3. 6. Conservation des Rhizobiums
3. 6. 1. Conservation des nodules par
déshydratation
La conservation des nodules a été
réalisée par déshydratation dans des flacons en verre
contenant du CaCl2 (Figure 5). Le flacon en verre est rempli au deux tiers de
son volume par du CaCl2. Les nodules ont été par la suite
déposés entre deux couches de coton (Vincent, 1970). Sur chaque
flacon on a noté le lieu et la date de prise de l'échantillon.
Figure 5: Conservation des nodules par
déshydratation.
3. 6. 2. Conservation des isolats bactériens
3. 6. 2. 1. Isolement et purification des
rhizobiums
L'isolement a été réalisé à
partir de nodules fraîchement récoltés et d'autres
conservés par déshydratation dans du CaCl2. Au total 10 nodules
par site ont été isolés. La réhydratation des
nodosités a été réalisée en condition
stérile par imbibition à l'eau distillée
stérilisée pendant 4 heures. Une fois les nodosités ont
repris leur volume initial; celles-ci ont été
désinfectées par l'alcool 95° pendant 15 secondes puis par
le HgCl2 (0,1%) pendant 45 secondes. Après une série de 10
rinçages à l'eau distillée stérile, les
nodosités ont été aseptiquement écrasées
à l'aide d'une pince stérilisée puis étalée
par striation directement sur des boîtes contenant le milieu YMA/RC
(Vincent, 1970) (Annexe 1) additionné du rouge Congo à 2,5%. Ces
différentes boîtes ont été par la suite
placées dans un incubateur à 28°C.
Après une série de repiquages, et en se basant sur
les caractéristiques morphologiques des colonies représentant le
type majoritaire, un nombre de 50 isolats a finalement été
retenu.
3. 6. 2. 2. Conservation sur gélose
inclinée
L'ensemble des 50 isolats sélectionnés a
été ensemencé (Figure 6) dans des tubes contenant du
milieu Yeast Extract-Mannitol (YEM) (Annexe 1) dépourvu du
rouge Congo à gélose inclinée puis maintenu à
4°C. Sur chaque tube, le nom de la souche et la date de conservation ont
été indiqués.
Figure 6: Ensemencement des souches sur milieu
YEM.
3. 6. 3. Conservation dans le glycérol
Ces isolats ont été également
conservés dans des congélateurs à -20°C et à
-80°C dans des ependorfs stériles contenant 200 ul de
glycérol et 800 ul de pré culture bactérienne
fraîche (Vincent, 1970).
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