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Analyse des bacteries non cultivables


par David LECHAUDEE
CNAM - Ingénieur 2010
Dans la categorie: Biologie et Médecine
   
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Disponible en mode multipage

CONSERVATOIRE NATIONAL DES ARTS ET METIERS DE PARIS

Mémoire de l'examen « communication pour l'ingénieur »
BLG 111

Spécialité : Sciences et techniques du vivant
Option : génie biologique

ANALYSE DES BACTERIES NON CULTIVABLES

Présenté par

David LECHAUDEE

Soutenu le lundi 25 mai 2009

Membres du jury :

Monsieur Ali Saib, Professeur titulaire de la chaire de Biologie Monsieur Robert Morfin, Professeur des universités

Monsieur Philippe Pochart, Professeur des universités Madame Antonia Suau-Pernet, Maître de conférences Madame Marie-Irène Malewiak, Maître de conférences Monsieur Fabien Magne, Maître de conférences Monsieur Olivier Hennebert, Maître de conférences

SOMMAIRE

Pages

INTRODUCTION 3

1. LES BACTERIES NON CULTIVABLES, CONTEXTE ET IMPACT SUR LA SANTE PUBLIQUE. 4

1.1 Caractéristiques physiologiques et morphologiques des bactéries non cultivables. 4

1.1.1 Caractéristiques des bactéries non cultivables et non viables. 4

1.1.2 Caractéristiques des bactéries viables non cultivables (VNC). 5

1.2 Les facteurs induisant l'état non cultivable. 7

1.2.1 Facteurs entraînant la mort cellulaire. 7

1.2.2 Les facteurs de stress cellulaire, induction de l'état viable non cultivable. 7

1.2.3 Induction expérimentale de l'état viable non cultivable. 8

1.3 Bactéries VNC dans les denrées alimentaires, impact et enjeux. 8

1.4 Les bactéries viables non cultivables dans l'environnement. 9

2. ANALYSES ET METHODES DE RECHERCHE DES BACTERIES NON CULTIVABLE. 10

2.1 Analyse par fluorimétrie. 10

2.1.1 Double coloration CTC / DAPI. 11

2.1.2 LIVE/DEAD® BacLightTM. 12

2.1.3 Cytométrie de flux. 13

2.2 Direct Viable Count (DVC). 15

2.3 Analyse en Biologie Moléculaire par RT-PCR. 18

3. ETUDES SUR LA VIABILITE, L'ETAT VIABLE NON CULTIVABLE ET LA RESSUSCITATION. 20

3.1 La ressuscitation. 20

3.2 Les facteurs de ressuscitation : les protéines Rpf et Sps. 22

CONCLUSIONS 24

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 25

LISTE DES ABREVIATIONS 29

INTRODUCTION

Les autorités sanitaires (ex : l'Association Française de NORmalisation (AFNOR) en France, Food and Drugs Administration (FDA) aux Etats-Unis) définissent des normes de recherche et de dénombrement de germes pathogènes dont la plupart sont basées sur l'utilisation de milieux de culture. Les laboratoires industriels et publiques utilisent ces milieux, liquides ou gélosés, sélectifs ou non, afin de permettre aux bactéries de se multiplier jusqu'à atteindre un niveau détectable et/ou dénombrable. Ces normes sont donc basées sur la capacité qu'ont les bactéries à se diviser ou à former des colonies sur milieux gélosés.

Chaque genre bactérien possède ses particularités et ses exigences nutritionnelles pour la croissance. Certaines bactéries sont plus difficiles à cultiver que d'autres, elles nécessitent des conditions particulières à leur développement, par exemple Legionella pneumophila (source : dictionnaire de bactériologie vétérinaire Euzéby J.P.,
http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/ll/legionella.html) ou encore Mycobacterium Leprae qui n'est pas cultivable sur milieux complexe ou synthétique (Mukherjee R. et Antia N.H., 1985 [27]).

Le caractère cultivable d'une bactérie dépend des caractéristiques physiologiques et biochimiques de son genre ou de son espèce (microorganisme anaérobie, microaérophile, halophile, différentes auxotrophies selon les espèces). Les conditions nécessaires à la prolifération des bactéries au sein d'un même genre ou d'une même espèce varient également selon l'état physiologique des cellules. Les conditions extérieures et des facteurs de stress peuvent influer sur l'état physiologique des cellules. Les stress peuvent également engendrer la mort des bactéries dans le cas où elles ne peuvent s'y adapter. Les cellules mortes, sans activité métabolique, ne peuvent pas être cultivée. Cependant une bactérie non cultivable n'est pas forcément morte, une coloration au CTC indiquant que la respiration cellulaire a lieu peut le montrer (chapitre 2.1.1).

Les bactéries soumises à des stress dus à leur environnement possèdent des stratégies pour survivre. Certaines bactéries ont la capacité de former des spores, d'autres de passer à un état non cultivable : l'état Viable mais Non Cultivable (VNC).

Dans cette étude, les méthodes d'analyses et de recherche des bactéries non cultivables seront décrites. Puis les axes de recherches portant sur le phénomène de retour à un état cultivable appelé « resuscitation » seront développés. Il est cependant indispensable dans un premier temps de décrire et de définir les formes non cultivables des bactéries. L'impact sur la santé publique de telles formes bactériennes et les conséquences de leur présence dans l'environnement sont autant de questions qui suscitent l'intérêt des microbiologistes et des agences sanitaires.

1. LES BACTERIES NON CULTIVABLES, CONTEXTE ET IMPACT SUR LA SANTE PUBLIQUE.

Les bactéries sont naturellement présentes à divers états dans le milieu naturel et dans l'alimentation. Les paragraphes suivants traitent des caractéristiques de ces différents états : viables, cultivables ou non, formes sporulées, mort. Ainsi que les conséquences de la présence de bactéries non cultivables dans l'alimentation ou dans notre environnement.

1.1 Caractéristiques physiologiques et morphologiques des bactéries non cultivables.

Les bactéries non cultivables peuvent se trouver à différents états dans le milieu naturel : mort, état VNC, spores. Les articles scientifiques décrivent chacun de ces états.

1.1.1 Caractéristiques des bactéries non cultivables et non viables.

Les bactéries mortes, non cultivables et non viables, n'ont plus de métabolisme. L'activité cellulaire n'existe plus, il n'y a plus d'échanges entre le cytosol et l'extérieur. Le renouvellement des lipides membranaires n'ayant plus lieu, la membrane plasmique des cellules mortes s'en trouve généralement altérée. Certains facteurs peuvent entraîner la mort des bactéries ou une lyse cellulaire : un choc osmotique, un traitement thermique, l'action de surfactant ou encore l'effet du pH. Ces facteurs et d'autres seront détaillés dans le paragraphe 1.2.1.

Lors d'une croissance en milieu de culture, la mort des bactéries intervient de façon importante lors de la phase de déclin.

Figure 1 : Courbe de croissance bactérienne, 1- phase de latence, 2- phase exponentielle, 3- phase de décélération, 4-
phase stationnaire, 5- phase de déclin

Une culture bactérienne peut être décomposée en différents stades (figure 1) : La première phase, dite de latence, est une période pendant laquelle les cellules bactériennes s'adaptent au milieu dans lequel elles se trouvent. La seconde phase est la croissance exponentielle : les cellules se divisent rapidement et colonisent le milieu, à ce stade il y a beaucoup plus de cellules vivantes que mortes dans la population bactérienne. A la fin de la phase exponentielle, la croissance ralenti, c'est la phase de décélération, puis la phase stationnaire. La population bactérienne reste stable, les bactéries utilisent les composants du milieu pour synthétiser des métabolites secondaires. Lors de cette phase le milieu évolue, les métabolites sécrétés par les bactéries s'accumulent, le nombre de cellules mortes augmente. Après une phase stationnaire prolongée les bactéries meurent, soit parce qu'elles ne peuvent plus assurer leur métabolisme, soit à cause de la toxicité de certains métabolites qu'elles ont sécrétées. La membrane cellulaire ainsi que la paroi bactérienne peuvent être endommagées, c'est ensuite la lyse cellulaire qui intervient. (Prescott et al., 2003 [33])

L'intérêt de l'étude des bactéries mortes est limité. Cependant, la présence de bactéries mortes peut signifier la présence de métabolites, de toxines et de résidus membranaires tels que les LPS. Ces résidus peuvent engendrer des intoxinations.

1.1.2 Caractéristiques des bactéries viables non cultivables (VNC).

Le premier article décrivant et démontrant l'existence de formes viable non cultivable sur les germes Escherichia coli et Vibrio cholerae date de 1982 (Xu et al., 1982 [44]). Depuis, la liste des microorganismes étudiés et décrits à l'état viable non cultivable s'est allongée (Tableau 1).

Tableau 1 : Liste des bactéries décrites comme pouvant entrée en état VNC. (Oliver, J.D., 2004 [30])

Une bactérie à l'état viable non cultivable a perdu sa capacité à se multiplier sur milieu de culture conventionnel mais possède une activité métabolique. Cette activité métabolique peut être mise en évidence par la présence de mRNA dont la durée de vie est de moins d'une minute (Yaron S., Matthews K.R., 2002 [45]). Ces bactéries peuvent retrouver leur « cultivabilité », phénomène appelé par abus de langage « ressuscitation» (Oliver J.D. , 2005, [29]).

Le passage à l'état VNC d'une bactérie est une stratégie qui permet aux cellules de survivre dans des conditions non favorables, il s'agit d'un état réversible à l'image de la sporulation des bacilles à GRAM positif tels que Bacillus ou Clostridium. Ces formes VNC possèdent des caractéristiques particulières et souvent différentes d'une espèce à l'autre. Plusieurs études décrivent les caractéristiques de germes à l'état VNC.

Une étude réalisée chez Campylobacter jejuni a montrée qu'une cellule viable non cultivable conserve un taux d'ATP comparable à une cellule cultivable (Beumer et al., 1992 [3]). Cependant, certains changements physiologiques ont été démontrés chez Campylobacter jejuni : baisse du pH intracellulaire, chute de la concentration en ions potassium (K+) (Tholozan et al., 1999, [40]).

Outre les caractéristiques métaboliques et physiologiques, les bactéries viables non cultivables présentent des différences morphologiques et structurelles par rapport aux formes cultivables. Il a été montré, chez Enterococcus faecalis, une augmentation significative de la résistance mécanique de la paroi bactérienne (Signoretto et al., 2000 [36]). Ceci pouvant s'expliquer par des changements dans la structure de la paroi : notamment par la présence de polymères muropeptidiques de degré supérieur à deux (trimères, tétramère, pentamères et plus).

Chez Vibrio vulnificus, des changements de composition de la membrane plasmique ont été décrits. La composition en acide gras de cette dernière varie entre l'état cultivable et non cultivable. A l'état cultivable les acides gras présents en majorité sont les C16 :0, C16 :1 et C18 :0, après une courte période à 5°C les acides gras majoritaires sont C15 :0, C16 :1, C16 :0, C17 :0 et C18 :0. (Day A.P. et Oliver J.D., 2004 [10]) (CXX :Y, dans la nomenclature des acides gras, XX correspond au nombre de carbone de la chaine aliphatique, Y correspond aux nombre d'insaturations de la chaine). Ce constat a été réalisé dans des conditions de stress hypothermique, l'hypothèse émise est que ces changements de composition de la membrane permettent de conserver sa fluidité. Sans ces modifications membranaires, le passage à l'état VNC est impossible pour Vibrio vulnificus, les cellules ne peuvent alors survivre au stress provoqué par le traitement thermique.

Il est important de souligner que les caractéristiques décrites précédemment sont valables pour
l'espèce et les conditions étudiées. Les caractéristiques de l'état VNC peuvent difficilement être
généralisées. Par exemple, chez Campylobacter jejuni le volume cellulaire augmente à l'état VNC

(Tholozan et al., 1999 [40]) alors qu'il n'apparaît pas de différences significative de volume chez Enterococcus faecalis (Signoretto et al., 2000 [36]).

1.2 Les facteurs induisant l'état non cultivable.

1.2.1 Facteurs entraînant la mort cellulaire.

De nombreux facteurs peuvent entraîner la mort cellulaire, qu'ils soient naturels ou provoqués par des procédés industriels :

> Températures hautes utilisées pour la stérilisation ou la pasteurisation

> Choc osmotique

> Solvants organiques et surfactants

> Forte concentration saline

> pH trop acide ou trop basique

> Manque de substrats nécessaires à la survie

> Conservation prolongée à de basses températures

> Enzyme (exemple : lysozyme)

> Antibiotiques

Tous ces facteurs peuvent engendrer la mort de bactéries. Leur effet est cependant à relativiser, les espèces extrêmophiles, halophiles, thermophiles ou psychrophiles ne réagirons pas de la même façon face à des conditions extrêmes que des bactéries telles que les entérobactéries.

C'est pour cela que certains des facteurs cités ci-dessus seront repris dans le paragraphe suivant comme pouvant induire des formes VNC.

1.2.2 Les facteurs de stress cellulaire, induction de l'état viable non cultivable.

Chaque espèce bactérienne possède des stratégies pour se protéger face à des stress extérieurs : formation de spores, production de protéines spécifiques face au stress thermique (ex : heat shock proteins), passage à des états non cultivable ou encore adaptation du métabolisme aux conditions extérieures.

Les cellules bactériennes entre en état VNC lorsqu'elles sont soumises à des stress tels que les
basses ou hautes températures, variation de la pression osmotique, carence nutritive, stress oxydatif
provoqué par l'oxygène et les dérivés actifs de l'oxygène, la déshydratation, l'exposition

prolongée à la lumière naturel (Besnard et al. 2002, [2] - Olivier J.D. 2004, [30]). Ces mêmes facteurs peuvent être létaux. L'effet de chacun d'entre eux dépend notamment de la durée et du degré d'exposition.

Les conditions naturelles dans lesquelles se trouvent les bactéries ne sont bien souvent pas optimales pour la croissance et favorisent l'apparition de formes VNC.

Par exemple, les premières bactéries à l'état VNC étudiées par Xu et al. en 1982 étaient Escherichia coli et Vibrio cholerae et provenaient d'eau de mer et d'eau estuarienne ; des eaux relativement froides (15°C) et d'une salinité élevée (en moyenne 35g/L de sels pour l'eau de mer). Dans l'alimentation humaine, les bactéries sont également mises à rudes épreuves : stockage prolongé à 4°C, aliments salés ou fumés, agents conservateurs ou encore pasteurisation sont autant de traitements qui peuvent éviter la prolifération bactérienne mais aussi induire la présence de formes VNC.

1.2.3 Induction expérimentale de l'état viable non cultivable.

De nombreuses études sont menées sur les formes bactériennes VNC. Pour les besoins de ces études il est nécessaire de pouvoir induire artificiellement le passage des bactéries à l'état VNC.

La plupart des études sont réalisées sur des formes induites par une carence nutritive. Pour cela, les bactéries sont stockées dans des solutions isotoniques dépourvues de nutriments ou dans de l'eau de mer artificielle. Ce traitement peut être accompagné d'une incubation à basse température (Whitesides M.D., Oliver J.D., 1996 [43])

Dans tous les cas, la viabilité des cellules contenues dans les échantillons bactériens doit être vérifiée. Par exemple par une double coloration CTC/DAPI, méthode qui sera explicitée au paragraphe 2.1.1. La « non-cultivabilité » des formes viables doit également être vérifiée par mise en culture sur milieu nutritif. Les milieux suivants sont cités dans plusieurs articles et sont fréquemment utilisés pour vérifier le caractère non cultivable des cellules artificiellement induites à l'état VNC : BHI (Brain Heart Infusion), TSA (Tryptone Soy Agar) ou HIA (Heart Infusion Agar).

1.3 Présence de bactéries VNC dans les denrées alimentaires, impact et enjeux.

De nombreuses espèces bactériennes, et notamment celles pathogènes pour l'Homme, sont décrites
comme pouvant se trouver dans un état non cultivable dans l'environnement mais aussi dans les
denrées alimentaires. Des germes tels que Salmonella enterica, Vibrio cholerae, Escherichia coli

O157 :H7 entéro-hémorragique, Campylobacter jejuni, Vibrio vulnificus, Shigella dysenteriae, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes et d'autres, tous pathogènes pour l'Homme, pourraient se trouver dans nos denrées alimentaires à l'état VNC. Ce constat soulève un problème de santé publique. Les formes VNC dans l'alimentation humaine seraient par définition non détectables par les méthodes conventionnelles de recherche de germes pathogènes, ces méthodes se basant principalement sur l'utilisation de milieux de culture.

La présence potentielle de ces germes dans l'alimentation amène la question de leur pathogénécité, de nombreux articles traitent de l'effet pathogène des bactéries VNC.

Par exemple Oliver et al. ont montrés que l'injection chez la souris de Vibrio vulnificus à l'état non cultivable conduisait à une infection puis à la mort des animaux (Oliver et al., 1995 [31]). Dans d'autres études la pathogénécité et le retour à l'état cultivable de formes VNC sont démontrés : l'inoculation chez le lapin de Vibrio cholerae engendre une pathologie (Colwell R.R. et al., 1985 [8]), l'injection chez des patients volontaires humains a démontré la capacité de Vibrio cholerae à revenir à l'état cultivable et à se multiplier dans l'intestin de l'hôte humain (Colwell R.R. et al., 1996 [9]).

Escherichia coli O157 :H7 entéro-hémorragique conserve également sa pathogénécité à l'état VNC, nous avons vu au paragraphe 1.1.2 qu'une bactérie VNC conserve un métabolisme actif, dans le cas de E. coli O157 :H7 la toxine sécrétée par la bactérie à l'état cultivable l'est toujours à l'état non cultivable (Liu Y. et al., 2008 [21]).

Tous ces constats montrent l'intérêt de la mise au point de méthodes de recherche et de détection des germes VNC dans l'alimentation, l'eau et l'environnement.

1.4 Les bactéries viables non cultivables dans l'environnement.

Selon Staley et al. plus de 99% des espèces présentent dans l'environnement seraient dans un état VNC (Staley J.T. et al., 1985 [37]). Certaines études ont été menées sur différentes matrices environnementales telles que les boues de station d'épuration (Garrec N. et al., 2005 [13]) ou sur des sols (terre brune) (Turpin P.E. et al., 1993 [41]). Selon les auteurs, la complexité de ces matrices rend les études fastidieuses et les résultats discutables. Une matrice plus fréquemment utilisée pour les études de bactéries VNC est l'eau de mer ou estuarienne car plus facile à traiter. Les données sur les bactéries VNC dans l'environnement sont à relativiser. En effet certaines études montrent que la persistance de formes VNC dans plusieurs matrices environnementales naturellement contaminées par une flore viable et cultivable n'est pas possible (Bogosian G. et al., 1996 [4] - Marscher et al. 2000 [23]). Cette forme de survie bactérienne serait très limitée dans le

temps face à une flore compétitive. L'hypothèse émise est que l'état VNC est effectivement un état de secours en cas de stress important. Cet état permet la survie des bactéries touchées par ce stress si toute la flore bactérienne environnante est elle aussi amoindrie. Dans le cas ou des germes stressés se trouvent à l'état VNC en compétition face à une flore abondante non stressée, leurs chances de survie s'en trouve très réduites.*

Un cas particulier de VNC dans l'environnement est cependant intéressant à évoquer, celui des légionelles. Ce pathogène de l'Homme pose un problème de santé publique en cas de présence dans les tours aéro-réfrigérées, dans les systèmes de climatisation ou dans les thermes. Les traitements utilisés pour détruire ces germes in situ (chloration, traitement thermique) peuvent induire l'apparition de formes VNC de Legionella. Ces germes ont entre autre la capacité à retrouver leur état cultivable en présence de protozoaires, comme Tetrahymena pyriformis très commun dans l'eau douce, dont elles sont les parasites (Alleron L., Thèse 2008 [1]). Il est a noté qu'une épidémie de légionellose en 1987 (101 personnes infectées dont 28 décédées) est à l'origine de la découverte des formes VNC de Legionella pneumophila dans des échantillons de l'hôpital de Stafford (U.K.). Le risque sanitaire dû à la présence de forme VNC est donc bien réel et peut avoir de graves conséquences.

2. ANALYSES ET METHODES DE RECHERCHE DES BACTERIES NON CULTIVABLE.

2.1 Analyse par fluorimétrie.

Plusieurs méthodes de recherche et de numération des bactéries viables sont basées sur la fluorimétrie. Cette technique nécessite l'utilisation de système de microscopie à épifluorescence (figure 2). Le principe de cette microscopie consiste à exciter un fluorochrome à une longueur d'onde donnée afin de pouvoir en observer le signal émis. Le traitement de l'image reçue peut être réalisé à l'aide d'un système informatique relié à une caméra CCD.

Figure 2 : schéma d'un microscope à épifluorescence, système microscopie à épifluorescence ZEISS (Source :
http://www.clermont.inra.fr/plateau_technique_microscopie/equipements_principaux/microscopie_a_epifluorescence)

2.1.1 Double coloration CTC / DAPI

La double coloration CTC-DAPI permet de dénombrer et de différencier les cellules mortes des cellules vivantes. Le CTC est un sel de tétrazolium qui, une fois réduit en sel de formazan insoluble, émet de la fluorescence rouge (après excitation à 450nm, émission de fluorescence rouge à 630nm). Le CTC est le colorant permettant de dénombrer les cellules viables, la réduction du CTC par les cellules est le signe que la respiration cellulaire à lieu, cela signifie que le métabolisme est actif. (Garrec N. et al., 2005 [13] - Joux F. et al., 1997 [15])

La coloration au DAPI permet de dénombrer la totalité des cellules, ce fluorophore se lie spécifiquement à l'ADN et émet une fluorescence bleue avec un maximum d'émission à 456nm (excitation à 372nm, lumière violette). Les colorations peuvent être réalisées simultanément (figure 3), ou séparément sur deux échantillons.

Figure 3 : Coloration : A) DAPI - B) CTC observé en microscopie à fluorescence (Source :
http://www.biochemj.org/bj/380/0859/bj3800859f05.htm?resolution=HIGH)

L'acridine orange est aussi fréquemment utilisée pour le dénombrement de la flore totale. Ce fluorochrome est un agent intercalant de l'ADN qui émet une fluorescence verte (maximum d'émission à 525nm).

2.1.2 LIVE/DEAD® BacLightTM

Il existe plusieurs versions de la méthode LIVE/DEAD® BacLightTM développée par Molecular Probes. Ce paragraphe décrit les versions principales utilisables pour l'étude des cellules viables Procaryotes et microorganismes unicellulaires Eucaryotes.

La version LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial viability kit est utilisable pour l'analyse des bactéries, levures, mycoplasmes et protozoaires. Le principe de ce kit est basé sur une double coloration par l'intermédiaire de deux florophores : le SYTO9® et le Propidium Iodide (PI). Le SYTO9® est un fluorophore qui, après excitation à 470nm, émet une fluorescence de couleur verte (540nm). Ce marqueur possède la capacité de diffuser dans les cellules, intègres ou non, et d'émettre de la fluorescence une fois lié à l'ADN. Le SYTO9® permet donc de marquer la totalité les cellules d'un échantillon. Le Propidium Iodide est un agent intercalant de l'ADN, une fois lié à ce dernier le PI émet une fluorescence rouge (635nm) après excitation à 470nm. Ce fluorophore ne peut pénétrer dans les cellules que si les membranes sont altérées, seules les cellules mortes fluorescent en rouge (figure 4).

Figure 4 : coloration LIVE/DEAD BacLight Bacterial viability kit SYTO9/ Propidium iodide (source : brochure
Invitrogen). En vert les cellules viables, en rouge les autres cellules.

Deux autres kit Baclight sont disponibles : le RedoxSensorTM Green vitality kit et le RedoxSensorTM CTC vitality kit.

Dans le RedoxSensorTM Green vitality kit. La différenciation entre cellules mortes et viables se fait grâce à deux fluorochromes : le PI et le RedoxSensorTM Green. Ce dernier est un indicateur de respiration cellulaire, à l'état réduit il émet un signal fluorescent vert. Les cellules viables sont marquées en vert et les autres cellules sont marquées en rouge par le PI.

Le kit RedoxSensorTM CTC vitality kit reprend la méthode de la double coloration CTC/DAPI vu dans le paragraphe précédent. Dans ce kit le DAPI peut être remplacé par le SYTO®24 dont le principe est similaire.

Molecular Probes a donc développé une série de kits permettant de différencier et de dénombrer les cellules viables et mortes.

Une étude comparative a été réalisée sur la flore totale d'eau potable entre le kit LIVE/DEAD® BacLightTM et colorations au CTC et à l'acridine orange (Boulos L. et al., 1999 [5]). Il ressort de cette étude que le système BacLightTM permet d'obtenir des résultats équivalent à une coloration au CTC sur une population de cellules non stressées. Les auteurs décrivent également que le nombre de cellules viables détectées par le système BacLightTM est supérieur à celui dénombré en coloration CTC et par dénombrement sur milieux de culture dans le cas de cellules stressées.

2.1.3 Cytométrie en flux

La cytométrie en flux (CMF) est une technologie largement utilisée en biologie notamment pour ses performances d'analyse mais aussi parce qu'elle permet un tri physique des populations étudiées ainsi qu'un dénombrement des cellules viables. La CMF permet de passer au crible les cellules une par une dans un flux, la rapidité d'analyse peut aller jusqu'à plusieurs milliers de cellules par seconde voir plusieurs dizaines de milliers.

Figure 5 : représentation schématique d'un cytomètre de flux (source INRP : http://www.ifr87.cnrs-
gif.fr/pbc/equipement/cytometre.html)

L'analyse par CMF passe par une préparation des échantillons : la détection des caractères étudiés nécessite une coloration fluorescente. Les cellules marquées sont convoyées dans une buse de très faible diamètre et sont soumises à un rayonnement LASER pour provoquer l'excitation du fluorophore. La fluorescence émise par le fluorochrome, provoquée par le passage du rayon laser dans la gouttelette, est mesurée par un ou plusieurs photomultiplicateurs ou une photodiodes. Les variations des signaux permettent de sélectionner différentes populations de l'échantillon et de les séparer à l'aide d'un champ électrique (Figure 5).

Plusieurs fluorophores permettent de mesurer la viabilité cellulaire et notamment la Rhodamine 123 (Rh-123) (Lopez-Amoros R. et al. 1997 [22]). Ce fluorophore se lie aux membranes plasmiques ; c'est un marqueur cationique révélant la présence de potentiel membranaire. Plus l'activité énergétique des cellules est élevée plus la différence de potentiel au niveau de la membrane seront élevés et plus les cellules accumuleront la Rh-123 (Kaprelyants A.S. et Kell D.B., 1991 [17]). La fluorescéine diacétate est également utilisée comme marqueur de cellule viable. La fluorescéine diacétate permet de détecter une activité métabolique dans les cellules, il s'agit d'un ester qui une fois hydrolysé par une estérase bactérienne libère un composé fluorogène (Diaper J.P. et al., 1994 [12]). Le défaut de ces colorations est que toutes les souches bactériennes ne présentent pas la même sensibilité à ces différents colorants. La même étude montre que le

marquage par le colorant ChemChrome B balayerai un plus large nombre d'espèces bactériennes qu'elles soient à GRAM positif ou négative alors que le FDA serait plus approprié pour colorer les bactéries à GRAM positif (Diaper J.P. et al., 1994 [12]).

D'autres fluorophores vus dans les précédents paragraphes peuvent aussi être utilisés, le CTC, le DAPI, le propidium iodide, le SYTO9 et d'autres (Morin N., 2008 [25]). L'intérêt d'utiliser la cytométrie en flux est d'augmenter la sensibilité et la rapidité de dénombrement par rapport à l'étude microscopique. De plus, le nombre de cellules étudiées par CMF peut être plus important qu'en microscopie ce qui permet un traitement statistique plus fiable.

2.2 Direct Viable Count (DVC)

La méthode Direct Viable Count (DVC) a été décrite par l'équipe de Kogure K. et al. en 1979 (Kogure K. et al, 1979 [19]). Cette méthode consiste à incuber les cellules d'un échantillon à étudier, éventuellement après purification ou extraction de la matrice d'origine, dans un milieu contenant de l'extrait de levures et un inhibiteur de synthèse d'ADN. L'antibiotique utilisé est l'acide nalidixique, il s'agit d'un bactériostatique de la famille des quinolones, il inhibe l'action de la girase empêchant par ce biais la synthèse d'ADN. Les bactéries viables et sensibles à l'acide nalidixique, ne pouvant plus se diviser, vont utiliser l'extrait de levures présent dans le milieu comme substrat et avoir une forme allongée. Ce caractère morphologique permet la différenciation et la numération des germes viables.

Le problème est la sensibilité de la méthode, faussée par les souches naturellement résistantes à cet antibiotique. C'est pourquoi de nombreuses équipes ont travaillées sur la méthode DVC en remplaçant l'acide nalidixique par des cocktails d'antibiotiques. Dans leur article, « Ecological Implications of an Improved Direct Viable Count Method for Aquatic Bacteria » paru en 1997, Fabien Joux et Philippe LeBaron de l'observatoire océanologique de Banyuls sur mer, montrent l'intérêt de l'utilisation d'un cocktail d'antibiotiques dans l'application de la méthode Direct Viable Count sur des échantillons marins (Joux F., LeBaron P., 1997, [15]). Dans un premier temps ils comparent la sensibilité de 100 souches bactériennes isolées de différents environnements marins côtiers à quatre inhibiteurs de synthèse d'ADN (ciprofloxacine, acide nalidixique, acide piromidique, acide pipemidique), et d'un inhibiteur de division cellulaire (cephalexine).

Le tableau 2 nous indique que seulement 36% des souches testées sont sensibles à l'acide
nalidixique. Ces résultats montrent donc que l'action de l'acide nalidixique seul est insuffisante

pour bloquer la croissance de toutes les bactéries d'un échantillon marin. Ceci implique un biais important dans les résultats d'une analyse par la méthode DVC.

Tableau 2 : Sensibilité de 100 souches isolées d'échantillons d'eau de mer (sur deux sites Méditerranéens) à différents antibiotiques. (Joux F., LeBaron P., 1997, [15])

Les auteurs ont alors testé le cocktail d'antibiotiques suivant : acide nalidixique (20ug/mL), acide piromidique (20ug/mL), acide pipemidique (10ug/mL), ciprofloxacine (0,5ug/mL) et cephalexine (10ug/mL).

La figure 6 présente l'évolution de la population bactérienne dans un échantillon d'eau de mer supplémentée avec 50mg/L d'extrait de levures, couplé dans un cas avec l'acide nalidixique et dans l'autre avec le cocktails d'antibiotiques. Les résultats montrent l'efficacité du cocktail d'antibiotiques à inhiber la flore des échantillons.

Figure 6 : Réponse d'un échantillon naturel d'eau de mer à l'ajout d'extrait de levures (50mg/L) et d'antibiotiques.
Barre noire : nombre de bactéries totales sans antibiotique ; barre blanche : nombre de bactéries totales avec acide
nalidixique, barre grise : nombre bactéries totales avec le cocktail antibiotique. Les échantillons présentant des
croissance sont annotés par des astérisques. (Joux F., LeBaron P., 1997 [15])

La combinaison de plusieurs antibiotiques permet d'inhiber la division et donc la prolifération des bactéries pendant 18h d'incubation (statique et à 20°C dans l'obscurité). Ceci permet de prolonger le temps d'incubation et donc le temps d'élongation des bactéries lors du test DVC. La figure 7 illustre ces résultats.

Figure 7 : Observation en microscopie à fluorescence, coloration au DAPI. (A) aspect des bactéries avant incubation,
(B) aspect après 6h d'incubation avec acide nalidixique, (C) aspect après 18h d'incubation avec cocktail
d'antibiotiques. Les flèches indiquent les cellules viables ayant métabolisées l'extrait de levure (Joux F., LeBaron P.,
1997 [15]).

La méthode DVC permet de dénombrer les cellules viables par microscopie. Cependant elle est
limitée par la sensibilité des bactéries aux antibiotiques, certaines résistantes, d'autres trop
sensibles. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter naturellement un

polymorphisme visible au microscope, par exemple un bacille à GRAM négatif peut se trouver dans la même culture en forme de coccobacille ou en forme de très long bacille.

La méthode DVC, optimisée par l'utilisation de cocktails d'antibiotiques, permet d'étudier la viabilité des cellules de certains échantillons. La limite de cette méthode est la différence de sensibilité des bactéries aux antibiotiques, son utilisation doit être précédée d'études préliminaires sur la sensibilité aux antibiotiques des souches étudiées.

2.3 Analyse en Biologie Moléculaire par RT-PCR

L'utilisation des outils de la Biologie Moléculaire a permis l'étude des bactéries à l'état viable non cultivable. Ce paragraphe décrit comment ces outils peuvent permettre la détection de bactéries VNC.

La Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) est une technique utilisée pour la recherche de VNC. Les cibles de cette réaction sont les mRNA transcrits à partir des gènes potentiellement indicateurs d'une viabilité cellulaire. Une étude de S. Yaron et K.R. Matthews compare l'efficacité de la RT-PCR sur des mRNA de différents gènes cibles (Yaron M., Matthews K.R., 2002 [45]). Dans cette étude, la transcription des gènes rfbE, fliC, stx1, stx2, mobA, eaeA, hly et le gène codant pour les ARN 16S est recherchée par une RT-PCR sur des cultures de E. coli O157 :H7 à différents stade de la croissance (figure 8).

Cette expérience permet de montrer que les gènes rfbE, stx1 et le gène codant pour les ARN 16S sont transcrits tout au long de la croissance.

Une seconde expérience est réalisée sur des cellules viables non cultivables ; l'amplification de tous les gènes par PCR, ainsi que l'amplification des mRNA par RT-PCR sont réalisées. Tous les gènes sont amplifiés par PCR alors que la RT-PCR ne permet d'amplifier que les gènes 16S RNA, stx1, rfbE et mobA. Cela signifie que malgré la présence de tous les gènes dans les cellules viables non cultivables seuls les gènes 16S RNA, stx1, rfbE et mobA sont transcrits. Cette expérience fait de ces gènes des cibles préférentielles pour la recherche des E. coli 0157 :H7 par RT-PCR. Les auteurs soulèvent cependant un problème de sensibilité de la méthode en précisant que la présence de 5.105 à 107 UFC sont requis selon le gène ciblé pour obtenir une amplification des transcrits par RT-PCR ; là ou 104 UFC sont nécessaire pour amplifier les gènes par une PCR classique.

Figure 8 : Amplification par RT-PCR : prélèvement d'échantillons à différents temps de la culture (a), résultat des
amplifications (b) : -, pas d'amplification ; +, amplification positive. nt : non traité. (Yaron M., Matthews K.R., 2002
[45])

Une équipe de chercheurs a récemment repris les travaux commencés par Yaron et Matthews et ont réussi diminuer le seuil de détection de la méthode en obtenant une amplification positive à partir de 50 UFC pour un litre d'échantillon (Liu Y. et al. 2008 [21]). Ces résultats ont été possibles grâce à l'utilisation d'une station électronique intégrant la technologie des puces à ADN.

L'inconvénient des méthodes RT-PCR est la spécificité. En effet, lors d'une PCR les cibles sont spécifiques, les gènes exploités dans l'exemple cité ci-dessus ne peuvent être utilisé que dans le cas d'une recherche de E. coli O157 :H7. La méthode restreint l'utilisateur à une seule cible, d'autres auteurs ont cependant déjà développé des méthodes de détection des cellules viables et VNC par RT-PCR pour d'autres espèces, par exemple : Listeria monocytogenes (Klein et Jejuna, 1997 [18]) ou Staphylococcus aureus (McKillip et al., 1998 [24]).

3. ETUDES SUR LA VIABILITE, L'ETAT VIABLE NON CULTIVABLE ET LA RESSUSCITATION

L'état VNC est une stratégie mise en place par les cellules pour survivre en condition de stress extérieur. Cette hypothèse implique que cet état soit transitoire et réversible. De nombreuses études sont menées sur le phénomène de ressuscitation..

3.1 La ressuscitation

La forme la plus simple de retour à l'état cultivable se produit lorsque les conditions sont favorables à la croissance. Une exposition à une température favorable peut suffire à lever l'état VNC (Whitesides M.D., Oliver J.D., 1996 [43]). Cependant ce cas n'est pas généralisé, de nombreux germes nécessitent des conditions particulières pour la levée de l'état VNC. Ces conditions dépendent des germes étudiés, il est donc nécessaire de traiter des exemples d'études sur des germes particuliers.

Certaines études montrent l'effet d'agents antioxydants ou anti-ROS (Réactive Oxygen Species). Les cellules à l'état non cultivable ont un métabolisme réduit, certains gènes ne sont pas exprimés. Dans l'étude menée par Kong et al., les auteurs émettent l'hypothèse que Vibrio vulnificus perd sa capacité à réduire l'H2O2 en raison de l'absence de synthèse de l'enzyme catalase. Les ROS, n'étant plus dégradés, deviennent toxiques et létaux pour les cellules cultivées sur milieux riches. Ce phénomène est d'autant plus vrai sur milieu gélosé où ces agents toxiques ne peuvent diffusés comme dans le cas d'une culture en milieu liquide. Cette hypothèse est vérifiée par l'intermédiaire d'un mutant dépourvu d'activité catalase (oxyR-). Ce dernier est incapable de former des colonies sur milieu HIA, il retrouve cette capacité lorsque le milieu est supplémenté avec une catalase ou du pyruvate de sodium (antioxydant) (Kong I.-S. et al., [20]).

Une autre étude a été menée dans ce sens, montrant l'effet de la ferrioxamine E, molécule sidérophore permettant l'importation de fer dans la cellule. Le fer permet de réduire la production de ROS et donc de réduire les dommages causés aux cellules par ces molécules. En utilisant la ferrioxamine E les auteurs ont réussi à obtenir un taux de cellules ressuscitées élevé en culture liquide (Reissbrodt R. et al. 2002 [35]).

Outres ces effet de l'oxydation sur les cellules d'autres facteurs entre en jeu pour le retour à un état cultivable :

Le cas de Legionella pneumophila a été étudié par Michael Steinert et al., ce germe pathogène pour l'homme est aussi parasite de certains protozoaires. Dans leur étude, l'équipe décrit un retour à l'état cultivable de Legionella pneumophila après avoir été en contact avec Acanthamoeba castellanii, un protozoaire hôte de Legionella (Steinert M. et al., 1997 [39]). L'hôte permet aux germes de se multiplier mais aussi d'être transportés vers un environnement où les conditions sont plus favorables.

Le retour à un état cultivable de Legionella pneumophila est également possible après incubation dans des jaunes d'oeuf fécondés (Hussong D. et al., 1987 [14]). Ce résultat a été reproduit chez d'autres espèces : sur Campylobacter jejuni (Cappelier J.M. et al., 1999 [7]), Listeria monocytogenes (Cappelier J.M. et al., 2007 [6]) et sur Salmonella enterica (Dhiaf A., A. Bakhrouf., 2004, [11]).

Les études citées ci-dessus soulignent l'importance de l'environnement sur le caractère cultivable des bactéries. D'autres études présentent des résultats allant en ce sens :

Reissbrodt et al. ont montré l'effet de molécules baptisées « heat-stable autoinducer ». Ces molécules sont sécrétées par les entérobactéries en présence de norepinephrine. Cette hormone stimule la croissance en simulant l'environnement des entérobactéries hôtes des intestins des mammifères (Reissbrodt R. et al. 2002 [35]).

Dans cette approche de l'importance de l'environnement de la bactérie, une étude a été réalisée sur l'importance de la flore environnante. Le principe de l'étude est de recréer artificiellement l'environnement naturel des germes non cultivable y compris la flore bactérienne. Ainsi les auteurs montrent l'interdépendance de deux types de germes, l'un ne pouvant se développer qu'en présence de l'autre (Kaeberlein T. et al., 2002 [16]).

Ces résultats de co-cultures ont été repris par une autre équipe et ont mené à la découverte de petits peptides agissant comme des facteurs de croissance en induisant la division des germes voisins. Cette étude a été réalisées à l'aide de boite de pétri compartimentées et pouvant laisser diffuser les molécules. (figure 9). (Nichols D. et al., 2008 [28])

Figure 9 : (A) boite de pétri compartimentée, (B-C) co-culture avec croissance des germes induit aux contours du
compartiment central contenant une bactérie sécrétant un signal de croissance , (D) Le compartiment central est vide
(témoin négatif), aucune culture dans le compartiment des bactéries à induire, (E) cellule seule, aucune croissance
n'est observée. (Nichols D. et al., 2008 [28])

Cette étude révèle donc l'existence de facteurs, de signaux peptidiques utilisés par les bactéries pour communiquer. Extraites de leur contexte naturel et en l'absence de signaux extérieurs certaines bactéries de l'environnement ne sont pas capable de se développer en milieu artificiel.

La complexité des facteurs de croissance bactériens explique en partie pourquoi tant de bactéries présentent dans l'environnement ne peuvent être isolées sur milieux de culture.

3.2 Les facteurs de ressuscitation : les protéines Rpf et Sps

Une étude menée sur Micrococcus luteus a permis de démontrer l'influence de la présence de formes viables et cultivables sur les cellules non cultivables dans un même milieu. En présence de cellules cultivables de Micrococcus luteus, les formes VNC de cette bactérie retrouvent leur capacité à se diviser (Votyakova T.V. et al., 1994 [42]). Cette « transmission » du caractère cultivable est induite par la présence de protéines baptisées Resuscitation Promoting Factor (Rpf). Il s'agit d'une peptidoglycane-hydrolase sécrétée par Micrococcus luteus à l'état cultivable. Cette protéine possède une activité lytique sur les composants de la paroi bactérienne et entre autre sur les muropeptides (Telkov M.V. et al., 2005 [39]- Mukamolova G.V. et al., 2006 [26]).

De telles protéines ont également été découvertes chez d'autres espèces, la plupart ont en commun un domaine (« Rpf domain ») et une activité similaire. Les études menées sur chacune des

protéines sécrétées par différentes espèces bactériennes ont permis de les classées en différents groupes. La famille des protéines Rpf comprends plusieurs sous-familles : RpfA, RpfB, RpfC, RpfD, RpfE, les Shorts Rpfs, les protéines LysM ainsi que le groupe des protéines SceA et SceD retrouvées chez Staphyloccocus, ce dernier étant le plus éloigné des autres groupes de protéines Rpf (Ravagnani A. et al., 2005 [34]). Une étude chez Salmonella typhimurium a également montré l'existence d'une protéine de type Rpf permettant un retour à la l'état cultivable (Panutdaporn N. et al., 2005 [32]).

Les protéines Rpf ne sont cependant pas les seules à avoir un effet sur la capacité qu'ont les bactéries à se diviser. La famille des protéines Sps (Stationary phase survival) a été découverte chez les Firmicutes. Ces protéines possèdent une activité lytique sur le peptidoglycane des parois bactériennes, activité similaire aux protéines Rpf. La famille des protéines Sps est également subdivisée en groupes A, B, C D et E ; chacun de ces groupes comprend des protéines possédant un domaine Sps. Les protéines MltA (Membrane-bound lytic transglycosylase A) présentent chez Clostridium ainsi qu'une protéine provenant d'un prophage de Bacillus subtilis, possèdent également un domaine Sps (Ravagnani A. et al., 2005 [34]).

Ces deux familles de protéines ne se retrouvent pas chez les mêmes espèces bactériennes, les protéines Rpf sont retrouvées chez les Actinobactéries alors que les Sps sont retrouvées chez les Firmicutes.

De tels facteurs pourraient avoir un impact sur la microbiologie conventionnelle et les milieux de culture. La mise au point de milieux de culture contenant des facteurs de croissances tels que les protéines Rpf, Sps ou encore des peptides « signal » vu au paragraphe précédent pourrais permettre d'élargir notre connaissance des germes existants dans l'environnement et de découvrir des espèces jusqu'alors non isolées.

CONCLUSIONS

Les formes non viables des bactéries font l'objet de nombreuses études. Les récentes publications montrent que les difficultés rencontrées à cultiver les microorganismes stressés sont dues à une méconnaissance de l'état VNC. La physiologie des cellules non cultivables est mal connue. Certaines études proposent des solutions, par l'intermédiaire de facteurs de croissance ou d'antioxydants. Ce qui amène à reconnaître le fait que si microorganismes non cultivables il y a, c'est que nous ne connaissons pas les solutions permettant de les rendre cultivables.

Les difficultés rencontrées pour cultiver toutes les bactéries présentes dans notre environnement et dans nos aliments rendent l'analyse de ces germes plus complexe. C'est pourquoi différentes méthodes ont été développées afin de pouvoir détecter et dénombrer toutes les bactéries viables. Ces méthodes se basent sur la mise en évidence de caractéristiques de l'état viable :

· Activité enzymatique ou métabolique et respiration cellulaire.

· Etat des membranes.

· Production d'acides nucléiques (RNA).

La plupart de ces méthodes permettent de détecter les cellules viables, mais pas de les identifier ni de les isoler. A l'exception de la RT-PCR qui permet une recherche par espèce.

La RT-PCR permet effectivement de savoir quels types de germes se trouvent dans la matrice étudiée grâce à des amorces spécifiques, mais ne permet pas de les isoler. De plus, le coût d'une analyse en PCR est trop élevé et ne pourrait actuellement pas servir de méthode normalisée de recherche de germes pathogènes dans des matrices alimentaires ou environnementales.

Une des techniques les plus intéressantes et déjà commercialisée (BactiFlow®, AES-Chemunex) est la cytométrie en flux. La CMF permet le dénombrement des cellules viables, la séparation physique entre les cellules viables et les cellules mortes. Un des atouts majeur de la CMF est la rapidité dans le traitement des matrices à analyser.

Malgré tout, les méthodes culturales sont aujourd'hui encore privilégiées dans les normes de recherche des germes pathogènes. C'est pourquoi les recherches sont encore tournées vers la microbiologie Pasteurienne, essayant de définir les molécules nécessaires à la croissance des germes VNC.

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LISTE DES ABBREVIATIONS

Par ordre alphabétique :

· ADN (ou DNA) : Acide DésoxyriboNucléique.

· AFNOR : Association Française de NORmalisation.

· ARN (ou RNA) : Acide Ribonucléique.

· ATP : Adénosine TriPhosphate.

· BHI : Brain Heart Infusion, milieu de culture.

· CCD (caméra) : Pour Charge Coupled Device, converti un signal lumineux en signal électrique.

· CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, sel de tétrazolium formant un composé fluorescent (Formazan).

Image extraite de: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Tetrazolium_reduction.png

· CMF : cytométrie en Flux.

· DAPI : 4'-6 diamino-2 phenylindole (Florophore) permet la coloration de l'ADN.

Image extraite de : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Mitose/43fluobleue.htm

· DVC : Direct Viable Count.

· FDA : Food and Drugs Administration.

· HIA: Heart Infusion Agar, milieu de culture gélosé.

· INRP : Institut national de recherche pédagogique ( http://www.inrp.fr/inrp).

· LASER : Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation.

· LPS : LipoPolySaccharide, il s'agit d'une chaine polyosidique lié à une chaine lipidique (Lipide A) insérée dans la membrane plasmique des bactéries à GRAM négatif.

· mRNA : ARNm, ou Acide RiboNucléique messager.

· pH : Potentiel Hydrogène.


· PI : Propidium Iodide.

· PCR : polymerase chain reaction.

· ROS : Reactive Oxygen Species.

· Rpf : Resuscitation promoting factor, famille de protéines.

· RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction.

· Sps : Stationary Phase Survival, famille de protéines.

· TSA : Tryptone Soy Agar, milieu de culture.

· UFC : Unité Formant Colonie, les UFC sont l'unité de dénombrement sur milieux gélosés.

· VBNC : Viable But NonCulturable (viable mais non cultivable).

· VNC : Viable non cultivable.