haricot.

3. 5. Effet des bactéries amélioratrices de la croissance des plantes

Parmi les microorganismes du sol, certains à effet PGPB (plant growth promoting bacteria) ont la particularité d'améliorer la croissance des plantes directement ou indirectement (Khan et al., 2009).

La stimulation directe consiste à fournir des éléments nutritifs pour la plante. Parmi ces éléments, figurent : (i) l'azote à travers l'activité des nitrate réductase; (ii) les phytohormones (tels que l'acide indole acétique, la zéatine, l'acide gibbérellique et acide abscissique); (iii) le fer séquestré par les sidérophores bactériens; (iv) le phosphore à travers la solubilisation d'acides organiques (Zaidi et al., 2009).

L'action indirecte inclue : (i) la prévention des phytopathogènes; (ii) l'allélopathie; (iii) la production d'antibiotiques; (iv) la compétition avec les agents délétères (Egamberdiyeva et Islam 2008).

L'inoculation avec des PGPB autre que les rhizobiums peut améliorer la nodulation par infection avec les rhizobiums à travers la modification de l'architecture des racines ou encore la suppression de la biosynthèse de l'éthylène au niveau racinaire. Cet élément qui est directement responsable de la suppression de la formation nodulaire serait inhibé par la l'ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase libérée par certaines rhizobactéries.

Dans ce sens, Shaharoona et al. (2006) ont rapporté que la coinoculation du haricot mungo (Vigna radiata L.) avec une PGPB associée à Bradyrhizobium améliorait la nodulation de cette fabacée de 48 % comparativement à celle inoculée avec Bradyrhizobium uniquement. Selon ces auteurs, cette amélioration est due à la diminution de la synthèse de l'éthylène sous l'action de l'ACC deaminase de la PGPB. Shahzad et al. (2008) ont aussi montré l'effet de l'activité de l'ACC deaminase de 3 souches rhizobactériennes sur l'amélioration de la nodulation d'une culture de pois chiche. Ces auteurs ont enregistré une amélioration de la nodulation de 87 % comparativement au témoin. Dans le même sens, Belimov et al. (2009) ont rapporté une amélioration de la croissance d'une culture de pois en condition de stress hydrique grâce à l'activité de l`ACC deaminase de la bactérie Variovorax paradoxus.

3. 6. Formes et qualité des inoculums

Les formes d'inoculums peuvent être poudreuse, granuleuse, ou encore liquide (Date, 2000; Deaker et al., 2004). La méthode la plus conventionnelle de l'inoculation est l'application directe sur les semences.

D'autres techniques proposent l'inoculation sur des granulés minéraux (Wadoux, 1991), ou encore sur le lit de semence (Hynes et al., 1995). Durant cette dernière décennie, le développement technologique a évolué dans le sens de l'utilisation, comme support pour les rhizobiums, de sous produits à la fois économiques et faciles à utiliser (Ben Rebah et al., 2007; Brockwell and Bottomley, 1995; Denton et al., 2009), (Tableau 3).

Tableau 3: Techniques d'inoculation des légumineuses (Brockwell, 1977; Thompson, 1988).

Les graines sont mélangées avec une solution aqueuse de tourbe souvent avec l'addition d'un adhésif

Les graines sont traitées avec un inoculum de tourbe et boue suivie d'un ajout de phosphate ou de carbonate de calcium.

La souche de Rhizobium est introduite dans ou sous le tégument des graines sous vide.

L'inoculum liquide est ajouté à la plante en stade jeune plantule
Des granules contenant l'inoculum sont semées avec les graines

Les inoculums sont produits et commercialisés dans plusieurs pays. Leur qualité dépend du nombre, de l'efficience ainsi que de la stabilité génétique des souches rhizobiales contenues dans ces inoculums (Hiltbold et al., 1980; Brockwell et Bottomley, 1995; Stephens et Rask, 2000; Amarger, 2001), mais aussi de leur niveau de compétition avec les rhizobiums indigènes ainsi que leur persistance dans le sol (Graham and Vance, 2003). Cette qualité est très variable d'un pays à un autre. En effet, il existe sur le marché des pays où les contrôles de qualité ne sont pas pratiqués systématiquement, des inoculums de mauvaise qualité (Catroux et al., 2001). Alors qu'en général, les inoculums sous forme liquide ou sur support poudreux, produits en Amérique du Nord, Europe, Australasie et certains autres pays sont de bonne qualité.

Les inoculums de haute qualité peuvent fournir approximativement 10⁴ à 10¹¹ rhizobium/g de sol. Ce qui représente près de 1 % de la population indigène présente dans l'horizon 0-20 cm du sol (Catroux and Amarger, 1992).

La conservation des inoculums est aussi un critère important pour leur qualité. Boonkerd (1991) a montré que la conservation des inoculums à des températures supérieures à 10°C diminue considérablement leur longévité.

MATERIEL ET METHODES

1. Sites de collecte des rhizobiums

Les prospections et collectes des couples symbiotiques sulla/rhizobium ont été réalisées en période de floraison des plantes durant les années 2005, 2006 et 2007; dans des champs de production de semences de sulla variété Bikra 21 de première année de culture. Ces derniers sont répartis dans des stations bioclimatiques de la Tunisie septentrionale (Figure 4).

Figure 4: Distribution géographique des sites de collecte des rhizobiums du sulla.

Pour chaque site, des informations éco-géographiques utiles ainsi que des analyses chimiques ont été effectuées:

- La position géographique (latitude, longitude et altitude). Ces coordonnées ont été mesurées par un GPS (global positionning satellite) de marque Garmin Etrex.

- Les cumuls pluviométriques du semis jusqu'à la récolte des graines de sulla respectifs aux années de prospection et collecte du matériel rhizobial.

Ces données ont été recueillies au près de la direction des ressources en eaux à Montfleury Tunis.

- La fertilité des sols a été déterminée par des analyses pédologiques dans l'horizon 0-20 cm. Les dosages réalisés ont concerné le pH dans l'eau H20 (Afnor 1981), la saturation en eau, la capacité d'échange cationique (Metson, 1956), les teneurs en matière organique selon la méthode de Walkley et Black (Afnor, 1983), calcaires total et actif (Afnor, 1982), le potassium échangeable (Pauwels et al., 1992) et phosphore assimilable selon la méthode Olsen (Afnor, 1984). L'ensemble des données collectées est résumé dans le tableau 4.

Tableau 4: Caractéristiques géographiques, climatiques et chimiques des sites de collecte des rhizobiums.

Nom du site	Lat N	Long E	Alt m			Analyses du sol							P
				pH H2O	SAT %	CE mS.cm^-1	CT	CA	MO	C	_P2O5	K20	mm
				pH H2O	SAT %	CE mS.cm^-1			%			ppm
Medjez El Bab	36°4	9°33	130	8,2	48	0,7	64	29	0,9	0,5	70	440	310,8
Smadah	36°55	9°29	318	7,2	60	0,9	51	24	1,1	0,6	240	980	456,5
Ghzéla	37°05	9°33	27	8,2	52	1,5	56	23	0,7	0,4	25	300	751,3
Téboursouk	36°25	9°05	484	8,2	60	0,6	57	24	0,8	0,5	20	260	479,5
Tunis	36°49	10°1	10	8,5	48	0,9	40	20	0,5	0,3	30	570	459,0
Oued Zarga	36°41	9°25	140	7,5	50	0,3	59	21	4,7	2,7	194	470	559,2
Ain Chalou	36°76	9°29	324	8,2	58	1	45	19	1	0,6	43	460	243,0
El Fahs	36°22	9°5	179	8	55	1,4	35	16	0,7	0,4	15	290	384,7
Ben Arous	36°36	10°08	82	7,5	43	1,1	18	6	2,7	1,6	101	420	516,2
Mateur Jalta	36°54	9°26	270	7,9	45	0,9	33	20	2,3	1,4	66	450	1560,1
Menzel
Bouzelfa	36°42	10°42	151	7,5	55	0,6	36	17	4,2	2,4	79	470	613,0
Methline	37°04	9°47	126	7,6	46	0,9	38	14	4,5	2,6	106	470	534,1
Badrouna	36°30	8°57	146	8,2	48	1,3	28	11	0,6	0,3	38	400	525,5
Goubellat	36°37	9°36	56	8,1	47	1,1	53	20	1	0,6	106	510	398,2

Lat : Latitude ; Long : Longitude ; Alt : Altitude ; SAT : Saturation en eau ; CE: conductivité électrique en; CT : Calcaire total; CA: Calcaire actif; MO: Matière organique; C: Carbone ; P2O5 : Phosphore assimilable ; K2O : Potassium échangeable ; P : Cumul pluviométrique

2. Conduite des cultures au niveau des champs de production de semences

Une enquête au près des multiplicateurs a été utile afin de déterminer les itinéraires techniques et conduite culturale relatifs aux diverses parcelles. Toutes les cultures de sulla avaient un même précédant cultural (Céréales). Les préparations du sol ont été de type conventionnelles et similaires à celles préconisées pour les autres fabacées à petites graines (un labour de 20 à 30, suivi d'un à deux recroisements).

Les semis en gousses ont été effectués mécaniquement en lignes à la dose de 25 kg/ha et à une profondeur de 1 à 2 cm. La période de semis a été échelonnée entre le 1^er et le 15 octobre à l'exception du site Mateur Jalta au mois de décembre.

La fertilisation réalisée dans les sites de Medjez El Bab, Smadah, Oued Zarga, Ain Chalou, Methline, Badrouna, et Ben Arous s'est limitée à un apport d'engrais phosphaté sous forme de super 45 à une dose de 150 kg/ha (Rondia et al., 1985). Seules les stations Ben Arous et Smadah avaient reçu en plus du phosphore, un apport d'engrais potassique sous forme de sulfate de potasse à raison de 100 kg/ha. Alors que, Ghezala, Téboursouk, Tunis, El Fahs, Mateur Jalta, Menzel Bouzelfa et Goubellat n'avaient eu aucun fertilisant. Vu la nature de l'espèce (fabacée), aucun engrais azoté (minéral ou organique) n'a été apporté.

Concernant la fertilisation biologique sous forme rhizobiale, les agriculteurs de ces stations ont confirmé n'avoir jamais effectué d'apport d'inoculum exogène.

La gestion des adventices n'a pas été homogène dans toutes les stations. En effet, 57 % des stations ont effectué un désherbage chimique en pré et post semis avec un anti- dicotylédone et un anti-graminée spécifiques. Les sites Ghézala et Ben Arous ont de plus été concernés par un second passage d'herbicide de type anti-dicotylédone spécifique. Alors qu'un binage manuel a été effectué à Tunis et El Fahs. Les sites de Goubellat, Mateur Jalta et Téboursouk n'ont par ailleurs subis aucun traitement herbicide.

3. Caractérisation agronomique et symbiotique du sulla cultivé

Les premières mesures ont été réalisées au stade floraison. A ces dates, le nombre de

jours depuis le semis jusqu'à la floraison, la densité de peuplement du couvert végétal (sulla et adventices) ont été déterminés. Cette dernière a été réalisée par un quadra métallique de 1 m², lancé aléatoirement dans les différentes parcelles à raison de 5 lancées par site. Le contenu du quadra en sulla et adventices (toutes espèces confondues) est dénombré sur place.

3. 1. Hauteur de végétation

Dix plantes entières ont été choisies d'une manière aléatoire de chaque parcelle pour l'évaluation de la croissance en hauteur du couvert végétal en cm. Les mesures ont été réalisées par un mètre ruban.

3. 2. Biomasse sèche

Au stade floral, un quadra de 1m² a été lancé de manière aléatoire dans les différentes parcelles à raison de 5 lancées. Le contenu du quadra a été fauché et pesé immédiatement au moyen d'une balance mobile. Au laboratoire, un échantillon de 500 g de plantes/quadra fraîchement coupées a été placé dans une étuve ventilée de marque Jouan à 70°C pendant 72 h. Cet échantillon a servi à la détermination des poids secs par une balance de marque Mettler.

3. 3. Semences en gousses

En fin de cycle et à maturation complète des gousses, le même quadra de 1 m² a servi à l'estimation des rendements en graines de chaque parcelle. La lancée du quadra a été réalisée arbitrairement à raison de 3 fois pour chaque parcelle. Les plants délimités par le quadra ont été récoltés manuellement à l'aide d'une faucille et placées dans des sachets. Au laboratoire, les gousses ont été séparées des fanes, puis pesées au moyen d'une balance de marque Mettler.

3. 4. Protéines brutes

Le dosage de l'azote total a été réalisé selon la méthode Kjeldahl (Bremner, 1965). Le principe de cette méthode consiste à minéraliser 0,1 g de la poudre végétale sèche avec de l'acide sulfurique concentré (5 ml); lequel, par son action oxydante, détruit les matières organiques, libérant ainsi l'azote sous forme d'ammonium (NH4 +). Cette minéralisation a été effectuée à une température de 350 à 400°C, pendant 30 à 60 minutes et accélérée par l'emploi d'un catalyseur (sulfate de sélénium). Cette opération a été suivie par la distillation, avec ajout au contenu du matras de 20 ml d'eau distillée et 20 ml d'une solution de soude 10 N. L'azote a été ensuite récupéré dans une solution d'acide borique en présence d'un indicateur coloré.

Enfin, la titration de l'ion ammonium a été faite avec l'acide chlorhydrique (0,1 N) jusqu'au virage de l'indicateur du vert au rose. Sachant que l'élément azote représente 16 % de la matière azotée totale, les protéines brutes ont été déduites après multiplication du taux de l'azote obtenu par le facteur 6,25.

3. 5. Paramètres de nodulation et collecte des rhizobiums

L'arrachage aléatoire au stade pleine floraison de 10 plantes avec racines et par parcelle a servi à l'évaluation de la nodulation du sulla ainsi qu'à la collecte du matériel rhizobial.

Le protocole adopté est celui préconisé par Vincent (1970) et Somasegaran et al. (1994) qui consiste à:

- creuser à environ 15 cm autour de la plante et 20 cm dans le sol pour extraire la plante et son système racinaire;

- enlever soigneusement le sol lié au niveau des racines sans abîmer les nodules;

- placer délicatement la plante avec la motte racinaire dans un sachet de plastique;

- laver délicatement au laboratoire les racines et les nodules à l'eau courante; et

- détacher les nodules à 1 ou 2 mm du site d'attache, les rincer, puis les sécher avec du

Les nodules collectés sont ainsi détachés de leurs racines puis pesées. La masse sèche de ces derniers a été estimée après dessiccation dans une étuve à 70°C pendant 72 h.

3. 6. Conservation des Rhizobiums

3. 6. 1. Conservation des nodules par déshydratation

La conservation des nodules a été réalisée par déshydratation dans des flacons en verre contenant du CaCl2 (Figure 5). Le flacon en verre est rempli au deux tiers de son volume par du CaCl2. Les nodules ont été par la suite déposés entre deux couches de coton (Vincent, 1970). Sur chaque flacon on a noté le lieu et la date de prise de l'échantillon.

3. 6. 2. Conservation des isolats bactériens

L'isolement a été réalisé à partir de nodules fraîchement récoltés et d'autres conservés par déshydratation dans du CaCl2. Au total 10 nodules par site ont été isolés. La réhydratation des nodosités a été réalisée en condition stérile par imbibition à l'eau distillée stérilisée pendant 4 heures. Une fois les nodosités ont repris leur volume initial; celles-ci ont été désinfectées par l'alcool 95° pendant 15 secondes puis par le HgCl2 (0,1%) pendant 45 secondes. Après une série de 10 rinçages à l'eau distillée stérile, les nodosités ont été aseptiquement écrasées à l'aide d'une pince stérilisée puis étalée par striation directement sur des boîtes contenant le milieu YMA/RC (Vincent, 1970) (Annexe 1) additionné du rouge Congo à 2,5%. Ces différentes boîtes ont été par la suite placées dans un incubateur à 28°C.

Après une série de repiquages, et en se basant sur les caractéristiques morphologiques des colonies représentant le type majoritaire, un nombre de 50 isolats a finalement été retenu.

L'ensemble des 50 isolats sélectionnés a été ensemencé (Figure 6) dans des tubes contenant du milieu Yeast Extract-Mannitol (YEM) (Annexe 1) dépourvu du rouge Congo à gélose inclinée puis maintenu à 4°C. Sur chaque tube, le nom de la souche et la date de conservation ont été indiqués.

3. 6. 3. Conservation dans le glycérol

Ces isolats ont été également conservés dans des congélateurs à -20°C et à -80°C dans des ependorfs stériles contenant 200 ul de glycérol et 800 ul de pré culture bactérienne fraîche (Vincent, 1970).

3.7. Analyse des données

Une analyse factorielle (SAS, 1985) par correspondance a servi à la caractérisation des différentes stations à travers l'étude des paramètres climatiques et édaphiques afin de les classer en groupes selon les caractères les plus discriminants.

Dans un premier temps, une analyse de variance (ANOVA) (SAS, 1985) pour l'ensemble des paramètres de croissance et de rendement relatifs à la culture dans les différentes stations a été réalisée. Cette méthode permet une comparaison des moyennes en utilisant le test LSD (Low Significance Difference) au seuil 5 %. Une analyse en composantes principales (ACP) a permis dans un second temps d'établir deux diagrammes de dispersion dans les quels apparaissent les cultures relatives à chaque site et les variables étudiées. Cette analyse a été complétée par la méthode de classification hiérarchique basée sur tous les scores de l'ACP en utilisant l'algorithme Unweighted Pair Group Method Average (UPGMA) (Sneath et Sokal, 1973).

4. Etude de la diversité des microsymbiotes du sulla

Dans le but d'étudier la diversité des microsymbiotes du sulla, nous avons procédé à une caractérisation phénotypique puis moléculaire des isolats de la collection.

4. 1. Caractérisation phénotypique

Les caractères phénotypiques permettent de sélectionner des souches efficientes, compétentes et indifférentes aux divers stress environnementaux.

4. 1. 1 Infectivité des isolats

La capacité d'induire la formation de nodosités sur les racines de la légumineuse hôte est un critère de base pour l'authentification des isolats. De ce fait, la capacité infective des 50 isolats a été évaluée par la présence de nodosités sur les racines du sulla variété Bikra 21.

Les graines ont été stérilisées par lavage à l'hypochlorite de sodium à 1% pendant 8 minutes suivie d'un lavage de 15 secondes avec de l'alcool à 95° puis d'une série de 7 rinçages à l'eau distillée stérile. Les graines ont été mises sur milieu de germination gélosé agar-agar 0,9 % et placées à l'obscurité à 4°C pendant 48 heures; puis elles ont été déplacées dans un incubateur à l'obscurité et à 25°C pendant 3 à 5 jours.

Les graines ayant une radicule d'environ 0,5 cm (Figure 7) ont été transférées aseptiquement dans des pots de volume 33 cl remplis de sable stérile (stérilisation à l'étuve: 200°C pendant 48 h) à raison d'une graine par pot.

Les pots ont été ensuite placés dans une chambre de culture à température, humidité et photopériode contrôlées respectivement 25°C, 36%, et 16 h lumière /8 h obscurité.

Figure 7: Germination des graines de sulla sur milieu gélosé agar-agar 0,9 %.

Une colonie bactérienne de chaque isolat a été introduite dans un milieu YEM liquide et mise en agitation à 150 tr/min à 28°C dans des conditions d'obscurité. Après 48 h, quand la solution est devenue trouble (10⁸ bactéries/ml); chaque plante a été inoculée par 1 ml de la suspension bactérienne. Trois pots contenant chacun une seule plante ont été utilisés pour chaque souche. Après inoculation, les pots ont été couverts avec du papier aluminium stérile pour éviter d'éventuelles contaminations (Figure 8).

Des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoin (T0). Les plantes ont été arrosées 3 fois par semaine alternativement avec de la solution nutritive dépourvue d'azote (Vadez et al., 1996) (Annexe 2) et de l'eau distillée stérile.

Figure 8: Test d'infectivité des souches de la collection en association avec Hedysarum coronarium L. et en conditions contrôlées.

Après 8 semaines de culture, l'infectivité des souches a été évaluée par la présence de nodules sur les racines de l'ensemble des 3 plantes. Les plantes ayant au moins une nodulation positive sur l'ensemble des 3 répétitions sont maintenues pour une ultérieure caractérisation morphologique et moléculaire.

4. 1. 2. Critères morphologiques

Afin d'identifier les bactéries isolées, on a procédé à une coloration Gram permettant de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne. Le principe de cette méthode consiste en la fixation de la solution bactérienne à la chaleur à environ 40°C pendant 10 minutes puis à la réalisation d'une série de colorations (Coloration par le violet de gentiane (1 min); mordançage au lugol (20 sec); décoloration à l'alcool (20 sec); et recoloration à la fuchsine (1 min)). Enfin l'observation du frottis au microscope (grossissement 1000) permet selon la couleur de la paroi de différencier entre les bactéries Gram + et Gram-.

Après purification des bactéries selon la technique de Vincent (1970) et incubation à 28°C pendant 4 à 5 jours, une analyse visuelle de l'aspect des colonies a été faite comme celle décrite par Jordan (1982). Les critères choisis sont relatifs à la forme, la taille et la consistance des colonies.

4. 1. 3. Critères physiologiques des colonies

Les critères physiologiques testés se sont limités aux plus importants facteurs de stress abiotique en Tunisie. Parmi ces facteurs la tolérance aux stress hydrique, salinité, pH et calcaire a été évaluée pour l'ensemble des souches de la collection ayant présenté au moins une nodulation positive par répétition.

Les tolérances aux facteurs de stress ont été effectuées par culture des souches en milieu liquide dans des flacons contenant 5 ml d'une solution YEM liquide et inoculée par une pré-culture en phase exponentielle. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque type de stress.

Après une incubation à 28°C pendant 5 jours en agitation (150 rpm), la limite de tolérance aux différents stress a été évaluée par mesure de la densité optique (DO) à 620 nm.

4. 1. 3. 1. Tolérance à la salinitéLa tolérance des souches au sel a été effectuée sur milieu YEM gélosé et liquide en

augmentant la concentration en NaCl par palier de 50 mM. Les teneurs ont varié de 100 à 1000 mM.

La méthodologie suivie pour l'évaluation de la tolérance au stress hydrique osmotique des bactéries est la même que celle appliquée pour la tolérance au sel (Buss et al., 1989). Le produit utilisé à ce propos est le polyéthylène glycol (PEG 6000). Les potentiels osmotiques testés sont -0,25 ; -0,5 ; -0,9 ; -0,95 et -1MPa.

Hedysarum coronarium L. est une plante adaptée aux sols argilo-calcaires. Ces sols se distinguent par un pH basique d'où l'initiative d'étudier la tolérance des souches aux pH alcalins.

Les souches ont été évaluées pour leur tolérance aux pH alcalins sur YEM liquide additionné d'une solution NaOH 5N. Le pH a été ajusté aux valeurs suivantes: 7; 7,5; 8 ; 8,5 ; 9; 9,5; 10 ; 10,5; 11; 11,5 et 12.

La capacité des souches à tolérer le stress calcaire a été évaluée sur milieu gélosé YEM additionné de rouge Congo (RC), renfermant des teneurs croissantes en CaCO3: 0,5 M ; 1M ; 1,5M et 2M.

4. 1. 4. Analyse numérique

L'analyse numérique des résultats de l'ensemble des tests phénotypiques a été indiquée par 1 pour tout résultat positif et 0 pour le négatif. Ainsi, les caractères relatifs aux stress abiotiques (pH, salinité, PEG), et les caractères morphologiques liés aux colonies ont été rapportés sur deux matrices différentes puis réunies sur une seule. La comparaison entre les souches prises deux à deux a été réalisée par la méthode UPGMA. Sur la base de cette méthode, trois phénogrammes ont été construit par le logiciel Statistica version V.

4. 2. Caractérisation moléculaire

4. 2. 1. Extraction de l'ADN bactérien

A partir d'une boîte de pétri, contenant des colonies pures de chaque isolat, une colonie a été repiquée sur milieu Yeast Extract-Tryptone (TY) (Beringer, 1974) gélosé incliné (Annexe 1) et incubée à 28°C pendant 48 heures. Après avoir ajouté 8 ml d'eau Milli-Q stérile, les bactéries ont été mises en suspension. Une centrifugation de 7 minutes a été effectuée et le culot est re-suspendu dans 50ul d'eau Milli-Q et soumis à une deuxième centrifugation de 3 minutes. Au culot, il a été ajouté 100 ul de tampon tris HCl 10 mM à pH 8,3; 100 ul d'eau distillée stérile; et 17ul de PK (Protéinase K 1 mg/ml). Le mélange a été ensuite incubé à 55°C pendant 12 heures. L'arrêt de la digestion a été provoqué après ébullition pendant 10 min.

4. 2. 2. Evaluation de la diversité génétique des isolats de la collection par Rep-

PCR

Dans la technique Rep-PCR, les amorces sont conçues pour s'hybrider d'une façon complémentaire aux extrémités des séquences répétitives inversées; de telle manière que la PCR permet l'amplification de toute la séquence localisée entre les sites d'hybridation des amorces. L'amplification génère ainsi différents fragments d'ADN de tailles variables.

Par séparation électrophorètique, ces fragments permettent la révélation d'une empreinte génétique spécifique (Versalovic et al., 1991; De Bruijn, 1992) à chacune des 45 isolats de la collection.

Les réactions d'amplification ont été réalisées selon une optimisation du protocole décrit initialement par De Bruijn (1992). L'amplification a été effectuée dans des micro-tubes de 100 pl contenant 30 pl de volume final de réaction. Le mélange réactionnel comprend le tampon de réaction au 1/10 du volume final et qui contient 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, et 0,1 % Triton X-100; 1 mM de chaque desoxyribonucléoside triphosphate (dNTP); 5 mM MgCl2; 3 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 %; 1 pl de bovine serum albumin (BSA) à 10 mg/ml; 30 pmol de chaque amorce; 2U de la Taq polymérase et 2 pl du lysat d'ADN. Les deux amorces palindromiques utilisées pour amplifier les séquences répétitives Rep sont Rep 1 et Rep 2.

Après addition des échantillons d'ADN des 45 isolats, les micro-tubes ont été placés dans un thermocycleur. Un micro tube dont l'ADN a été remplacé par de l'eau bi-distillée stérile est utilisé en tant que témoin négatif.

Les mélanges ont été alors soumis au processus d'amplification établi par Grundmann et al. (1997) selon le programme Rep-PCR (Tableau 5).

A la fin de l'amplification, un aliquote de 15 jtl de chaque amplifiat a été mélangé avec 2jil de bleu de Bromophénol (BBE). Les différents mélanges ont été soumis à une électrophorèse horizontale sur gel d'agarose (Sigma Ultra Pure) à 1,5% dans le tampon Tris, Acétate, EDTA (TAE) (Annexe 4) pendant trois heures à 80V. Le 100 pb et le 1Kb step ladder (Promega) ont été utilisés comme marqueurs de poids moléculaire lors de chaque migration effectuée. Le gel a été coloré dans une solution de bromure d'éthidium à 1 mg/ml pendant 20 à 25 min, rincé dans de l'eau distillée pendant 3 min, puis placé sous UV au Biodoc pour être photographié.

La taille en paire de base des différentes bandes obtenues a été évaluée par comparaison à celles des marqueurs moléculaires utilisés à l'aide du logiciel PM, Macintoch, Vs 4,0.

4. 2. 3. Identification moléculaire par PCR-RFLP de l'ADNr 16S

L'amplifiat a été préparé dans un volume final de 25 ul en utilisant les amorces rd et fd selon le prototole mentionné dans le tableau 5. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur (Biometra TRIO-Thermoblock) selon le programme approprié (Tableau 6).

La vérification de l'amplification a été réalisée par électrophorèse horizontale sur un gel d'agarose 0,9 % (Sigma medium EEO type II) à 100V pendant 30 min dans le tampon TAE 1X (Tris Acétate EDTA). Le gel a été coloré au BET (1ug/ml d'eau distillée) et visualisé sous UV (312 nm) au Biodoc (Biodoc 2NT/Biometra). Le Felix-500 pb Ladder a été utilisé comme marqueur standard de taille (Annexe 3).

Les fragments amplifiés ADNr 16S avec des amorces non marquées, ont été digérés par l'enzyme de restriction MspI (Invitrogen) dans un volume de 15 pl à 37 °C pendant 3 h. La discrimination a été réalisée aussi par NdeII (Invitrogen). La digestion a été réalisée sur 8 ul de l'amplifiat mélangé avec 1 ul d'une enzyme de restriction à site de coupure tetranucléotidique (5U/ul), dans un volume équivalent de tampon (0,9 tampon + 0,1ul BSA (10mg/ml)). La réaction a été arrêtée après incubation à 65°C pendant 10 min pour inactiver l'enzyme de restriction. La séparation des fragments d'ADN digérés a été réalisée par migration électrophorétique sur gel d'agarose (QA-Agarose, Q-Biogène), à une concentration de 3 % (m/v) dans un tampon TAE 1X (Tris-acétate 40 mM, EDTA 1 mM).

Tableau 5: Quantités et réactifs utilisés pour l'amplification de l'ADNr 16S et de la séquence Rep-PCR.

Le marqueur de poids moléculaire Smart ladder (échelle de 200 à 10000 pb) ou Smart ladder low 20 pb (échelle de 20 à 1000 pb, Eurogentec) a été utilisé comme standard de taille. Les ADNs ont été visualisés par fluorescence aux UV après imprégnation au BET (1 cg/ml). La taille en paire de base des différentes bandes obtenues a été évaluée par comparaison à celles des marqueurs moléculaires utilisés à l'aide du logiciel PM, Macintoch, Vs 4,0.

Tableau 6: Cycles de variation des températures au cours de l'amplification des différents gènes.

4. 2. 4. Séquençage du gène de l'ADNr 16S

La détermination du statut taxonomique des souches de sulla étudiées par le séquençage du gène de l'ADNr 16S précisera si ces souches constituent une nouvelle espèce parmi les rhizobiums.

L'ADN 16S est purifié avec le kit Gene Elute PCR cleaning up Kit, et le gène est préparée pour le séquençage en mélangeant 8 à 10 pmol/100 pb d'ADN avec 3 ul du Sequencing reaction mix (Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)) et 3,2 pmol du primer et le volume est ajusté à 10 ul avec de l'eau Milli-Q stérile.

Les réactions de séquençage de l'ADN ont été réalisées selon la méthode de Sanger, à l'aide du kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) selon les recommandations du fournisseur. Les produits des réactions de séquence ont été ensuite purifiés sur des colonnes Sephadex AutoSeq G-50 (Amersham Pharmacia Biotech). L'électrophorèse capillaire a été effectuée sur un séquenceur automatique ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Les séquences nucléotidiques ont été ensuite comparées aux séquences contenues dans les banques de données à l'aide du logiciel Blast (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.gov/blast). Le logiciel Clustal W ( www.infobiogen.fr) a permis l'alignement des séquences.

4. 2. 5. Analyse numérique

Les similarités entre les différentes souches analysées ont été évaluées par comparaison des profils de restriction prises deux à deux. Une matrice bidimensionnelle a été construite sur la base de ces profils. Les distances génétiques calculées selon UPGMA ont permis la construction d'un dendrogramme mettant en évidence les relations génétiques existantes entre les différentes souches analysées.

5. Evaluation de l'efficience symbiotique des isolats de la collection

Dans le but d'évaluer les performances symbiotiques des isolats de la collection, 30 souches ont été testées pour leur efficience.

5. 1. Conduite de l'essai

L'évaluation de l'efficience symbiotique des souches a été réalisée en association avec Hedysarum coronarium L. variété Bikra 21. Les graines ont été désinfectées par imbibition à l'hypochlorite de sodium (1 %) et à l'alcool (95°) respectivement pendant 8 min et 15 secondes.

Ces dernières ont été ensuite rincées 8 fois à l'eau distillée stérile et immédiatement semées le 12 novembre 2007 dans des gobelets de 33 Cl, à raison d'une graine par gobelet. L'ensemble des gobelets a par la suite été placé sous serre vitrée. A l'apparition des cotylédons, les plants ont été inoculés avec 1 ml d'une solution bactérienne fraîchement préparée (10⁸ bactéries/ml). Des plantes non inoculées ont été utilisées comme témoins : un premier témoin absolu (T0) et un deuxième (TN) avec un apport azoté de 60 unités fractionné en deux. Le premier apport a été réalisé au stade cotylédonaire et le second au stade 3 feuilles uni-foliolées. Quatre répétitions ont été réalisées pour chaque traitement.

Les plantes ont été arrosées 3 fois par semaine alternativement avec de la solution nutritive dépourvue d'azote (Vadez et al., 1996) (Annexe 2) et de l'eau distillée stérile.

5. 2. Paramètres mesurés

Douze semaines après inoculation, et au stade 6^ème feuille pluri foliée du sulla, les paramètres de nodulation (nombre et poids) ont été évalués selon les techniques précitées. La croissance en hauteur a été réalisée à l'aide d'une règle graduée. La surface foliaire cumulée pour l'ensemble des feuilles constituant une seule plante a été estimée en Cm²/ plante et déterminée au moyen d'un planimètre de marque LICOR.

Les rendements en biomasse sèche par plant de sulla ont été estimés après dessiccation de la partie aérienne des plantes à l'étuve ventilée à 70°C pendant 72 h puis mesure des poids secs par une balance.

Le dosage des protéines brutes aériennes par plante a été réalisé par la méthode Kjeldhal, à partir de la poudre végétale des plants desséchés, selon le même protocole préalablement cité.

6. Evaluation de l'efficience symbiotique du couple Hedysarum coronarium L./R. sullae en conditions de stress hydrique

Dans le présent essai, on se propose de tester les performances symbiotiques de 3 souches rhizobiales (HC1, HC5 et HC14) en association avec Hedysarum coronarium L. variété Bikra 21 dans quatre régimes hydriques (100 % RU, 75 % RU, 50 % RU et 25 % RU) correspondant aux volumes d'eau additionnés respectivement de 300 mm; 225 mm; 150 mm et 75 mm). Deux témoins (T0 et TN) ont été introduits dans le dispositif expérimental comprenant trois répétitions par traitement. Le TN comprend un apport de 90 unités d'azote réparties en trois apports selon les stades biologiques cotylédonaire, 3 feuilles uni-foliolées et ramification.

6. 1. Installation de l'essai

La culture a été réalisée en pots désinfectés par rinçage à l'eau de javel puis essuyés

avec du coton imbibé d'alcool 95°. Ces pots de diamètre 16 cm ont été remplis avec du sable de carrière préalablement stérilisé à l'étuve à 120°C pendant 24h à raison de 3,8 Kg par pot. Le semis a été effectué le 2 Décembre 2008 après désinfection des graines à raison d'une graine par pot. Ces derniers ont par la suite été placés sous serre vitrée (Figure 9).

Figure 9: Essai d'évaluation de l'efficience symbiotique des souches rhizobiales, en condition de stress hydrique, sous serre vitrée.

6. 3. Conduite de l'irrigation

La réserve totale RT a été estimée sur la base de 4 échantillons de substrat (sable de carrière) ramenés à la capacité au champ, pesés, puis séchés à 105°C pendant 48 h, et enfin repesés.

La différence entre le poids sec à la capacité au champ (3813 g) et le poids sec après séchage (2740 g) correspond à la réserve totale (Ducroq, 1990):

Tous les pots ont été maintenus à 100% de la réserve utile (RU) durant la période semis-inoculation. La date de l'inoculation a été le point de départ de l'application du stress hydrique. Afin d'éviter tout risque de carence minérale et pour bien observer l'effet souches, l'irrigation des pots a été faite par une solution nutritive carencé en azote (Annexe 2).

6. 4. Paramètres mesurés

L'essai a été maintenu 80 jours après l'inoculation, au terme desquelles, la nodulation (nombre et poids nodulaire), la croissance (croissance en hauteur et surface foliaire), et le rendement (biomasses aériennes et racinaires; et teneur en protéines brutes aériennes) du sulla ont été évalués.

7. Evaluation de l'activité symbiotique des souches en plein champ

L'efficience symbiotique dessouches rhizobiales HC5 et HC14 a été testée durant la campagne agricole 2008-2009, à régime pluvial et dans deux stations expérimentales différentes Tunis et Goubellat respectivement favorable et défavorable à la culture du sulla sans inoculation par le rhizobium spécifique.

7. 1 Caractéristiques climatiques des sites

Les deux sites Goubellat et Tunis appartiennent à l'étage bioclimatique du semi aride respectivement inférieur à hiver doux et supérieur à hiver tempéré. Les diagrammes ombrothermiques ont été déterminés en rapport avec le cycle de développement du sulla du semis à la floraison (Figure 10).

Figure 10: Variation des pluviométries (A) et des températures minimales et maximales (B) mensuelles receuillies durant la campagne agricole 2008-2009 dans les stations Tunis et Goubellat.

7. 2. Caractéristiques chimiques des sols

Les caractéristiques chimiques des sols relatifs aux deux sites expérimentaux sont présentées dans le tableau 7. La mesure du pH du sol est un paramètre important puisqu'il contrôle la disponibilité des éléments nutritifs dans les sols par les cultures. Ce paramètre a un effet direct sur la croissance et le développement du couvert végétal. Les mesures des pH révèlent que les sols de Tunis et Goubellat sont de type sub-alcalin (Sanaa et Robbez-Masson, 1986).

MO: matière organique; Nt : azote total; CE: conductivité électrique; CA: calcaire actif; _P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium échangeable.

7. 3. Dénombrement des populations natives de rhizobium nodulant le sulla dans les stations d'essai

L'analyse de la densité de la population rhizobiale: Most Probable Number (MPN)

spécifique au sulla du nord a été réalisée dans les deux stations avant l'installation de l'essai et au moment du démarrage de la végétation en cours de la deuxième année de culture du sulla uniquement dans le site Goubellat vu que celui de Tunis a été inondé. Cette expérience a pour but d'estimer la densité bactérienne des rhizobiums spécifiques au sulla. Cette technique est basée sur le piégeage des bactéries du sol par la plante hôte par inoculation de celle ci par des solutions de sol préparées de la manière suivante: Dans un Erlen Meyer stérile, 10 g de sol ont été solubilisés par agitation dans 90 ml de solution stérile de NaCl 0,9 %. Puis, des suspensions-dilutions de sol de concentration 10^-1 jusqu'à 10^-10 ont servi comme inoculum. L'inoculation a été faite avec 100 ul de chaque dilution et les répétitions sont à raison de quatre plantes par dilution. A la fin de la culture qui dure 60 jours, les plantes nodulées pour toutes les dilutions ont été dénombrées.

m: constante, en fonction du nombre de plantes nodulées (Vincent, 1970) (Annexe 5 ), d: dilution minimale = 10^-1 , et v: volume d'inoculation = 100 ul.

7. 4. Installation et conduite des essais

Pour les deux stations, le dispositif expérimental est en Bloc complètement randomisé à 3 répétitions, chaque bloc a été divisé en 4 unités expérimentales représentées par des lignes individuelles de 2 m de long. L'écartement entre les unités expérimentales a été de 3 m (Figure11).

Le semis du sulla (variété Bikra 21) a été effectué manuellement les 26 et 27 novembre 2008 respectivement dans les sites Tunis et Goubellat, à une profondeur de 1cm. A la levée, un éclaircissage a été réalisé sur l'ensemble des lignes en respectant un espacement de 2 cm entre les plants.

L'inoculation a été réalisée avec les souches HC5 et HC14 au stade cotylédonaire soit 15 et 30 jours après le semis respectivement à Tunis et Goubellat.

L'inoculation sous forme liquide a été réalisée par un arrosoir désinfecté à l'eau de javel puis lavé à l'eau distillée stérile. Chaque ligne a été inoculée par une préparation composée de 500 ml d'une suspension bactérienne fraîchement préparée (10⁸ bactéries/ml) diluée dans 10 l d'eau distillée stérile (Figure 12).

Figure 12 : Dilution de la pré culture rhizobiale (A) et inoculation du sulla au champ (B)

Les plantes non inoculées ont été utilisées comme témoin non azoté (T0). Le témoin azoté (TN) a été représenté par des plantes non inoculées mais recevant de l'azote sous forme d'ammonitrate 33,5%. Ce dernier a été dilué dans l'eau à raison de 30 unités au stade cotylédonaire, 30 unités au stade 3 feuilles uni-foliolées et 30 unités à la ramification.

Le désherbage a été effectué manuellement entre les lignes et moyennant un motoculteur entre les unités expérimentales dans les deux stations. Cette opération a été effectuée au stade 3 feuilles uni-foliolées et au stade ramification.

En deuxième année de culture le témoin azoté dans le site Goubellat a également été fertilisé avec de l'ammonitrate 33,5% à raison de 60 unités fractionnées en deux apports espacés de 30 jours.

7. 5. Paramètres mesurés sur le sulla de 1ère année

En première année de la culture et au stade floraison, une évaluation des paramètres de croissance (croissance en hauteur, surface foliaire), de nodulation (nombre et poids nodulaire) et de production (biomasse aérienne sèche et rendement en protéines brutes) a été réalisée dans les stations après arrachage de plantes entières.

7.6. Paramètres mesurés sur le sulla de 2ème année

L'essai a été maintenu durant la campagne agricole 2009-2010 uniquement dans la station Goubellat. A Tunis les pluviométries printanières excessives ont occasionné une asphyxie du système racinaire causant la sénescence de la culture.

L'analyse de la nodulation du sulla de deuxième année dans le site Goubellat a été réalisée au stade bouton floral par arrachage et observation des racines de 10 plants pris au hasard au niveau de chaque traitement.

Un mois après le démarrage de la végétation une première coupe a été effectuée et dix plantes par unités expérimentales ont été pesées, séchées à l'étuve puis broyées. Au stade bouton floral, la croissance en hauteur a été mesurée in situ. Dix plantes par unité expérimentale ont été choisies au hasard puis coupées manuellement à l'aide d'une faucille à un niveau de 5 cm du sol. Le rendement en matière sèche a été obtenu par pesée de ces plantes après séchage dans une étuve ventilée à 70°C pendant 72 h. Les plantes représentant un même traitement sont mélangées, broyées. La poudre végétale a servie à la détermination des protéines brutes.

8.Analyses statistiques

L'ensemble des mesures réalisées dans les essais d'évaluation de l'efficience du couple symbiotique R. sullae/Hedysarum coronarium a fait l'objet d'une analyse de la variance (ANOVA) (SAS, 1985) par comparaison des moyennes en utilisant le test LSD (Low Significance Difference) au seuil 5 %.

RESULTATS ET DISCUSSIONS

1. ETUDE DE LA VARIABILITE AGRONOMIQUE DU SULLA PORTE-GRAINES EN REGIONS NORD DORSALIENNES

Ce chapitre traite les états aussi bien agronomiques que symbiotiques de diverses cultures de sulla destinées à produire des semences. Une évaluation des potentialités symbiotiques des populations rhizobiales autochtones a été nécessaire en vue d'une caractérisation de ce matériel biologique.

1. 1. Caractéristiques édapho-climatiques des sites géographiques prospectés

La zone de prospection couvre les latitudes 36 et 37° N et les longitudes 9 et 10° E, et comprend les gouvernorats de Bizerte, Béja, Jendouba, Tunis, Zaghouan et Nabeul. Ces régions sont réparties selon l'échelle bioclimatique d'Hemberger entre l'étage semi aride inférieur à hiver doux (Menzel Bouzelfa, Goubellat) et l'étage humide à hiver doux (Mateur Jalta). Les différents sites varient en altitude de 10 à 484 m et en pluviométrie moyenne annuelle de 380 à 800 mm (Tableau 4).

Le pH du sol dans les sites de prospection varie de 7,2 à 8,5. Concernant la matière organique, 78 % des stations présentent de faibles teneurs variant de 0,5 à 1 %. Seules les stations Menzel Bouzelfa, Methline et Oued Zarga présentent des teneurs importantes en MO (4,2 - 4,7 %).

Les valeurs enregistrées au niveau du calcaire montrent que 64 % des sols sont très riches en calcaire actif (Ca > 19 %).

Les teneurs en phosphore assimilable révèlent une bonne richesse des sols en cet élément pour la totalité des sites (> 20 ppm). Seul le site El fahs présente une richesse moyenne en cet élément (15 ppm).

Les sites prospectés sont moyennement à riches en potassium assimilable, ceci ne justifie pas les apports en engrais potassique.

L'analyse factorielle par correspondance réalisée pour l'ensemble des données climatiques et édaphiques a permis d'expliquer 87,89 % de la variation totale à travers les axes 1 et 2.

L'axe 1 absorbe 59,58 % de la variation totale. Cet axe est défini de son coté positif par l'altitude, alors qu'il est représenté du côté négatif par la pluviométrie.

L'axe 2 absorbe 28,31 % de la variation totale (Figure 13). Cet axe est représenté essentiellement par les paramètres édaphiques (phosphore assimilable, potassium échangeable, matière organique, carbone, calcaire total, calcaire actif).

Figure 13: Projection plane des 2 principaux axes 1 et 2 discriminants avec les sites et données pédoclimatiques relatives. Lat: latitude; Long: longitude; Alt: altitude; SAT: saturation en eau; CE: conductivité électrique; CT: calcaire total; CA: calcaire actif; MO: matière organique; C: carbone; _P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium échangeable; P: cumul pluviométrique.

Les sites Téboursouk et Ain Chalou se distinguent par les altitudes les plus importantes respectivement 484 et 318 m. Alors que les stations Tunis et Ghzéla sont caractérisées par les plus faibles altitudes respectivement 10 et 27 m.

Les sites Smadah, Oued Zarga, et Goubellat forment un groupe qui se distingue essentiellement par la richesse de leurs sols en phosphore assimilable, et de façon moins importante par la teneur en matière organique.

Mateur Jalta Ghzéla Téboursouk Smadah Menzel Badrouna Methline El Khir Oued Inat A Chalou El Fahs Goubellat Medjez El Bab

Figure 14: Dendrogramme de similarité des sites selon les paramètres pédoclimatiques (méthode UPGMAdistance euclidienne).

La comparaison des paramètres édaphiques et climatiques en utilisant l'indice de similarité selon la méthode UPGMA à une distance euclidienne de 300 fait apparaître 5 groupes distincts (Figure 14):

- groupe 1: ce groupe ressort le site Mateur Jalta en solitaire. Cette station se distingue par une abondante pluviométrie (1560 mm), et des sols à faible saturation en eau (42 %) avec des teneurs importantes en carbone;

- groupe 2: il engendre la station Ghzéla qui se distingue par une faible altitude (27 m), et des sols pauvres en matière organique;

- groupe 3: il est représenté par 2 sites Téboursouk et Smadah, à topographie montagneuse, altitude moyenne de 401 m, terres riches en calcaire actif (24 %), saturation élevée (60 %), et pluviométrie moyenne de 468 mm;

- groupe 4: Les stations Tunis, Oued Zarga, Menzel Bouzelfa, Methline, Ben Arous et Badrouna forment ce groupe et se caractérisent par les sols les plus riches en matière organique ( 2,87 %); et

- groupe 5: les stations Ain Chalou, El Fahs, Goubellat et Medjez El Bab spécifiques à ce groupe se distinguent par une faible pluviométrie de 334 mm (Tableau 8).

Tableau 8: Caractéristiques pédoclimatiques des groupes spécifiques aux sites à une distance euclidienne de 300.

Groupes	Alt	pH	SAT	CE	CT	CA	MO	C	P2O5	K2O	P
			%	mS.cm^-1	%	%	%	%	ppm	ppm	(mm)
1	270	7,9	45	0,9	33	20	2,3	1,4	66	450	1560,1
2	27	8,2	52	1,5	56	23	0,7	0,4	25	300	751,3
3	401	7,7	60	0,75	54	24	0,95	0,55	130	620	468,0
4	109	7,8	48,3	0,85	36,5	14,8	2,87	1,65	91,3	470	534,5
5	172	8,1	52	1,05	49,3	21	0,9	0,53	58,5	308,3	334,2

Alt: altitude; SAT: saturation en eau; CE: conductivité électrique; CT: calcaire total; CA: calcaire actif; MO: matière organique; C: carbone; _P2O5: phosphore assimilable; K2O: potassium échangeable; P: cumul pluviométrique.

1. 2. Caractérisation agronomique des sullas

La croissance et la production du sulla cultivé varient significativement d'un site à un autre. Au stade floraison, la meilleure croissance en hauteur a été de 137,4 cm, enregistrée dans le site Ben Arous. Alors que, les plus faibles couverts végétaux ont été de 11,2 cm de haut à Goubellat.

Concernant les paramètres de production du sulla, les meilleurs rendements en fourrage sec ont été enregistrés à Tunis, Ain Chalou, Badrouna et Methline respectivement de 10,73; 10,27; 10,01; et 9,91 t/ha. Dans ces sites, la culture atteint et dépasse même le potentiel productif moyen de la variété Bikra 21 de première année estimé à 6,5 t/ha. Bien que les rendements en biomasse sèche dans ces sites soient comparables, la qualité du fourrage sous forme de protéines brutes a été de 18 ,41% à Tunis, mais très faible à Badrouna (7,85 %) (Tableau 9).

De point de vue production grainière, les stations Oued Zarga et Téboursouk se distinguent par les meilleurs rendements respectivement 2114 et 2032 kg/ha. Dans les stations Menzel Bouzelfa, ces rendements diminuent pour atteindre 620 kg/ha; alors qu'à Goubellat les rendements grainiers sont nuls.

Tableau 9: Variables quantitatives et qualitatives relatives à la culture du sulla dans les stations prospectées.

Paramètres Sites	NOD (nodules /plante)		PSN (mg/ plante)		PMN (mg/ nodule)		H (cm)		BSA (t/ha)		PB (% MS)		R (kg/ha)		SUL ADV		JSF
Paramètres Sites	NOD (nodules /plante)		PSN (mg/ plante)		PMN (mg/ nodule)		H (cm)		BSA (t/ha)		PB (% MS)		R (kg/ha)		(plant/m2)		JSF
Medjez El
Bab	28	f	25,38	h	0,85	ef	64,5	def	4,96	d	9,49	de	1146	f	75	102	177
Smadah	64	a	68,1	bc	1,1	d	71,1	cde	6,69	bc	17,13	a	1410	e	62	57	173
Ghzéla	48	c	76,62	b	1,62	c	75,8	cd	5,63	bcd	12,92	c	1662	cd	103	67	180
Téboursouk	48	c	59,25	cd	1,24	d	61,1	ef	6,26	bcd	17,4	a	2032	ab	49	27	200
Tunis	53	bc	94,43	a	1,76	bc	110, 5	b	10,73	a	18,41	a	1826	bc	121	35	168
Oued zarga	18	g	40,93	g	2,32	a	82,5	c	6,81	b	16,79	ab	2114	a	58	58	177
A Chalou	68	a	72,18	b	1,08	de	112	b	10,01	a	11,46	cd	1505	de	79	53	193
El Fahs	32	ef	48,22	fg	1,59	c	71,7	cde	6,13	bcd	13,97	bc	1593	de	72	74	167
Ben Arous	36	de	52,12	de	1,54	c	137,4	a	6,93	b	12,94	c	1521	de	44	23	175
Mateur Jalta	54	b	86,83	a	1,62	c	73,5	cd	5,29	cd	12,45	c	1059	f	94	85	168
Menzel
Bouzelfa	18	g	15,34	i	0,84	f	57,4	f	2,44	e	13,6	c	620	g	31	34	165
Methline	29	f	53,9	de	1,91	b	64,6	def	9,91	a	10,46	de	1530	de	98	32	169
Badrouna	38	d	49,47	efg	1,29	d	121,5	b	10,27	a	7,85	ef	1685	c	112	54	178
Goubellat	0	h	0	j	0	g	11,2	g	0,21	f	5,86	f	0	h	54	112	160
Moyenne générale	38		53,48		1,34		79,72		6,59		12,82		1407		75,14	58,1	175
LSD 5 %	6		9,169		0,237		12,06		1,41		1,423		250,84

SUL: densité de sulla; ADV: densité des adventices; JSF: nombre de jours entre le semis et la floraison; H: hauteur de la végétation; BSA: biomasse sèche aérienne; PB: teneur en protéines brutes; R: Rendement en graines; NOD: nombre de nodules; PSN: poids sec nodulaire; PMN: poids moyen d'un nodule.

L'analyse des paramètres de nodulation révèle un nombre particulièrement élevé des nodules dans les racines de sulla de Ain Chalou et Smadah respectivement 68 et 64 nodules par plant. Contrairement à ces sites, le sulla de Menzel Bouzelfa est nettement moins nodulé (18 nodules/plante). Alors qu'à Goubellat, aucune formation nodulaire n'a été observée, ce qui témoigne d'une absence de symbiose sulla/rhizobium dans cette région.

La nodulation dans ces stations varie en nombre, mais aussi en poids. Le poids moyen de nodules par plante le plus faible est enregistré à Menzel Bouzelfa (15,34 mg/plante). Cette masse est 5,6 à 6,1 fois plus élevée respectivement à Mateur Jalta (86,83 mg/plante) et Tunis (94,43 mg/plante). La forme, la taille, et la couleur des nodules sont aussi variables selon les sites. Oued Zarga se caractérise par des nodules particulièrement gros et rassemblés en amas (Figure 15). En effet, le poids moyen d'un nodule est significativement plus important dans ce site (2,32 mg/nodule).

Paradoxalement, les nodules de Menzel Bouzelfa sont particulièrement petits (0,84 mg/nodule) et de couleur verdâtre signe d'inefficience symbiotique.

Figure 15: Morphologie de nodules rhizobiales sur racines de sulla dans le site Oued Zarga.

1. 3. Etude de la variabilité des sullas

L'analyse en composantes principales relative aux variables quantitatives et qualitatives mesurées dans les parcelles à sulla révèle que les 2 premières composantes regroupent 67,5 % de la variation totale (53,53 et 13,97 % respectivement pour la première et la deuxième composante principale):

- l'axe 1 première composante principale est corrélé positivement aux paramètres rendement en graines, biomasse sèche aérienne, hauteur de végétation, poids sec nodulaire, poids moyen d'un nodule et nombre de nodules/plante; et

- l'axe 2 est représenté positivement par les densités de sulla et adventices. Du côté négatif, cet axe résume une tendance pour les valeurs élevées de la teneur en protéines brutes ainsi que le nombre de jours entre le semis et la floraison.

Le côté positif de l'axe 1 absorbe 71 % des sites traduisant une bonne nodulation et une importante production en fourrage et en graines du sulla dans ces stations. Alors que le côté négatif de cet axe est représenté par les sites à faible productivité de sulla et à densité d'adventices élevée (Goubellat, Medjez El Bab) (Figure 16).

Figure 16: Projections planes des deux principaux axes discriminants avec les 14 sites prospectés (A) et les paramètres mesurés (B).

A une distance euclidienne de 60, le dendrogramme de similarité a mis en évidence cinq groupes régionaux de culture de sulla (Figure 17).

Figure 17: Dendrogramme de similarité des sullas cultivés dans les stations prospectées (méthode UPGMA selon la distance euclidienne).

- groupe 1: Ce groupe englobe une seule culture de sulla (Goubellat) caractérisée par une croissance en hauteur au stade floraison limitée à 11 cm et une absence de nodulation. La culture dans ce site se distingue aussi par les plus faibles rendement en biomasse sèche aérienne (0,21 t /ha); teneur en protéines brutes (5,86 %); ainsi qu'une absence de production de graines (0 kg/ha).

- groupe 2: dans ce groupe une seule station est représentée (Menzel Bouzelfa) qui se distingue par la plus faible densité de peuplement en sulla (31 plant/m²) et une faible croissance en hauteur des plants (57,4 cm). Au niveau racinaire les plants de sulla présentent une nodulation limitée en nombre (18,4 nodules/plant) et en poids (15,34 mg/plant). Concernant la productivité de la culture, ce groupe présente de faibles rendements de biomasse sèche (2,4 t/ha) et graines (621 kg/ha).

- groupe 3: il est représenté par la culture de sulla dans les sites de Medjez El Bab, El Fahs, Oued Zarga, Methline, Smadah et Téboursouk. Ce groupe se caractérise par des densités de peuplement de sulla relativement faibles (69 plants/m²) et par les teneurs en protéines brutes ainsi que les rendements en graines les plus élevés respectivement 14,2 % et 1630 kg/ha.

- groupe 4: ce groupe englobe les sullas des stations de Ghzéla, Tunis, Ain Chalou, Mateur Jalta et Badrouna. Il se distingue par une densité élevée de sulla (102 plantes/m²), une importante nodulation en nombre (52 nodules/plant) et en poids (76 mg/plant); ainsi que des rendements élevés en biomasse sèche aérienne (8,38 t/ha).

- groupe 5: seulement une culture de sulla du site de Ben Arous constitue ce groupe qui se caractérise par la plus faible densité d'adventices (23 plants/m²) et la meilleure croissance en hauteur du sulla (137,4 cm) (Tableau 10).

Tableau 10: Répartition en groupes des cultures de sulla selon la moyenne des paramètres mesurés.

1. 4. Discussions

L'analyse des corrélations montre que la croissance et la productivité du sulla dépendent essentiellement de l'activité symbiotique dans les sites prospectés. En effet, la croissance en hauteur, la teneur en protéines brutes ainsi que les productions de fourrage sec et de graines sont significativement corrélés aux paramètres de nodulations mesurés (NOD, PSN, PMN) (Tableau 11). Ce résultat met en évidence l'effet bénéfique de la nodulation dans les stations du groupe 4 sur les rendements en fourrages et en graines respectivement 8,38 t /ha et 1630 kg/ha et explique la faible productivité fourragère dans les sites Menzel Bouzelfa et Goubellat où la nodulation est respectivement faible et absente.

Cette variation de la nodulation dans ces sites est en relation avec la fréquence d'introduction du sulla dans ces sites. En effet, l'historique des parcelles montre que les stations n'ayant pas introduits cette fabacée dans le passé comme Menzel Bouzelfa et Goubellat ont présenté une déficience de nodulation dans la culture de sulla. Alors que tous les autres sites ayant déjà introduit cette espèce dans la rotation culturale ont présenté une bonne nodulation en poids et nombre. Ce résultat peut être expliqué par la présence ainsi que l'abondance des souches bactériennes spécifiques. Dans ce sens, Peoples et al. (1995) et Sturz et al. (1997) ont montré que la probabilité d'existence du rhizobium spécifique à une culture de légumineuse augmente avec la fréquence de son introduction dans un système de culture.

Le poids moyen d'un nodule est positivement corrélé au rendement en graines (r = 0,80). Cet effet est particulièrement visible au site Oued Zarga où on a enregistré le meilleur rendement en graines (2114 kg/ha). Dans ce site, les nodules particulièrement gros (2,32 mg/nodule) ont une activité symbiotique qui dure plus longtemps que celle des nodules de petites tailles assurant par conséquent les besoins en azote pour la culture pendant la période de remplissage des graines (L'taief et al., 2009). Paradoxalement, les nodules de petite taille perdent rapidement leur pouvoir fixateur affectant négativement les rendements grainiers (Menzel Bouzelfa).

La corrélation significative entre le poids sec nodulaire et la densité de sulla par m2 peut être expliquée par l'accroissement dans ces sites de la densité racinaire responsable de la libération des flavonoïdes. La concentration de ces derniers dans le sol conduit à la stimulation des nodules en nombre et en masse (Hopkins 2003; Macheix et al., 2005).

Les rendements du sulla sont aussi influencés par les densités des plants et adventices. La biomasse sèche aérienne est corrélée positivement à la densité de sulla (r = 0,64), alors que la présence d'adventices est corrélée négativement avec les rendements en fourrage (r = -0,54) et graines (r = -0,55). En effet, la parcelle désherbée deux fois de Ben Arous s'est caractérisée par les densités d'adventices les plus faibles, engendrant ainsi un effet positif sur la croissance et la production du sulla. Ce désherbage ne semble par ailleurs pas affecter la nodulation. Rennie et al. (1984) ont montré que l'application de 5 herbicides différents n'avait aucun effet ni sur la fixation symbiotique, ni sur la production des graines d'une culture d'haricot. Contrairement à Lindström (1985) qui a rapporté une altération de la morphologie des racines ainsi qu'une réduction du nombre de nodules et de l'activité de la nitrogénase des plants suite à une application d'herbicide sur Trifolium pratense L..

Parmi les caractères environnementaux, l'altitude est significativement corrélée (r = 0,64) à la durée du cycle de la plante depuis le semis jusqu'à la floraison donc la précocité. Cet effet a été observé dans les stations Smadah et Téboursouk situées en zone montagneuse où l'altitude serait responsable de l'allongement du cycle du sulla et influencerait ainsi positivement les rendements de la culture en graines. Dans ce sens, Sarno et al. (1978) ont constaté qu'en altitude, le sulla tend à fleurir tardivement et à produire plus de fourrage. Parmi les paramètres édaphiques, le pH basique a un effet positif (r = 0,55) sur la densité du couvert végétal en sulla, ce qui confirme l'adaptation de cette culture aux sols alcalins (Moore et al., 2006). Par contre, une corrélation négative a été observée avec les teneurs en matière organique (r = -0,69) et phosphorée (r = -0,8) du sol confirmant les observations de réalisées par Bordeleau et Prévost (1994).

A propos de la pluviométrie totale annuelle, son effet n'a pas été corrélé significativement aux paramètres de rendements. Les fortes pluviosités ne sont pas toujours à l'origine des bons rendements. Avec une hauteur de pluie de 1560 mm, Mateur Jalta n'a pas eu les meilleures biomasses fourragères et grainières respectivement 5,29 t/ha et 1059 kg/ha. Alors qu'Ain Chalou, des rendements meilleurs ont été obtenus de l'ordre de 10 t/ha et 1146 kg/ha de fourrage sec et graines, et ce avec seulement 243 mm de pluie par an. Ces observations confirment celles de Ben jeddi (2005) et de Martiniello (2000) relatives aux potentialités de production du sulla en condition de pluviométrie limitante.

1. 5. Conclusion

Une variabilité significative de croissance et production du sulla a été démontrée entre les divers sites de production de semences. Cette variabilité est liée aux:

En conséquence, une collection de nodosités racinaires a été réalisée en vue d'une caractérisation des bactéries nodulant le sulla.

2. ETUDE DE LA DIVERSITE DES MICROSYMBIOTES DU SULLA

L'isolement des bactéries à partir des nodules du sulla collectés des différents sites prospectés a permis de constituer une collection de 50 isolats. Dans ce chapitre, on se propose d'étudier la diversité phénotypique et génétique de ces isolats.

2. 1. Caractérisation phénotypique des rhizobiums

La caractérisation phénotypique des différentes souches nodulant le sulla permet d'une part de démontrer les variations phénotypiques entre les souches rhizobiales et d'autre part sélectionner celles qui présentent une bonne capacité de fixation de l'azote atmosphérique en condition de culture stressante, comme le pH, la salinité, le calcaire et la sècheresse.

2. 1. 1. Evaluation de l'infectivité des isolats

Le contrôle de la capacité infective de la collection rhizobiale exige le passage par un test de nodulation. Parmi les 50 isolats retenus, 45 ont été capables d'induire des nodules sur les racines du sulla. Alors que les plants inoculés par les cinq isolats restants se sont comportés comme les témoins non inoculés.

2. 1. 2. Critères morphologiques

2. 1. 2. 1. Description des isolats

La coloration Gram a révélé la présence d'une seule souche Gram⁺ (Hc12) parmi l'ensemble des isolats testés. Le reste des isolats sont des gram^- en forme de bâtonnets de l'ordre de à 0,5 à 1 um de long (Figure 18).

Figure 18: Observation sous microscope (x 10³) des souches rhizobiales Gram^-.

Ces isolats ont formé sur le milieu YEM/RC solide, après 5 jours d'incubation à 28°C des colonies circulaires à ovoïdes de diamètre variable et d'aspect différents (Figure 19). La vitesse de prolifération est variable et les premières colonies apparaissent au bout de 2 jours. Un mucus de consistance coulante et d'aspect translucide a été observé chez les souches à croissance rapide; alors que celles à croissance plus lente avaient développé une consistance épaisse et visqueuse avec une teinte blanchâtre.

Figure 19: Aspect des colonies bactériennes sur milieu de culture YEMA/RC. A: diamètre 1-2mm, B: diamètre 3-4 mm, C: diamètre 5-6 mm.

2. 1. 2. 2. Tolérance à la salinité

La limite de tolérance sur milieu TY liquide des isolats testés a été limitée à 700 mM,

alors que sur milieu gélosé, les seuils de tolérance à la salinité ont été de 850 mM (Figure 20). Ce résultat suggère une meilleure fiabilité des tests en milieu liquide.

Figure 20: Croissance des souches rhizobiales à des teneurs croissantes en NaCl sur milieu gélosé.

L'évaluation de la tolérance des souches à la salinité (150 mM) sur milieu liquide a montré que la totalité des isolats bactériens présente une croissance similaire au témoin (0 mM). A 200 mM de NaCl, la majorité des isolats (84 %) arrivent à se développer. A partir de 400 Mm de sel dans le milieu, 44 % de souches arrive à croitre. A une concentration élevée de la salinité dans le milieu de culture (700 mM), seulement 16 souches arrivent à se développer (Tableau14). Tandis qu'aucune souche n'arrive à supporter la concentration de 800 mM de NaCl (Figure 21).

Figure 21: Cinétique de tolérance des souches rhizobiales de sulla selon la salinité (NaCl) du milieu de culture liquide.

Avec des souches R. sullae, El Boutari (2009) a rapporté des niveaux de tolérance au sel entre 170 à 850 mM NaCl. Cependant, Squartini et al. (2002) ont trouvé des spectres de tolérance plus limités, compris entre 290 à 548 mM de NaCl. Des niveaux de tolérance à la salinité beaucoup plus élevés (1190-1700 mM NaCl) ont été notés avec souches rhizobiales nodulant le Lupin (Zahran et al., 1994; Raza et al., 2001).

2. 1. 2. 3. Tolérance au pH basique

Toutes les souches arrivent à croître normalement dans des milieux à pH variant entre 7 et 8. A partir d'un pH de 8,5, deux souches parmi les 45 testées cessent de se développer. Tandis que 82,2 % des souches ont été capables de croître normalement jusqu'à un de pH 9,5. Ce n'est qu'à partir d'un pH de 10 que le pourcentage des souches tolérantes baisse à 55,6%.

Le pH 10,5 représente ainsi une limite de tolérance des rhizobiums collectés (Tableau 12). En effet aucune souche n'a été capable de croitre à un pH de 11 (Figure 22).

Figure 22: Cinétique de tolérance des souches rhizobiales de sulla selon la variation du pH du milieu de culture liquide.

Sur 62 souches isolées de l'espèce Hedysarum coronarium L., El Boutari (2009) a rapporté une tolérance au pH des rhizobiums spécifiques variante entre 9 et 9,5. Ce résultat concorde avec les seuils de tolérance aux pH trouvés. Cette tolérance se trouve aléatoire d'une espèce à une autre (Jordan, 1984). En effet, Glenn et Dilworth (1994) ont rapporté que le groupe des souches bactériennes à croissance rapide a tendance à tolérer des milieux basiques allant jusqu'à un pH de10. Dans ce sens, Rao et al. (1994) ont isolé des rhizobiums de pois pouvant tolérer des pH supérieurs à 11,5. Quant à Diatloff (1970), il a rapporté que la le Bradyrhizobium japonicum présente une croissance limitée à pH 8,5.

2. 1. 2. 4. Tolérance au stress hydrique

L'ensemble des souches de la collection a supporté le stress hydrique jusqu'à -0,5 MPa. Ce niveau de stress a été la limite de tolérance pour 31 % des souches, alors que la majorité des isolats de la collection (60 %) ont présenté une tolérance jusqu'à -0,9 MPa. Uniquement quatre souches ont pu supporter le niveau -0,95 Mpa de stress hydrique (Figure 23, Tableau 12). Ce niveau a largement été dépassé par des souches isolées de nodosités de sulla par El Boutari (2009), qui a trouvé une marge de tolérance au stress hydrique entre 0 et - 1,5 MPa.

Figure 23: Cinétique de tolérance des souches rhizobiales de sulla selon la variation de stress osmotique du milieu de culture liquide.

2. 1. 2. 5. Tolérance au stress calcaire

L'analyse de la tolérance des souches de la collection au stress calcaire engendré par le CaCO3 a révélé une croissance normale de l'ensemble des 45 souches à des niveaux de calcaire variables de 0 à 2 M (Figure 24). En milieu liquide, l'addition progressive du CaCO3 provoque rapidement une saturation empêchant la lecture par spectrophotométrie.

La variation du calcaire jusqu'à 2 M n'a pas engendré d'effet inhibiteur sur la croissance des souches à l'état libre. Cette faculté de croissance à de fortes teneurs en calcium pourrait être en relation avec la nature des protéines Ca²⁺ dépendante et constituant la membrane bactérienne (Gobat, 1998; Dardanelli et al., 2003).

Figure 24: Croissance des souches sur milieu YEM/RC solide enrichi en calcaire.

Tableau 12: Origine des souches nodulant le sulla avec leurs limites de tolérance aux stress abiotiques.

Sites	Souches	pH	NaCl	PEG
			(mM)	(Mpa)
	HC1	9,5	150	-0,50
Medjez El	H	10,0	200	-0,90
Bab	HC3	9,0	200	-0,90
	HC4	10,0	200	-0,90
	HC5	8,5	400	-0,95
	HC6	9,0	200	-0,90
Smadah	HC7	8,5	400	-0,95
	HC8	9,0	200	-0,90
	HC9	9,0	200	-0,90
	HC10	10,5	700	-0,90
	HC11	10,5	700	-0,90
Ghzéla
	HC12	10,5	700	-0,90
	HC13	10,5	700	-0,90
	HC14	10,0	200	-0,90
	HC15	10,0	200	-0,90
Oued Zarga
	HC16	10,0	200	-0,90
	HC17	10,5	700	-0,90
	HC18	10,0	200	-0,90
	HC19	10,0	200	-0,90
	H0	10,0	200	-0,90
Téboursouk	H1	10,0	200	-0,90
	H2	10,0	200	-0,90
	H3	10,0	200	-0,90
	H4	10,0	200	-0,90
	H5	10,5	150	-0,50
	H6	10,5	200	-0,90
	H7	10,5	150	-0,50
	H8	10,5	150	-0,50
Tunis	H9	10,5	200	-0,90
	HC30	10,5	150	-0,50
	HC31	10,5	150	-0,50
	HC32	10,5	150	-0,50
	HC33	10,5	400	-0,95
Ain Chalou	HC34	10,5	700	-0,90
	HC35	9,0	400	-0,95
	HC36	10,5	700	-0,50
	HC37	10,5	700	-0,50
	HC38	10,5	700	-0,50
	HC39	10,5	700	-0,50
El Fahs	HC40	10,5	700	-0,90
	HC41	10,5	700	-0,50
	HC42	10,5	700	-0,50
	HC43	10,5	700	-0,50
	HC44	10,5	700	-0,90
	HC45	10,5	700	-0,90

2. 1. 3. Analyse des critères phénotypiques par UPGMA

La caractérisation phénotypique des 45 souches bactériennes isolées des racines de sulla a été basée sur 27 caractères. Les résultats ont été traités par UPGMA, le dendrogramme qui en dérive est représenté par la figure 25. Les caractères les plus discriminants de cette analyse ont été groupés et représentés dans le tableau 13.

A 65 % de niveau de similitude, les souches se trouvent réparties en trois groupes:

- le groupe1 est formé par des souches isolées essentiellement de deux stations (Tunis et El Fahs); seule la souche HC1 est originaire de la station Medjez El Bab. Ces souches ont des critères morphologiques communs relatifs aux colonies particulièrement au niveau de la présence de relief, de la consistance épaisse et de l'absence du noyau. Dix souches parmi les 13 de ce groupe forment des colonies à diamètre variable de 3 à 4 mm après 5 jours d'incubation. Concernant les critères physiologiques, les souches de ce groupe sont caractérisées par un niveau de tolérance au stress hydrique de -0,5 MPa, un pH majoritairement élevé (10,5) et un niveau de tolérance au stress salin (NaCl) variable de 150 à 700 mM;

- le groupe 2 englobant 55 % des souches, est le plus hétérogène de la collection avec des souches appartenant à 6 stations différentes; et

- le groupe 3 renferme les souches ayant induit une nodulation non reproductible. Elles sont originaires de 3 stations différentes. Ces souches forment des colonies transparentes, majoritairement (6/7 colonies) non visqueuses, sans relief et absorbent le rouge Congo. Ces isolats sont particulièrement tolérants au stress salin (700 mM) et aux pH élevés (10,5).

Figure 25: Dendrogramme de similarité entre les souches de la collection pour l'ensemble des caractères phénotypiques (méthode UPGMA selon l'indice de Jaccard).

Tableau 13: Caractéristiques phénotypiques des groupes de souches nodulant le sulla selon l'analyse UPGMA.

	Groupe 1	Groupe 2	Groupe 3
Nombre de souches	13	25	7
Infectivité:
Répétitive	10	24	0
Non répétitive	3	1	7
Diamètre des colonies:
1 à 2 mm	2	0	4
3 à 4 mm	10	20	2
5 à 6 mm	1	5	1
Absorption Rouge Congo:
absorbe	1	0	6
n'absorbe pas	12	25	1
Forme de la colonie:
circulaire	11	24	4
ovoïde	2	1	3
Présence de noyau:
avec noyau	0	1	3
sans noyau	13	24	4
Transparence:
transparente	8	4	7
opaque	5	21	0
Consistance:
Coulante	0	2	2
épaisse	13	23	5
Relief:
sans relief	0	0	6
avec relief	13	25	1
Viscosité:
non visqueuse	5	15	1
visqueuse pH:	8	10	6
8,5	0	2	0
9	0	5	0
9,5	1	0	0
10	0	12	0
10,5	12	6	7
NaCl:
150 mM	7	0	0
200 mM	0	18	0
400 mM	0	4	0
700 mM	6	3	7
PEG 6000:
-0,5	13	0	1
-0,9	0	21	6
-0,95	0	4	0

2. 2. Caractérisation moléculaire des souches nodulant le sulla

L'étude de la diversité génétique entre les 45 isolats issus de nodosités de sulla porte graines originaires de huit stations a été analysée par différentes techniques.

2. 2. 1. Analyse de la diversité intra spécifique par Rep-PCR

La Rep-PCR est utilisée pour l'étude de la variabilité intra spécifique des rhizobiums. Par cette méthode, les variations génétiques sont détectées au niveau chromosomique. Utilisée avec succès pour le typage d'isolats de grandes collections, cette technique s'est révélée d'un bon pouvoir de résolution (Judd et al., 1993; Leung et al., 1994; Louws et al., 1996; Versalovic et al., 1994).

La séparation électrophorétique des produits de l'amplification a montré une abondance de séquences dont le nombre varie de 9 à 20 bandes par profil (Figure 26).

HC28 HC29 HC30 HC31 HC32 HC33 HC35 HC36 HC45 M M HC38 HC39 HC40 HC41 HC42 HC44 HC14 HC15 HC16 HC10

Figure 26: Electrophorèse des amplifias obtenus par Rep-PCR de quelques souches nodulant le sulla. M: marqueur moléculaire 100pb.

La comparaison des différents profils a permis d'établir un dendrogramme illustrant les relations phylogénétiques entre les différentes souches (Figure 27). Ce dernier a révélé l'existence d'une importante diversité intra spécifique entre les souches de la collection.

Figure 27: Dendrogramme (UPGMA) illustrant les relations génétiques estimées par l'indice de Dice résultant de l'analyse par Rep-PCR des souches nodulant le sulla.

Un niveau de similitude de 100 % a été noté entre deux souches originaires de Smadah et 3 autres de Medjez El Bab; réduisant ainsi le nombre de génotypes de la collection à 43. Ces isolats bien que représentés par des génotypes similaires ont des caractéristiques phénotypiques différentes (Tableau12), ce qui exclue l'hypothèse de la présence de clones parmi les isolats.

En se situant à un niveau de similarité de 60 %, on obtient 7 groupes et 15 lignages indépendants (Figure 27). Ces groupes englobent les isolats à nodulation efficiente alors que les endophytes non spécifiques à la culture sont représentés par des lignages indépendants. L'analyse de ces groupements révèle une corrélation entre la diversité intra spécifique, la diversité phénotypique et les origines géographiques des souches (Tableau14).

De même, un regroupement de la majorité des souches originaires de la station Téboursouk dans les mêmes groupes a été observé; aussi bien pour les caractères phénotypiques que génotypiques. Ce regroupement concerne aussi les souches H, HC3 et HC4 de la station Medjez El Bab; ainsi que 6 souches parmi 9 de la collection de Tunis.

Tableau 14: Origines géographiques et limites de tolérance au stress osmotique des souches dans chacun des groupes délimités par l'analyse Rep-PCR à 60 % de similitude.

2. 2. 2. Analyse de la diversité intra-spécifique par PCR-RFLP de l'ADNr 16S

L'analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction du gène de l'ADNr 16S amplifié par PCR a été utilisée dans un second temps.

Cette méthode, qui est l'une des plus utilisées pour l'identification des rhizobiums (Young et al., 2001) permet de regrouper les souches bactériennes à un niveau de résolution taxonomique qui s'étend de l'espèce au genre (Heyndrickx et al., 1996).

Le gène ribosomique de l'ADNr 16S des 45 souches de sulla a été amplifié. L'amplification a donné lieu à une bande unique révélée par électrophorèse chez l'ensemble des souches. La taille de la bande a été évaluée visuellement par comparaison au marqueur et correspond approximativement à 1500 pb (Figure 28).

Figure 28: Amplification de l'ADNr 16S de quelques souches nodulant le sulla.

Le gène de l'ADNr 16S amplifié par PCR des 45 souches a été sujet à une digestion par 2 enzymes de restriction (MspI, NdeII) (Figure 29). Les profils obtenus par chaque enzyme et pour chaque souche ont été désignés par des lettres alphabétiques (Tableau 15). Les mêmes profils ont été comparés par paire afin d'établir le ribotype correspondant à chaque souche.

Les profils obtenus montrent une variation des bandes en nombre de 2 à 8 et en tailles (de 70 à 1300 pb) selon la souche et l'enzyme. Un profil majoritaire (AA) représente 32 parmi les 45 souches de la collection. Le reste des isolats a donné des ribotypes différents les uns des autres. Ce travail a été complété par un séquençage de l'ADNr 16S des souches ayant des profils différents ainsi que de 7 souches représentatives du profil majoritaire (AA).

HC8 HC11 HC12 HC13 HC17 HC29 HC34 HC36^M HC14 HC16 HC45 HC38 HC39 HC24 HC25 HC26 HC27 HC28^M HC30 HC31 HC32 HC33 HC36 HC45 HC38 HC39

Figure 29: Profils électrophorétiques de la restriction par RFLP de l'ADNr 16S obtenus pour quelques souches de la collection après digestion par les endo-nucléases MspI (A) et NdeII (B).

Tableau 15: Ribotypes des souches isolées du sulla et déterminés par PCR/RFLP du gène de l'ADNr 16S

2. 2. 3. Séquençage du gène 16S

Le séquençage du gène de l'ADNr 16S a révélé une similarité de plus de 99 % des souches (Tableau 16) représentatives du ribotype AA avec R. sullae souche IS 123^T (Squartini et al., 2002). Les autres ribotypes sont plutôt apparentés à des genres non Rhizobium.

Tableau 16: Séquençage du gène de l'ADNr 16S de quelques souches de la collection.

2. 3. Discussions

Une importante diversité phénotypique des isolats qui semble dépendante des origines géographiques des isolats a été trouvée (Tableau 12). Les souches les plus tolérantes aux pH élevés (10 - 10,5) ont toutes été isolées depuis les sites à pH de sols alcalins (8,2 - 8,5). De même, les souches les plus tolérantes au stress salin (700 mM) ont été isolées à partir des sites de Ghzéla et El Fahs qui se caractérisent par les conductivités électriques les plus élevées (1,4 - 1,5). L'existence de souches tolérantes à la salinité dans les sites halomorphes peut être une indication de leur adaptation au stress osmotique conséquente d'une augmentation de la concentration d'ions et de la variation de l'humidité du sol durant les périodes sèches (Mpepereki et al., 1997).

Cette diversité phénotypique est aussi corrélée à la diversité génétique intra spécifique révélée par la Rep-PCR qui semble elle aussi dépendante de la distribution géographique des isolats.

Ces résultats concordent bien avec ceux trouvés par Richardson (2002) qui a noté une corrélation entre les groupements génotypiques et l'origine géographique des isolats. Dans le même sens, Zghan et al. (1999) ont aussi noté, en utilisant la Rep-PCR, que les souches isolées à partir d'un même cultivar et d'une même région ont appartenu au même groupe génotypique. Contrairement à ces auteurs, il a été souvent rapporté que la distribution des rhizobiums est indépendante du site d'origine (Khbaya, 1998; Rejili, 2009; El Boutari, 2009). Dans notre situation, il est possible que les propriétés physico-chimiques des sols ainsi que l'exposition des rhizobiums à l'activité agricole dans les stations soient à l'origine de la diversité phénotypique et génotypique des souches de la collection (Palmer et Young 2000; Andrade et al., 2002; Laguerre et al., 2006). Dans ce sens, Giongo et al. (2008) ont rapporté l'existence d'un haut niveau de similarité génotypique entre des isolats nodulant le haricot collecté depuis des champs cultivés dans le sud du Brésil. Il est toute fois à noter que certaines souches tels que HC1 (Medjez El Bab), HC5 (Smadah), ou encore H3 (Téboursouk) présentent des caractéristiques phénotypiques et /ou génotypiques différentes de celles des autres isolats des mêmes stations. Cette distinction est probablement due à l'exposition de ces souches à différentes niches ayant des propriétés physico-chimiques variables.

L'analyse de la diversité génétique par PCR-RFLP de l'ADNr 16S associé au séquençage du gène 16 S confirme la haute spécificité symbiotique entre H. coronarium L. et R. sullae (Glatzle et al., 1986; Kishinevsky et al., 1996; 2003; Squartini et al., 2002). Concernant les autres souches, il est possible qu'un transfert horizontal de gènes de nodulation entre ces isolats soit à l'origine de leur capacité infective (Moulin et al., 2001). Il a été rapporté que les nodules de certaines fabacées peuvent être colonisés par des bactéries non fixatrices de l'azote. Ces microorganismes appelés aussi endophytes ont même été décris dans le xylème des racines de plants de luzerne (Gagné et al., 1987). Recuenco et al. (2000) ont découvert que Pantoea agglomerans et Pseudomonas fluorescens sont les endophytes les plus communs des cultivars de petit pois. Tokala et al. (2002) ont signalé la présence de Streptomyces lydicus dans les nodules de pois et Bai et al. (2003) ont montré que Bacillus subtilis et B. thuringiensis peuvent naturellement cohabiter les nodules du haricot avec le symbiote Bradyrhizobium japonicum, et améliorer ainsi la productivité de la culture.

Plus récemment, Benhizia et al. (2004) et Mureso et al. (2008) ont signalé la présence de bactéries non fixatrices de l'azote (Enterobacter cloacae, Enterobacter kobei, Escherichia vulneris, Pantoea agglomerans et Leclercia adecarboxylata) dans les nodules racinaires du genre Hedysarum.

Ces souches qui ont temporairement nodulé le sulla peuvent contenir des gènes de nodulations (Nif, Nod), d'où l'intérêt de vérifier dans un travail ultérieur l'existence de ces gènes.

2. 4. Conclusion

L'étude de la diversité des microsymbiotes isolées des nodosités racinaires du sulla a révélé une importante diversité phénotypique en relation avec l'origine géographique des isolats. De point de vue génétique, la caractérisation montre une importante diversité intra spécifique entre les isolats, une dominance de l'espèce R. Sullae (71%), et une présence d'endophytes non spécifiques au sulla.

Des souches hautement, moyennement tolérantes et sensibles au stress abiotique (salinité, sécheresse et pH alcalin) sont identifiées. Ces souches constituent un matériel biologique devrant être testé en association avec le sulla du nord afin de sélectionner parmi ces inoculums ceux qui présentent les meilleures performances symbiotiques.

3. EVALUATION DE L'EFFICIENCE SYMBIOTIQUE DES BACTERIES NODULANT LE SULLA

L'évaluation de l'efficience symbiotique entre le sulla et 30 souches de la collection dont 28 appartenant à l'espèce R. sullae a été réalisée en condition de culture stérile.

L'analyse des paramètres de croissance, nodulation, et rendement des plantes inoculées avec ces différentes souches a été effectuée au stade 6^ème feuille pluri foliée, en comparaison avec deux témoins: TN (témoin fertilisé avec 60 unités d'ammonitrate 33,5 %) et T0 (Témoin non fertilisé).

3. 1. Evaluation des paramètres de croissance

L'analyse des paramètres de croissance des plantes montre une large variabilité de la croissance en hauteur et de la surface foliaire selon les souches (Tableau 17).

Contrairement aux plantes témoins non fertilisées (T0) marquées par une petite taille et peu de feuillage, celles inoculées par R. sullae souche H8 (INAT) se distinguent par la croissance en hauteur et la surface foliaire les plus élevées. En effet, cette souche offre des améliorations par rapport au témoin T0 de 325 et 894 % respectivement pour la hauteur et la surface foliaire. Néanmoins, en présence de HC1, cette amélioration n'est que de 203 et 563,7 % respectivement pour la hauteur et la surface foliaire.

Des améliorations de la croissance en hauteur ainsi que de la surface foliaire ont été de même enregistrées en présence d'endophytes non spécifiques au sulla HC10 et HC17. Ces souches bien que nettement moins efficientes que leurs analogues R. Sullae ont amélioré la croissance en hauteur par rapport aux témoins non fertilisés de 191 et 166 % respectivement avec HC10 et HC17. Ces dernières ont amélioré la surface foliaire du sulla respectivement de 295 et 235 %.

Tableau 17: Effets de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches de la collection sur la croissance en hauteur et la surface foliaire.

Souches	Croissance en hauteur (cm)	Surface foliaire (cm²/plant)
H8	19,05 a	69,75 a
HC14	18,57 ab	54,22 efghijk
H4	17,90 abcd	66,21 abc
HC35	17,56 bcde	63,71 abcde
H3	17,25 bcdef	61,18 abcdef
H0	17,22 bcdef	60,70 abcdefg
H7	16,95 cdefg	55,90 defgij
H1	16,82 cdefgh	64,70 abcde
H5	16,77 cdefgh	57,02 cdefgi
H6	16,77 cdefgh	68,95 a
HC16	16,48 defghi	57,34 cdefg
HC6	16,20 efghij	68,52 ab
H2	16,00 fghij	66,52 abc
HC18	15,90 fghij	59,35 abcdefgh
HC5	15,70 fghij	60,04 abcdefgh
HC19	15,47 ghij	50,43 hijk
HC30	15,42 hij	68,51 ab
HC33	15,20 ijk	57,26 cdefghi
HC7	15,15 ijkl	56,78 cdefgi
HC8	14,97 jkl	55,13 efghij
HC4	14,92 jkl	49,74 hijk
HC9	13,92 klm	57,96 bcdefgh
H9	13,92 klm	50,67 fghijk
HC3	13,67 jkl	45,47 jk
HC32	13,40 mno	56,96 cdefgi
HC31	13,22 mno	46,89 ijk
H	12,35 nop	45,65 jk
HC1	11,90 opq	43,93 k
HC10	11,20 pqr	23,03 l
HC17	9,75 rs	18,40 l
T0	5,85 t	7,80 m
TN	18,40 abc	43,65 k
LSD 5 %	1,41	10,84

3. 2. Analyse de la nodulation du sulla

L'examen du système racinaire de l'ensemble des plantes après 12 semaines de culture (stade ramification) de sulla a montré une variabilité significative de distribution des nodules.

En effet, les nodosités de 6 mm de diamètre ou plus ont été majoritairement localisées au dessous du collet; alors que les nodosités de moindre taille ont été plus denses sur les racines latérales. De pareilles constatations ont été rapportées par El Hilali (2006) lors des essais d'inoculation du lupin par différentes souches rhizobiales.

L'analyse de l'infectivité des souches évaluée par le nombre (3 à 71 par plante) et la masse des nodules est significativement variable. Toutes les souches appartenant à l'espèce R. sullae ont engendré des nodules à aspect caractéristique des rhizobiums du sulla (forme allongée, bi à trilobée, de couleur vermeille et de taille variant de 2 à 9 mm) (Figure 30).

Figure 30: Formes et tailles des nodules issues de la symbiose entre quelques souches de la collection et le sulla.

Parmi ces souches, seul l'isolat HC33 se distingue par le nombre et le poids nodulaire le plus important, contrairement à HC1 (Tableau 18). Concernant les souches HC17 et HC10 non spécifiques au sulla, on a constaté que ces dernières engendrent des excroissances non reproductibles marquées par leurs faible nombre, importante taille (5 - 11 mm), et couleur blanche (Figure 31).

Figure 31: Système racinaire d'un plant de sulla avec un amas nodulaire inefficient.

Tableau 18: Effet de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches de la collection sur la nodulation (nombre de nodules et masse sèche nodulaire par plante).

3. 3. Evaluation des paramètres de rendement du sulla

3. 3. 1. Biomasse sèche aérienne

L'inoculation du sulla par les différentes souches rhizobiales a significativement amélioré la production de biomasse sèche aérienne par rapport au témoin absolu (Tableau 19). Cette amélioration dépend toute fois de la souche utilisée. En effet, le maximum de production a été enregistré en présence de la souche HC14 qui a produit 10,46 fois plus de matière sèche aérienne que le témoin non fertilisé (T0). A l'exception de HC10 et HC17, toutes les autres souches testées ont occasionné une amélioration au moins équivalente à celle du témoin azoté TN soit 7,29 fois plus que T0.

3. 3. 2. Teneur en protéines brutes

Comparativement au témoin non fertilisé (T0), l'ensemble des 28 souches R. sullae améliorent significativement la teneur en protéines brutes du sulla (Tableau 19). Parmi ces souches, les isolats HC14, HC16 et HC5 assurent la meilleure amélioration de la teneur en protéines brutes aériennes variante entre 3,54 et 2,46 points par rapport au témoin azoté. Paradoxalement, les isolats HC10 et HC17 non spécifiques à la culture produisent des teneurs équivalentes à celles du témoin T0.

Tableau 19: Effets de l'inoculation, du sulla cultivé en pot, par différentes souches de la collection sur la production de biomasse sèche et la teneur en protéines brutes aériennes.

3. 4. Discussions

L'inoculation du sulla par différentes souches de la collection a occasionné la formation de nodosités racinaires, dont le nombre et le poids sont positivement corrélés aux rendements en protéines brutes par plante (Annexe 6). Cette symbiose a assuré une amélioration des paramètres de croissance (Tableau18) et de rendement (Tableau 19) par rapport au témoin non inoculé (T0) avec l'ensemble des souches de la collection. Dix neuf souches sont particulièrement intéressantes à retenir puisqu'elles ont induit une meilleure fixation de protéines brutes par plante que le témoin fertilisé avec 60 unités d'azote chimique. Parmi ces souches HC14 et HC5 ont induit des améliorations par rapport témoin azoté (TN) respectivement de 103 et 85% (Figure 32).

Figure 32: Rendement des protéines brutes fixées par le sulla cultivé en pot et inoculé avec différentes souches rhizobiales.

La variation de l'efficience entre souches rhizobiales est expliquée par l'effet PGPB, en plus de leur capacité de fixation symbiotique de l'azote atmosphérique (Loper and Schroth 1986; Amellal, 1998; Antoun et al., 1998; Bezzate et al., 2000; Ferguson and Lessenger 2006; Solano et al., 2008). L'amélioration due à la PGPB est aussi notée en présence de souches non spécifiques au sulla HC10 et HC17. De pareilles améliorations ont été rapportées par Fauzia et al. (2006) sur un blé inoculé par une souche de Bacillus pumilus.

L'efficience des souches semble aussi variable selon leur origine géographique. En effet les souches originaires du site Medjez El Bab (HC1, H, HC3, HC4) sont particulièrement de faible efficience comparativement à HC14 et HC5 provenant respectivement des stations Oued Zargua et Smadah. Ce résultat corrobore avec les résultats de l'évaluation au champ de la productivité du sulla et confirme l'intérêt de sélectionner des souches rhizobiales à partir de plantes cultivées (Fettell et al., 1997; Young et al., 1998; Handley et al., 1999).

3. 5. Conclusion

Le test d'efficience des souches a permis l'identification de souches à haut pouvoir fixateur de l'azote. Parmi celles-ci, HC14 et HC5 produisent des biomasses sèche et protéique équivalentes à une culture de sulla fertilisée par respectivement 122 et 111 unités d'azote chimique.

L'efficience symbiotique complétée par l'analyse de la diversité phénotypique permet de sélectionner les bons candidats pour des essais d'inoculation de sulla en pots et au champ.

4. EFFET DE LA CONTRAINTE HYDRIQUE SUR LA SYMBIOSE

RHIZOBIUM/SULLA

En Tunisie, les régions arides occupent près du 1/3 du pays, et sont marquées par une insuffisance pluviométrique chronique limitant la production végétale (Le Houerou, 1969; Chaieb et al., 1992; Neffati et al., 1994). Cet effet est d'autant plus perceptible que la fixation symbiotique de l'azote est sensible à la contrainte osmotique (Zahran 1999b). Néanmoins, l'inoculation par des souches tolérantes au stress hydrique peut apporter un gain significatif à la symbiose en condition hydrique stressante (Athar et Johnson, 1996) à condition que la souche utilisée soit sélectionnée pour son efficience (Jahansooz et al., 2007; Mnasri et al., 2007; Mhadhbi et al., 2008; Ben Romdhane et al., 2009) et sa tolérance au stress osmotique (Athar et Johnson, 1996).

Trois souches R. sullae HC1, HC14, et HC5 et caractérisées à l'état libre par 3 niveaux de tolérance au stress osmotique respectivement faiblement, moyennement, et hautement tolérantes ont été testées dans le présent chapitre en symbiose avec le sulla du nord sous différents régimes hydriques (100, 75, 50, et 25 % RU).

4. 1. Effet de la contrainte hydrique sur la croissance et la nodulation du sulla

Avec un faible apport d'eau 25 % RU, la croissance du sulla est bloquée, ne dépassant pas le stade 3^ème feuille au moment de la récolte (Figure 33). Alors qu'avec des niveaux de 100 et 75 % RU, les plants ont atteint les stades reproducteurs (bouton floral et floraison).

Figure 33: Effet du stress hydrique sur le développement du sulla cultivé en pot.

4. 1. 1. Croissance en hauteur

Les niveaux 100 et 75 % RU sont favorables à la croissance du sulla pour l'ensemble des traitements, et particulièrement en présence des souches HC5 et HC14. A ces niveaux d'humidité, la souche HC1 offre une croissance similaire au témoin azoté.

A 50 % RU, la souche HC14 assure la meilleure croissance en hauteur (15,8 cm) contrairement à HC1 et HC5 avec lesquelles, la croissance diminue respectivement à 8,9 et 8,6 cm (Figure 34).

Figure 34: Effet du stress hydrique sur la croissance du sulla cultivé en pot et inoculé par les souches HC1, HC5 et HC14.

4. 1. 2. Surface foliaire

Quelle que soit la souche utilisée, les meilleures surfaces foliaires sont enregistrées en condition d'humidité favorable (100 % RU).

Figure 35: Effet du stress hydrique sur la surface foliaire du sulla cultivé en pot et inoculé par les souches HC1, HC5 et HC14.

Dans ces conditions, les souches HC5 et HC14 assurent une amélioration de la surface foliaire par rapport au témoin azoté respectivement de 143 et 157 %. A 75 % RU, la souche HC5 offre la meilleure surface foliaire (53,5 cm²/plante) avec une amélioration de 134 % par rapport au témoin azoté (TN).

Les souches HC5 et HC14 développent des surfaces foliaires 2 fois plus importantes que celles enregistrées avec le témoin TN à 50 % RU. En condition d'aridité extrême (25 % RU), l'effet souche n'est plus visible et la surface foliaire enregistrée pour toutes les plantes est à sa plus faible valeur moyenne de 4,08 cm²/plante (Figure 35).

4. 1. 3. Nodulation du sulla

Les nodules présents au niveau des plants de sulla sont de forme cylindrique en bâtonnet caractéristiques des rhizobiums à croissance indéterminée (Gorenflot, 1975). Aucune différence de forme n'a été observée entre les nodules des 3 souches. Par contre, un nombre visiblement plus élevé d'amas a été noté avec la souche HC14 (Figure 36).

Figure 36: Morphologie des nodules des sullas cultivés en pot et inoculés par HC14 et HC5.

La meilleure nodulation en nombre est enregistrée en présence de la souche HC14 (230 nodules/plante) à 100 % RU contre 66 nodules/plante avec HC1. L'application du stress hydrique à 75 % RU affecte la nodulation par la diminution du nombre de nodules de 86,5; 62, et 11 % respectivement avec les souches HC1, HC14, et HC5.

A 50 % RU, HC5 présente le nombre de nodules le plus élevé (60 nodules/plante) contrairement à HC1 qui ne donne que 6 nodules/plante. A 25 % RU, la souche HC5 assure la meilleure nodulation (11 nodules/plante) contre 3 en présence de HC14. Aucune formation nodulaire n'est par ailleurs observée sur les racines du sulla inoculé par HC1 (Figure 37 B).

Figure 37: Effet du stress hydrique sur la nodulation du sulla cultivé en pot et inoculé par les souches HC5, HC14 et HC1 exprimée en poids sec nodulaire (A), et nombre de nodules par plant (B).

Pour l'ensemble des niveaux d'humidités testées, la souche HC14 donne les poids nodulaires les plus élevés. Alors que les plus faibles poids sont notés en présence de HC1 (Figure 37 A).

4. 2. Effet de la contrainte hydrique sur les rendements du sulla inoculé

4. 2. 1. Biomasse sèche aérienne des sullas

Les meilleures productions de biomasses sèches sont enregistrées à 100 % RU avec la souche HC14 (4,7 g/plante) suivie de la souche HC5 (2,8 g/plante). Ces souches donnent aussi les meilleures biomasses sèches à 75% et 50 % RU qui dépasse les rendements du témoin azoté (TN) et de la souche HC1. A 25 % RU, l'effet souche n'est plus observé et tous les traitements sont similaires au témoin non fertilisé T0 (Figure 38).

Figure 38: Effet du stress hydrique sur la biomasse sèche aérienne du sulla cultivé en pot et inoculé par les souches HC1, HC5 et HC14.

4. 2. 2. Rapport partie racinaire sur partie aérienne du sulla

En condition hydrique normale (100 % RU), l'inoculation rhizobiale favorise le développement du système racinaire au détriment de la partie aérienne, alors que la fertilisation azotée est en faveur de la croissance aérienne.

De même sous un stress hydrique de 75 % RU, un effet bénéfique sur le développement de la biomasse aérienne au détriment de la partie racinaire a été obtenu avec le traitement azoté et avec les souches HC5 et HC14. Paradoxalement, la souche HC1 a significativement été affectée par ce stress occasionnant une augmentation des racines au détriment de la partie aérienne. A 50 % RU, le rapport partie racinaire sur partie aérienne (PR/PA) est maintenu avec les souches HC5 et HC14 alors qu'il diminue de 82 % en présence de HC1. A 25 % RU, un déséquilibre du développement se fait en faveur de la partie racinaire avec l'ensemble des souches (Figure 39).

Figure 39: Variation du rapport PR/PA du sulla inoculé selon les traitements hydriques.

4. 2. 3. Protéines brutes aériennes fixées par le sulla

Au stade bourgeonnement, le maximum de teneur en protéines brutes (PB) aériennes est noté en présence de la souche HC14 à 100 % RU, soit 32,38 % de la matière sèche. Le niveau 50 % RU, affecte HC14 à un taux de PB de 20,39 % (Tableau 20). Contrairement à HC14, la souche HC5 améliore la teneur en protéines brutes aérienne à 75 et 50 % RU.

Ce niveau de stress représente le seuil de tolérance de la plante. En effet, à 25 % RU, l'inoculation par des souches rhizobiales n'a plus aucun effet sur la teneur en protéines brutes et l'apport d'azote entraîne une diminution de cette teneur à 7,2 %.

Tableau 20: Effet du stress hydrique sur la teneur en protéines brutes aériennes du sulla cultivé en pot et inoculé par les souches HC1, HC5 et HC14.

Le meilleur rendement en protéines brutes est assuré à 100 % RU par la souche HC14 (1532 mg/plante) suivi de la souche HC5 (624 mg/plante). A 75 % RU, HC14 est aussi la plus efficiente, mais à 50 % RU, c'est HC5 qui assure la meilleure fixation de protéines brutes (177 mg/plante) contre 127 mg/plante en présence de HC14 et seulement 31 mg/plante avec HC1. En passant à 25 % RU, une réduction des rendements en protéines brutes est notée avec l'ensemble des souches. Néanmoins, HC5 assure dans ces conditions les meilleurs rendements (33 mg/plante) (Figure 40).

Figure 40: Effet du stress hydrique sur le rendement en protéines brutes fixées (mg/plante) du sulla cultivé en pot et inoculé avec les souches HC1, HC5 et HC14.

4. 3. Discussions

Les conditions de déficit hydrique variant de 75 à 25% RU engendrent une réduction des paramètres de croissance et de rendements du sulla d'une manière aléatoire selon la nature des souches rhizobiales. De même, une diminution de la nodulation en nombre et poids a été notée selon l'accroissement du niveau du stress hydrique. Cette réaction serait due à une diminution de l'infection des poils absorbants des racines (Robson, 1969; Zahran et al., 1986; Saadallah et al., 2001), et le nombre de poils racinaires (Zahran et al., 1986).

Selon Williams et al. (1984), un faible niveau de stress hydrique diminue seulement le nombre de nodules formés sur les racines de soja, tandis qu'un stress hydrique modéré ou sévère réduit à la fois le nombre mais aussi la taille des nodules.

La variation de la nodulation est étroitement liée à la souche utilisée. En effet, la souche HC14 donne le nombre le plus élevé de nodules (230 nodules/plante) à 100 % RU. Alors qu'en augmentant le stress hydrique à 75% RU, la souche HC5 induit le nombre de nodules le plus important (Figure 37 B). Ces mêmes constatations ont été rapportées par Krasova-Wade (2006), signalant une variation de la nodulation du haricot en condition de stress hydrique selon la souche. Dans cette situation, la souche ORS 3257 nodule plus en condition d'humidité favorable, alors que ORS 3260 le serait en condition hydrique limitante.

La capacité de nodulation des souches HC5 est HC14 à 25 % RU est en relation avec la tolérance des rhizobiums à l'environnement; qui serait selon Zahran (2001) étroitement liée à leurs origines. Ainsi Mnasri (2007b) a isolé une souche rhizobiale efficiente et hautement tolérante au stress hydrique depuis des oasis tunisiennes. Il est aussi probable que les nodules volumineux occasionnés par la souche HC14 sont en partie responsables de son adaptation au stress hydrique sévère (Sprent, 1981; Sanchez-Diaz et al., 1995). Selon Figueiredo et al. (1998), les gros nodules possèdent un parenchyme cortical plus épais qui empêche ou réduit leur déshydratation, alors que les nodules de petite taille perdent rapidement leur réserve en eau.

L'accroissement du stress hydrique de 100 à 50 % RU a occasionné, en présence de HC14 et HC5, la réduction du développement racinaire au détriment du système aérien. De pareilles constatations ont été décrites par Ghidhaoui et al. (2008) avec deux souches de R. sullae qui tendent à minimiser l'effet néfaste du stress salin par une diminution du rapport PR/PA.

Contrairement à ces souches, en présence de HC1, le rapport PR/PA augmente à 75 % puis diminue à 50 % RU. Selon Kafkai (1991), l'augmentation du rapport PR/PA sous contrainte osmotique est due à l'allongement des racines en vue la de la recherche de l'eau, alors qu'en conditions de stress hydrique plus sévères, le transport des photo-assimilats vers les racines est spécifiquement affecté et l'alimentation des parties aériennes est à son tour réduite (Bayuelo-Jiménez et al., 2002; Figueiredo et al., 2008 a).

Entre 100 et 75 % RU, la souche HC14 assure les meilleurs rendements en biomasse sèche et protéines brutes aériennes. Celle-ci semble être affectée par le stress hydrique à partir de 50 % RU puisqu'elle diminue la teneur en protéines brutes de 10 points. Contrairement à HC14, la souche HC5, améliore les teneurs en protéines brutes aériennes avec l'accroissement du stress hydrique de 100 à 50 % RU. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par L'taief et al. (2009) qui ont trouvé une bonne adaptation de la souche S1 à différents régimes hydriques suite à l'amélioration de la teneur en azote total du pois chiche contrairement à d'autres souches.

La capacité de HC5 à fixer l'azote en condition de stress hydrique sévère serait en relation avec l'efficience de la souche, mais aussi sa tolérance au stress hydrique (Zahran, 1999). Il est aussi probable que la souche HC5 ait la capacité de libérer des phytohormones directement ou indirectement responsables de la modération des effets du stress hydrique sur la plante (Boiero et al., 2007; Figueiredo et al., 2008a; Cohen et al., 2009; Yang et al., 2009; Belimov et al., 2009).

L'inoculation du sulla par son rhizobium spécifique a donné des améliorations similaires (HC1) sinon meilleures (HC5 et HC14) que celles enregistrées par le témoin azoté (90 unités). Ce résultat pourrait être expliqué, d'une part, par la capacité de fixation symbiotique des souches qui dépasse manifestement ce niveau de fertilisation azoté; et d'autre part, par l'action directe des microorganismes sur la plante, à travers des phytohormones produites par ces rhizobiums (Juszczuk et al., 2004); ou par l'action indirecte, de l'amélioration des propriétés physiques de la rhizosphère suite à la libération des exo-polysaccharides (EPS). Dans ce sens, Kaci (2005) a rapporté que la souche R. sullae (KYGT207) isolée depuis une région aride du sud de l'Algérie, aurait par l'inoculation du sol, la capacité d'améliorer des propriétés physiques de la rhizosphère des céréales.

4. 4. Conclusion

En condition d'humidité favorable (100 % RU), la souche rhizobiale HC14 moyennement tolérante aux stress abiotiques (200 mM NaCl et -0,9 MPa), assure les meilleures biomasses sèche (4,75 g/plante) et protéique (1531 mg/plante). A 75 % RU, cette souche est aussi efficiente que celle hautement tolérante HC5 (400 mM NaCl et -0,95 MPa).

En augmentant le stress hydrique à 50 % RU, HC5 produit le maximum de protéines brutes (177 mg/ plante) dépassant HC14 de 39 %. En conditions extrêmes (25 % RU), HC5 et HC14 ont été capables d'induire des nodules, contrairement à la souche sensible au stress osmotique HC1 (150 mM NaCl et -0,5 MPa).

Les souches HC5 et HC14 sont par conséquent intéressantes à retenir pour des essais d'inoculation en plein champ.

5. ETUDE DE L'EFFICIENCE SYMBIOTIQUE DES SOUCHES RHIZOBIALES SELECTIONNEES AU CHAMP

Les effets de l'inoculation rhizobiale par les souches sélectionnées HC5 et HC14 sur la croissance et la production du sulla dans deux sites favorable et défavorable à la culture de sulla respectivement Tunis et Goubellat sont traités dans le présent chapitre.

5. 1. Evaluation de la densité rhizobiale autochtone spécifique au sulla dans les sites expérimentaux

La méthode MPN (Most probable Number) a mis en évidence la présence d'une importante densité rhizobiale spécifique au sulla dans le site Tunis évaluée à 3,2 x 10⁴ bactéries/g de sol. En revanche, dans le site de Goubellat, cette densité a été nulle.

5. 2. Effet de l'inoculation rhizobiale sur la culture de sulla de 1ère année dans les sites Tunis et Goubellat

5. 2. 1. Croissance en hauteur du sulla première année

Au stade floraison, la hauteur de végétation du sulla est en moyenne 2 fois plus élevée à Tunis qu'à Goubellat. La meilleure croissance est enregistrée au site de Tunis en présence de la souche HC14, suivie de HC5 assurant un gain de croissance par rapport à T0 respectivement de 23 et de 7 % (Figure 41).

Figure 41: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la croissance en hauteur du sulla de 1^ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

A Goubellat, l'inoculation avec HC14 est particulièrement favorable à la croissance du sulla assurant une amélioration de 80 % par rapport à T0 (Figure 42).

Figure 42: Cultures de sulla non inoculée A, et inoculée B par la souche HC14 dans le site de Goubellat (mai 2009).

5. 2. 2. Surface foliaire du sulla de première année

Au stade floraison, La surface foliaire moyenne du sulla est de 1233 cm²/plante à Tunis, contre 688 cm²/plante à Goubellat. La fertilisation azotée est, dans les 2 sites, plus favorable à l'accroissement de la surface foliaire que l'inoculation rhizobiale (Figures 43).

Figure 43: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la surface foliaire du sulla de 1^ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

5. 2. 3. Nodulation du sulla de première année

L'apport d'un inoculum exogène n'a pas eu le même effet sur la nodulation dans les deux sites. En effet, à Tunis tous les traitements ont développé des nodosités racinaires avec un maximum en présence de HC5 (31,4 nodules/plantes). Cette dernière a aussi présenté le nombre de nodosités le plus important à Goubellat (12,7 nodules/plantes). Les témoins non inoculés n'ont par ailleurs présenté aucune formation nodulaire dans ce site (Tableau 21).

A Tunis la fertilisation chimique (TN) a significativement affecté la nodulation par la diminution du nombre mais aussi du poids nodulaire.

L'inoculation rhizobiale à Tunis a amélioré, par rapport au témoin non fertilisé T0, le poids nodulaire de 56 à 71% respectivement avec HC14 et HC5. Cette dernière a aussi développé le poids nodulaire le plus élevé à Goubellat (56,15 mg/plante) (Tableau 21).

Tableau 21: Effet de l'inoculation au champ du sulla avec les souches HC14, HC5 sur le nombre et le poids des nodules dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

5. 2. 4. Biomasse sèche aérienne du sulla de première année

Au stade floraison, l'inoculation et la fertilisation azotée n'ont eu aucun effet sur la biomasse sèche aérienne à Tunis. Alors qu'à Goubellat, cette technique a assuré des rendements en fourrage sec similaires à ceux produits par fertilisation azotée (Figure 44), assurant ainsi des améliorations par rapport au témoin non fertilisé (T0) de 161 à 185 % respectivement avec HC5 et HC14.

Figure 44: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la biomasse sèche aérienne du sulla de 1^ère année dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

5. 2. 5. Protéines brutes aériennes du sulla de première année

Dans le site de Tunis et au stade floraison du sulla, ni l'inoculation rhizobiale, ni la fertilisation azotée n'ont d'effet sur la teneur en protéines brutes. Paradoxalement, à Goubellat, l'inoculation rhizobiale améliore de 3,5 à 6,54 points les taux de protéines brutes fixées par la plante respectivement avec HC14 et HC5 par rapport au témoin non fertlisé (T0). La fertilisation azotée assure dans ces conditions la meilleure teneur en protéines brutes que l'inoculation du sulla avec HC5 (Tableau 22).

Tableau 22: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ du sulla sur sa teneur en protéines brutes aériennes dans les sites de Tunis et Goubellat au stade floraison.

A Tunis, les rendements protéiques sont semblables pour l'ensemble des traitements. Alors qu'à Goubellat, l'inoculation rhizobiale améliore ces rendements par rapport au témoin non fertlisé (T0) de 272 à 311% respectivement avec HC14 et HC5, sans toute fois dépasser significativement la production issue d'une fertilisation azotée (Figure 45, Annexe 10).

Figure 45: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur les rendements en protéines brutes aérienne du sulla de 1ère année dans les sites Tunis et Goubellat au stade floraison.

5. 3. Evaluation des croissances et nodulation du sulla de deuxième année dans la station de Goubellat

En deuxième année de culture, la croissance en hauteur et la surface foliaire des plants de sulla sont significativement homogènes pour l'ensemble des traitements (Figure 46, Annexe 11). Cependant, la nodulation des plants a été observée sur l'ensemble des traitements (Tableau 23).

Tableau 23: Effet de l'inoculation rhizobiale au champ sur la croissance en hauteur, la surface foliaire et la nodulation du sulla de 2^ème année au stade bouton floral.

5. 5. Discussions

L'inoculation rhizobiale du sulla en plein champ entraîne des effets aléatoires sur les paramètres de croissance, nodulation et rendements selon le site et la nature de l'inoculum.

Comparé à Goubellat, le site de Tunis se caractérise par une supériorité de la croissance et de la nodulation du sulla de 1^ère année indépendamment de la souche utilisée. La croissance en hauteur est en moyenne 2 fois plus élevée à Tunis qu'à Goubellat. En conséquence, les rendements en biomasses sèches aériennes et protéiques se trouvent affectés. La différence du comportement agronomique du sulla dans les deux stations et selon les traitements serait liée à la présence d'une population rhizosphérique efficiente dans le site Tunis (Fitouri Dhane, 2011). De plus, l'irrégularité des pluviosités, combinée à une amplitude thermique plus importante à Goubellat durant la période d'installation et de croissance du sulla en première année de culture pourraient contribuer à une croissance limitée de la plante (Lapeyronie, 1982).

Dans les deux stations, et au stade floraison du sulla, la souche HC14 entraîne les meilleures croissances en hauteur. Concernant les paramètres de nodulation, l'inoculation avec les souches HC5 et HC14 dans le site de Tunis a permis d'améliorer le nombre (de 12 à 51 %) et le poids (de 57 à 72%) nodulaire. A Goubellat, l'inoculation avec la souche HC5, a assuré au stade floraison, la nodulation la plus élevée en nombre (12,7 nodules/plantes) et en poids (56,15 mg/plante).

De point de vue efficience symbiotique, la souche HC14, moyennement tolérante au stress abiotique, a assuré une amélioration des rendements protéiques par rapport au témoin non fertilisé (T0) de 11,4% à 272% respectivement à Tunis et Goubellat. En présence de HC5 qui est plus tolérante au stress abiotique, ces améliorations ont augmenté à 312 % dans le site Goubellat. L'adaptation des souches rhizobiales à la variation des conditions édaphiques et climatiques du milieu dépend des caractéristiques phénotypiques de celles-ci (Zahran 1999, Vinuesa et al., 2003).

Les souches HC5 et HC14 semblent aussi particulièrement compétitives dans le site Tunis où la densité rhizobiale spécifique au sulla se trouve déjà suffisante (3,2 10⁴ bactéries/g de sol). Il a été rapporté dans ce sens que l'introduction de souches efficientes de Rhizobium favorisait la nodulation et par conséquent la fixation biologique de l'azote (Sultan et al., 2002); mais à condition, que la souche introduite soit compétitive (Graham 1994).

Cette compétitivité des souches est toute fois tributaire des sources d'énergie disponibles dans le sol (Bromfield et al.,1985; Streit et al., 1996; Murphy et al., 1987) ainsi que des interactions entre les souches de Rhizobium (Robleto et al., 1998; Oresnik et al., 1999), bactéries et champignons rhizosphériques autochtones qui peuvent être positives (Dashti et al., 1998) ou négatives (Mrabet et al., 2006).

En deuxième année de culture, la présence de nodosités racinaires fixatrices de l'azote sur l'ensemble des plants de sulla du site Goubellat ainsi que l'accroissement de la densité rhizobiale spécifique au sulla de 0 en première année à 1,7 x 10² bactéries/g de sol témoigne d'une bonne dispersion de l'inoculum dans la rhizosphère et d'une adaptation des souches introduites aux conditions environnementales de la station. En effet, après deux années de culture à Goubellat, la biomasse sèche et les protéines brutes cumulées sont semblables entre tous les traitements.

L'effet néfaste de la fertilisation azotée sur la nodulation du sulla dans le site de Tunis a été observé au stade floraison. Cet effet de l'azote sur la nodulation, a déjà été rapporté par plusieurs auteurs (El Mili, 1983; Vance et al., 1987; L'taief et al., 2008). L'augmentation de la quantité d'azote sous forme de NH4 + et NO3 - dans le sol aurait pour conséquence une inhibition de l'infection racinaire (Abdel-Wahab et al., 1996) et du développement nodulaire (Atkins, et al., 1984; Imsande, 1986; Timmers et al., 2000). Dans ce sens, Tibaoui et Zouaghi (1989) ont rapporté une réduction hautement significative de la nodulation provoquée par la fertilisation azotée, particulièrement pendant la fin du cycle végétatif du sulla.

5. 6. Conclusion

L'inoculation rhizobiale du sulla en plein champ avec HC5 et HC14 a selon le site stabilisé ou amélioré les rendements fourragers et protéiques.

En condition favorable à la culture du sulla (Tunis), l'inoculation avec les souches HC14 et HC5 a maintenue une production fourragère et protéique semblable à celle du témoin non fertilisé.

Mais à Goubellat, où le milieu édaphique est considéré comme défavorable, les souches HC5 et HC14 ont assuré à travers la fixation symbiotique de l'azote, une production de fourrage sec équivalente à une culture de sulla qui aurait été fertilisée par respectivement 59 et 64 unités d'azote chimique.

Après deux années de culture, l'inoculum est préservé dans le site de Goubellat, et a assuré des productions fourragère et protéique équivalente à celles produites par un sulla qui aurait reçu 140 unités d'azote chimique.

Conclusions générales et perspectives

La prospection des potentialités symbiotiques du sulla cultivé dans divers sites du nord de la dorsale tunisienne et la collecte de matériel rhizobial autochtone ont permis de déceler d'une part différentes caractéristiques d'intérêt fonctionnel des souches et d'autre part une diversité biologique bien développée. Une variabilité de la productivité de la plante hôte a été observée en relation avec l'environnement physique, et la population rhizobiale autochtone en symbiose.

L'étude de la diversité phénotypique des isolats collectés a révélé une influence du site géographique sur les groupements phénotypiques. Cette diversité est aussi corrélée à la diversité génétique intra spécifique révélée par Rep-PCR. L'analyse de la diversité génétique par PCR-RFLP de l'ADNr 16S associée au séquençage du gène 16S a confirmé la haute spécificité symbiotique entre H. coronarium L. et R. sullae, et mis en évidence la présence de certains endophytes non spécifiques à cette plante à effet PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria).

Trois niveaux de tolérance aux stress abiotiques (salinité, sécheresse, pH) ont été mis en évidence entre les souches de R. sullae: souches hautement tolérantes (400 mM NaCl et - 0,95 MPa); moyennement tolérantes (200 mM NaCl et -0,9 MPa); et sensibles (150 mM NaCl et -0,5 MPa).

L'évaluation de l'efficience symbiotique sous quatre régimes hydriques (100, 75, 50 et 25 % RU) des souches HC5, HC14 et HC1 classées respectivement comme hautement, moyennement tolérantes, et sensible au stress osmotique a montré que la souche moyennement tolérante (HC14) donne les meilleures biomasses sèches (4,75 g/plante) et protéiques (1531 mg/plante) à 100 % RU. A 75 % RU, les souches HC14 et HC5 en symbiose avec le sulla permettent une production de biomasses sèches similaires et équivalentes à celles produites en condition de fertilisation azotée respective à 125 unités d'azote chimique. En condition de stress plus sévère (50 % RU), la souche hautement tolérante au stress HC5 a produit le maximum de protéines brutes (177 mg/ plante) dépassant HC14 de 39 %.

Conclusions générales et perspectives

L'inoculation du sulla par HC14 et HC5, dans deux sites, favorable (Tunis) et défavorable (Goubellat) à la culture, a montré l'adaptation de ces souches aux deux conditions environnementales:

- A Tunis, où le rhizobium spécifique au sulla est présent, l'inoculation a significativement amélioré la masse nodulaire de 52 à 71 % respectivement avec HC14 et HC5. Cette amélioration de la nodulation n'a toute fois pas affecté les rendements fourragers et protéiques.

- A Goubellat, où le rhizobium spécifique au sulla est absent, l'inoculation a fourni en première année de culture et au stade floraison une production de biomasse sèche équivalente à celle produite par une fertilisation chimique de 59 à 64 unités d'azote respectivement avec HC14 et HC5. En deuxième année, la densité rhizobiale spécifique au sulla à Goubellat est passée de 0 à 1,7 x 10² bactérie/g de sol et la production de fourrage de sulla cumulée a été équivalente à celle d'une culture sous régime de fertilisation chimique avec 140 unités d'azote.

En conséquence, l'efficience symbiotique des souches HC14 et HC5 a été vérifiée et couronnée par l'inscription d'un brevet intitulé Bio-fertilisant à base d'une souche locale de rhizobium spécifique au sulla du nord Hedysarum coronarium L. sous le numéro TN 2010/0310 du 02 Juillet 2010.

Du point de vue taxonomique, la recherche sur la diversité génétique des souches nodulant le sulla utilisant d'autres techniques moléculaires, en l'occurrence le séquençage des gènes atpD et recA, permettrait une meilleure classification de ces souches (analyse en cours).

Dans une étape ultérieure, l'évaluation de l'efficience des souches testées sous de nouvelles formes de stress biotique (champignons telluriques) ou abiotique (température) serait particulièrement intéressante dans une conjoncture de changement climatique.

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ANNEXES

Annexe1 : Milieux de culture pour les bactéries

Le rouge congo permet à la fois de neutraliser les actinomycètes et de déceler certains

Annexe2 : Milieu de culture et solution nutritive de base des plantes Milieu Fahraeus

Le milieu est ajusté à pH 7,5, additionné de 15g/l d'agar puis stérilisé à 120°C et un bar durant 24 minutes

Annexe 3 : Marqueurs de poids moléculaire

Annexe 5 Nombre de rhizobium estimé par la méthode MPN (Vincent, 1970) Dilution par un facteur de dix.

Annexe 6 : corrélation entre les paramètres de nodulation et le rendement en protéines brutes aériennes du sulla inoculé par les souches de la collection

Annexe 7 : Carrés moyens et coefficients de variation des variables quantitatives et
qualitatives relatives à la culture de sulla dans les stations prospectées