Memoire Online - Evaluation de la toxicité des moules (mytilus galloprovencialis) issues de Jorf Lasfar (JL) et Oualidia (OL) sur la moelle osseuse chez le rat

L'eau côtière n'est pas un bien marchand comme les autres mais un patrimoine qu'il faut protéger, défendre et traiter comme tel. Le Maroc possède une richesse maritime considérable à haute productivité biologique, qui contribue à son développement socioéconomique. Ce domaine marin si riche en faune et en flore impose un engagement pour la protection et la préservation de ses ressources naturelles inestimables pour les générations futures.

Ces dernières années le littoral subit l'influence d'une pression démographique croissante et d'une concentration industrielle importante. La région de Jorf Lasfar abritant une industrie de traitement de minerais des phosphates (figure 1) qui contiennent des métaux toxiques (Al, Cd, Cr, Cu, Hg, Pb etc...) connus par leurs effets néfastes, notamment mutagènes, cancérigènes, génotoxiques et cytotoxiques (Arisa et Wiliams 1996 ; Bernier et al., 1995). Ces polluants divers sont rejetés directement dans la mer et sans aucun traitement préalable, ils peuvent induire à une eutrophisation de l'environnement marin et favoriser les croissances des microalgues productrices de toxines marines. L'ensemble des éléments toxiques, notamment les métaux et les toxines marines peut avoir un impact sur la faune marine et provoquer des effets toxiques. Par l'effet du courent du nord vers le sud (figure 1), ces polluants rejetés dans le site JL peuvent être entraînés et contaminer d'autre région comme celle d'Oualidia (OL) (figure 1), zone touristique, maraîcher et d'ostréiculture connue à l'échelle nationale et internationale. Ces déchets nocifs rejetés dans la mer peuvent être concentrés par les animaux filtreurs et plus particulièrement par les moules (Mytilus galloprovincial is). Plusieurs épisodes d'intoxication voir même des décès qui ont été déjà observées suite à la consommation de fruits de mer en 1971 à Casablanca, Safi, Mohammedia, Rabat, etc. (Taber, 1986), en 1975 à Casablanca, Safi et Kenitra, en 1982 à Agadir (51 cas d'intoxication et deux décès) (Bourhili, 1984), puis récemment, plusieurs intoxications ont entraîné 23 hospitalisations et quatre décès (Tagmouti, et al., 2000).

Figure 1 : localisation des sites d'études (Jorf Lasfar et Oualidia) sur la côte atlantique Marocaine

L'objectif de cette étude est d'une part, caractériser le danger par dosage des métaux toxiques (Al, Cd, Cr, Cu et Pb) dans les moules séchées issues de deux sites situés sur la côte atlantique Marocaine : Jorf Lasfar, Site potentiellement pollué par les rejets chimiques des traitements des phosphates bruts, situé à 125 km au sud de Casablanca et Oualidia, site agricole et touristique situé à 45 km au sud de JL (figure 1). D'autre part, tester in vivo sur des rats la toxicité subchronique, en fonction des quantités des moules séchées ingérées par intubation gastrique et pendant 28 jours, tout en évaluant :

Le taux des métaux toxiques (Cd, Cr et Pb) dans les organes cibles (foie et reins) ; Le taux des différentes lignées de la moelle osseuse hématopoïétique

I. LES MOULES

I.1. Choix des moules

Les organismes marins plus particulièrement les moules, concentrent les contaminants, en particulier les métaux, en fonction des concentrations présentes dans le milieu (Goldberg, 1975; Philips, 1977; Philips et Segar, 1986). C'est dans cette optique que Goldberg (1975) a proposé de suivre, à l'échelle internationale, les concentrations des contaminants dans les organismes vivants pour surveiller le milieu marin. En effet, ces bivalves présentent des caractéristiques, qui en font de bons bioindicateurs très largement utilisés dans divers programmes de surveillance de la pollution des milieux marins. Elles ont été choisies pour les raisons suivantes :

) Large répartition géographique allant des régions tempérées aux régions subarctiques; ? Mode de vie sessile et euryhalin ;

La respiration chez les moules (figure 4) se fait en filtrant activement l'oxygène dans l'eau a l'aide des branchies, les mollusques filtreurs se nourrit principalement de phytoplancton et d'autres matières organiques, la croissance de moule est optimale dans un milieu où la nourriture est riche et abondante. Les moules vivent partout dans le monde, dans les eaux polaires, tempérées, peu profonds et légèrement saumâtres, elles se trouvent également dans des milieux très profonds a forte salinité en haute mer.

II. DONNES TOXICOLOGIQUES

La côte atlantique marocaine contribue en grande partie à l'économie nationale, du fait de la concentration industrielle (80 % des effectifs permanents des industries), touristique (50 % de la capacité d'accueil) et commercial (92 % du commerce extérieur) (REEM, 1999).

En effet cette industrialisation croissante a été accompagnée d'une pollution inquiétante et représente une menace pour la préservation de la richesse en faune et en flore marine (Chafik et al., 2001). Quant à l'appauvrissement biologique, les pertes de la biodiversité, les problèmes de la pêche, la dégradation des sites d'intérêt biologique, historique et culturel, ne peuvent être, que des signes alarmants de l'état critique du littoral atlantique marocain.

Certaines substances polluantes telles que les pesticides, les hydrocarbures et les déchets issues de traitement des minerais de phosphate (métaux, phosphate, sulfate, nitrates, chlorures...) (Kaimoussi et al., 2001) sont souvent, déversées dans la mer et accumulées par les organismes marins, leurs concentration s'amplifient à travers les maillons de la chaîne trophiques. La qualité des eaux côtières atlantiques marocaines a été suivie de 1993 à 1996, dans le carde d'un programme de surveillance, visant à évaluer l'état des lieux du littoral atlantique marocain, par Chafik et al., (2001), Ce qui a pu montrer des concentrations importantes en nitrates, en oxygène dissous, matière en suspension, révélant ainsi la trace des émissaires d'eaux usées urbaines et industrielles, notamment à Mohammedia, Casablanca, Kenitra, Jorf Lasfar et Safi. Dans l'axe El Jadida-Safi des teneurs élevées en métaux ont été mesuré chez M. galloprovincialis, d'origine industriels (traitement de minerais de phosphate) (Chafik et al., 2001 ; Kaimoussi et al., 2001). Cette contamination par les métaux toxiques (Al, Cd, Cr, Cu...) est accentuée ces dernières années, et les concentrations mesurées dépassent largement les normes internationales (Moustaid et al., 2005).

Dans certaines conditions de pollution marine, des micro-algues peuvent produire des toxines qui se concentrent dans les moules, dont la consommation engendre des intoxications chez l'homme (Yasumoto et al., 1984 ; Wright et al., 1989). Les toxines marines (l'acide okadaïque et ses dérivés) sont impliquées dans la peroxydation lipidique et l'inhibition de la synthèse d'ADN et des protéines (Matias et al., 1999 ; Traoré et al., 2001). Des études de cytotoxicité sur des cellules intestinales humaines (Caco-2) (Traoré et al., 1999 et 2000) ont montré que des métaux lourds, en particulier le Cd, et des toxines marines ont un effet synergique dans la peroxydation lipidique et dans la modification des bases puriques et pyrimidiques (m5dC, 8-OH-dG).

Au Maroc, en 1999, date à la quelle une eau colorée à Lingulodinium polyedrum est survenue le long des côtes marocaines atlantiques. Observée au début dans la région de Kenitra, elle s'est étendue avec la dérive littorale jusqu'au sud de Safi et a touché, au passage, une zone soumise à une surveillance sanitaire. Cette zone comprend d'importants gisements naturels de moules et de palourdes, ainsi que les sites exploités d'Oualidia et de Sidi Moussa. Cette efflorescence est apparue pour des températures des eaux superficielles (17-18 °C) propices au désenkystement et au développement du dinoflagellé. Le schéma observé de deux à trois bandes parallèles à la côte a suggéré une agrégation du phytoplancton générée par des vagues internes engendrées par les vents modérés de direction et de vitesse constantes. Les toxines de type diarrhéique trouvées dans certains coquillages (moules, huîtres) ne peuvent être le produit de L. polyedrum mais plutôt d'espèces accompagnatrices telles Dinophysis acuminata et D. acuta qui ont été dénombrées par Joutei, (2002).

Si les métaux sont souvent indispensables au déroulement des processus biologiques (oligoéléments), nombre d'entre eux peuvent s'avérer toxiques, lorsque leur concentration dépasse un seuil, c'est le cas du Fe, Cu, Zn, Ni, Se, Mo et Mn (Miquel, 2001). D'autres ne sont pas nécessaires à la vie et peuvent être même néfastes comme As, Cd, Cr, Hg, Pb et Sb, (Chiffoleau et al., 2001)

II.2.1. Le Cadmium

Le cadmium est toxique pour l'homme et une exposition excessive pourrait causée la mort (Othumpangat et al., 2005), Il s'introduit dans les cellules et s'accumule en grande concentration dans l'espace cytoplasmique et nucléaire (Beyersmann et al., 1997; Satoh et al., 2003). Il a une forte affinité pour le foie et les reins (Cai et al., 2001), Chez l'homme, le phénomène de toxicité aiguë est connu depuis 1950 sous le nom de syndrome d'Itai-Itai défini par l'association d'une insuffisance rénale avec ostéoporose (déminéralisation et fragilisation des os) et ostéomalacie (déminéralisation et déformation des os). Il est cancérigène (Satoh et al., 2002; Banerjee et al., 2005) et tératogène (Hovland et al., 2000). L'effet génotoxique et apoptotique a été observé dans plusieurs type de cellules (Fahmy et al., 2000; Kim et al., 2005; Mondal et al., 2005). Le comité mixte FAO/OMS, a recommandé chez l'homme une dose hebdomadaire tolérable (DHT) de Cd, de 7 ìg/ kg de poids corporel et par semaine.

II.2.2. Le Plomb

Le seuil de qualité sanitaire réglementaire est de 1,5 mg/kg dans l'alimentation selon le règlement européen CE 221/2002. C'est un élément toxiques (Le Roux et al., 2005). Plusieurs recherches ont prouvé que le plomb peut causer des troubles neurologiques, hématologiques, gastro-intestinales, reproductives, immunologiques et apoptotiques (Patrick, 2006 ; Xu et al., 2008). En outre, l'acétate et le phosphate de plomb sont classés parmi les agents concérigènes (NIEHS, 1994), l'agence internationale de la recherche sur le cancer a classé aussi cet élément dans la liste des composés inorganiques 2B (l'agent est peut-être cancérogène pour l'homme) des produits chimique (IARC, 1987; Pulido et Parrish, 2003). Des études récentes, ont montré que le Plomb inhibe l'activité des enzymes impliquées dans le stress oxydatif (glutathione peroxidase, catalase et desuperoxide dismutase) (Bolin et al., 2006; Ercal et al., 2001). D'autres études in vitro ont montré l'augmentation de la production des radicaux libres après traitement avec le Plomb inorganiques (Aykin-Burns et al., 2005, Chen et al., 2003). Risom et al. (2005) ont démontré que les radicaux libres sont responsables, d'une manière directe ou indirecte, de nombreux dommages oxydatifs (figure 5) au niveau des macromoléculaire (acides nucléiques, protéines, lipides...), les résidus acides gras polyinsaturés de phospholipides membranaires et des lipoprotéines, sont extrêmement sensibles à l'oxydation, initiant ainsi des chaînes de peroxydation lipidique en produisant des aldéhyde et principalement le malonyle dialdehyde (M DA). Ces deux produits notamment les radicaux libres et le MDA induit d'irréversible dommages dans l'ADN, ainsi qu'un dysfonctionnement mitochondrial (Xu et al., 2008).

II.2.3. Le Chrome

Le chrome s'accumule principalement dans les poumons, il est hautement toxique. Une intoxication aiguë peut provoquer une tubulonéphrite et une intoxication chronique au chrome développe des lésions cutanées et des muqueuses avec des atteintes respiratoires allant jusqu'à des cancers broncho-pulmonaires (Rodier et al., 1996). Le Cr (VI) pénètre les cellules a travers le système de transport des ions, une fois à l'intérieur de la cellule il est réduit en Cr (III) (Goodale et al., 2008). Cette forme réduite du Cr et/ou un ou plusieurs des intermédiaires,est probablement un ultime agent génotoxique et susceptible d'inciter des cassures au niveau du double brin d'ADN (Xie et al., 2005 ; Goodale et al., 2008).

Figure 5 : Mécanismes d'induction du stress oxydatif par les métaux toxiques. Proposé par Risom et al. 2005.

Si les efflorescences phytoplanctoniques toxiques ou non, ne sont pas des phénomènes d'origine récente, leur implication dans la mortalité massive de poissons et dans les problèmes de la consommabi lité des coquillages, est une préoccupation majeure de ces dernières années.

Les algues microscopiques planctoniques constituent la nourriture de base pour un bon nombre d'organismes vivants des océans, notamment pour les bivalves filtreurs commercialisés (moules, huîtres, coquilles Saint-jacques, palourdes) ainsi que pour les larves de crustacés et de poissons. Dans la plupart des cas, les proliférations ou les efflorescences algales sont bénéfiques pour la faune et l'aquaculture. Toutefois sous certaines conditions hydrologiques et climatologiques, des espèces peuvent se développer si intensément qu'elles en arrivent à modifier la couleur apparente de la surface des mers et à conduire à des épisodes d'eaux colorées (Reizopoulou et al., 2008). L'origine algale de certaines intoxications faisant suite à la consommation de produits de la mer n'a été découverte qu'en 1937 par Sommer et Meyer pour les toxines paralysante PSP (parlytic Shllfish poisoning) et en 1979 pour la ciguatera (Yasumoto et al., 1979). Au cours de ces dernières années les eaux rouge comme les épisodes phytoplanctoniques néfastes sont en expansion tant par leur nombre, que par leur fréquence et intensité (Anderson, 1989 ; hallegraeff, 1993). Certains scientifiques pensent que la multiplication de ces épisodes nuisibles, est reliée ces dernières années dans certains cas à des processus d'eutrophisation et/ou des conditions climatiques anormales. Les activités de transports (eaux de ballast contenant des kystes d'espèces toxiques) et d'aquacultures ont également été mises en cause dans l'extension géographique des efflorescences.

II.3.1. Les toxines diarrhéiques (DSP) (figure 6)

Il s'agit de polyéthers linéaires qui sont produits par les genres Dinophysis et Prorocentrum. L'acide Okadaïque (AO) est la phycotoxine la plus répandue, mais selon l'espèce algale en cause, l'AO est substitué en DTX1 (dinophysistoxine) ou DTX2. L'AO est un inhibiteur de phosphatases, enzymes impliquées dans les processus de la multiplication cellulaire, l'inhibition de ces dernières entraîne une accumulation de protéines phosphorylées dans le cytoplasme, ce qui peut résulter d'une contraction des muscles lisses et expliquer l'activité de promotion tumorale démontrée chez la souris (Arendt et al., 1995 et Chen et al., 2006).

II.3.2. Les toxines paralysantes (PSP) (figure 7)

Elles comprennent les saxitoxines et les gonyautoxines dont on dénombre aujourd'hui un peu plus d'une vingtaine de molécules dont le squelette moléculaire commun est la saxitoxine (STX) produite par des Dinoflagellés du genre Alexandrium (Lassus et al. 1994, Amzil et Motteau 2000). Ces intoxications entraînent une paralysie musculaire et, dans les cas les plus graves, peuvent être mortelles lorsque le système respiratoire est atteint. La STX agit en bloquant les canaux Na⁺, empêchant la naissance d'un potentiel d'action au niveau des cellules excitables, ce qui peut entraîner la mort par paralysie des muscles respiratoires quand la dose est suffisante (Cheun et al., 1996). La _DL50 sur souris de la STX est de 10 ìg.kg^-1. (Cheun et al., 1998).

III. LA MOELLE OSSEUSE HEMATOPOÏTIQUE

La majorité des cellules sanguines matures sont destinées à vivres quelque heures (polynucléaires), voir quelques semaines (globules rouges) avant d'être détruites. A fin de compenser cette destruction rapide, la moelle osseuse hematopoïtique, chez un homme de 60 kg doit assurer 2.10¹¹globules rouges et 1,6.10⁹ polynucléaires par jours. Cette intense production journalières a lieu dans la moelle osseuse hematopoïtique et réglée par un système très complexe, de facteurs de croissances et d'inhibitions, le tout dans un écosystème très adapté (microenvironnement médullaire), on distingue quatre compartiments, d'importance inégale, dans un système hematopoïtique (figure 8) :

? Le compartiment des cellules souches hematopoïtiques : Dans la moelle osseuse des cellules mères dites cellules souches hematopoïtiques destinées à assurer le renouvellement de l'ensemble des cellules sanguines, myéloïdes et lymphoïdes, ces cellules souches hematopoïtiques ont une capacité d'autorenouvellement et de différenciation, elles sont identifiées comme cellules souches hematopoïtiques totipotentes.

? Le compartiment des progénitures engagés : Ces cellules sont engagées dans une ou plusieurs voies de différenciation, leurs capacité d'autorenouvellement est réduite, ce processus d'engagement aboutit finalement a des progénitures totalement prédéterminées, différenciées en une seules lignée, on distingue :

III.1. La lignée lymphoïde

III.2. La lignée myéloïde

III.2.1. La lignée Erythroïde

III.2.3. La lignée granulocytaire

III.2.3.1. Les polynucléaires neutrophiles

III.2.3.2. Les polynucléaires éosinophiles

III.2.3.3. Les polynucléaires basophiles

III.2.3. La lignée monocytaire

I.2. Site Jorf Lasfar (figure 9).

I.2. Site Oualidia (figure 10)

les moules congelées sont décortiquées égouttées, pesées puis séchées de façon à former une préparation stable dans une étuve portée à 60°C, pendant des intervalles de temps réguliers (12h), les échantillons sont pesés jusqu'à l'obtention d'une masse constante. On prépare une suspension mère (SM) comme suit : 600 mg de moules séchées et finement broyées dans un mortier, sont mises en suspension dans 10 ml d'eau ultra pure et thuraxés à l'ultra thurax, deux fois pendant 2 min puis la SM est diluée au 1/2 et au 1/1 0.

Figure 9 : photo prise par satellite du site de prélèvement : Jorf Lasfar.

Figure 10 : photo prise par satellite du site de prélèvement : Oualidia.

Les rats utilisés (35 rats) de souche Wistar (centre d'élevage DEPRE, Saint-Doulchard, France), de masse moyenne 74,47 #177; 3 g, sont répartis en 7 lots de cinq rats (figure 11). Un contrôle parsitologique, bactériologique et virologique a été réalisé par l'unité vétérinaire et agroalimentaire du laboratoire de Touraine (France), sur trois rats s'est révélé négatif. Les rats ont été acclimatés aux conditions expérimentales du laboratoire pendant 5 jours avant le gavage. Le traitement des rats a été fait par intubation gastrique à l'aide d'une sonde spéciale. Des homogénats ont été préparé à des quantités équivalentes de différents échantillons de moules prélevées à différentes périodes (mai à octobre 2004) issues de chaque site OL et JL, Chaque lot est ensuite traité avec la dose 6, 30 et 60 mg/ 100 g de poids vif, 1 fois toutes les 24 heures pendant 28 jours. Le lot témoin a été gavé dans les mêmes conditions avec de l'eau ultra pure.

Après le dernier jour de traitement, les rats sont placés dans des cages métaboliques pendant 24 h afin de collecter les urines sans contamination fécale. Les animaux sont alors pesés et sacrifiés par décapitation. Les organes (coeur, rein, foie et cerveau) sont prélevés et pesés. Les échantillons (urine et organes) sont immédiatement stockés à -28 ?C jusqu'à utilisation.

Figure. 11 : Répartition des rats destinés au gavage avec la poudre de moules JL et OL

La lecture a été réalisée sur 1000 cellules par lame au microscope photonique à l'objectif 1 00X. Puis on réalise une formule complexe en comptant tout d'abord le taux respectif de chaque lignée (figure 8, page 15) :

La lignée granulocytaire (neutrophile, éosinophile et basophile): le myéloblaste, le promyélocyte, le myélocyte, le métamyélocyte, le granulocyte non segmenté et le granulocyte neutrophile.

La lignée lymphoïde : le lymphoblaste, le petit lymphocyte; le grand lymphocyte et le plasmocyte.

La lignée érythrocytaire : Proérythroblaste, Erythroblaste basophile, Erythroblaste plychromatophile, Erythroblaste acidiphile et Erythrocyte.

Les résultats sont présentés sous forme de moyennes #177; SEM (erreur standard sur la moyenne) et analysés pour les différences significatives en utilisant un test non paramétrique de :

I. DOSAGE DES METAUX DANS LES MOULES :

Le dosage des métaux toxiques et plus particulièrement celui d'Al, Cd, Cr, Cu et Pb a été réalisé sur une période de six mois courent mai à octobre 2004, sur des moules séchées prélevées au hasard dans deux sites. JL (site potentiellement pollué par les rejets chimiques des traitements de minerais de phosphate) situé à 120 km au sud de Casablanca et OL (site agricole et touristique situé à 45 km au sud du site JL). Les résultats obtenus (figure 12) montrent des teneurs en Al, Cd Cr et Cu chez M. galloprovincialis nettement plus élevées, par rapport à celles obtenues dans la littérature, quelque soit la période et le site de prélèvement. Par ailleurs ces teneurs sont plus élevées dans le site JL par rapport au site OL à l'exception de l'Al et du Cu.

L'étude de l'évolution temporelle de la concentration en Cadmium chez M. galloprovincialis est représentée sur la figure 12A. Le dosage du Cd dans les moules séchées issues du site JL montre des teneurs qui varient de 75 à 118,7 .ig/g de poudre de moules, correspondant aux mois de mai et de septembre respectivement. Quant aux moules du site OL, les teneurs en Cd sont de 6 à 26 .ig/g de poudre de moules, prélevées au cours des mois août et mai respectivement. Ces teneurs sont significativement très faibles par rapport à celles trouvées dans les moules JL, montrant ainsi une forte contamination des moules JL par rapport aux moules OL (4 à 12 fois plus forte). Les normes du règlement européen (CE) n° 266/2001, précisent que le seuil de qualité sanitaire réglementaire en Cd est fixé à 5 .ig/g du poids sec de mollusques. Ainsi nos dosages montrent une concentration 21 fois supérieurs dans le cas des moules JL et deux fois supérieurs chez celles de OL.

Les concentrations en Aluminium dans la poudre de moules issues des deux sites JL et OL (figure 12B) sont très élevées. Elles augmentent du moi de mai à octobre, en passants de 197 à 417,2 .ig/g de poudre de moules issues du site JL. Alors que pour le site OL, une fluctuation mensuelle a été observée avec deux pics de forte concentration en Al, le premier en mai et le deuxième en août avec des taux de 115 et 317 .ig/g des moules séchées respectivement. Les teneurs en Al sont très élevées dans le site JL et dans le site OL, bien que ce dernier est loin de toute sorte de pollutions industrielles. Ces teneurs élevées pourraient avoir une origine aussi bien naturelle qu'anthropique. Cependant, seul le dosage de ce métal dans des zones continentales, proche de nos sites, pourrait le confirmer.

Figure 12 : Teneurs en métaux toxiques dans les moules séchées issues des sites JL et OL. Cd (A), Al (B), Cr (C), Cu (D), Pb (E)

Les histogrammes représentent les teneurs mensuelles en métaux toxiques dans la poudre des moules, n = 1 *Supériorité significative des teneurs en métaux obtenues dans le site JL par à OL pour P < 0,05

Le dosage du Chrome dans la poudre de moules issue des site JL et OL (figure 12C), a montré que les taux de contaminations des moules est significativement plus importants dans le site JL que dans le site OL (2 à 5 fois plus supérieur). En effet, durant toute la période d'étude la concentration en Cr dans les moules OL est relativement stable autour d'une moyenne de 4,8 #177; 0,9 .ig/g de poudre de moules. Dans le site JL une variation mensuelle a été observée avec des teneurs en Cr qui varient entre 7,5 et 23,7 .ig/g de poudre de moules prélevées aux mois juillet et août respectivement. Les concentrations en Cr dans les moules OL sont inférieurs a celles trouvées au cours de la période allant d'août 2001 à février 2002 par Moustaid et al., (2005), elles restes également inférieurs a celles trouvés par Maanan, (2008) (tableau II), par contre les teneurs trouvés dans moules JL sont pratiquement similaires a celles trouvés auparavant par Moustaid et al., (2005).

Les teneurs en Plomb dans les moules issues de JL et OL prélevées à différentes période sont représentées sur la figure 12D. Le Pb est sous forme de trace, les taux mesurés en ce métal ne dépassent pas 0.12 et 014 .ig/g de poids secs des moules OL et JL respectivement. Ces teneurs en Pb restent très faibles par rapport à celles obtenues dans les moules issues des mêmes sites (OL et JL), prélevées au cours de la période allant d'août 2001 à février 2002 (Moustaid et al., 2005). Elles sont également inférieurs au seuil de qualité sanitaire réglementaire qui est de 7,5 .ig/g poids sec des mollusques, du règlement européen CE 266/2001.

Les taux en Cuivre (figure 12E) sont très élevés dans la poudre des moules issues des deux sites JL et OL. Ils vont de 168 à 583 .ig/g de poudre de moules issues du site OL correspondant aux mois d'août et de septembre respectivement. Pour le site JL ils varient entre 260 et 689 .ig/g de poudre de moules et pour les mois juin et juillet respectivement. Ces teneurs sont très élevées par rapport a celles mesurées chez les moules issues des côtes de la ville El Jadida (tableau II), obtenues notamment par Chafik et al., (2001) et par Maanan, (2008).

Les teneurs en métaux trouvées dans les moules issues des deux site OL et JL, notamment celles du Al, Cd, Cu et Cr sont très élevées par rapport à celles déjà obtenues auparavant dans des moules issues des mêmes sites par Kaimoussi et al., (2001) et par Chafik et al., (2001). Elles sont très élevées aussi par rapport à celles obtenues au cours de la période août 2004 à mai 2005 par Maanan, (2008), (tableau II). Cette différence de concentrations pourrait s'expliquer, par la procédure de minéralisation utilisée en particulier par Chafik et al., (2001), qui ne détruit pas complètement les matières organiques et qui sous-estime donc largement

les concentrations en métaux. Contrairement à la technique de minéralisation utilisée par ces auteurs qui donne une suspension, notre méthode de minéralisation dans un four à micro ondes permet d'obtenir une solution limpide qu'on analyse sans filtration.

Les teneurs en Al, Cd, Cu et Cr sont très élevés dans les moules issues du site JL que dans celles issues du site OL et dépassent les normes décrites dans la littérature, elles sont très élevées a celles trouvées au nord de la cote atlantique de l'Espagne par Besada et al., (2002) (tableau II). Cependant les variations mensuelles des teneurs en métaux toxiques pourraient s'expliquer soit par le rythme des activités industrielles et les apports d'eau de pluie qui peuvent mettre en suspension les sédiments contenant des ions métalliques toxiques. En outre, le processus de bioaccumulation des éléments métalliques chez les moules est lié à des facteurs biotiques (cycle biologique, age, nutritions...) ainsi qu'aux conditions physicochimiques de leurs milieu aquatique, peuvent influencer considérablement la variation des taux des métaux (Buestel, 1997 ; Saha et al., 2006). Cette contamination des moules par les métaux toxiques confirme la pollution du site JL principalement par les rejets du traitement des minerais de phosphate du complexe Jorf Lasfar Phosphore, les rejets de la centrale thermique qui utilise le charbon comme source d'énergie, le port Jorf Lasfar et sans oublier les rejets urbaines de la ville d'El Jadida. Ces rejets industriels et urbains sont souvent drainés plus loin par le courant Nord-Sud, en contaminant d'autres eaux côtières. Le site OL situé à 45 km au sud de JL se trouve ainsi contaminé par les charges polluantes du site JL.

II. EVALUATION DE TOXICITE DES MOULES SUR LES RATS

Lors du traitement des rats par les moules récoltées sur le site OL, plusieurs effets directs visibles ont été observé, notamment dressement des poils, diarrhées et stress. Nous avons aussi observé lors des essais de prélèvement du sang que ce dernier avait une couleur légèrement noirâtre et qu'il coagulait rapidement par rapport au sang des rats témoins.

Des travaux récents réalisés par Nasser et al., (2008) ont montrés que les extraits de moules (lipophiles et hydrophiles), contaminées par des métaux toxiques issues des sites JL et OL et tester in vitro sur des cellules humaines intestinales type caco 2, perturbent la biosynthèse des macromolécule, la viabilité cellulaire par inhibition de la fonction mitochondriale et provoquent la fragmentation de l'ADN. Compte tenus des teneurs très élevés en métaux toxiques dans les moules notamment celles du Cd, sachant que ces métaux ne jouent aucun rôle biologique et du fait que ces métaux sont hépatotoxiques (Li et al., 2007), néphrotoxiques(Cai et al., 2001), génotoxiques (Kim et al.,2005 ; Nasser et al., 2008) et apoptotiques (Tersago et al., 2004 ; Mondal et al., 2005 ; Jung et al., 2007). Nous avons étudié l'effet du traitement par des moules contaminées par des métaux toxiques sur la concentration en Cd, Cr et Pb dans les organes cibles à savoir le foie et les reins des rats traités avec différentes doses de poudres de moules issues des deux sites, une fois toute les 24 heurs. Après 28 jours de traitement les animaux ont été sacrifiés, le foie et les reins ont été récupérés pour doser les métaux (Cd, Cr et Pb) comme décrit dans le paragraphe (dosage des métaux, pages 23).

L'analyse statistique a montré une différence significative des concentrations du Cd dans les organes des rats traités avec la poudre des moules issues des deux sites JL et OL (figures 1 3A et 14A). En effet, les teneurs en Cd accumulées dans le foie et les reins des rats augmentent avec la quantité de poudre de moules administrées. Ces teneurs sont toutefois très élevées dans les reins que dans le foie, elles sont de l'ordre de 7,3 #177; 1,3 et 4,3 #177; 0,33 .ig/g des reins des rats gavés avec 60 mg de poudre de moules issues des sites JL et OL respectivement, par 100g de poids vifs. Dans le foie, elles sont de 2,85 #177; 0,9 et de 1,7 #177; 0,37.ig/g de foie des rats gavés avec 60 mg de poudre de moules issues des sites JL et OL respectivement, par 100g de poids vifs. Chez le lot des rats témoins les teneurs hépatiques et rénales ne dépassent pas 0,97 #177; 0,14 et 2,3 #177; 0,3 .ig/g respectivement. Dietrich et al., (2006) ont traité des souris par voie orale, avec 1.ig de CdCl2/g/jour et pendant cinq jours, les résultats obtenus ont montré une accumulation hépatique et rénales du Cd.

Figure 13 : Teneurs en métaux toxiques dans les reins des rats traités avec la poudre des moules JL et OL

Les histogrammes représentent la moyenne #177; SEM en jtg de métaux par g des reins, n = 3.

Figure 14 : Teneurs en métaux toxiques dans le foie des rats traités avec la poudre des moules JL et OL. Cd (A), Cr (B) et Pb (C)

Les histogrammes représentent la moyenne #177; SEM en tg de métaux par g de foie frais, n = 3. *Différence significative par rapport aux témoins pour P < 0,05

Toutefois ces teneurs en Cd restent inférieur a celles que nous avons trouvés dans notre étude, cela pourrait être expliqué par le fait que le moules utilisées pour gaver les rats contiennent des teneurs très élevées en Cd (548,03 tg/g/ 28 jours) (tableau III), ainsi que la longue durée de traitement (28 jours).

L'analyse statistique montre une variation significative des teneurs en Cr dans les reins des rats traités par les moules issues des deux sites JL et OL (figure 12B). D'une manière générale, le dosage a montré des fortes concentrations rénales et hépatiques en ce métal, elles varie aussi selon la quantité et l'origine des moules ingérées. En effet les teneurs en Cr sont de 3,85 #177; 0,84 et 2,5 #177; 0,15 .ig/g des reins des rats gavés avec 60 mg de moules JL et OL respectivement, par 100g de poids vifs. En ce qui concerne le Cr dans le foie (figure 14B) aucune variation significative n'est observé chez les rats traités par intubation gastrique avec les moules issues des deux sites.

Les teneurs en Pb dans le foie et les reins des rats traités avec les moules de JL et OL sont respectivement représentées sur les figures 13C et 14C. Les taux en Pb dans les reins augmentent d'une manière significative avec les quantité et l'origine des moules ingérées, ils sont de l'ordre de 4,1#177; 1, et 2,67 #177; 0,24 15 .ig/g des reins frais des rats gavés avec 60 mg de moules de JL et OL respectivement, par 100g de poids vifs. Dans le foie les taux en Pb ne varient pas d'une manière significative. Les taux en Pb dans les organes sont supérieurs a la quantités totales en Pb dans les moules ingérés pendant les 28 jours du gavage, ceci est surprenant (tableau III). L'explication la plus probable est une contamination soit au niveau de la nourriture, soit nos animaux ont été déjà contaminés.

Les teneurs en métaux toxiques (Cd, Cr et Pb) sont supérieurs dans le foie et les reins des rats traités avec les moules séchées issues des deux sites, par rapport aux rats témoins, ces teneurs sont toutefois plus élevées dans les reins que dans le foie. Les métaux tels que le Cd possèdent une très forte affinité pour le foie et les reins, son accumulation s'effectue principalement dans ces deux organes (Cai et al., 2001 ; Li et al., 2007). La distributions et la retentions de ce métal est étroitement liées à la biosynthèse des métallothionéines. Lors d'une longue exposition aux métaux tels que le Cd, il y a induction des métallothionéines dans le foie et dans les reins, qui se fixent sur les métaux, le complexe formé est ensuite éliminé par les reins, jusqu'à ce que la capacité de ces derniers a synthétisé cette protéines soit dépassée, les métaux vont alors s'accumuler et entraîner une lésions dans les organes (Dietrich et al., 2006).

Tableau III : teneurs des métaux (Cd, Cr et Pb) en tg/g de foie et des reins frais des rats traités avec les moules JL et OL

Jorf Lasfar

Oualidia

Poudre
de moules*

Reins

Foie

Poudre
de moules*

Reins

Foie

38,38
254,75
548,03

2,36 #177; 0,13

2,75 #177; 0,1

3,6 #177; 0,3^*

7,3#177; 1,3^*

0,97 #177; 0,14

1 #177; 0,12

1,4 #177; 0,2
2,85 #177; 0,9 *

3,13

15,70
32,00

2,36 #177; 0,13
2,65 #177; 0,8
3 #177; 0,26

4,3 #177; 0,34 *

0,8 #177; 0,2 0,83 #177; 0,16 1,28 #177; 0,08 1,7 #177; 0,37 *

1,43#177; 0,17

1,3 #177; 0,3

1,43#177; 0,17

1,3 #177; 0,3

1,19

1,57 #177; 0,16

1,7 #177; 0,2

1,6 #177; 0,2

2#177; 0,03

2,97

5,99

2,2 #177; 0,23

1,4 #177; 0,4

15,03

1,7 #177; 0,05

1,97 #177; 0,09

11,72

3,85 #177; 0,84 *

1,5 #177; 0,7

29,39

2,5 #177; 0,15^*

1,5 #177; 0,1

1,25 #177; 0,22

0,71 #177; 0,2

1,25 #177; 0,22

0,8 #177; 0,2

0,02

1,58 #177; 0,21

0,72 #177; 0,13

0,01

1,5 #177; 0,26

0,7 #177; 0,2

0,11

2,21#177; 0,23^*

0,75 #177; 0,05

0,05

2,2 #177; 0,47

0,73 #177; 0,26

0,21

4,1 #177; 1,3 *

1,87 #177; 0,6

0,10

2,67 #177; 0,24 *

1,2 #177; 0,09

* Calculé a partir de quantité totale de poudre de moules ingérées au cours des 28 jours de gavage. * Différenoe significative par rapport aux témoins pour P < 0,05 avec n= 3.

Figure 15 : Gain de poids corporel (%) des rats traités avec la poudre de moules issues de JL et OL

L'histogramme représente la moyenne de gain de masse corporelle #177; SEM en % * Différence significative par rapport aux témoins pour P < 0,05 avec n= 5

Plusieurs auteurs ont déjà montrés que les métaux toxiques ont des effets néfastes sur les tissus osseux et le système immunitaire (Burns et al., 1995 ; Tersago et al., 2004 ; Hemdan et al., 2006). Ces polluants métalliques sont capable de moduler le système immunitaire, cette immunomodulation est soit une immunosuppression, soit immunopotentialisation et qui dépend entre autres, de la nature du métal, de sa concentration et de sa biodisponibilité (Lawrence et al., 2002 ; Tersago et al., 2004 ; Lynes et al., 2006). Les métaux toxiques ont également un effet néfaste sur le développement des cellules souches, mais on sait peut de chose sur leur réponse toxicologiques. Etant donné que la moelle osseuse hématopoïétique contient des cellules matures, des précurseurs, des progénitures et des cellules souches multipotentes. Ces deux dernières sont également dotées d'une capacité d'autorenouvellement et de différenciation (Rando, 2006), et elles sont impliquées dans des maladies inflammatoires chroniques ainsi que le cancer (Reya et al., 2001 ; Dietrich et al., 2006 ; Dalerba et al., 2007). Ces cellules peuvent représenter une cible clé de substances toxiques en raison de la faiblesse éventuelle de leur système de réparation de l'ADN, ce qui pourrait faciliter la mutagenèse après expositions toxiques (Trosko et Tai, 2006 ; Gioacchino et al., 2008). Les réponses

toxicologiques des cellules souches sont relativement peu connues, et différentes de celles des autres cellules en raison de leurs propriétés biologiques uniques liées a leurs rôles de rénovation et la répartition des tissus (Rando, 2006), de leurs processus biochimiques ainsi que de leurs compartiments intracellulaires (Inoue et al., 2002). Pour ces multiples raisons nous avons choisi de déterminer l'effet de moules contaminées par des métaux toxiques sur la moelle osseuse hématopoïétique.

Durant cette étude nous avons compté au microscope photonique (X100) 1000 cellules du tissu médullaire sur lame colorées au Geimsa. La lignée granulocytaire neutrophile (myéloblaste, promyélocyte, myélocyte, métamyélocyte, et polynucléaire neutrophile), la lignée granulocytaire éosinophile, la lignée basophile, lignée Monocytaire (petit monoblaste, grand monoblaste promonocyte, monocyte basophile et monocyte) et la lignée lymphoïde (lymphoblaste, petit lymphocyte, grand lymphocyte).

II.3.1. Evolutions de la lignée granulocytaire neutrophile

La numération de la lignée neutrophile (figure 16A), montre une baisse significative inversement proportionnelle à la quantité des moules administrées, elle est plus accentuée chez les rats gavés avec les moules JL que chez ceux gavés avec les moules OL. En effet le taux de la lignée neutrophile est de 57,8 #177; 2,1 %, 47,7 #177; 2,8 %, 41,6 #177; 2,6 % et 33,98 #177; 3,6 % respectivement pour les doses 0, 6, 30 et 60 mg de moules séchées issues du site JL par 100 g de poids vif des rats. Chez les rats traités avec les mêmes doses des moules séchées issues du site OL le taux de la ligné est de 57,8 #177; 2,1 %, 46,8 #177; 2,1%, 48,7 #177; 3,5% et 41 #177; 1,1% respectivement. Cette baisse pourrait être le début d'une neutropénie notamment chez les rats traités avec la poudre de moules JL. Des études immunotoxicologiques sur des souris de bois exposées au métaux lourds ont montrées une corrélation négative entre les teneurs des métaux dans le foie des rats et aux taux des leucocytes (Tersago et al., 2004). La baisse des taux des leucocytes a été observée aussi chez des cellules souches hématopoïétiques, issues du sang du cordon ombilical, exposées au Cr et au Cd, cette baisse est due au déclenchent de la mort cellulaire par autophagie (Gioacchino et al., 2008).

II.3.2. Evolutions de la lignée granulocytaire basophile.

En ce qui concerne la lignée granulocytaire basophile (figure 16B), la plus rare des lignées hématopoïétiques, La numération au microscope photonique (X100) a montré une absence quasiment totale des basophiles chez les rats témoins. Par contre, les basophiles sont présentes chez les rats traités avec les moules issues des deux sites. En effet, on a obtenu des taux de


									*

Figure 16 : Effets de la poudre de moules issues des sites JL et OL sur les l'hématopoïèse.

Lignée neutrophile (A), basophile (B), éosinophile (C), monocytaire (D) et lymphocytaire (E), L'histogramme représent la moyenne #177; SEM en %

l'ordre de 0,55 #177; 0,05 et 1,28 #177;0,38% chez les rats traités avec 30 et 60 mg de poudre de moules OL respectivement, par 100g de poids vifs. Chez les rats traités avec la poudre de moules JL les taux des basophiles sont de l'ordre de 0,71#177;0,18, de 1,3#177; 0,4 et de 0,82 #177; 0,24 % pour les doses 6, 30 et 60 mg par 100g de poids vifs. Etant donné que le faible taux des granulocytes basophiles est responsable des réactions d'hypersensibilités (choc anaphylactique), leur biosynthèses peut s'expliqué par la présence de(s) allergène(s) dans les moules OL et JL.

II.3.3. Evolutions de la lignée granulocytaire éosinophile.

L'évolution de la lignée granulocytaire éosinophiles en fonctions des quantités des moules administrées (figure 16C), montre une baisse significative du taux de lignée éosinophile chez les rats traités avec la poudre de moules OL. Cette baisse est de 3 #177; 0,71, 1,61 #177; 0 ,6 et 2,8 #177; 0,2 % (contre 6 % chez le témoin) chez les rats traités avec les doses 6, 30 et 60 mg de poudre de moules OL respectivement, par 100g de poids vifs. Chez les rats traités avec les moules JL, seule la dose 6 mg de moules par 100g de poids vifs a entraîné une baisse (3,6 #177; 0,9 %) de la lignée éosinophile, cependant les doses 30 et 60 mg/100g de poids vif n'ont entraîné aucune variation significative. Cela suggère que la baisse de cette lignée ne dépend pas de la dose administrée. Les éosinophiles sont cellules immunitaires indispensable au défense antiparasites, une étude chez le souri de bois exposé au métaux lourds dans une fonderie a montré que la résistance aux parasites augmente avec la distance qui sépare les souris de la fonderie (Tersago et al., 2004).

II.3.4. Evolutions de la lignée myéloïde monocyte.

La numération de la lignée monocytaire (figure 16D) des rats traités avec moules récoltées sur le site JL, montre que les taux de cette lignée augmentent avec les doses des moules administrées, toutefois l'analyse statistique montre que cette augmentation est significative seulement chez les rats traités avec 60 mg de poudre de moules par 100 g de poids vifs, par rapport au rats témoins. Aucune variation significative n'est observée chez les rats traités avec les moules OL par rapport au rats contrôle.

II.3.5. Evolutions de la lignée lymphoïde

Aucune variation significative n'a été observé dans la lignée lymphoïde (figure 16E) chez les rats traités avec les différentes doses des moules de OL et de JL par rapport aux rats témoins à l'exception du lot traité avec la dose 60 mg de poudre de moules de JL par 100 g de poids vifs (27 #177; 3,2 % contre 33,2 #177; 2,9 % chez le témoin).

L'évaluation de la cytotoxicité subchronique sur la moelle osseuse hématopoïétique des rats traités par intubations gastrique par les doses 6, 30 et 60 mg de poudre de moules contaminées par des métaux toxiques, a été réalisé sur une période de 28 jours. A notre connaissance, il n'existe pas de données publiées sur la cytotoxicité des moules contaminées par les métaux toxiques sur l'hématopoïèse. Notre étude a montré une baisse de la principale lignée granulocytaire (lignée des neutrophiles) et une augmentation de la lignée basophile chez les rats traités avec la poudre de moules issues des sites JL et OL. Cependant la relation de la dose des moules avec le niveau de perturbation de l'hématopoïèse est difficile à établir. Beaucoup d'auteurs ont montré que les métaux toxiques notamment le Cd, Cr, et Pb sont capables de moduler le système immunitaire (Burns et al., 1995 ; Tersago et al., 2004 ; Hemdan et al., 2006). Cette immunomodulation est soit une immunosuppression ou immunopotentialisation et qui dépend de la nature du métal, de sa concentration, sa biodisponibilité, ainsi que d'autre facteurs (Lawrence et al., 2002 ; Tersago et al., 2004 ; Lynes et al., 2006). Des faibles doses en Cd ont causé une altération intracellulaire, notamment dilatation du réticulum endoplasmique rugueux et des dommages mitochondriaux chez les cellules souches hématopoïétique humaine isolées de sang du cordon ombilical (Gioacchino et al., 2008). Ces modifications constituent la preuve d'un certain niveau de toxicité pour la moelle osseuse hématopoïétique et suggèrent, que les cellules progénitures sont très sensibles aux métaux toxiques même à des très faibles doses qui ne sont pas toxiques pour d'autres systèmes cellulaires (Burastero et al., 2006 ; Mazzotti et al., 2002).

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Conclusion

Cette étude avait pour objectifs, d'une part la détermination des concentrations de cinq métaux (Al, Cd, Cr, Cu et Pb) dans les moules séchées issues du site : Jorf Lasfar (JL) (site potentiellement pollué par les rejets chimiques des traitements des minerais des phosphates bruts) et Oualidia (OL) (site situé a 45 km au sud de JL et réputé par ces lagunes d'ostréicultures) (figure 1) sur une période de six mois courent mai à octobre 2004. D'autre part l'évaluation de l'effet de ces moules in vivo chez le rat.

Les résultats obtenus montrent des concentrations très élevées en Al, Cd, Cr et Cu dans les moules du site JL et OL par rapport à celles indiquées dans la littérature. Par ailleurs ces teneurs son nettement plus élevées dans le site JL que dans le site OL a l'exception d'Al et du Cu. Elles varient aussi en fonction du moi de prélèvement. Ceci pourrait s'expliquer soit par le rythme de l'activité industrielle, soit par l'influence des facteurs biotiques et abiotiques du processus de bioaccumulation des éléments métalliques chez les moules. La contamination des moules par les métaux toxiques confirme la pollution du site JL principalement par les rejets du traitement des minerais de phosphate du complexe Jorf Lasfar Phosphore, les rejets de la centrale thermique qui utilise le charbon comme source d'énergie, le port Jorf Lasfar et sans oublier les rejets urbaines de la ville d'El Jadida. Ces rejets industriels et urbains sont souvent drainés plus loin par le courant Nord-Sud, en contaminant d'autres eaux côtières. Le site OL situé à 45 km au sud de JL se trouve ainsi contaminé par les charges polluantes du site JL.

Le dosage des métaux toxiques (Cd, Cr et Pb), dans les organes cible (foie et reins) des rats traitées avec la poudre des moules JL et OL a montré une forte accumulation des métaux dans les reins par rapport au foie notamment celle du Cd. Elle est plus accentuées chez les rats gavées avec les moules JL par rapport a OL. Cependant, les teneurs en métaux trouvé dans ces deux organes restent très faible part rapport aux quantités totales trouvées dans la poudres de moules utilisées dans le traitement des rats, a l'exception du Pb, dont les teneurs trouvées dans le foie et les reins sont supérieurs a celles dosées dans la poudre des moules JL et OL.

Le gavage des rats avec les moules issues des deux sites a entraîné une baisse du poids corporel par rapport aux contrôles traités avec de l'eau. Au cours de traitement des animaux avec la poudre des moules OL, des effets directs visibles ont été observés notamment dressement des poils de la fourrure des animaux, diarrhée et le sang avait une couleur « brun chocolat » et coagulait rapidement par rapport au sang des rats témoins. Compte tenu que site OL est si riche en faune et en flore, l'hypothèse de l'existence des toxines marines (DSP,

PSP etc...) a été émise. Leurs identifications et proportions relatives n'ont pas été déterminées.

La numération des différentes lignées cellulaires de la moelle osseuse chez les rats montre, d'une manière générale une perturbation de l'hématopoïèse, incarnée par une augmentation du taux de la lignés basophile et une baisse du taux de la lignée neutrophile et lymphoïde des animaux traités avec les moules de JL. Ceux traités avec la poudre de OL, ont augmenté aussi le taux de la lignée basophile et ont baissé légèrement le taux de la lignée neutrophile ainsi que celle de monocyte. Ces résultats, selon notre étude bibliographique ont montré pour la première fois le phénomène observé à savoir la myélotoxicité chez le rat causé par l'ingestion de la poudre de moules issues des sites d'étude.

L'ensemble des résultats obtenus nous poussent à émettre l'hypothèse que la consommation des moules JL et OL, peut entraîner une toxicité chez le consommateur. Cependant, l'extrapolation à l'homme des résultats de cette étude, ne peut être permise, que si des investigations épidémiologiques à grande échelle et sur une longue période soient réalisées.

Pour que l'eau côtière ne soit pas un bien marchand comme les autres mais un patrimoine qu'il faut protéger, défendre et traiter comme tel. Nous soulignons sur la nécessité d'une action législative basée sur une politique rationnelle, efficace et cohérente, dont les acteurs seront l'état, l'industrie, les communautés locales et sans oublier le public, et doit être fondée sur les principes de précaution et d'action préventive et sur le principe de la correction, par priorité à la source, des atteintes à l'environnement ainsi que sur le principe du pollueur- payeur.

Au terme de cette étude, certains aspects se sont révélés très intéressants a poursuivre. Il s'agit :

V' D'élargir la zone d'étude d'échantillonnage surtout dans le site OL afin de pouvoir déterminer la source de pollution.

V' Du traitement des rats avec les moules issues des sites d'étude sur de longues périodes (90 jours), du dosage des métaux dans les organes cibles (foie et reins), de l'étude des enzymes marqueurs de la pollution et de l'étude de l'effet des moules sur l'état de l'ADN.

V' D'une étude in vitro sur des cellules humaines des extraits hydrophiles et lipophiles afin d'évaluer leurs effets cytotoxiques et génotoxiques.

V' De l'extraction des toxines hydrophiles et lipophiles des moules, de l'identification et purification par chromatographie liquide a haute pression accouplée au spectromètre de masse (HPLC-SM).

V' Enfin d'une étude épidémiologiques sur une longue échelle et a long terme chez les population cibles.

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INTRODUCTION GENERALE

INTRODUCTION