Memoire Online - Qualité des produits halieutiques : dosage des teneur en histamine, azote basique volatile total (abvt) et du taux des sulfites dans quelques produits de pêche

A. El Hammadi Prof. à la Faculté des Sciences d'Agadir, M. Hamdani Prof. à la Faculté des Sciences d'Agadir,

L. El Maimouni Prof. à la Faculté des Sciences d'Agadir, A. Laknifli Prof. à la Faculté des Sciences d'Agadir,

J4ucune dédicace ne saurait exprimer l'estime, le dévouement, le respect et l'amour que je porte pour vous. Acceptez ce modeste travail en reconnaissance de tous les sacrifices que vous avez consentis pour mon éducation et ma formation. 'T'ous étiez toujours prêts a m'encourager et a me soutenir au cours de ces longues années.

[I'ful ne pourra exprimer mon attachement et ma reconnaissance pour vos sacrifices et vos encouragements durant mes longues études. )tu signe de ma profonde affection, je vous dédie ce mémoire en vous souhaitant bonheur et réussite.

Les travaux présentés dans ce mémoire ont été effectués aux laboratoires de l'unité de production CIBEL et LRARVA sous la direction de Monsieur Lahcen ELMAIMOUNI, professeur a la Faculté des Sciences d'Agadir.

En premier lieu, je tiens a exprimer ma profonde gratitude a Monsieur Lahcen ELMAIMOUNI pour m'avoir initié a la recherche et dirigé ce travail avec beaucoup d'intérêt et pour sa qualité d'encadrement. J'ai trouvé auprès lui compétence, rigueur et patience.

Je remercie également Monsieur Abdellatif LAKNIFLI, professeur a la faculté des sciences d'Agadir pour sa gentillesse, pour l'encouragement quTil mTa apporté tout au long de mon stage. J'ai apprécié son enthousiasme qui a constitué un précieux soutien.

Je remercie également MM A. El HAMMADI et M. HAMDANI, professeurs a la Faculté des Sciences d'Agadir, qui mTont fait lThonneur d'avoir accepter de juger ce travail. Que Mr HAMDANI, trouve ici mes sincères remerciements pour avoir accepté de présider ce jury. J'exprime aussi mes plus sincères remerciements a toute l'équipe du laboratoire LRARVA en particulier Mlle F. OUMLLOUK, directeur adjoint, M. MZOUGH, chef de la section chimie, H. KOUROUSS, ingénieur chimiste, Y RIBANNI, technicien de laboratoire ; Mes remerciements vont également au personnel du CIBEL, je cite en particulier B. OUARDI responsable du service Qualité, et M. El FARISSI, et L. KRIOUCH Techniciens de laboratoire pour leur accueil et collaboration.

Je tiens a remercies les Professeurs Mr A .LACHERAI et M .ZERBET pour les discussions scientifiques que nous avons eues ensemble.

J'adresse aussi mes remerciements les plus sincères a tous les Professeurs du Département de Chimie.

Que A. Ait Etaleb, doctorant au sein de l'équipe Matériaux et Physico-chimie des Milieux Naturels, trouve ici mes sincères remerciements pour les discussions menées ensemble et pour sa gentillesse. Mega Thaink you a tous les étudiants de master de Chimie de la promotion 2007-2009, avec qui j'ai partagé ces deux années.

Introduction générale Chapitre I :	1
I- Approche HACCP et normes de qualité des produites halieutiques	.3
I.1. Introduction	. 3
I.2. Approche HACCP	3
I.3. Méthodes usuelles de dosage et normes de Qualité des produits de pêche	4
I.3.1. Azote Basique Volatile Total	4
I.3.2. La teneur en histamine	6
I.3.3. Le taux de bisulfites	.8

Chapitre II :

II- Introduction	...11
II.1. Détermination de l'ABVT dans les produits de mer	11
II.1.1. Principe de la méthode utilisée	. .12
II. 1.2. Procédure expérimentale	12
II.2. Dosage de l'histamine dans les produits de mer	14
II.2.1. Procédure expérimentale	15
II.2.2. Étalonnage du fluorimètre	....16
II.3. Détermination du taux de dioxyde de soufre	...18
II.3.1. Introduction	..18
II.3.2. Détermination du dioxyde de soufre par la méthode de Monier-Williams modifiée	....19
Chapitre III:
III. Résultats et discussion	22
III.1. Mécanisme His-OPA	.....22
III. 2. Résultats analytiques	24
III.2.1. Analyse type 1	24
III.2.2. Analyse type 2	25
III. 3. Interprétation des résultats	26

Introduction

Introduction générale

Dans plusieurs pays, le secteur de la pêche joue un rôle socio-économique vital et occupe une place très avancée parmi les secteurs de l'économie nationale en particulier dans les pays qui sont à la fois producteurs, consommateurs et exportateurs de produits halieutiques. Sur le plan alimentaire (ingrédients protéiques), les produits de pêche contribuent de manière déterminante à la satisfaction des besoins alimentaires de la majorité de la population mondiale. Le nombre de personnes travaillant directement ou par induction dans ce secteur est en augmentation progressive. Rappelons que la production halieutique mondiale avoisine actuellement les 120 millions de tonnes par an, un nombre prévue auparavant par Ababouch depuis 1995 (Ababouch, 1995).

Au Maroc, avec le tourisme et l'agriculture, la pêche maritime constitue une source économique de grande importance (source de devises), d'autant plus que la demande des produits halieutiques sur le marché international est en constante augmentation. Cependant, cette expansion s'accompagne d'une plus grande exigence des consommateurs sur la qualité des produits. Ceci a poussé une bonne partie des grands pays importateurs de produits de mer de renforcer leur réglementation sur le contrôle des aliments et deviennent de plus en plus exigeants sur les produits de pêche en raison de la pollution des écosystèmes aquatiques engendrée par des eaux usées rejetées sans traitements préalables et des pollutions accidentelles.

Avec plus de 3000 km de côtes (atlantiques et méditerranéennes) et la présence de plusieurs zones d'up welling, le Maroc dispose de ressources halieutiques considérables. Le domaine de la transformation et de valorisation des produits de la mer revêt une importance particulière, en raison du potentiel considérable qu'elle recèle en matière d'investissement, d'emploi, d'exportation et de création de valeur ajoutée, points essentiels sur lesquels s'articule le plan émergence lancé au Maroc en 2005.

Selon les études comparatives effectuées par McKinsey, les produits de la mer constituent un secteur important pour le Maroc. D'après ces mêmes études, les industries de transformation des produits de la mer représentent un métier au potentiel largement inexploité. A ce propos, un pôle de développement de ce secteur est en cours d'installation

(pôle de compétitivité en halieutique). Son schéma est largement inspiré du modèle européen. Par ailleurs, et dans l'objectif de préserver ses ressources et de diversifier ses produits de mer, la stratégie nationale vise l'encouragement de l'aquaculture.

L'amélioration de la qualité des produits halieutiques est devenue donc une préoccupation majeure des pouvoirs publics et de tous les acteurs opérant dans ce domaine : le contrôle des taux de substances générées dans les tissus des poissons, destinées à la consommation, telles que l'histamine _(C5H9N3), l'azote basique volatil total « ABVT » et récemment les métaux lourds (Hg, Cd, ...), est devenu obligatoire. Les teneurs en additifs, généralement ajoutés pour le traitement et la conservation des crustacés (crevettes, langoustines), font également l'objet d'une réglementation stricte et exigeante. Par exemple, les bisulfites de sodium, utilisés comme conservateurs contre le noircissement enzymatique de ces espèces, revêt un intérêt majeur dans le domaine de la qualité des produits de la pêche (IFREMER, 1975).

Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans le cadre de master de Chimie de la Faculté des Sciences d'Agadir ; Son objectif principal est de faire des analyses physicochimiques d'intérêt agro-alimentaire ; il s'agit de l'évaluation de trois paramètres les plus déterminants de la qualité des produits halieutiques à savoir : l'ABVT, l'Histamine et le taux des bisulfites via le dioxyde de Souffre. Elles sont toutes effectuées dans le cadre des collaborations bilatérales entre l'Université Ibn Zohr et les laboratoires CIBEL et LRARVA.

Le premier chapitre de ce mémoire présente les normes de qualité relatives aux produits halieutiques ainsi qu'un bref aperçu sur l'approche systématique HACCP «Hazard Analysis Critical Control Point» souvent adoptée comme programme d'auto-contrôle. Dans le second chapitre, nous présentons d'une manière exhaustive les méthodes d'analyses de l'histamine, de l'ABVT et des sulfites via la détermination du SO2. Les résultats et leurs interprétations seront exposés dans le troisième chapitre de ce rapport. A la fin du manuscrit, une conclusion générale et des annexes sont présentées.

Chapitre I

Selon cette démarche HACCP, la réception de la matière première est un point critique majeur de la chaîne de reproduction. Des séries de contrôles seront faites afin de refuser ou accepter cette matière. Parmi ces contrôles, on cite:

Il est très important de signaler ici que, les contrôles n° 1 et 3 sont des critères déterminants pour l'appréciation du degré de fraîcheur du poisson frais à la réception (Rachidi, 1998).

I.3. Méthodes usuelles de dosage et normes de Qualité des produits de pêche

Dans le domaine d'agroalimentaire, les produits de la pêche font l'objet de contrôles officiels au moment du débarquement, ou avant la première vente. Pour ce faire, des réglementations sont établies par des Commissions spécialisées (ex. commission de la communauté de l'union européenne, Commission de la pêche au Canada, ...etc) pour définir les limites ou normes d'acceptabilité ou refus de la marchandise au niveau de chaque contrôle. Ces normes s'expriment via des paramètres observables et / ou mesurables.

Les amines volatiles sont principalement constituées par l'ammoniac (NH3), la dimèthylamine [DMA = (CH3)2NH], la triméthylamine [TMA = (CH3)3N]. Ces molécules sont souvent regroupées selon le nom de bases azotiques volatiles totales.

Pour la quantification de ces substances, il existe plusieurs méthodes de dosage: certaines de ces méthodes permettent la mesure de l'ABVT d'une manière absolue (proportion de chacune des amines volatiles), d'autres méthodes conduisent uniquement à une appréciation globale généralisée. Le principe de base des techniques couramment utilisées dans ce domaine, est décrit ci-dessous :

·Méthode de distillation d'un extrait déprotéinisé par l'acide perchlorique :

C''est la méthode de référence retenue par l'union européenne (règlement CE n° 2074/2005). La première étape est une déprotéinisation de l'échantillon par l'acide perchlorique (HClO4). En suite on procède à la distillation de l'ABVT à la vapeur, suivie de sa neutralisation par l'acide chlorhydrique (HCl). La description de cette méthode sera présentée avec plus de détail dans le chapitre suivant.

Elaborée depuis 1968, par la comité du «Codex Alimentarius » pour les poissons et produits de la pêche, cette méthode fut la première utilisée avant qu'elle soit modifie par la Commission de l'Union Européenne : l'acide trichloracétique (CCl3CO2H) est tout simplement remplacé par l'acide perchlorique (HClO4).

La décision de la commission du 8 mars 1995 (95/149/CE) fixant les valeurs limites en azote basique volatil total pour certaines catégories de produits de la pêche et les méthodes d'analyse à utiliser, définie clairement les valeurs normes de ces analyses.

D'une manière générale, l'état de fraîcheur des poissons frais, congelés ou surgelés est satisfaisant lorsque la teneur en ABVT est inférieure à 25-30 mg/100g chair.

Tableau 1 : Concentrations limites en mg pour 100g de poisson relatives à l'ABVT. (Décision
Européenne 95/149/CE)

Catégories de produit de mer	Limites
	bonne qualité	qualité commerciale courante	qualité médiocre	taux limite
conserves ou semi-conserves de poisson (sardines, sardinelles, maquereaux).	< 50	50 à 60	60 à 70	> 70
crustacés frais ou en conserves.	< 30	30 à 40	40 à 60	> 80

L'histamine est une amine biogène provenant de la dégradation de l'histidine par décarboxylation. Elle est très toxique. Sa présence à des teneurs élevées dans les produits halieutiques est susceptibles de provoquer des problèmes sanitaires graves (intoxication, allergies, troubles respiratoires, vomissements, diarrhées, etc.) (Rabani A. 2008).

Nombreuses sont les insuffisances observées dans les méthodes actuelles (instabilité, interférences, longue durée et coût très élevé) de dosage de l'histamine dans les produits alimentaires (produits halieutiques et dérivés, fromages, etc.) (FDA, 2000 ; Branowky JD, 1990 ; Summer SS, 1990 ; Frank HA, 1984) et les liquides physiologiques (sang, plasma, urine, larmes, etc.) (FDA, 2000 ; Imanara I, 1984). Le dosage de ce paramètre représente un enjeu sanitaire et économique très important.

(Lerke PA, 1978 ; Arnold SH, 1978). Depuis sa découverte, diverses méthodes ont été utilisées pour son dosage dans différentes matrices:

Du fait de l'instabilité du dérivé formé en milieu basique, on procède à l'acidification du milieu. Le signal de fluorescence du dérivé His-OPA est donc très sensible à la variation du pH, une infime variation de ce dernier conduira à des résultats très différents (Douabalé et

al., 2003, AOCA, 1995). Il est bien établi que après l'étape d'acidification, la stabilisation du fluorophore nécessite environ 25 min avant toute mesure du signal de fluorescence (Douabalé et al., 2003). Ce temps ajouté aux durées de préparation des solutions étalons et de la réalisation de la courbe de calibration font que cette méthode prend une durée considérable.

D'où la nécessité de chercher une nouvelle méthode qui serait absolue, un agent dérivatisant qui réagi instantanément avec les amines primaires : c'était notre objectif au début de ce travail.

Sur le plan production et mise sur la marché des produits de la mer, la réglementation établie par la commission (règlement communautaire CE n° 2073/2005) fixe les règles sanitaires régissant ces procédures de surveillance. En effet, lors d'un plan de surveillance, neuf échantillons sont prélevés sur chaque lot:

> La teneur moyenne ne doit pas dépasser 100 mg/kg de chair de poisson ; > Deux échantillons peuvent dépasser 100 mg/kg sans atteindre 200 mg/kg; > Aucun échantillon ne doit dépasser 200 mg/kg.

> Clupéidés : harengs, ethmaloses, chardines, sardines, sardinelles, sardinops,..... ; > Engraulidés : anchois ;

Selon la Directive 91/493/CEE et norme de matière première suivant l'auto-contrôle HACCP, la limite de la teneur en histamine pour les poissons frais, quelque soit le type ne doit pas dépasser 50 mg/kg.

Au Maroc, La pêche des crevettes représente environ 89,77% du total des crustacés débarqués par les chalutiers côtiers aux différents ports nationaux. Une bonne partie (13%) de ces crustacés est destinée à l'exportation à l'état frais (ElMarrakchi et Laghmari, 2005). Les modifications de la qualité des crevettes entreposées sous glace ont fait l'objet de plusieurs travaux et ont montré son extrême altérabilité qui dépend principalement des

conditions de stockage et de la nature de la flore d'altération, elle-même dépendant du lieu de capture (Chinivasagam et al, 1996, 1998 ; Yamagata et al, 1995).

Les crevettes sont donc confrontées aux problèmes de leur extrême fragilité qui se traduit par le phénomène du noircissement. Pour améliorer la qualité « commerciale » des crevettes, les professionnels ont recours souvent au glaçage associé à l'utilisation des sulfites comme conservateur pour retarder l'apparition du noircissement (Susamma et al, 1998) parfois sans connaissance des limites réglementaires à cette matière qui généralement, ne s'applique pas de façon appropriée à bord. Cet usage anarchique de ce produit, conduit sans doute à son augmentation qui dépasse souvent la limite permise.

Le dioxyde de soufre (SO2) rencontré lors de la sulfitation peut entraîner des problèmes de santé, notamment des complications cardiaques chez les personnes asthmatiques (Taylor et al., 1986). De même, une sulfitation excessive est parfois appliquée aux crustacés pour cacher des défauts d'altération d'origine microbienne. Il faut toutefois noter que si les conditions de bonne pratique de fabrication sont respectées lors de la sulfitation, les taux toxiques de SO2 ne sont jamais atteints.

Un des objectifs fixés dans notre présent travail, est d'évaluer le taux de SO2 dans les crevettes marocaines déjà distribuées dans le marché pour voir si les méthodes de traitement sont appliquées d'une manière contrôlée.

La méthode de référence pour le dosage de SO2 dans plusieurs pays est la méthode de Monier-Williams modifieé. Plusieurs pays ont adopté des normes limites concernant les résidus de SO2 dans les crevettes. Selon la Directive 91/493/CEE concernant les additifs dans les crevettes on a les limites de tolérance consignées dans le tableau ci dessous :

*Produit de la mer*	*Seuils de tolérance* en mg/kg
Crustacés frais, congelés et surgelés	150
Moins de 80 unités	150
Entre 80 et 120 unités	200
Plus de 120 unités	300
Cuite	50

Chapitre II

Ce travail purement expérimental a été effectué dans deux laboratoires d'analyses : le Complexe Industriel et commercial belhassan-CIBEL et le Laboratoire Régional d'Analyses et de Recherches Vétérinaires d'Agadir (LRARVA). Ces deux établissements entretiennent des relations de collaborations scientifiques avec les établissements de l'Université Ibn Zohr, en l'occurrence la Faculté des Sciences d'Agadir.

Le LRARVA a été crée en 1980 pour couvrir les besoins de la zone de sud du Maroc en matière d'analyse et contrôle de qualité des produits agro-alimentaires et halieutiques. Après une période de formation du personnel et la mise en place des équipements, le laboratoire a démarré ses activités techniques en 1985. Le laboratoire est organisé en 4 sections (section administrative, section qualité, section appui et logistique et section technique). Quant au Laboratoire CIBEL, il est fondé en 1989, c'est une unité active dans le secteur « Produits des industries alimentaires » et dont l'activité principale est le contrôle de la qualité des poissons et produits de la pêche préparés.

Comme signalé auparavant, l'ABVT est un des critères utilisés pour évaluer l'altération des produits de la mer. Il résulte principalement de la dégradation des protéines par l'action des bactéries ou enzymes présents dans la chair des poissons. Son dosage reste l'une des méthodes les plus anciennement utilisées dans ce domaine. Il permet de déterminer la teneur totale en azote des bases azotées volatiles (NH3, DMA, TMA et R-NH2) résultant de la dégradation des composés azotés protéiques et non protéique du poisson. (Schéma 1)

La DMA et la TMA sont produites à partir de l'oxyde de triméthylamine (OTMA) dont la teneur varie d'une espèce à une autre. Les transformations de TMA génèrent les mauvaises odeurs et celles de la DMA en présence du formaldéhyde (un polluant ubiquiste des écosystèmes naturels) conduisent au durcissement de la chair du poisson.

Après l'extraction des protéines d'un échantillon du poisson (100 g de chair prélevée dans trois endroits différents du corps) à l'acide perchlorique (HClO4), l'extrait obtenu subit une distillation suivie d'une neutralisation de l'ABVT (essentiellement des bases volatiles) via l'acide chlorhydrique. Afin d'alléger le manuscrit, nous avons opter de présenter le mode opératoire sous formes des points suivants :

Pour garantir la fiabilité et la répétabilité des résultats, tous les produits chimiques que nous avons utilisé sont d'une pureté analytique (HPLC grade): les solutions sont préparées dans de l'eau déminéralisée ; une attention particulière a été réservée à la préparations des réactifs (acide perchlorique (HClO4, 0,6 mg. L^-1), soude caustique 2 g. L^-1 et une solution standard d'HCl (0,05 N)) dans le but de minimiser les sources d'incertitudes. Dans notre cas, un appareil de distillation automatique est utilisé et par conséquent le titrage est réalisé à l'aide d'une solution standard d'HCl (0,01 N). (Schéma 2)

Après avoir hacher soigneusement l'échantillon à analyser, on pèse 10 g qui sont broyés dans récipient approprié puis mélangés à 90 ml de solution d'acide perchlorique (0,6 mg. L^-1). Un mélangeur rapide assure l'homogénéisation de la solution obtenue. L'extrait ainsi obtenu, après filtration, est parfois conservés pendant 7 jours à une température comprise entre 2 et 6 °C. Une quantité de 50 ml de l'extrait obtenu est ensuite placée dans un appareil de distillation à la vapeur. On vérifie l'alcalinisation du milieu par l'ajout de quelques gouttes de phénophtaléine. Avant de démarrer le processus de distillation, quelques gouttes d'agent anti-moussant à base de silicone et un volume de 6,5 ml de soude caustique (2 g. L^-1) sont introduits dans le milieu réactionnel. Après mélange, NaOH neutralise le HClO4, selon l'équation :

Il y a un excès de NaOH et cela libère les amines en solution, selon la réaction:

La distillation à la vapeur est ajustée de façon à produire 100 ml de distillat au bout de 10 minutes. Les bases volatiles entraînées sont recueillies dans une solution d'acide borique (100 ml à 0,3 g. L^-1) en présence d'indicateur de Tachiro.

Les amines volatiles contenues dans la solution d'acide borique sont ensuite titrées par une solution étalon d'HCl (0,01 N). Un essai à blanc est toujours effectué dans les mêmes conditions que l'échantillon.

La teneur en ABVT par titrage de la solution d'acide borique contenue dans le récepteur est déterminée à partir de l'équation :

V2 = volume en ml d'HCl 0,01 N pou neutraliser le blanc. m = masse de l'échantillon en g.

L'histamine est une amine provenant de la dégradation de l'histidine (acide aminé présent à forte dose dans certains poissons) par décarboxylation. Sa présence, à des teneurs supérieures à 10 mg/100g dans des poissons, est susceptible de provoquer des phénomènes d'intoxication. La formation d'histamine est très rapide lorsque les conditions de température, de pH et de la salinité sont favorables.

Le principe du dosage de l'histamine consiste à solubiliser cette amine dans de l'acide trichloracétique (TCA) suivie d'une séparation sur une colonne chromatographique échangeuse d'ions. L'éluant obtenu est complexé avec l'orthophtalaldéhyde (OPA) comme agent dérivatisant pour former un dérivé flourophore (His-OPA), facilement détectable par fluorimétrie aux longueurs d'onde d'émission et d'excitation respectives de 450 et 360 nm,

En vue d'être dans les conditions réelles de l'extrait d'histamine des produits halieutiques, la solution mère d'histamine 1000 ppm est préparée dans HCl (0,1 N) : 1 g d'histamine est placé dans une fiole jaugée (1 L). Les solutions filles 10 Òg/ml (10 ppm) sont ensuite préparées à partir de la solution mère.

Le dérivé fluorescent est formé classiquement dans une série de fiole à partir des volumes d'histamine _(vHis) et d'OPA (v (OPA)).

Après avoir hacher soigneusement l'échantillon représentatif de poisson, 10 g de la masse broyée sont placés dans un récipient auquel 90 ml de solution d'acide trichloracétique (10%) sont ajoutés. L'homogénéisation du mélange est réalisée via un mixeur rapide. Une aliquote de 0,2 ml de l'extrait obtenu après filtration, est ajoutée à 20 ml d'une solution tampon (acétate de sodium + acide acétique) de pH = 4,6. Ce mélange est ensuite chromatographie via une colonne remplie de résine échangeuse d'ions selon le mode suivant : (i) l'addition de 30 ml du tampon comme phase mobile, (ii) l'élimination des substances non fixées est réalisée par l'ajout de 100 ml du tampon.

Ensuite, les amines retenues par la résine, sont élués par l'ajout de 20 ml (HCl, 0,2 N). Comme pour les autres méthodes, un blanc traité exactement dans des conditions similaires que l'échantillon est toujours préparé.

Une fois l'histamine élué, elle est récupérée dans un bêcher, 2 ml de l'éluât sont prélevés et ajoutées au mélange dérivatisant préalablement préparé (1 ml de NaOH (1 N) , 100 uL de l'OPA à 0,1 g. L^-1).

Comme nous l'avons déjà mentionné, le complexe fluorescent est relativement instable en milieu basique, c'est pour cette raison, on ajoute 2 ml d'HCl (0,7 N) pour le stabiliser.

La Solution mère d'histamine à 1 g/litre. Dans une fiole jaugée d'un litre son introduite 1,673 g d'histamine, 2 mL d'HCl et compléter au trait de jauge avec HCl 0,1 N. Solution fille 10 Òg/ml (10 ppm). Introduire 1 ml de la solution mère dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au trait de jauge par l'HCl 0,2 N.

Numéro de l'étalon	Volume à prélever de la solution fille (10 ppm) en ml, *	Concentration de l'étalon en (ppm)
1	0,22	0,022
2	0,5	0,05
3	0,8	0,08
4	1	0,1
5	1,33	0,133
6	1,8	0,18
7	2	0,2

Le fluorimètre est étalonné si le coefficient de corrélation de la régression linéaire est supérieur à 0,75 (R² > 0,75). Un exemple de valeurs utilisées pour établir la droite de calibration est consigné dans le tableau 4. La figure 3 illustre la droite d'étalonnage obtenue.

Numéro de l'étalon	Concentration de l'étalon en (ppm)	Fluorescence correspondante
1	0,022	20 #177; 9
2	0,05	45 #177; 3
3	0,08	70 #177; 13
4	0,1	90 #177; 10
5	0,133	120 #177; 2
6	0,18	160 #177; 6
7	0,2	180 #177; 12

Figure 3 : Droite d'étalonnage représentant l'intensité du fluorescence
en fonction de la concentration (ppm), la pente est de 895,65, et R² = 0,9997

Trilogy Turner est un instrument de laboratoire compact pour la fabrication de fluorescence, les conditions de travail sont :

Le noircissement des crevettes est causé par une réaction chimique d'oxydation des constituants de la carapace (tyrosine notamment), similaire à la réaction qui prend place lors du bronzage suite à l'exposition au soleil.

La mélanine, responsable du noircissement se forme sous l'action de la tyrosinase contenue dans le sang qui oxyde la tyrosine libre existant dans les tissus soit à l'état naturel, soit après hydrolyse bactérienne.

La tyrosinase est connue pour oxyder directement l'orthodihydroxyphénol (DOPA). Les quinones résultant de cette oxydation se polymérisent pour donner des pigments dont la couleur varie avec la nature du substrat (IFREMER a, 1991).

Schéma 3 : des réactions chimiques impliquées lors du phénomène de noircissement.

II.3.2 Détermination du dioxyde de soufre par la méthode de Monier-Williams modifiée

Cette méthode décrite le dosage de SO2 total dans les crevettes ou tout autre produit de la mer. Il se base sur l'entraînement, par un courant d'azote, du dioxyde de soufre extrait du produit acidifié et chauffé, sa fixation et son oxydation par barbotage dans une solution neutre

diluée de peroxyde d'hydrogène puis le dosage de l'H2SO4 formé par une solution titrée de NaOH. (Norme AFNOR VO3- Mai 1975).

Pour assurer la répétabilité des résultats, tous les réactifs que nous avons utilisés sont d'une pureté analytique reconnue. Les solutions sont préparées dans de l'eau déminéralisée.

La figure 4 illustre le schema du montage utilisé pour la distillation et le dosage de SO2 dans les crevettes : (A) ballon rodé, (B) réfrigérant, (C) ampoule d'incubation d'HCl, (D) ampoule à barbotage.

Avec une précision de 0,01 g, on pèse entre 10 g et 100 g de l'échantillon qui est broyés dans un récipient approprié puis mélangés à 100 ml d'eau avant d'introduire l'ensemble dans le ballon (A), pour favorise la réaction ci-dessous :

On place dans l'ampoule (C) 50 ml de solution d'acide chlorhydrique à 100 g.L^-1, ensuite on mets dans le barboteur (D) 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène à 3 % plus 0.1 ml d'indicateur coloré (bleu de bromophénol), la solution de peroxyde d'hydrogène est neutralisé par la solution d'hydroxyde de sodium 0,01 N. La circulation est fait par un courant d'azote pour chasser l'air contenu dans le ballon et dans l'ensemble du dispositif. On verse dans le ballon (A) la solution diluée d'acide chlorhydrique contenue dans l'ampoule (C) et on porte lentement le contenu du ballon à ébullition qui est maintenue tout en faisant circuler régulièrement l'azote à raison d'une à deux bulles par seconde.

En général, le dioxyde de soufre est entraîné en 15 minutes, mais il est quelquefois nécessaire de prolonger davantage l'opération d'entraînement par la réaction suivant :

On peut vérifier si l'entraînement du dioxyde de soufre a été total en remplaçant le barboteur par un autre contenant une nouvelle charge de 3 ml de solution de peroxyde d'hydrogène neutralisée. Le SO2 piéger dans la solution de peroxyde d'hydrogène est ensuite titrées par une solution étalon NaOH (0,1 N). Effectuer deux déterminations sur le même échantillon pour essai.

La teneur en dioxyde de soufre, exprimée en milligrammes par kg d'échantillon (ppm) est égale à :

Figure 4 : Appareil utilisé pour la distillation et le dosage de SO2, (A) ballon rodé, (B) réfrigérant, (C) ampoule d'incubation d'HCl, (D) ampoule à barbotage.

Chapitre III

En milieu basique, l'histamine réagi avec l'OPA, pour conduire à la formation du produit (A) qui subit un réarrangement pour former le produit (B). Par élimination d'un proton on obtient le produit (C). En milieu acide on aura élimination de deux molécules d'eau par attaque nucléophile de l'azote primaire d'une part, et d'autre part la desaromatisation du benzyle pour aboutir au produit (D) qui se condense avec une 2^éme molécule d'OPA. Ce qui nous permet d'obtenir le complexe His-OPA.

Le mécanisme de complexation de l'histamine avec OPA (orthophthalaldéhyde) en milieu basique est schématisé ci-dessous.

Les analyses effectuées lors de ce stage ont été choisies selon des critères bien définis à savoir le taux de consommation et le lieu de pêche. Les poissons ainsi analysés sont les plus consommés à l'échelle nationale et internationale, ils sont tous pêchés localement (port d'Agadir) (ONDEP, 2003. Maroc) et analysés dans leur états frais.

Ces analyses ont portées d'une part sur la détermination de la teneur en histamine et le taux en ABVT pour le cas des sardines, des maquereaux, des anchois et du merlan (analyse type 1), et d'autre part sur le contrôle en sulfites via le taux en SO2 et l'ABVT dans le cas des crevettes largement répondus au Maroc (analyse type 2).

Afin d'alléger ce manuscrit, nous avons opté de représenter l'ensemble de nos résultats sous forme de tableaux et les comparer aux valeurs recommandées par l'Union Européen (Deux directives 91/492/CEE et 91/493/CEE).

III.2.1.Analyse type 1 :

Le tableau 5 regroupe l'ensemble de nos valeurs obtenus et analysés à différentes dates sous les mêmes conditions.

Tableau 5 : Récapitulatif des analyses effectuées sur cinq espèces halieutiques.

* en ppm (mg/kg chair), ** : mg/100g de chair, un échantillon : 500 g de chacune des espèces

N° échantillons	Espèces	Histamine *	Limites *	ABVT **	Limites**
1	Sardine	23	= 50	14,0	~ 25-30 (CE n° 95/149)
	Anchois	22		12,6
	Maquereau	17		16,8
	Merlan	14		21,0
2	Sardine	33,7	= 50	42,0
	Anchois	26,2		28,0
	Maquereau	22		26,6
	Merlan	27		35,0
3	Sardine	15	= 50	19,6
	Anchois	18		21
	Maquereau	19		24
	Merlan	15		22,5
	Chinchard	18		22,6
4	Sardine	23	= 50	16,7
	Anchois	20		23,5
	Maquereau	18,6		20,8
	Merlan	15		25,2
	Chinchard	14		18,5

III.2.2. Analyse type 2 :

Le tableau 6 présente les valeurs concernant l'ABVT et le taux en sulfites dans les crevettes prélevés en trois lieux différents.

Tableau 6 : Résumé des analyses effectuées sur crevettes dans trois sites commerciaux * (en gramme), ** en mg N/100 g chair; *** ppm de SO2

Lieu de prélèvement	Masse des crevettes *	Teneur en SO2, ***	limites	ABVT **	limites
Centre Commercial Marjane	60,47	343,97	Directive 91/493/CEE	50,40	Décision CE N°95/149
	60,45	333,50
Marche Bensergao	60,75	684,77		65,52
	62,00	722,58
Marché central Al Massira	60,00	1146,66		108,36
	60,87	1146,04

III. 3. Interprétation des résultats

Au vu des résultats concernant l'analyse type 1, on peut remarquer que les valeurs des taux de l'ABVT et de l'histamine pour l'ensemble des échantillons restent largement en deçà des normes fixées par les organismes internationaux. Par conséquent, ces produits de pêche sont déclarés de bonne qualité.

Comme il a été signalé auparavant, les poissons sont analysés dans leur état frais sans subir aucun processus de glaçage. Ce dernier constitue en fait un moyen efficace pour fixer la teneur en histamine d'une part et faire diminuer encore plus bas celui de l'ABVT d'autre part et ainsi garder la fraîcheur des poissons pour une période encore plus longue (Taylor, 1986).

Au regard des résultats issus des analyses type 2, deux remarques principales peuvent être dégagées :

- Pour tous les échantillons analysés, le taux des bisulfites dépasse largement la limite permise,

- A l'exception de la première valeur, les valeurs en ABVT sont trop élevées et dépassent également les normes recommandées,

Selon ces résultats, les méthodes de traitement sont certainement réalisées d'une façon incorrecte. Signalons ici que la première valeur est obtenue pour le seul échantillon (pour l'ABVT) issu du Centre Commercial Marjane Founty (Agadir).

Pour les processus de traitement, nous recommandons une formation professionnelle des pêcheurs en matière d'utilisation des additifs, une sensibilisation ciblée sur les dysfonctionnements que peuvent engendrées les bisulfites sur le plan sanitaire, multiplier les systèmes de contrôle et les fréquences de contrôles des quantités des aditifs, unifier l'application des dispositions réglementaires et imposer la possession d'une traçabilité concernant la quantité de ces aditifs utilisées par rapport au tonnage de la production.

Conclusion

Conclusion générale

Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans le cadre de master de Chimie de la Faculté des Sciences d'Agadir ; Son objectif principal est de faire des analyse physicochimiques dans le domaine de l'agro-alimentaire ; il s'agit de l'évaluation de trois paramètres les plus déterminants de la qualité des produits halieutiques à savoir : l'ABVT, l'Histamine et le taux des bisulfites. Elles sont toutes effectuées dans le cadre des collaborations bilatérales entre l'Université Ibn Zohr et les laboratoires CIBEL et LRARVA.

Dans un premier temps, notre travail est orienté vers le mécanisme de la réaction de dérivatisation de l'histamine par OPA puisque c'est une étape qui n'est pas encore bien établie. Nous avons donc proposé un nouveau mécanisme qui apporterait certainement des informations capitales pour comprendre et résoudre les nombreuses insuffisances souvent observées lors du dosage de l'Histamine via sa dérivatisation par OPA.

Dans un deuxième temps, nous avons effectué des analyses de l'ABVT et Histamine pour 5 échantillons des marchés locaux de la ville d'Agadir. Pour l'histamine, les analyses d'échantillons ont permis de détecter des teneurs en histamine comprises entre 14 - 34 ppm. Ces valeurs sont largement en dessous du seuil de tolérance en histamine dans les produits halieutiques et leurs dérivés (100 à 200 ppm, selon la nature de l'échantillon et selon la législation des Etats).

Pour l'ABVT, à l'exception pour deux cas (sardine, merlan), toutes les valeurs obtenues ne dépassent pas les seuils autorisés.

Quant aux analyses réalisées sur les crevettes prévenant des différents lieux, les conclusions pouvant être dégagées sont :

- Pour l'ABVT : A l'exception de la première valeur, les valeurs en ABVT sont trop élevées, alors que celles de bisulfites présentent des non-conformités, ceci pourrait être expliqué par la façon dont les processus de traitement ont été réalisés.

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Annexe

	528	20	40	10
		20	40	11
		20	43	65
Fax : 212	528	20	40	80
		20	52	40

Nous soussignes, Societe CIBEL departement Oued Souss Conserves, sise a Agadir, Quartier Industriel Anza B.P. 135 attestons, par la presente que :

A bien effectuer un stage dans le laboratoire pendant la periode allant de 15/03/2009 au 15/04/2009.

Durant cette periode l'interesse a montre son dynamisme, son serieux et sa ponctualite.

En foi de quoi, nous lui delivrons cette attestation pour servir et valoir ce que de

Attijari Wafa bank : Cpte N' : 007 010 0000 00 1842 000 333 66
Banque Populaire Centre - Sud ( B.P.A ) Cpte : 101 010 21211 5089758 0000 88

ROYAUME _DU MAROC -,:, ",,,,,.

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MINISTERE DE L'AGRICULTURE -c

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DIRECTION DE L'ELEVAGE⁶t.. ...

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Je soussigne, Directeur du Laboratoire Regional d'Analyses et ( Recherche Veterinaire d'Agadir atteste, par la presente, que Monsiet Noureddine EL BARAXA, C.I.N. JC 404111, licencie es Sciences, filler Sciences de Ia matiere Chimie a la Faculte des Sciences d'Agadir, a effectue t stage de fin d'etude de Master a Ia Section de Chimie du 05/04 au 22/06/09.

Cette attestation est delivree a l'interesse, a sa demande, pour servir valoir ce que de droit.