Memoire Online - Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

ECOLE NATIONALE D'INGENIEURS DES TECHNIQUES DES INDUSTRIES AGRICOLES ET ALIMENTAIRES DE NANTES (ENITIAA)

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

Stage effectué au Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l'ENITIAA de Nantes

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

Stage réalisé au Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de l'ENITIAA de Nantes

Je tiens tout d'abord à remercier Monsieur le Professeur Hervé PREVOST, responsable du laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle (LMAI) de l'ENITIAA, de m'avoir accueilli au sein de son unité.

Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Xavier DOUSSET pour son encadrement scientifique et les conseils prodigués tout au long de mon stage.

Je remercie également Monsieur Bernard ONNO pour son encadrement scientifique, sa persévérance et sa contribution à la réalisation de ce travail.

J'adresse ma vive reconnaissance à Angélique FOURRIER « Technicienne » du laboratoire pour m'avoir, initié aux techniques de biologie moléculaire et pour ses précieuses valeurs humaines. Je la remercie également pour sa patience, sa bonne humeur et sa joie de vivre.

J'exprime ma gratitude à Maria IGNATOVA et à Zouheir BEN BELGACHEM « Thésards » à l'ENITIAA pour leur collaboration et leur disponibilité au cours de ce travail.

Je remercie conjointement tous les stagiaires et thésards du laboratoire en particulier : Morgan, Ségolène, Emmanuel, Sébastien et Stella pour leur conseils et surtout pour leur accueil qui a rendu mon séjour très agréable à l'ENITIAA.

Enfin, je n'oublie pas de remercier les enseignants chercheurs ainsi que le personnel du laboratoire pour leur soutien, leur disponibilité et leur gentillesse.

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques de levains de panification

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques 5

IV.2. Milieux de dénombrement, d'isolement et d'identification des bactéries 12

Le pain est un aliment de base dans de nombreuses sociétés humaines. Il est fabriqué à partir de farine, de levure ou levain et d'eau. Ce qui caractérise le pain, c'est le fait que la pâte est soumise à un gonflement dû à la fermentation. La farine provient principalement de céréales panifiables : blé et seigle. En effet, celle-ci se caractérise par la présence d'une protéine, le gluten, qui emprisonne les bulles de gaz carbonique dégagées par la fermentation et permet la levée de la pâte.

Le premier pain produit par l'humanité était vraisemblablement un pain au levain résultat d'une fermentation mixte levures-bactéries lactiques. Ce procédé traditionnel de panification s'est perpétué jusqu'à ce jour, malgré la place prépondérante occupée par la levure de boulangerie.

Les industries des produits céréaliers fermentés (panification, viennoiserie, crackers, boissons aux céréales) ont actuellement un regain d'intérêt pour les fermentations mixtes-bactéries lactiques, sur le modèle levain naturel dans le but d'améliorer les qualités aromatiques, organoleptiques, nutritionnelles et bioconservatrices des aliments.

La maîtrise de ce procédé de fermentation mixte s'appuie d'une part sur l'étude de la biodiversité microbienne des levains et d'autre part sur la caractérisation des flores, notamment, lactiques à l'aide de méthodes d'identification biomoléculaires.

La région intergénique ITS qui sépare les gènes ribosomiques codant pour l'ARNr 16S et 23S de l'opéron ribosomique met en évidence un polymorphisme de taille et de séquence suffisant pour permettre l'identification et la différenciation des genres, des espèces bactériennes et éventuellement des souches d'une même espèce.

Ce projet a d'abord pour objectif : d'une part de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces de Lactobacillus et d'autre part de valider les méthodes moléculaires de caractérisation des flores lactiques par amplification et restriction enzymatique des régions intergéniques 16S-23S sur des échantillons de levains.

Ces études concernant la caractérisation moléculaire des levains de panification se réalisent au sein du laboratoire de Microbiologie alimentaire et industrielle de l'Ecole Nationale d'Ingénieurs des Techniques des Industries Agricoles et Alimentaires (ENIT IAA) à Nantes.

I. Généralités

Quatrième producteur de blé au monde, la France est un pays de tradition boulangère. Pourtant la consommation de pain en France n'a cessé de chuter depuis la moitié du 20^èmesiècle. Les modifications du mode de vie et le développement des techniques de réfrigération favorisant la consommation d'autres aliments peuvent expliquer cette baisse de popularité.

Dans ce contexte, des efforts sont entrepris, notamment par le secteur artisanal, pour améliorer la qualité des produits et pour diversifier l'offre. Les fermentations longues sont un des moyens pour atteindre cet objectif. La fermentation au levain pourrait, dans ce cadre, connaître un nouvel essor du fait des caractéristiques organoleptiques des produits obtenus par ce procédé.

II. La définition d'un « levain » de panification

Il s'agit à la base, d'un mélange de farine de blé ou de seigle, du sel et de l'eau potable soumis à une fermentation lente (24 à 48 h) initiée par des levures et des bactéries lactiques contenues dans la farine (Vogel et al., 1999). C'est le levain chef. Il est utilisé comme inoculum pour la fabrication du pain. Le développement et l'activité des levains sont maintenus par une incorporation périodique et répétée de farine et d'eau à la température ambiante entre 20 et 35°C. Cette opération s'appelle le rafraîchi. Ainsi, les microorganismes continuent à produire des acides. Le levain suffisamment actif, prêt à être incorporé dans le pétrissée est appelé « levain tout point ». (Onno et Roussel 1994).

Pratiquement, une classification en trois types de fermentations a été proposée par des chercheurs allemands:

Le type I : avec des levains maintenus par une inoculation répétée à la température ambiante (20-30°C) selon les procédés traditionnels (rafraîchi) où les microorganismes montrent une activité métabolique accrue, le type II : levains avec une période longue et des températures élevées de fermentation (plus de 5 jours) et une teneur en eau plus élevée, principalement, utilisée dans les procédés industriels pour l'acidification des pâtes et le type III: levains qui sont initiées par des cultures starters définies généralement utilisées comme suppléments pour augmenter l'acidité et améliorer les propriétés aromatiques. Dans ce type les levains sont généralement déshydratés et sont obtenus par séchage des levains naturels. Ces levains ont une activité bactérienne assez faible (Vogel et al., 1999 ).

Un levain peut être préparé à partir des bactéries lactiques sélectionnées, seules ou en mélange avec des levures, permettant d'ensemencer une pâte en vue de l'élaboration rapide d'un levain Dans ce cadre, on distingue deux types de ferments: les levains liquides et les starters lyophilisés. (Brochoire et al., 1996)

III. Les microorganismes des levains de panification

Un levain naturel de panification est constitué d'un équilibre entre les bactéries lactiques et les levures avec un ratio moyen de 10⁹/ 10⁷UFC/g respectivement. Ce sont les bactéries lactiques qui dominent dans les pains aux levains (Gobbetti et al., 2005). Ces germes préexistants dans la farine sont également apportés par l'air ambiant et le milieu du travail (Brochoire et al ., 1996).

III.1: Les levures

L'espèce la plus connue en boulangerie est Saccharomyces cerevisiae. Au cours de la fermentation, la levure produit du gaz carbonique, de l'alcool et d'autres composés. Le gaz carbonique va permettre la levée de la pâte et modifier ses propriétés physiques. Dans le cas du levain, la microflore levurienne n'est pas uniquement composée de Saccharomyces

Levains étudiés	Bactéries lactiques		Levures	Auteurs
Levains étudiés	Homofermentaires	Hétérofermentaires	Levures	Auteurs
Levains français et marocains	Lb plantarum Lb delbrueckii Pc pentosaceus Lc lactis subsp. lactis Lb sakei Lb curvatus	Lb brevis Lb brevis subsp. lindneri Ln mesenteroïdes Ln mesenteroïdes subsp. dextranicum Ln citreum	Non identifiées	Bervas, 1991
Levains français	Lb plantarum Lb casei Lb delbrueckii sp. Pediococcus	Lb brevis Lb sanfranciscensis Lb fermentum Lb buchneri Lb fructivorans	Saccharomyces Candida Torulopsis	Larpent, 1992
Levains italiens	Lb plantarum Lb farciminis	Lb brevis subp. lindneri	S.cerevisiae C.krusei S.exiguus H.anomala	Gobetti et al., 1996
Levains allemands	Lb crispatus Lb delbrueckii sp.	Lb brevis Lb sanfranciscensis Lb fermentum Lb fructivorans Lb pontis	Non identifiées	Vogel et al., 1999
Levains allemands	Lb amylovorus Lb delbrueckii sp. Lb acidophilus Lc lactis	Lb brevis Lb sanfranciscensis Lb fermentum Lb fructivorans Lb pontis Lb panis	Non identifiées	Vogel et al., 1999
Levains italiens	Lb plantarum Lb alimentarius Lb acidophilus Lb delbrueckii subsp. delbrueckii Lc lactis	Lb brevis Lb sanfranciscensis Lb fermentum Ln citreum Weissella confusa	S.cerevisiae C.krusei S.exiguus	Corsetti et al., 2001
Levains français	Lb plantarum Pc pentosaceus	Lb brevis Lb sanfranciscensis Lb buchneri	S.cerevisiae S.exiguus C.tropicalis C.holmii C.krusei	Roussel et Chiron, 2002
Levains grecs	Lb paralimentarius	Lb brevis Lb sanfranciscensis Weissella cibaria	Non identifiées	De Vuyst et al., 2002
Levains allemands	Lb crispatus Lb johnsonii	Lb mindensis Lb sanfranciscensis Lb fermentum Lb frumenti Lb reuteri Lb pontis Lb panis	Non identifiées	Meroth et al., 2003

Lb: Lactobacillus, Lc: Lactococcus, Ln: Leuconostoc, Pc: Pedioc occus, S:Saccharomyces, C:Candida, H: Hansenula, Sp: species

cerevisiae mais par une combinaison entre des espèces sauvages comme Candida milleri, Candida krusei et Saccharomyces exiguus (Corsetti et al., 2001). Meroth et al., 2003 ont inventorié 23 espèces de levures présentes dans les levains étudiés.

La caractérisation des levures des levains a été précisée par les techniques biomoléculaires. La RFLP de l'ADN mitochondrial a montré son intérêt pour la détection des populations appartenant au genre Saccharomyces ou à d'autres espèces. Par ailleurs, le polymorphisme de la séquence intergénique Ä (de l'ADN mitochondrial) amplifiée permet l'identification des souches de S. cerevisiae.

D'autres méthodes d'identification et de suivi dynamique de la population des levures par PCR-DGGE ont été décrites par Meroth et al., en 2003 .

III. 2: Les bactéries lactiques

La caractéristique qui fait l'unité de ce groupe bactérien est la production de l'acide lactique à partir de différents substrats carbonés. En dehors de ce point commun, les nombreux genres et espèces qui constituent ce groupe présentent une grande diversité de caractéristiques morphologiques et physiologiques. Cela se traduit par l'existence au sein des espèces de nombreuses souches possédant des propriétés technologiques différentes. (Desmazeaud 1998).

Ce sont des cellules vivantes, procaryotes et hétérotrophes dont les caractéristiques sont les suivantes: bacilles ou coques gram positif, généralement immobiles, asporulées, aérotolérants, chimiotrophes et ne possèdent ni catalase, ni nitrate-réductase et ni cytochrome oxydase (Stiles et al., 1997 ). Le genre le plus fréquemment isolé des levains est le genre Lactobacillus.

Les lactobacilles sont présent naturellement dans la nature et sont rarement pathogènes. Ce sont des cellules allongées, régulières en forme de bâtonnets ou coccobacilles isolés ou en chaînettes de taille variable, asporogènes, immobiles ou mobiles grâce à des flagelles péritriches, anaérobies facultatifs. Leurs exigences nutritionnelles complexes et leurs températures de croissance (2 à 53°C) sont très variables d'une espèce à l'autre mais elles sont toutes acidophiles avec un pH optimal de croissance de 5,5 a 6,2. Leurs GC% sont de 36 à 47. Leur mode de fermentation est à la base de la subdivision en trois groupes.

-Groupe I: forme de lactobacilles homofermentaires stricts qui ne fermentent que les hexoses par la voie d'Embden-Meyerhof en produisant presque exclusivement du lactate. Ce groupe comprend notamment Lb. acidophilus, Lb. farciminis, Lb. johnsonii, Lb. amylovorus, Lb. paralimentarius (Cai et al., 1999), Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus (Torriani et al., 1999), Lb. nantensis (Valcheva et al., 2006).

-Groupe II: renferme les lactobacilles homo-hétérofermentaires facultatifs qui fermentent les hexoses mais aussi les pentoses en lactate et acétate par la voie d'Embden-Meyerhof. Il s'agit en particulier de Lb. alimentarius, Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. graminis, Lb. paracasei, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei (Stiles et al., 1997). Ces espèces bactériennes sont présentes dans les végétaux fermentés comme l'ensilage et dans les produits carnés et laitiers fermentés.

-Groupe III: forme de lactobacilles hétérofermentaires stricts qui fermentent les hexoses en lactate, acétate (ou éthanol) et CO₂. Les pentoses aussi sont fermentés en lactate et en acétate. Ces Lactobacillus ont un faible pouvoir acidifiant et produisent des substances aromatiques. Il s'agit notamment de Lb. brevis, Lb.buchneri, Lb. fermentum, Lb.hilgardii, Lb.fructivorans, Lb.panis (Wiese et al., 1996) , Lb.pontis, Lb. reuteri, Lb.hammesii (Valcheva et al., 2005), Lb. sanfranciscensis, Lb. spicheri, Lb. kimchii et Lb. frumenti (Müller et al., 2000). Ces espèces se retrouvent dans les levains de panification et les produits laitiers fermentés (Oheix 2003).

La flore bactérienne peut se classer en deux types selon l'âge des levains: la flore des levains jeunes est hétérogène, surtout homofermentaire et d'une minorité hétérofermentaire et la flore des levains plus âgés devient majoritairement hétérofermentaire. Elle comprend en majorité Lb. brevis et Lb. sanfranciscensis (86 à 95 % de la flore totale) (Spicher 1987).

Parmi les effets bénéfiques des levains de panification sur la qualité du pain citons: le retard du rassissement, l'augmentation de l'acidité, la protection contre les moisissures, l'abaissement de l'index glycémique et l'amélioration du flaveur et de la texture (De Vuyst et al., 2002).

La dégradation des protéines est due, soit à l'activité protéolytique bactérienne, soit à l'activation des protéases de la farine en milieu acide. Les bactéries lactiques provoquent une augmentation des protéines solubles dans la pâte et l'apparition de peptides et d'acides aminés qui outre le fait qu'ils stimulent la croissance des microorganismes, interviennent dans la formation de certains composés aromatiques. Par ailleurs, le pH optimal des protéases de la farine étant voisin de 4, l'acidification de la pâte favorise leur activation et la production des acides aminés à partir du gluten (Onno et Roussel 1994). La dégradation du gluten affecte les caractéristiques rhéologiques des pâtes et la texture du pain. Les études ont montré que l'acidification par les acides lactique et acétique change complètement les caractéristiques rhéologiques durant la fermentation (Thiele et al., 2004) et est à l'origine d'une diminution de viscosité et d'extensibilité. Ce changement est prononcé pour un pH allant de 3,8 a 4,1.

L'activité protéolytique dépend des souches bactériennes. Les travaux de Gobbetti et al., en 1996 ont montré que Lb. sanfranciscensis CB1 isolé du levain naturel a une capacité particulière à dégrader les protéines ou les peptides durant la fermentation.

Les espèces suivantes: Lb. sanfranciscensis, Lb. brevis 14G et les souches CRL 759 et CRL 778 du Lb. alimentarius sont potentiellement capables d'hydrolyser la gliadine, la fraction protéique du gluten responsable de la maladie coeliaque (Gobbetti et al ., 2005; Rollan et al., 2005; Di Cagno et al., 2002).

En panification directe, les levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae sont les seuls agents de fermentation. Les levures jouent un rôle important dans la production du gaz carbonique provenant de la dégradation des glucides qui contribue à la levée de la pâte (Onno et Roussel 1994). Les bactéries lactiques homofermentaires produisent seulement de l'acide lactique. Seules les bactéries lactiques hétérofermentaires produisent du gaz carbonique mais comparativement aux quantités produites par les levures, elles contribuent faiblement à la levée de la pâte (Onno et Roussel 1994). Il a été noté que l'association du Lb. sanfranciscensis avec S. cerevisiae et S. exiguus M14 accroissait la production du gaz carbonique en comparaison avec S. cerevisiae seule (Gobbetti et al., 1997).

Les caractéristiques aromatiques du pain font le sujet de plusieurs investigations et plus de 500 composés volatils ont été signalés dans plusieurs types de pains (Gzerny et Schieberle 2002). L'arôme du pain doit être attribué non pas à un seul composé, mais à un mélange complexe de substances aromatiques, d'origine microbienne et enzymatique.

La qualité aromatique du pain au levain dépend du pH de la pâte et du rapport acide lactique/ acide acétique appelé quotient fermentaire. (Czerny et Schieberle 2002 ; Rohrlich 1953).

La fermentation lactique confère aux produits finis un goût typique du pain au levain, aigrelet par l'acide lactique et plus piquant par l'acide acétique. La quantité de chaque acide produite est variable d'un levain à l'autre. On appelle le quotient fermentaire (QF) le rapport molaire des concentrations en acide lactique et acide acétique. Le QF dépend des conditions de fermentation et des espèces présentent dans le levain ou le starter. Pour le pain de levain de froment (farine de blé tendre) caractéristique du pain Français, les valeurs optimales du quotient fermentaire pour définir un bon arôme n'ont pas été déterminées, mais il est préconisé, à titre indicatif, un rapport compris entre 4 et 10. Le pain allemand, plus riche en acide acétique, a un goût acide plus prononcé que celui du pain français. (Onno et Roussel 1994 ; Roussel et Chiron 2002)

Les bactéries lactiques ont un rôle fondamental dans l'inhibition des flores non lactiques, dont certaines sont préjudiciables à la qualité du pain. Cette action est due à l'abaissement du pH (qui inhibe la croissance de la plupart des germes non lactiques), à la toxicité propre de l'acide lactique, mais aussi à la sécrétion de bactériocines (facteurs bactéricides) et des substances antifongiques (Desmazeaud 1998).

A côté des composés comme les acides organiques, le peroxyde d'hydrogène et le diacétyle, les bactéries lactiques des levains inhibent les germes indésirables en produisant des bactériocines comme la plantaricine libérée par Lb. plantarum ST31, des substances dites bactériocines-like (BLIS) comme le BLISC57 de Lb. sanfranciscensis C57 et des antibiotiques comme la reutericycline produite par Lb. reuteri LTH2584 (Gobbetti et al., 2005 Gobbetti et al., 1997).

Des substances comme l'acide phényllactique et l'acide 4-hydroxy-phényllactique isolées des souches de Lb. plantarum 21B et 20B ont montré une activité inhibitrice contre Aspergillus, Penicillium et Monilia. Par ailleurs, une gamme d'acides organiques tels que les acides:

acétique, formique, caproïque, propionique, butyrique et valérique libérées par Lb. sanfranciscensis CB1, possèdent le même effet contre Aspergillus, Fusarium, Penicillium et Monilia. Ces acides agissent d'une manière synergique (Gobbetti et al., 2005 ; Lavermicocca et al., 2003 ).

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques

Pour l'identification de la population microbienne des levains de panification, des méthodes d'analyses basées sur les critères phénotypiques (physiologique et biochimique) et moléculaires (PCR-RFLP, PCR-RAPD, PCR multiplex, PCR avec primers spécifiques des espèces) ont été utilisées (Settani et al., 2005 ; Randazzo et al., 2005 ; Ehrmann et al., 2003 ; Corsetti et al., 2001, Zavaleta et al., 2001, Müller et al., 2000 ; Zapparoli et al., 1997). Ces méthodes ont permis l'identification de la quasi-totalité des bactéries lactiques dans les pains aux levains (De Vuyst et al., 2002 ; Valcheva et al., 2005). Ces méthodes sont basées sur le principe de la PCR (polymerase chain reaction) ou technique d'amplification utilisant l'ADN-polymérase qui permet d'amplifier in vitro une molécule d'ADN en plusieurs millions de copies.

De même, la variabilité dans la longueur et la séquence de la région intergénique 16S/23S ARNr ou ITS (Internal Transcribed Spacer) rend l'étude de cette région intéressante pour identifier la microflore lactique (Tannock et al., 1999). Les ITS sont constitués d'une part de régions très conservées qui sont les séquences codant pour les gènes ARNt d'isoleucine et ARNt d'alanine mais aussi des régions variables utilisables pour l'identification des espèces (Gürtler et Stanisich 1996).

Figure n°1: Positions des régions conservées de l'opéron ribosomique 16S-23S chez Escherichia coli. Les lignes noires représentent la région ISR qui sépare les ARNr 16S et 23S. Cette région contient les deux gènes d'ARNt (ARNt^Ile et ARNt^Ala) (Gürtler et Stanisich 1996).

Parmi les bactéries, il a été démontré que la structure de l'ITS reste stable dans la limite du genre (Kabadjova et al., 2002 ). Les ITS de Lactobacilles se présentent sous la forme de deux copies différentes, l'un qui comprend les gènes tARN^alaet tARN^ile, et l'autre sans ces séquences codantes ce qui explique qu'on observe deux fragments après une amplification de la région 16S/23S (Nour et al., 1998) . Selon Kabadjova et al., 2002, le genre Carnobacterium possède trois types d'opérons ribosomiques. Les bactéries des genres Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus et Streptococcus possèdent un seul opéron rrn avec une structure dans l'ordre 5'-16S-seq-tAla-seq-3' qui est visualisée par un seul produit de la réaction. (Le Jeune et Lonvaud-Funel 1997).

L'organisation de l'opéron rrn 5'-16S-23S-5S-3' est montrée par la figure suivante :

Figure n°2 : Organisation de la région intergénique 16S-23S de l'ARNr chez les bactéries lactiques. La région intergénique est en vert. S-ISR : petit ISR, M-ISR : moyen ISR, L-ISR : grand ISR. A : groupe de C. divergens, C. mobile, C. funditum, C. alterfunditum, C. inhibens, et C. viridans ; B : groupe de C. piscicola et C. gallinarum

La PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) est une méthode appropriée pour la différenciation des espèces voir les souches des Procaryotes. Dans cette méthode, on compare les profils électrophorétiques de différentes molécules d'ADN digérées par les mêmes enzymes de restriction. On obtient les fragments de restriction. Si les molécules d'ADN que l'on compare sont différentes, leurs sites de restriction le sont aussi; par conséquent, les fragments de restriction obtenus en électrophorèse seront aussi différents (Caillez 2004). La méthode PCR-RFLP de la région ISR a permis l'identification de quatre espèces de Carnobacterium, de certaines souches de Leuconostoc (Rachman et al., 2004 ; Zavaleta et al., 1996) et des bactéries acétiques (Ruiz et al., 2000).

Les endonucléases de restriction souvent utilisées sont signalées dans le tableau suivant:

Tableau n°2: Exemples de quelques enzymes de restriction et leurs séquences de reconnaissance

Enfin, la TTGE (Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis) est une méthode qui utilise une électrophorése en conditions dénaturantes pour détecter la diversité, le suivi dynamique et l'activité des communautés bactériennes dans des différents aliments (Randazzo et al., 2005 ; Meroth et al., 2003 ; Duthoit et al., 2003 ; Ogier et al., 2002, Cocolin et al., 2000, Zoentendal et al., 1998). La TTGE est une forme parallèle de la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), où un gradient de température est appliqué au lieu du gradient chimique. La température est la même quelque soit la position sur le gel mais elle change en fonction du temps. Plusieurs fragments de Tm (melting temperature) différentes peuvent donc être séparés sur le même gel de TTGE. Au cours de l'électrophorèse, l'ADN migre d'abord à l'état double brin, puis rencontre des conditions qui dénaturent le domaine de fusion moins stable de la molécule, formant une structure partiellement simple brin, dite ramifiée. Cette structure est formée grâce à l'utilisation de GC clamp, une séquence de guanines (G) et cytosines (C) de 30 à 50 nucléotides, ajoutée et attachée à l'extrémité 5' d'une de deux amorces utilisées. Cette séquence co-amplifiée et introduite dans les fragments amplifiés empêche la dénaturation complète ; l'ADN double brin ne se transforme donc pas en simple brin. Cette dénaturation partielle entraîne une réduction de la mobilité électrophorétique de sorte que sa position finale dans le gel dépend exclusivement de la température de fusion (Tm) du domaine le moins stable. La révélation des fragments sous UV est réalisée en général en utilisant le SYBR Green I comme colorant (agent intercalant). (Rachman 2004 ; Müyzer et Smalla 1998 ; Vasquez et al., 2001).

Figure n°4: Formation d'un brin d'ADN ramifié grâce à la présence de GC clamp. (Rachman et al., 2004)

Cette technique est utilisée dans le but d'étudier l'écologie microbienne. L'extraction de l'ADN bactérien est effectuée directement à partir de la matrice à analyser. L'ADN bactérien d'une région variable V6-V8 est amplifié par PCR et est ensuite soumis à une électrophorése dénaturante par la température. Les fragments obtenus correspondant aux bactéries recherchées peuvent être récupérés et séquencés afin de confirmer leur identité. La technique TTGE permet donc d'obtenir des empreintes électrophorétiques, donc génétiques d'un écosystème microbien. Cette technique a été appliquée par Meroth et al., 2003 à l'étude de la dynamique des flores lactiques de levain de panification.

I. Souches de référence

Souches	Références	Souches	Références
Lactobacillus acidophilus	DSM 20079	Lactobacillus hilgardii	DSM 20176
Lactobacillus alimentarius	CIP 102986^T	Lactobacillus panis	DSM 6036
Lactobacillus amylovorus	DSM 20531	Lactobacillus paralimentarius	DSM 13238
Lactobacillus brevis	DSM 20556	Lactobacillus plantarum	ATCC 14917
Lactobacillus brevis	DSM 1268	Lactobacillus pontis	DSM 8475
Lactobacillus curvatus	DSM 20019	Lactobacillus reuteri	DSM 20016
Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus	CIP 55.1	Lactobacillus sanfranciscensis	ATCC 43322
Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii	DSM 20074	Lactobacillus sanfranciscensis	CIP 103252^T
Lactobacillus farciminis	DSM 20180	Lactobacillus frumenti	DSM 13145
Lactobacillus fermentum	DSM 20052	Lactobacillus casei	DSM 20011
Lactobacillus mindensis		Lactobacillus kimchii	DSM 13961
Lactobacillus spicheri	DSM 5753

DSMZ:Deutsche Sammlung Von Microorganismen and Zelkulturen GmbH, BRAUNSCHWEIG, GERMANY, CIP: Collection de l'Institut Pasteur, PARIS - FRANCE, ATCC: American Type Culture Collection, ROCKVILLE, MD, USA, ^T: Type strain.

Dans l'objectif d'observer l'influence de la farine utilisée lors du renouvellement du milieu (rafraîchi), deux levains naturels français de panification provenant de la région du pays de la Loire ont été analysés : le levain BF (BioFournil), utilisé par l'entreprise du même nom, avec rafraîchi régulier sur farine témoin type 70 et ce même levain BF après rafraîchi sur la farine du blé concassé. Les analyses ont été effectuées à partir de 10 g de levain de chaque échantillon dilués avec 90 ml d'une solution de Tryptone-sel stérile. La solution sera ensuite homogénéisée à l'aide d'un stomacher (Lab-Blender 400) et utilisée pour toutes les analyses physico-chimiques et microbiologiques.

Après mesure du pH, l'acidité titrable totale (TTA-Total Titrable Acidity) est dosée à l'aide d'une solution de soude N/10 pour 10 ml de la solution initiale du levain. Le volume de soude nécessaire pour atteindre la valeur de pH de 8,5 est mesurée et le résultat est exprimé en ml/NaOH N/10/10 g de levain.

Le dénombrement des levures est effectué sur milieu Sabouraud glucose agar avec du chloramphénicol (Biokar, France). Toutes les boîtes sont ensemencées en surface avec 0,1ml et incubées à 25°C pendant 48 heures en aérobiose.

IV.2. Milieux de dénombrement, d'isolement et d'identification des bactéries lactiques

Le milieu MRS agar modifié (1% de maltose, 0,5% de fructose, 0,5g/l de cystéine et 5 ml d'extrait de levure fraîche) à pH final de 6,2 et le milieu SDB (SourDough Bacteria) sont utilisés pour l'analyse des échantillons et la culture des souches de référence. (Kline et Sugihara 1971).

Les souches ainsi que les isolats sont conservés à -20 °C dans un mélange de bouillon MRS modifié et glycérol à 40% (V/V) pour les bactéries lactiques (Biokar, Beauvais, France).

Après dilutions décimales de la solution mère dans une solution de Tryptone-sel stérile jusqu'à 10^-6.0,1 ml des dilutions 10^-5 et 10^-6seront déposés sur les milieux cités précédemment. Les dénombrements se feront sur les milieux MRS modifié agar et sur SDB agar après 72 heures d'incubation et à 30°C dans des conditions d'anaérobiose (anaerocult). 20 colonies sont isolées du milieu MRS modifié en bouillon pour l'identification des bactéries lactiques.

VI. Caractérisation des bactéries lactiques

L'observation microscopique est nécessaire pour définir la forme des cellules bactériennes (coques ou bacilles). La coloration de Gram des isolats après 72 h de culture sur MRS modifié permet de s'assurer que nous sommes effectivement en présence des bactéries gram positive (coloration violette).

La catalase est une enzyme contenant du fer, elle catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène. Le test de détection de cette enzyme dans une souche bactérienne, consiste à ajouter du peroxyde d'hydrogène aux cellules bactériennes, la présence de la catalase se marque par la formation des bulles de gaz (oxygène).

La souche est cultivée dans un bouillon MRS modifié en bouillon. Le dégagement du gaz carbonique retenu par la cloche de Durham met en évidence le caractère hétérofermentaire.

1 ml de la culture bactérienne en phase exponentielle de croissance est centrifugé à 7500 rpm pendant 10 minutes. Après avoir éliminé le surnageant, le culot bactérien est resuspendu avec 180ul de tampon de lyse (20mM Tris-HCl pH 8 ; 2mM EDTA ; 1,2% Triton X-100 ; 20 mg/ml lysozyme) suivi d'une incubation à 37°C pendant une heure. 25ul de protéinase K et 200ul de tampon AL sont ajoutés pour dégrader toutes les protéines après une incubation à 70°C pendant 30 minutes. Cette étape est suivie par l'addition de 200 ul d'éthanol absolu. Le mélange est ensuite transvasé sur une colonne, puis centrifugé à 8000 rpm pendant une minute. L'éluant est éliminé et l'ADN est récupéré sur une colonne dans un tube de 2 ml à lequel on ajoute 500 ul de tampon AW1. On centrifuge à 800rpm pendant une minute et on jette l'éluant et le tube. De nouveau, l'ADN est récupéré dans un tube de 2 ml à lequel on ajoute 500 ul de tampon AW2. On centrifuge à 15 000 rpm pendant 3 minutes et on jette l'éluant et le tube. On place la colonne sur un tube de 1,5ml et on ajoute cette fois-ci 100 ul de tampon AE directement sur la membrane. On incube à température ambiante pendant une minute et on centrifuge à 8 000 rpm pendant une minute. Cette démarche est renouvelée puis, on jette la colonne et on conserve l'ADN pur extrait à -20°C.

Le but est d'obtenir une concentration d'ADN entre 20 et 100 ng/ul pour chaque échantillon avant de réaliser le PCR. La quantification se fera grâce au spectrophotomètre UVIKON BIOTEK. La concentration d'ADN sera calculée selon la formule suivante:

Les amorces oligonucléotidiques utilisées dans cette étude sont obtenues d'Invitrogen

Code	Localisation	Séquences oligonucléotidiques Primers (5'?3')	T (°C) Hybridation	*Références*
16S/2	16S 1389-1407 de E.coli	CTT GTA CAC ACC GCC CGT C	60°C	Gürttler et Stanisich 1996
23S/10	23S ARNr 456-474 de E.coli	CCT TTC CCT CAC GT ACT G	60°C	Idem
23S/7	23S ARNr 188-208 de E.coli	GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC	60°C	Idem
ARNt^ala	ITS	TAG CTC AGC TGG GAG AGC	60°C	Idem
Ls1		AAGTCGCCCAATTGATTCTTAGT	65°C	Zapparoli et al., 1997
Ls2		TTCACCCTAATCATCTGTCCCA	65°C	Zapparoli et al., 1997
TGGE (L1401)	V6-V8	GCG TGT GTA CAA GAC CC	56°C	Zoetendal et al., 1998
*TGGE* *(U968-GC)*	V6-V8	CGC CCG GGG CGC GCC GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC	56°C	Vasquez et al., 2001 Zoetendal et al., 1998

Le mélange final pour les réactions de PCR a un volume de 25 ul et contient 1x PCR Mix du tampon Taq polymérase sans MgCl_2, 2,5 mM MgCl₂(Biolabs, New England), 1uM pour chaque amorce (Invitrogen), 0,25 mM pour chaque dNTP (Eurogentec), 1U de Taq polymérase (Biolabs, New England) et 20-50ng/ml d'ADN. La réaction du PCR s'effectue dans le thermocycleur PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown MA, USA). L'amplification des ISRs comprend 35 cycles : 1 minute de dénaturation à 94°C, 1 minute d'annealing ou d'hybridation à 60°C et 1 minute d'extension à 72°C.

La composition du mélange PCR et les conditions d'amplifications sont les mêmes que celles qui sont décrites ci-dessus. Cette deuxième réaction d'amplification est faite après l'obtention des résultats de la première amplification (présence de 2 ou 3 fragments).

La composition du mix PCR est la même que précédemment. L'amplification des ISRs comprend 35 cycles avec un changement au niveau de la température d'hybridation des amorces qui est de 65°C.

C'est une méthode rapide et efficace pour la détection et l'identification de la population des levains de panification. Des colonies de diamètre compris entre 1-1,5 mm ont été choisies et mélangées avec 5 ul de l'eau stérile. Cette suspension sera incubée 5 minutes à 95°C. On centrifuge à l'aide d'une micro-centrifugeuse et 1-3,5 ul sont utilisés pour la réaction de PCR. Les conditions d'amplifications sont les mêmes que celles qui sont décrites plus loin et la composition du mélange PCR reste le même à laquelle on ajoute 0,1 x BSA.

Les molécules placées dans un champ électrique migrent vers l'anode. Dans le gel, la mobilité électrophorétique dépend de la taille des molécules et de leur conformation. Les molécules de forme linéaire migrent d'autant plus vite qu'elles sont de petites tailles. Les produits d'amplifications seront séparés sur un gel d'électrophorèse à 1,5% d'agarose dans une solution tampon TAE colorée au BET. La migration se fait sous un voltage de 100V. L'observation de chaque gel se fera sur le transilluminateur à UV grâce à la fluorescence sous UV du complexe ADN-UV. Afin de déterminer la taille de chaque fragment, le marqueur de poids moléculaire 100 pb DNA ladder sera utilisé.

Les produits du PCR avec les primers tRNA^ala- 23S/10 sont digérés par des enzymes de restriction. Les enzymes utilisées sont : HindIII, HinfI et áTaqI (Biolabs). La réaction de enzymatique se réalise avec un volume final de 20 ul contenant 1x du tampon 0,1 x BSA, 10U de l'enzyme et 16 ul du produit du PCR. Les produits de digestion sont séparés sur un gel d'électrophorèse dans 2% (wt/vol) agarose-résophore dans le TBE comme tampon (1x). Les gels sont colorés par 0,5 ug/ml de BET et visualisés sous UV. Les photographies sont prises par une vidéo caméra (Sony, Clichy, France) et sauvegardés. Ils seront analysés par le logiciel Bio Profile 1D⁺⁺(Vilbert Lourmat, Marne La Vallée, France).

L'extraction de l'ADN total bactérien est décrit par Meroth et al., (2002) avec des petites modifications. 10g de levain sont homogénéisés pour 5 minutes par un stomacher dans un sac contenant 90 ml d'une solution de tryptone-sel. Un aliquote (50 ml) est centrifugé à 4°C pour 5 minutes à 100 rpm. Le surnageant est centrifugé pour 15 minutes à 4000 rpm et le culot cellulaire est stocké à -20°C. Le culot est ensuite déposé sur glace et lavé 3 fois par 1 ml d'une solution tampon de phosphate saline et une fois par 1 ml de l'eau. Puis on le resuspend dans 130 ul d'un tapon lyse ( 6 ,5% sucrose, 50mM Tris HCl pH 8, 0,1 mM EDTA, 20 mg/ml lysozyme et 100ug/ml RNase). Après une incubation d'une heure à 37°C, on ajoute 30 ul du NaCl (5M) et le tout est incubé pour 10 minutes à 65°C. Ensuite, on ajoute successivement 20 ul de protéinase K (15mg/ml) et 10 ul de sodium dodécyle sulfate (20%). Le nouveau mélange est incubé pendant 30 minutes à 60°C. Enfin, 200 ul de phénol (65°C, pH =7) ont été ajoutés à la mixture et incubée pour 6 minutes à 60°C. Après le refroidissement sur glace, on procède 2 fois à l'extraction et avec des volumes égales de phénol-chloroforme-isoamyl alcool (25 :24 :1) et 2 fois par du chloroforme. Après la précipitation par de l'éthanol, l'ADN est gardé dans 100ul de Tris-HCl (10 mM, pH =8).

La PCR-TTGE est obtenue en utilisant les deux primers amplifiant les régions variables V6-V8 du gène ARNr. La PCR est effectuée dans un volume total de 50 ul contenant 1x tampon PCR sans le chlorure de magnésium, 2,5 mM MgCl_2,1 ug/ml ADN, 0,3 uM pou chaque primer, 0,25 mM dNTP et 1U de Taq polymérase. On a les mêmes conditions des PCR précédentes. Les produits du PCR sont séparés sur 1,5 % (wt/vol) du gel d'agarose (Eurobio, France) et consécutivement visualisés sous la lumière UV après une coloration par le BET.

10 ul du produit amplifié par PCR sont analysés par la TTGE sur le gel du polyacrylamide (composition et préparation dans l'Annexe 1). L'analyse du TTGE est effectuée en utilisant DCode Universal Mutation Detection System (Bio Rad, Marnes la coquette, France). Le gel du polyacrylamide 16 cm/16cm/1 mm est utilisé avec le tampon 1x TAE (2M tris base, 1M acide acétique glacial, 50mM EDTA). Les gels ont été préparés avec 11 % (wt/vol) de la solution d'acrylamide (acrylamide-bisacrylamide ; 37,5 :1) et une concentration d'urée finale de 9,7M. Pour séparer les bactéries étudiées, les conditions suivantes ont été admises : voltage -55V, température initiale -65,5°C, température finale - 70,5°C, gradient de température 0,2°C/h et le temps de migration est de 18 heures. 10 ul du produit de PCR sont introduites dans les pores. En outre, le gel est coloré pour 15 minutes par le colorant SYBR Green I

(Molecular Probes, Eugene OR, USA) et photographié sur la table disposant d'un transilluminateur à UV.

L'objectif de cette étude est de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces du genre Lactobacillus. Pour cela deux échantillons de levains ont été analysés : BF -70 entretenu sur farine de type 70, et BF-FC rafraîchi sur farine de blé concassé.

L'acidité plus élevée du levain BF-FC peut-être mise en relation avec le taux de cendres supérieur et la quantité plus importante de parties périphériques du grain dans le cas du blé concassé.

Les dénombrements sont effectués sur les milieux MRS modifié agar et SDB agar pour les bactéries lactiques et sur le milieu Sabouraud glucose agar avec chloramphénicol pour la flore levurienne (Tableau n°6).

Tableau n°6: Dénombrement des levures et des bactéries lactiques dans les levains BF

La population bactérienne observée sur SDB agar est plus importante que sur MRS modifié agar. Les colonies sont plus petites sur SDB agar et elles présentent pratiquement la même morphologie. Les populations obtenues ne présentent pas de différences significatives entre les deux levains analysés.

Selon les analyses antérieures sur ce levain, Lb. sanfranciscensis est la flore lactique dominante du levain BF. Le milieu SDB, de part sa composition (pH qui vaut 5,6 et présence d'extrait frais de levure) est favorable à la croissance et au dénombrement cette espèce bactérienne (Kline et Sugihara, 1971). A l'inverse, le milieu MRS m est moins favorable et ne permet pas le dénombrement de la totalité des flores présentes dans le levain.

Les étapes d'identification consistent à réaliser les différents tests phénotypiques comme la coloration de Gram, le test catalase et le test homo-hétérofermentaire.

A partir du milieu MRS m, 20 isolats de chaque échantillon ont été purifiés et soumis à la coloration de Gram et au test catalase. Les 20 isolats provenant de la farine BF-70 sont des bacilles Gram positifs, catalases négatives, 18 sont hétérofermentaires et 2 homofermentaires. Sur la farine concassée, le même travail a été entrepris. Les 20 isolats obtenus sont des bacilles Gram positif, catalase négative et tous sont hétérofermentaires.

L'amplification par PCR avec les amorces 16S/2-23S/7 des 16 isolats hétérofermentaires du BF-70 montre un profil de 3 bandes sur le gel d'agarose. Ce profil correspond à l'espèce Lb. sanfranciscensis type de notre étude. En effet selon Valcheva et al., 2006 la présence de ces 3 fragments est uniquement observée chez Lb. sanfranciscensis alors que toutes les autres espèces de Lactobacillus présentent seulement 2 types d'opérons ribosomiques.

l'amplification des souches de référence utilisées dans cette étude : 1-Lb.

paralimentarius, 2- Lb.spicheri,3-Lb. kimchii, 4-Lb. sanfranciscensis ATCC

Après avoir déterminé de manière probable l'espèce qui domine dans l'échantillon BF-70, nous avons confirmé ce résultat en procédant à l'amplification de la région tRNA^ala-23S/10 par les amorces correspondantes à cette séquence nucléique dans le but de faire ensuite la restriction enzymatique .On observe donc la présence d'un seul fragment d'amplification sur la figure n°8 :

Figure n°8: Amplification par les amorces tRNA^ala-23S/10 (souches : 1,8 et 16)

On observe ainsi que toutes les souches présentent un seul fragment de taille identique de 740 pb environ. L'étape suivante va consister à générer des profils de restriction en utilisant des enzymes permettant de différencier Lb. sanfranciscensis. Les 3 enzymes choisis dans notre étude sont : Hind III, Hinf I et á Taq I.

Pour tous les isolats il génère le même profil connu et caractéristique pour Lb. sanfranciscensis ATCC 44322.

Seul l'enzyme á Taq I donne un profil unique pour cette souche de Lb. sanfranciscensis ATCC 43322. Les tailles des fragments digérés par l'enzyme á Taq I sont les suivantes : 110,140, 160, 310 et 380 pb.

Les autres enzymes génèrent des profils communs à Lb. paralimentarius DSM13238, Lb. alimentarius CIP 102986^T et Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii DSM 20074. Les tailles des fragments des fragments digérés par Hinf I sont : 60, 210 et 470 pb et par Hind III sont : 320 et 420 pb.

La taille des fragments a été obtenue à l'aide du logiciel Bio Profile 1D⁺⁺(Vilbert Lourmat). Lors de cette étude, nous avons pris les valeurs moyennes arrondies de tous les essais par souche et par enzyme de restriction. L'intervalle de confiance estimé à environ 7% pour chaque fragment à l'aide du logiciel Bio 1D⁺⁺.

Pour la confirmation finale des résultats on a choisi de faire la PCR avec des primers spécifiques de Lb. sanfranciscensis (Zapparoli et al., 1997) sur les isolats. Elle permet l'identification définitive de Lb. sanfranciscensis ATCC 43322 pour les isolats étudiés comme le montre la figure n°10 où on oberve un seul fragment de 1460 pb spécifique de cette espèce (Zapparoli et al., 1997) .

On a procédé tout d'abord à l'amplification de la région ITS par les amorces 16S/2-23S/7. Sur 20 isolats, seules 12 souches ont été amplifiées. Les isolats proviennent du milieu MRS modifié.

On recueille un profil de 3 bandes pour toutes les souches étudiées (figure n°11). Lb. sanfranciscensis représenterait encore une fois 100% de la flore lactique de la farine concassée. On procède aux mêmes démarches que celles utilisées pour l'étude de la flore lactique de BF-70.

Après une amplification de la région tRNA^ala-23S/10 et une restriction enzymatique par les enzymes de restriction utilisés pour les isolats du BF-70, on observe sur la figure n°12 pour l'isolat M9 choisi comme exemple que celui-ci comme les autres isolats de ce levain présente un profil de restriction identique à celui de Lb. sanfranciscensis ATCC 44322. .

Figure n°12: PCR t^ala/10 et RFLP par Hinf I, Hind III et á Taq I de l'isolat M9

En outre, pour confirmer que les isolats appartiennent à l'espèce Lb. sanfranciscensis, une PCR avec les amorces spécifiques a été faite. La figure n°13 ci-dessous montre le résultat d'amplification des 3 isolats avec les amorces spécifiques.

Figure n°13 : PCR avec primers spécifiques de l'espèce Lb. sanfranciscensis ATCC 43322

Les approches classiques pour la caractérisation et l'identification des bactéries lactiques des levains prennent beaucoup de travail et du temps.

Dans cette étude, nous avons essayé de développer la PCR sur colonie comme méthode pour la détection rapide de la population des bactéries lactiques. Différents protocoles avec différentes modifications ont été employés. Les petites colonies ont été sélectionnées et inoculées dans 5 ul de l'eau stérile. Ensuite elles seront incubées pendant 5 minutes à 95°C et 2 à 3 ul de la suspension est utilisée pour y être amplifiée. Des modifications au niveau du mix PCR ont été faites.

Cette méthode permet de détecter rapidement la population et le pourcentage de Lb. sanfranciscensis dans l`échantillon de levains. Dans notre cas, la PCR sur colonies a confirmé que ces isolats provenant des deux échantillons appartenaient à l'espèce Lb. sanfranciscensis.

Cette technique est choisie pour étudier le suivi dynamique des communautés bactériennes. Ainsi, chaque communauté est représentée par un profil où chaque bande électrophorétique correspond à une espèce définie. L'identification des espèces se fait grâce à un référentiel préalablement établi à partir de fragments d'ADN de souches pures.

L'extraction d'ADN bactérien est effectuée directement de la matrice à analyser. Dans notre cas on a choisi à amplifier la région V6-V8 du 16S rDNA des deux échantillons.

Le gel ci-dessus montre le profil des échantillons BF. Les fragments correspondent 100 % à Lb. sanfranciscensis ATCC 44322.

Il faut noter que la TTGE ne permet pas d'identifier les populations sous-dominantes, qui peuvent avoir un intérêt.

Ce projet avait pour objectifs : d'une part de montrer l'influence de la matière première mise en oeuvre sur la flore lactique d'un levain et notamment sur la diversité des espèces de Lactobacillus et d'autre part de valider les méthodes moléculaires de caractérisation des flores lactiques. Les principaux résultats obtenus sont les suivants :

- Les populations obtenues ne présentent pas de différences significatives entre les deux levains analysés.

- Les 20 isolats provenant de la farine BF-70 sont des Lactobacillus, 18 d'entre eux sont hétérofermentaires et 2 homofermentaires. Sur la farine concassée, les 20 isolats obtenus sont des Lactobacillus hétérofermentaires.

- L'amplification par PCR avec les amorces 16S/2-23S/7 a mis en évidence la présence de 3 fragments d'amplification et a conduit à l'identfication présumée de Lb. sanfranciscensis pour les 16 isolats hétérofermentaires du BF-70 et les 12 isolats BF-FC .

- L'étape suivante (RFLP) consistant à générer des profils de restriction en utilisant des enzymes Hind III, Hinf I et á Taq I a permis d'identifier spécifiquement Lb. sanfranciscensis et l'enzyme Taq I s'est révélée être la plus discriminante.

- Enfin l'utilisation des des primers spécifiques de Lb. sanfranciscensis (Zapparoli et al., 1997) a permis de conclure que tous les isolats hétérofermentaires appartenaient à l'espèce Lb. sanfranciscensis .

En conclusion, dans les levains de panification réalisées à partir de la farine concassée, la flore lactique semble être constituée uniquement de l'espèce Lb. sanfranciscensis alors que la biodiversité bactérienne semble être plus importante dans les levains fabriqués à partir de la farine BF-70 (une faible pourcentage de lactobacillus homofermentaires).

? Compléter l'étude de la biodiversité des flores lactiques des levains français de panification en identifiant les espèces de bactéries non encore identifiées par d'autres méthodes moléculaires telles que la PCR multiplex et la RAPD.

? Valider les méthodes moléculaires de caractérisation et de détection des flores céréaliers par PCR-RFLP et PCR spécifiques sur les régions intergéniques 16S-23S sur un échantillon plus large de levains et constituer une banque de profils avec les souches de référence et les souches sauvages des levains.

? Contribuer à une meilleure connaissance de la dynamique des écosystèmes par des méthodes moléculaires cultures indépendantes comme la TTGE.

? Utiliser des souches pour reconstituer des levains pour obtenir des propriétés technologiques et nutritionnelles intéressantes.

? Analyser quantitativement les populations bactériennes par des méthodes moléculaires comme la PCR quantitative (Real Time PCR).

1- Brevas E., 1991. Mise au point des levains bactériens pour la panification. Thèse de doctorat. Université Blaise Pascal (Clermont II). 179 pages.

2- Brochoire G., Netter A., Onno B., Rio I., Roussel Ph., Stephan C., 1996. Les nouvelles de la boulangerie pâtisserie, supplément technique.

3- Cai Y., Okada H., Mori H., Benno Y., Nakase T., 1999. Lactobacillus paralimentarius sp. nov., isolated from sourdough. International Journal of Systematic Bacteriology, 49: 1451-1455.

4- Caillez J-C 2004 La biologie moléculaire, 1ère édition, Ellipses-238p.

5- Cocolin L., Manzano M., Cantoni C., Comi G., 2000. Development of a rapid method for the identification of Lactobacillus ssp. isolated from fermented Italian sausages using a polymerase chain reaction-temperature gradient gel electrophoresis. Letters in Applied Microbiology, 30:126-129.

6- Corsetti A., Lavermicocca P., Morea M., Tosti N., Gobbeti M., 2001. Phenoypic and molecular identification and clustering of lactic acid bacteria and yeasts from wheat (species Triticum durum & Triticum aestivum) sourdoughs of Southern Italy. International Journal of Food Microbiology, 64: 95-104.

7- Czerny M., Schieberle P., 2002. Important aroma compounds in freshly ground wholemeal and white wheat flour-identification and quantitive changes during sourdoughs fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 6835-6840.

8- Desmazeaud M., 1998. Bactéries lactiques et qualité des fromages. Laboratoire de recherches laitières, INRA.

9- DeVuyst L., Schrijvers V., Paramithiotis S., Hoste B., Vancanneyt M., Swings J., Kalantzopoulos G., Tsakalidou E., Messens W., 2002. The biodiversity of lactic acid bacteria in Greek traitionnal wheat sourdoughs is reflected in boh composition and metabolite formation. Applied & Environnemental Microbiology, 68, N°12: 6059-6069.

10- Di Cagno R., De Angelis M., Lavermicocca P., De Vincenzi M., Giovannini C. Faccia M., Gobbetti M., 2002. Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: Effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Applied and Environnemental Microbiology, 68, N°2: 623-633.

11- Duthoit F., Godon J-J., Montel M-C., 2003. Bacterial community dynamics during production of registered designation of origin salers cheese as evaluated by 16S rRNA gene single-strand conformation polymorphism analysis. Applied & Environmental Microbiology, 69, N°7: 3840-3848.

12- Ehrmann M., Müller M., Vogel R., 2003. Molecular analyses of sourdough reveals Lactobacillus mindensis sp. nov., .International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53:7-13.

13- Gobbetti M., Corsetti A., 1997. Lactobacillus sanfrancisco a key sourdough lactic acid bacterium. Food Microbiology, 14: 175-187.

14- Gobbetti M., De Angelis M., Corsetti A., Di Cagno R., 2005 Biochemistry and physiology of sourdough lactic acid bacteria. Trends in Food Sciences and Technology, 16:57-69.

15- Gobbetti M., Smacchi E., Corsetti A., 1996. The proteolytic system of Lactobacillus sanfrancisco CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase. Applied and Environmental Microbiology, 62, N°9: 3220-3226.

16- Gürtler V., Stanisich VA., 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology, 142: 3-16.

17- Ignatova M. 2005. Identification moléculaire des levains de panification. Mémoire de stage. ENITIAA. 41p.

18- Kabadjova P., Dousset X., Le Cam V., Prevost H., 2002. Differentiation of closely related Carnobacterium food isolates based on 16S-23S ribosomal DNA Intergenic Spacer Region polymorphism. Applied and Environmental Microbiology, 68, N°11: 5358-5366.

19- Kitahara M., Sakata S., Benno Y., 2005. Biodivesity of Lactobacillus sanfranciscensis strains isolated from five sourdoughs. Letters in Applied Microbiology, 40:353-357.

20- Kline L., Sugihara T.F., 1971. Microorganisms of the San Francisco sourdough bread process. Applied Microbiology, 21, N°3: 439-465.

21- Larpent J-P., 1992. La microbiologie de la fermentation panaire. Agro-alimentaire Information CDIUPA. Université Blaise Pascal-Clermont II.

22- Lavermicocca P. Valerio F., Visconti A., 2003. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products. Applied and Environmental Microbiology, 69, N°1: 634-640.

23- Le Jeune C., Lonvaud-Funel A., 1997. Sequence of DNA 16S/23S spacer region of Leuconostoc oenos (Oenococcus oeni): application to strain differentiation. Res. Microbiol., 148:79-86.

24- Meroth C., Walter J., Hertel C., Brandt M., Hammes W., 2003. Monitoring the bacterial population dynamics in sourdough fermentation process by using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 69, N°1: 475-482.

25- Müller M., Ehrmann M., Vogel R., 2000. Lactobacillus frumenti sp. nov., a new lactic acid bacterium isolated from rye-bran fermentations with a long fermentation period. International journal of systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 2127-2133.

26- Müller M., Ehrmann M., Vogel R., 2000. Multiplex PCR fort he detection of Lactobacillus pontis and two related species in a sourdough fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 66, N°5: 2113-2116.

27- Müyzer G., Smalla K., 1998. Application of denaturing gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antoine Van Leuwenhoek, 73: 127-141.

28- Nour M., 1998. 16S-23S and 23S-5S Intergenic spacer regions of lactobacilli: nucleotide sequence, secondary structure and comparative analysis. Res. Microbiol. 149: 433-448.

29- Oheix N., 2003. Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification. Mémoire d'ingénieur. ENITIAA. 81p.

30- Onno B., Roussel P., 1994. Technologie et microbiologie de la panification au levain. Bactéries lactiques Volume II. Edition Lorica. Pages 293-321.

31- Ogier J-C., Son O., Gruss A., Tailliez P., Delacroix-Buchet A., 2002. Identification of the Bacterial Microflora in Dairy Products by Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, 68, N°8: 3691-3701.

32- Rachman C., 2004. Développement d'outils moléculaires d'identification et d'analyse de la biodiversité de l'écosystème bactérien du saumon fumé. Thèse de Doctorat. ENITIAA. 230 p.

33- Rachman C., Kabadjova P., Valcheva R., Prevost H., Dousset X., 2004. Identification of Carnobacterium species by restriction fragment length polymorphism of the 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region and species-specific PCR. Applied and Environmental Microbiology, 70, N°8: 4468-4477.

34- Randazzo C.L., Heilig H., Giudici P., Caggia C., 2005. Bacterial population in traditionnal sourdough evaluated by molecular methods. Journal of Applied Microbiology, 99, 251-258.

35- Rohrlich M., 1953. Beiträge zur kenntnu der biologie und biochemider sauerteiggärung II Mit: Untersuchum gen uber denbiochemischen Mechanismus der Barkteriellen sauerteiggärung, z. lebens. Unkers. Forsch. 96, p.24-40.

36- Rollan G., De Angelis M., Gobbetti M., Valdez G.F, 2005. Proteolytic activity and reduction of gliadin-like fractions by sourdough lactobacilli. Journal of Applied Microbiology, 99: 1495-1502.

37- Roussel Ph., Chiron H., 2002. Les pains Français, 1 ^èreédition, MAÉ-ERTI-433p.

38- Ruiz A., Poblet M., Mas A., Guillamon J., 2000. Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S and 16S-23S rDNA Intergenic Spacer. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 1981-1987.

39- Settanni L., Van Sinderen D., Rossi J., Corsetti A., 2005. Rapid differentiation and in situ detection of 16 sourdough Lactobacillus species by multiplex PCR. Applied and Environmental Microbiology, 71, N°6: 3049-3059.

40- Spicher G., 1987. Die Mikroflora des sauerteiges XXII Mitt: Die in Weizensauerteign Vorkommenden lactobacillen; z.lebens.Unters.Forsch. 184, p.300-303.

41-Sriranganathan N., Seidler R., Sandine W., Elliker PR., 1973. Cytological and deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization studies on Lactobacillus isolates from San Francisco sourdough. Applied Microbiology, 25, N°3: 461-470.

42- Stiles M., Holzapfel W., 1997. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Areview J. Food Microbiol, 36: 1-29.

43- Tannock GW., Timisjarvi A., Rodtong S., NG J., Munro K., Alatossava T., 1999. Identification of Lactobacillus isolates from the gastrointestinal tract, silage, and yoghurt by 16S-23S rRNA gene Intergenic spacer region sequence comparisons. Applied and Environmental Microbiology, 65, N°9: 4264-4267.

44- Thiele C., Grassl S., Gänzle M., 2004. Gluten hydrolysis and depolymerization during sourdough fermentation. Journal of agricultural and food chemistry, 52: 1307-1314.

45- Torriani S., Zapparoli G., Dellaglio F., 1999. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp.lactis.

46- Valcheva R., Korakli M., Onno B., Prevost H., Ivanova I., Ehrmann M., Dousset X., Gänzle M., Vogel R., 2005. Lactobacillus hammesii sp. nov., isolated from french sourdough.

47- Valcheva R., Ferchichi M., Korakli M., Ivanova I., Gänzle M., Vogel R., Prévost H., Onno B., Dousset X. 2006. Lactobacillus nantensis sp. nov., isolated from French wheat sourdough. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 587-591.

48- Vasquez A., Ahrné S., Pettersson B., Molin G., 2001. Temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for identification of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae and Lactobacillus rhamnosus. Letters in Applied Microbiology, 32: 215-219.

49- Vogel R., Knorr R., Muler M., 1999. Non-dairy lactic fermentations: the cereal world.

50- Wiese B., Strohmar W., Rainey F., Diekmann H., 1996. Lactobacillus panis sp. nov., from sourdough with a long fermentation period. International Journal of Systematic Bacteriology, 46, N°2: 449-453.

51- Zapparoli G., Torriani S., 1997. Rapid identification and detection of Lactobacillus sanfrancisco in sourdough by species-specific PCR with 16S rRNA-targeted primers. System. Appl. Microbiol. 20: 640-644.

52- Zavaleta A., Martinez A., Rodriguez F., 1996. 16S-23S rDNA intergenic sequences indicate that Leuconostoc oenos is phylogenetically homogeneous. Microbiology, 142: 2105-2114.

53- Zoetendal E., Akkermans A., De Vos W., 1998. Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human faecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 64, N°10: 3854-3859.

Tableau n°2: Exemples de quelques enzymes de restriction et leurs sites de reconnaissances

Tableau n°6: Dénombrement des levures et des bactéries lactiques dans les levains BF 16

Tableau n°7: Ratio des isolats homo/hétérofermentaires dans les levains 17

Figure n°1 : Positions des régions conservées de l'opéron ribosomique 16S-23S chez

Figure n°2 : Organisation de la région intergénique 16S-23S de l'ARNr chez les bactéries

Figure n°4 : Formation d'un brin d'ADN ramifié grâce à la présence de GC clamp 9

Figure n°8 : Amplification par les amorces tRNA^ala-23S/10 (souches : 1,8 et 16) 19

Figure n°12 : PCR t^ala/10 et RFLP par Hinf I, Hind III et á Taq I de la souche M9 21

Figure n°13 : PCR avec primers spécifiques de l'espèce Lb. sanfranciscensis

ANNEXE I

55,3 g du milieu est mélangé avec : 10 g/l de maltose, 5 g/l de fructose, 0,5 g/l de cystéine et 5 ml de FYE et mis en suspension dans un litre d'eau distillée, ensuite chauffé sous agitation magnétique jusqu'à homogénéisation complète. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Le milieu est coulé dans des boîtes de pétri à 45°C en milieu stérile.

Le bouillon MRS modifié (55g/l) a la même composition sauf qu'il ne contient pas de l'agar biologique.

Ce milieu contient 2 g de peptone et 17 g de chlorure de sodium. La solution est répartie dans des tubes de 9 ml avant d'être stérilisée à 121°C pendant 15 minutes et stockée à 4°C. Cette solution sert pour les dilutions.

20% de suspension commerciale de levure boulangère est mélangée dans de l'eau distillée. Le mélange est stérilisé pendant 30 minutes à 121°C. Après une nuit de repos et de décantation entre 2 et 8°C, le mélange est ensuite centrifugé. Le surnageant est récupéré et stocké à -20°C.

60g/l sont mis en suspension dans un litre d'eau distillée. Le mélange st chauffé lentement sous agitation magnétique jusqu'à la dissolution complète. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

On mélange 50% d'agarose-réosphore (référence 018649 Eurobio) et 50% d'agar standard (référence 018054 Eurobio). On ajoute 100 ml du tampon TBE sur la mixture ci-dessus.

On vérifie que l'agarose est complètement dissous et on ajoute 15 ul de BET pour la coloration.

12,6 g d'urée dans 14,5 ml d'eau (mélange à 45°C), 1ml d'ammonium persulfate, 6ml d'acrylamide, 750ul du tampon TAE 50x, 27,5ul d'une solution TEMEO et 275 ul d'APS à 10%. Le gel demande 2 heures pour y être polymérisé.

On mélange 30 ul du colorant SYBR Green avec 300 ul d'une solution tampon TBE 1X.

Tests N° tubes	Morphologie et aspect des colonies	La coloration de Gram	Test au catalase	Test homo-hétérofermentaire
1	Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.	+	-	Hétéro
2	idem	+	-	Hétéro
3	idem	+	-	Hétéro
4	idem	+	-	Hétéro
5	idem	+	-	Hétéro
6	idem	+	-	Hétéro
7	idem	+	-	Hétéro
8	idem	+	-	Hétéro
9	idem	+	-	Hétéro
10	idem	+	-	Hétéro
11	idem	+	-	Hétéro
12	idem	+	-	Hétéro
13	idem	+	-	Hétéro
14	idem	+	-	Hétéro
15	idem	+	-	Homo
16	idem	+	-	Hétéro
17	idem	+	-	Hétéro
18	idem	+	-	Hétéro
19	idem	+	-	Hétéro

Tests

N° tubes

Morphologie et aspect des colonies

La coloration de Gram

Test au catalase

Test homo-hétérofermentaire

Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

Grosses colonies

Hétéro

Colonies de petite taille (1-1,5 mm), blanches crémeuses, bombées, lisses et rondes.

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

idem

Hétéro

Grosses colonies

Hétéro

idem

Hétéro

ENZYMES

SOURCE MICROBIENNE

SEQUENCE

Alu I

Arthrobacter luteus

5'-A-G-C-T-3'

3'-T-C-G-A-5'

Bam HI

Bacillus amyloliquefaciens H

5'-G-C-A-T-C-C-3'

3'-C-C-T-A-G-G-5'

Eco RI

Escherichia coli

5'-G-A-A-T-T-C-3'

3'-C-T-T-A-A-G-5'

Eco RII

Escherichia coli

5'-C-C-T-G-G-3'

3'-G-G-A-C-C-5'

Hae III

Hæmophilus ægyptius

5'-G-G-C-C-3'

3'-C-C-G-G-5'

Hind III

Hæmophilus influenzæ b

5'-A-A-G-C-T-T-3'

3'-T-T-C-G-A-A-5'

Hinf I

Hæmophilus influenzæ Rf

5'-G-A-N-T-C-3'

3'-C-T-N-A-G-5'

á TaqI

5'-T-C-G-A-3'

3'-A-G-C-T-5'

Code

Localisation

Séquences oligonucléotidiques

Primers (5'?3')

T (°C)

Hybridation

Références

16S/2

16S

1389-1407 de E.coli

CTT GTA CAC ACC GCC CGT C

60°C

Gürttler et Stanisich 1996

Kabadjova et al, 2002

23S/10

23S ARNr

456-474 de E.coli

CCT TTC CCT CAC GT ACT G

60°C

idem

23S/7

23S ARNr

188-208 de E.coli

GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC

60°C

idem

ARNt^ala

ITS

TAG CTC AGC TGG GAG AGC

60°C

idem

TTGE

GCG TGT GTA CAA GAC CC

TTGE

CGC CCG GGG CGC GCC GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC

Psfpar1

ITS

5' CTC TGT TAT ATT TGA ATA AGTACT 3'

psfspich

ITS

5' GAC CGC AAG GTC ATC ATT AT3'

CTAAGGATATGGTACTTTGGTACCAACGGAAATACACAATTGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGGGGTCTACCTGGCGCTTTCGGGCCTATAGCTCAGCTGGTTTAGAGCGCACGCCTGATAAGCGTGAGGTCGATGGTTCAAGTCCATTTAGGCCCATTTTCTCTGTTATAATTGAATAAGTACTATGGGGGTTTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGAGGTCATCGGTTCGATCCCGTTAACCTCCATTGACAGAGATGTCATACTCGTACCTTGTAAACTGGATATTAAGGATTAATGAATTAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGGCAATCTTTTTGATTGCCAGCTGTGACGAAAGTCATGGCAAATTGTTTTAAATTACTTTTTGTAATTTAATTTAGGTTAAGTTATAAAGGGCGCAC

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CTAAGGATATGGTGCTTTAGCACCAACGGAAATACACAACGTTAAAACTTTGTTTAGTTTTGAGAGGTCTACTCTCAAACTCGTACCTTGAAAACTGGATATTAAGAATTAATGATTTAAAAGAAACACCGAAAACTGCGCGATAAAAGTGGATGTATTTCCATATTCTGTCAAGATTAAGTTATAAAGGGCGCAC

CTAAGGAATAATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTTTTGAGGGGTCTACCCTCAAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAAGATAATTAAACCGAGAACACCGCGTTTATTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTTAAAATTCGCTAATACTCGATTAATCGTTCATCACGACGTGATGAATA

CTAAGGAATATACGGAGGCTACACATACTTTGTCGAAACAATGGTCAGTTTTGAGAGGTCTACTCTCAAACTTGTTCTTTGAAAACTAGATATTATCAATTATTTTCCTTTAATTATTAAGATAATTAAACCGAGAAACAACTGCGTACTTTTGAGTTTTTTAATTAGTTTATATCGCTAATACTCAATTAATCAGCGATTACGAAGTAATCGTTA

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Les industries des produits céréaliers fermentés (panification, viennoiserie, crackers...) ont actuellement un regain d'intérêt pour les fermentations mixtes La maîtrise de ce procédé de fermentation mixte s'appuie d'une part sur l'étude de la biodiversité microbienne des levains et d'autre part sur la caractérisation des flores, notamment, lactiques à l'aide des outils biomoléculaires .L'objectif était d'étudier la biodiversité des flores lactiques des levains français de panification et l'influence du paramètre type de farine sur la flore lactique, ainsi que, la validation des méthodes moléculaires (PCR, PCR-RFLP) de caractérisation de ces flores.

Deux échantillons de levains français ont été analysés : un levain BF rafraîchi avec une farine de type 70 et un levain BF rafraîchi avec la farine du blé concassé. La flore lactique du levain de panification est constituée principalement de bactéries du genre Lactobacillus. La région intergénique (ITS) 16S-23S présente un polymorphisme de taille et de séquence suffisant entre les espèces pour permettre une caractérisation moléculaire de ces bactéries. L'amplification de cette région intergénique par les amorces 16S/2 et 23S/10 a permis de confirmer les genres des bactéries de référence et ceux des isolats de levains. Celle-ci a généré un profil électrophorétique de 3 bandes qui est particulier à l'espèce Lb. sanfranciscensis.

L'amplification de la séquence tARN^ala- 23S/10 suivie d'une digestion enzymatique (PCR-RFLP) par trois enzymes de restriction a généré différents profils de restriction ont montré que, dans les deux échantillons, Lb. sanfranciscensis était l'espèce prédominante. La banque de données informatisée contenant ces profils de restriction a permis une confirmation des résultats d'identification des isolats de levains de panification. L'amplification d'une séquence spécifique de la région rDNA 16S de cette espèce bactérienne a contribué à la validation des résultats obtenus par PCR-RFLP.

Cette étude semble montrer que la farine utilisée pour le rafraîchi des levains n'a pas d'influence sur la flore majoritaire dans les conditions de l'étude. Toutefois, il est nécessaire d'identifier un nombre plus important d'isolats, de tester d'autres types de farine et sur un nombre plus important de rafraîchis.

Mots-clés : Lactobacilles, bactéries lactiques, Lb. sanfranciscencis, levains, panification, PCR-RFLP, ITS, flore lactique.

Industries of the fermented cereal products (panification, viennoisery, crackers...) currently have a renewed interest for mixed fermentations the control of this process of mixed fermentation is based on the one hand on the study of the microbial biodiversity of the leavens and on the other hand on the characterization of the flora, in particular, lactic using the biomolecular tools. The objective was to study the biodiversity of the lactic flora of the French leavens of panification and the influence of the standard parameter of flour on the lactic flora, like, the validation of the molecular methods (PCR, PCR-RFLP) of characterization of this flora.

Two French leaven samples were analyzed: a leaven BF refreshed with a flour of the type 70 and one leaven BF refreshed with the flour of bruised grain. The lactic flora of the leaven of panification is made up mainly of bacteria of the Lactobacillus kind. The intergenic area (ITS) 16S-23S has a sufficient polymorphism of size and sequence between the species to allow a molecular characterization of these bacteria. The amplification of this intergenic area by the primers 16S/2 and 23S/10 made it possible to confirm the kinds of the bacteria of reference and those of the leaven isolates. This one generated an electrophoretic profile of 3 bands which is particular with the species Lb sanfranciscensis.

The amplification of the sequence tARNala - 23S/10 followed by an enzymatic digestion (PCR-RFLP) by three enzymes of restriction generated various profiles of restriction showed that, in the two samples; Lb. sanfranciscensis was the prevalent species. The computerized bank of data containing these profiles of restriction allowed a confirmation of the results of identification of the leaven isolates of panification. The amplification of a specific sequence of the area rDNA 16S of this bacterial species contributed to the validation of the results obtained by PCR-RFLP.

This study seems to show that the flour used for refreshed leavens does not have an influence on the majority flora under the conditions of the study. However, it is necessary to identify a more significant number of isolates, to test other types of flour and on a more significant number of refreshed.

Key words: Lactobacilles, lactic acid bacteria, Lb. sanfranciscencis, leavens, panification, PCR-RFLP, ITS, TTGE, lactic flora.

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques des levains de panification

REMERCIEMENTS

ABREVIATIONS

SOMMAIRE

INTRODUCTION

I. Généralités

II. La définition d'un « levain » de panification

III. Les microorganismes des levains de panification

III.1: Les levures

III. 2: Les bactéries lactiques

IV. Les méthodes de caractérisation moléculaire des bactéries lactiques

I. Souches de référence

Lactobacillus frumenti

VI. Caractérisation des bactéries lactiques

CONCLUSION

PERSPECTIVES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

TABLEAUX ET FIGURES

ANNEXE I