Memoire Online - Optimisation des conditions de culture des lipases chez une souche bactérienne de type Actinomadura Keranitilytica par RSM

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité: Biochimie Appliquée

Optimisation des conditions de culture des lipases chez une souche bactérienne de type Actinomadura Keranitilytica par



	Remerciements Nous tenons tout d'abord à remercier Dieu le Tout Puissant et Miséricordieux, qui nous a donné la force et la patience d'accomplir ce modeste travail. La première personne que nous tenons à remercier est notre encadreur madame Benamia Fatiha Professeur à l'université Badji Mokhtar-Annaba pour son dévouement encadrement continu, pour les remarques constructives qu'elle a fournies ainsi que pour ses précieux conseils durant toute la période de notre travail. Ses conseils nous ont été d'une grande aide. Qu'elle trouve dans ce travail un hommage vivant à sa haute personnalité. Particulièrement, nous tenons à remercier notre co-encadreur monsieur Ladjama Ali Professeur à l'université Badji Mokhtar-Annaba pour l'orientation, la confiance, la patience qui ont constitué un apport considérable sans lequel ce travail n'aurait pas pu être mené à bon port. Nos vifs et chaleureux remerciements vont également à madame Habbeche Amina M.C.B à l'université Badji Mokhtar-Annaba de nous avoir fait l'honneur de présider le jury. Mes remerciements vont également à monsieur Chekireb Djamel Professeur à l'université Badji Mokhtar-Annaba pour l'intérêt qu'il a porté à notre recherche en acceptant d'examiner et juger notre travail, aussi de l'enrichir par ses propositions. C'est avec un grand plaisir que nous témoignons ici toute notre reconnaissance à la doctorante Semache Noura pour vous remercier beaucoup pour votre contribution à ce travail qui était fructueux, et pour vos idées et vos remarques que vous n'avez jamais hésité à nous les donner avec un grand coeur généreux, vous méritez tout notre profond respect et toute notre reconnaissance.




		Dédicace ,fie dédie ce modeste travail à *Ma très chère mère Drabna Saliha* Source inépuisable de tendresse, de patience et de sacrifice. Quoique je puisse dire et écrire, je ne pourrais exprimer ma grande affection et ma profonde reconnaissance. Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour exprimer ce que tu mérites pour tous les sacrifices que tu n'as cessé de me donner depuis ma naissance, durant mon enfance et même à l'âge adulte. Ta prière et ta Bénédiction m'ont été d'un grand secours tout au long de ma vie. Puisse Dieu Tout Puissant, te préserver et t'accorder santé, longue vie etBonheur *Mon très cher père Mansouri Djilani* De tous les pères, tu es le meilleur. Tu as été et tu seras toujours un exemple pour moi par tes qualités humaines, ta persévérance et perfectionnisme. Tes conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. Ta patience sans fin, ta compréhension et ton encouragement sont pour moi le soutien indispensable que tu as toujours su m'apporter. ,fie te dois ce que je suis aujourd'hui et ce que je serai demain et je ferai toujours de mon mieux pour rester ta fierté et ne jamais te décevoir. Aucune dédicace ne saurait exprimer mes respects, ma reconnaissance et mon profond amour. Puisse Dieu vous préserver et vous procurer santé et bonheur. Mes frères & soeurs Aucune dédicace ne peut exprimer la profondeur des sentiments fraternels et d'amour, d'attachement que j'éprouve à vos égards. ,fie vous dédie ce travail en témoignage de ma profonde affection en souvenirs de notre indéfectible union qui s'est tissée au fil des jours. Puisse dieu vous protéger, garder et renforcer notre fraternité. *Mes neveux* : Nassim ,jad, ferial , amir ,adam ,younes , et assil A tous ceux que j'aime et qui m'aimentJe dédie ce travail espérant avoir répondu à leur souhait de me voir réussir. Rayane Mansouri.




		Dédicace Je dédie ce modeste travail à *Ma très chère mère Maouche Assia* Affable, honorable, aimable : Tu représentes pour moi le symbole de la bonté par excellence, la source de tendresse et l'exemple du dévouement qui n'a pas cessé de m'encourager et de prier pour moi. Tu as fait plus qu'une mère puisse faire pour que ses enfants suivent le bon chemin dans leur vie et leurs études. Je te dédie ce travail en témoignage de mon profond amour. Puisse Dieu, le tout puissant, te préserver et t'accorder santé, longue vie et bonheur. *Mon très cher père Hadji Djamel* De tous les pères, tu es le meilleur. Aucune dédicace ne saurait exprimer l'amour, l'estime, et le respect que j'ai toujours eu pour vous. Rien au monde ne vaut les efforts fournis jour et nuit pour mon éducation et mon bien être. Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as consentis pour mon éducation et ma formation. *Mes soeurs Soumia & Hadjer* Je vous dédie ce travail en témoignage de ma profonde affection en souvenirs de notre indéfectible union qui s'est tissée au fil des jours. Puisse dieu vous protéger, garder et renforcer notre fraternité. Hadji khaoula.

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La demande en thermo-enzymes pour des applications biotechnologiques est de forte croissance. Les lipases sont des enzymes qui font partie de la famille des hydrolases qui interviennent dans l'hydrolyse des lipides. Vue la polyvalence de ces enzymes, les lipases ont attiré l'attention des chercheurs scientifiques grâce à leur large spectre d'application dans divers secteurs industriels.

Au cours de ce travail, nous avons cherché à optimiser différents paramètres impliqués dans la production de lipase extraite d'une souche sauvage d'actinomycète thermophile Actinommadura keritiniltytika Cpt29 (souche de laboratoire avec numéro d'accession KC447297).

Les résultats obtenus montrent que la recherche des conditions optimales, à partir de la méthode RSM, a permis de localiser la valeur optimale de l'activité enzymatique des lipases produites chez la souche d'actinomycète thermophile Cpt29. La valeur optimale obtenue (182 U/ml) est trois fois plus grande que celle prise après extraction (70U/ml).

Mots clés : Actinommadura keritiniltytika Cpt29, Lipase, Thermophiles, Optimisation.

CHAPITRE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1.4. Matériel génétique des actinomycètes
1.1.5. Cycle de développement des Actinomycètes

1.1.7. Intérêt des actinomycetes

CHAPITRE 2. MATERIELS ET METHODES

2.3. Optimisation des paramètres de culture de la lipase .
2.3.1.Présentation de la méthode des plans d'expériences

2.3.1.2. Méthode de plans d'expériences

2.3.1.4. Analyse des résultats de calcul

CHAPITRE 3. RESULTATS ET DISCUSSION

Tableau	Titre	Page
01	Classe Actinobacteria.	6
02	Habitats de certains actinomycètes.	10
03	Caractéristiques physico-chimique des microorganismes producteur des lipases	14
04	Micro-organismes producteurs de lipasess.	17
05	Aperçu des applications	18
06	Facteurs et domaines du plans de criblage	34
07	Matrice des expériences de criblage	35
08	Effet et coefficient estimés pour la réponse	36
09	Analyse de variance pour l'activité lipasique.	37
10	Facteurs et domaine d'élude du plan de Box-Behnken.	38
11	Plan de Box-Behnken et les résultas expérimentaux obtenus.	39
12	Coefficients estimés pour l'activité U/ml.	40
13	Analyse de variance pour l'activité U/ml.	40

Figure	Titre	Page
01	Observation au microscope électronique à balayage illustrant les types fragmentaire et permanent du mycélium des actinomycètes. (A) Bactéries du genre Nocardia en fragmentation, (B) Bactéries du genre Streptomyces en sporulation.	7
02	Cycle de développement des actinomycètes sur milieu solide .	9
03	Présentation de la réaction enzymatique, qui catalyse l'hydrolyse ou la synthèse de triglycéride.	13
04	Mécanisme d'intervention de la triade (Ser-Hist-Asp) et formation de l'acyl-enzyme.	15
05	pH-stat piloté par un micro ordinateur ( SI ANALYTICS Titroline^® 7000).	23
06	Aspect morphologique d'actinomycète thermophile strain cpt29.	24
07	La courbe y = f(x) .	26
08	L'établissement du plan d'expériences .	28
09	Graphique de comparaison de réponse mesurée et estimée.	30
10	Diagramme de Pareto des effets des variables explicatives.	37
11	Diagramme des réponses mesurées en fonction de celles estimées.	41
12	Diagrammes de contours présentant les effets des différents facteurs sur l'activité.	42
13	Optimisation de l'activité par la fonction Désirabilité.	43

INTRODUCTION

Les enzymes sont des protéines qui allient la capacité de reconnaitre très spécifiquement des molécules au pouvoir de catalyser efficacement leur transformation en composées utiles au métabolisme des organismes vivants. Les réactions chimiques dans les systèmes biologiques se font rarement en l'absence d'enzymes et celles-ci ne favorisent pas seulement une réaction chimique donnée, elles empêchent aussi la présence de réactions secondaires gênantes. Une enzyme est une protéine, qui de par sa séquence et sa structure tertiaire ou quaternaire, possède la capacité d'interagir avec une autre molécule et de la modifier chimiquement.

C'est ainsi qu'au cours de ces dernières années, les enzymes se retrouvent dans de nombreux domaines : chimie fine, agro-alimentaire, secteur biomédical, etc. Pour cela beaucoup de recherches s'orientent maintenant vers l'étude de la spécificité et l'exploitation du potentiel synthétique d'enzymes produites à partir de souches de micro-organismes. Divers microorganismes, notamment différentes espèces d'actinomycètes présentent des capacités de biodégradation des molécules organiques aussi variées que récalcitrantes. Cette fonction de biodégradation est due à la variété d'enzymes qu'elles peuvent synthétisé telles que les cellulases, les xylanases, les amylases et les lipases (A.J.Mc Carthy et al.,1992). Ces dernières années, il a été rapporté que des enzymes thermoactives ont été extraites des souches bactériennes du type Actinomycètes thermophiles, parmi ces enzymes on cite les keratinases d'Actinomadura keratinilytica (A.Habbeche et al., 2014).

C'est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés à la recherche d'enzymes lipasiques produites par des souches bactériennes d'Actinomycètes autochtones thermophiles issues du compost de poulet qui est connu pour abriter des microorganismes thermophiles. Dans le présent travail, une souche d'actinomycète isolée à partir d'échantillons de déchets de volailles riches en matières organiques, ont fait l'objet d'un criblage dans cette optique.

La première partie de ce manuscrit est consacrée à une présentation bibliographique sur les actinomycètes en général ainsi qu'un aperçu sur les enzymes lipasiques. La seconde partie du document développe les méthodes utilisées et les résultats obtenus relatifs aux différentes étapes de ce travail à savoir l'extraction et l'isolement de l'enzyme lipidique, l'optimisation de production de l'enzyme.

INTRODUCTION

Chapitre 1 : Etude bibliographique Chapitre 2 : Méthodes et matériels Chapitre 3 : Résultats et discussion

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE 1.1. Généralités sur les Actinomycètes

Les microorganismes sont omniprésents dans notre environnement (le sol, l'air et les eaux)

et ne cessent d'occuper une place de plus en plus importante dans notre vie et sont actuellement à l'origine de l'essor du domaine de la biotechnologie (S.Smaoui,2010)

Parmi ces microorganismes, les actinomycètes ont acquis une importance particulière, car ils sont la source la plus importante pour la productions d'antibiotiques et d'autres métabolites secondaires (K.Sudo et al.,1995; J.J.Sanglier et al.,1996 ; Y.Takahashi et S.Omura,2003 et M.Kitouni et al.,2005 ; A.M.Valan et al.,2008) , ils sont connus pour être à l'origine de la production d'environ 80% des antibiotiques commercialisés (J.Bérdy,2005).

Etymologiquement, le mot actinomycète a été dérivé des mots grecs «Aktis» qui veut dire rayon et «mykes» qui veut dire champignon «Champignons à rayons» ou «Champignons rayonnants». Les actinomycètes ont été considérés comme un groupe intermédiaire entre bactérie et champignons. Maintenant, ils sont reconnus comme des organismes procaryotes. Pourtant, ces microorganismes présentent des similitudes à la fois avec les bactéries et avec les champignons (H.Merizig,2015).

Les actinomycètes, ou Actinobacteria, sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies circulaires à la morphologie complexe (H.Merizig,2015). Ce sont des bactéries Gram-positives aérobies qui forment des filaments ramifiés ou hyphes et de spores asexuées. Bien qu'ils constituent un groupe diversifiés, les actinomycètes partagent de nombreuses propriétés (L.M.Prescott et al., 2003). Ces bactéries constituent l'ordre des Atinomycetales. Ce sont des bactéries formant des filaments minces et ramifiés, septées, bacilles à Gram positive; possédant un coefficient de Chargaff (GC%) élevé compris entre 60-70%, la majorité saprophytes. La plupart des espèces sont immobiles, hétérotrophes mais certaines sont chimio-autotrophes (H.Merizig, 2015).

Les actinomycètes sont très répandues dans la nature, surtout dans les sols ou leurs capacités métaboliques très étendues leurs font jouer un rôle majeur dans le recyclage de la matière organique. Divers microorganismes, notamment différentes espèces d'actinomycètes présentent des capacités de biodégradation des molécules organiques aussi variées que récalcitrantes.

Cette fonction de biodégradation est due à la variété d'enzymes qu'elles peuvent synthétisé

telles que les cellulases, les xylanases, les amylases et les lipases (A.J.Mc Carthy et al.,

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

1992). Ces dernières années, il a été rapporté que des enzymes thermoactives ont été extraites des souches bactériennes du type Actinomycètes thermophiles, parmi ces enzymes on cite les keratinases d'Actinomadura keratinilytica (A.Habbeche et al.,2014) .

Les actinomycètes appartiennent au règne des Procaryotes, à la division des Firmicutes et à

la classe des Thalobacteria, contenant l'ordre des Actinomycetales (J.P.Larpent,2000). La classe des Actinobacteria se présente comme suit (tableau 1) :

La plus part des genres sont des bâtonnets, non sporulant, de forme irrégulière, Ces bâtonnets peuvent être droits ou légèrement incurvés(L.M.Prescott,2003).

- Le second comprend des organismes qui sont morphologiquement plus complexes que le premier (H.Merezig,2015).

Le mycélium des actinomycètes présente une grande diversité de morphologies. On rencontre des espèces dont le mycélium est rudimentaire au point d'être inexistant (la plupart des Mycobacterium), d'autres au mycélium fugace, qui se fragmente (certaines Nocardia), et enfin des espèces au mycélium développé et persistant comme dans le genre Streptomyces. Les mycéliums fragmentaires et permanents sont illustrés sur la (figure 1).

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

Figure 1. Observation au microscope électronique à balayage illustrant les types fragmentaire et permanent du mycélium des actinomycètes. (A) Bactéries du genre Nocardia en fragmentation, (B) Bactéries du genre Streptomyces en sporulation (L.Belyagoubi, 2014).

Les conidies peuvent, suivant les groupes, être produites isolément (Micromonospora), deux à deux longitudinalement (Microbispora), en courtes chaînes (Actinomadura), en longues chaînettes (Streptomyces). Les chaînettes de spores peuvent être ramifiées ou non, droites, sinuées ou en spirales. De plus, elles peuvent être rayonnantes autour d'hyphes sporophores (Streptoverticillium) (http: // www .universalis.fr/encyclopedie/actinomycetes, mai 2018). Les actinomycètes sont reconnus depuis plus de cent ans principalement sur des critères morphologiques. Ils sont généralement considérés comme des bactéries capables de ramifier les hyphes à un stade de leur développement (https: // doi . org / 10. 1146 / annurev. Mi . 37 .100183.001201, mai 2018). Pour la plus part des actinomycètes ne sont pas mobiles et lorsque qui il y a une mobilité, elle est limité aux spores flagellés qui permettent la dispersion dans les habitats aquatiques (L.M.Prescott,2003).

1.1.3. Physiologie des Actinomycètes

La croissance des actinomycètes est influencée par plusieurs paramètres physiologiques en particulier : l'oxygène, le pH, la température...etc. ces paramètres se présentent comme suit :

? Oxygène : On peut deviser les actinomycètes selon leurs types respiratoires en deux grands groupes : Les formes fermentatives anaérobies strictes ou facultatives, représentées par le genre type Actinomyces, et les formes oxydatives aérobies, telles que les Streptomyces.

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

? pH: Pour le pH, la plupart des actinomycètes se comportent comme des bactéries neutrophiles, et font une croissance optimale dans un intervalle de pH compris entre 7 et 8. Mais on peut observer une croissance à des valeurs de pH inférieurs à 4 (R.E.McKinney,2004), telle est le cas pour les souches acidophiles comme le genre Streptacidiphilus (L.Wang et al.2006).

? Température: La température optimale de croissance est entre 25 à 30°C, mais les espèces thermophiles peuvent croitre à des températures entre 55 et 65°C (G.Rangaswami et al.,2004).

? Tolérance en NaCl: Selon leurs exigences en NaCl, les microorganismes sont divisés en deux groupes :

? Les halophiles : Ce sont ceux qui ont besoin de sel (NaCl) pour leurs croissances, cette concentration peut varier de 1 à 6 % (Poids/Volume) pour les faiblement halophiles, jusque 15 à 30 % pour les bactéries halophiles extrêmes.

? Les halotolérants : Acceptent des concentrations modérées de sels mais non obligatoires pour leurs croissances. On distingue, ceux qui sont : légèrement tolérants (tolère de 6 à 8 % de NaCl (Poids/Volume) ; les modérément tolérants (tolère de 18 à 20 % de NaCl (P/V) ; et les extrêmement tolérants (se développe de 0 % jusqu'à saturation en NaCl) (H.Merizig,2015).

1.1.4. Matériel génétique des actinomycètes

Le matériel génétique des actinomycètes est constitué d'ADN (Acide désoxyribonucléique) chromosomique ainsi que chez certaines souches par l'ADN plasmidique ou de l'ADN phagique. La plus part des actinomycètes sont caractérisées par une proportion élevée en (G/C) environ 70 %.

Elles possèdent un remarquable degré de variabilité génétique due à des réarrangements du

génome à cause de plusieurs types de mutations essentiellement chromosomiques, les plasmides peuvent aussi être sujets à des réarrangements. (H.Merizig, 2015).

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE 1.1.5. Cycle de développement des Actinomycètes

Le cycle de vie de nombreux actinomycètes commence par la germination des spores (Figure 2). Ce processus nécessite la présence des ions de calcium. Cette germination donne naissance à un mycélium primaire ramifié (R.O'Gara et al., 2008). Un mycélium aérien vient s'installer au-dessus du mycélium de substrat. Ce dernier s'autolyse et les produits de la lyse sont utilisés par le mycélium aérien. C'est généralement, à ce moment-là que les composés dit métabolites secondaires sont synthétisés (S.Smaoui, 2010). A l'extrémité du mycélium aérien se forme des spores asexuées à paroi fine appelées conidies ou conidiospores. Ces spores naissent par séptation du mycélium primaire habituellement en réponse à un stresse environnemental comme le manque de nutriment par exemple. Si les spores sont enveloppées dans un sac, on les appelle des sporongiospores.

Généralement ces spores ne sont pas résistantes à la chaleur, mais résistent bien à la dessiccation et sont donc doués de capacités adaptatives importantes. Les actinomycètes sont immobiles, excepté pour les spores de certains genres (Actinoplan, Spirillospora....etc.) (L.M.Prescott et al,2010).

Figure 2: Cycle de développement des actinomycètes sur milieu solide (A. Breton et al .,1989).

Historiquement, les actinobactéries étaient largement considérées comme des bactéries du

sol, mais sont maintenant reconnues comme étant cosmopolites. On les trouve dans pratiquement tous les écosystèmes, avec une distribution couvrant la plus grande partie de la

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

planète. En tant que microbes vivant en liberté, ils sont abondants dans les milieux pédologiques, en particulier ceux qui ont un pH plus élevé et dans les écosystèmes marins et d'eau douce. Les actinobactéries sont également associées à des hôtes eucaryotes dans diverses niches, telles que l'exosquelette de certaines fourmis tropicales, les poumons et la peau des mammifères, ainsi que les racines et les tissus internes des plantes. Certains genres, y compris Streptomyces, Kineococcus et Mycobacterium, s'étendent sur divers écosystèmes du sol au milieu marin en eau douce. D'autres, comme Atopobium, Bifidobacterium, Kocuria et Rothia, se trouvent principalement dans les associations hôtes. Leurs présences dans les niches les plus divers montre leur capacité physiologique à croître dans différentes et grande gamme de conditions physico-chimique. Ces capacités extraordinaires sont d'ailleurs exprimées dans le patrimoine génétique de ces bactéries. Cependant plusieurs rôles écologiques de ces bactéries sont encore méconnus (R.L.Gina Lewin et al., 2016).

Les actinomycètes ont une importance pratique considérable. Ils peuvent dégrader un

nombre et une variété énorme de composés organiques et ils sont extrêmement importants pour la minéralisation de la matière organique (L.M.Prescott et al., 2003).

Ils sont généralement saprophytes, mais peuvent vivre à l'état libre ou en association. Les associations établies sont : la symbiose avec les plantes non légumineuses comme le genre Frankia (fixation de l'azote atmosphérique) ou l'endophytisme dans les tissus de plantes où ils stimulent leur croissant (H.Merizig, 2015).

Tableau 2 : Habitats de certains actinomycètes (R.Grigorova et J.R.Norris, 1990).

Les enzymes sont les produits industriels les plus importants des actinomycètes (J.Theilleux, 1993) après les antibiotiques. En effet, les actinobactéries sont d'excellents producteurs d'enzymes à utilisation industrielle telle que des protéases, des chitinases (Y.Tanaka et S.Omura, 1990 ; G.Vonothini et al., 2008), des amylases, des cellulases, des xylanases et des lipases (J.O.Park et al., 2002).

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

Les lipases font partie de la classe des hydrolases d'esters carboxyliques, largement présentes chez les plantes et chez les animaux ainsi que chez les microorganismes (F. Pabai, 1997). Ces enzymes appartiennent au groupe des sérines hydrolases et exigent la présence d'aucun cofacteur pour leur activité. Il a été rapporté que les lipases sont définies comme étant des carboxyles estérases qui catalysent l'hydrolyse et la synthèse d'esters formés de glycérine et des acides gras de longues chaînes (M. Gargouri et al.,2008).

Ces enzymes présentent une grande spécificité au substrat et dégradent souvent des esters du p-nitrophenyl de l'acyle, Tweens et phospholipides avec une sélectivité vis-à-vis de la position stéréo de la longueur de chaîne.

Les lipases constituent un groupe d'enzymes très largement utilisées en biotechnologie qui trouve de nombreuses applications dans différents secteurs industriels tels que l'industrie pharmaceutique, l'industrie alimentaire, l'agrochimie (pesticides), l'industrie des détergents, l'industrie des cosmétiques et des parfums, etc...(A. Ghanem,2007). Elles jouent un rôle important dans le métabolisme des graisses et sont présentes dans la plupart des tissus animaux et végétaux, et aussi dans de nombreux micro-organismes (S. Gupta et al.,2008)

La fonction biologique des lipases est de catalyser l'hydrolyse d'esters comme les triglycérides. Elles reconnaissent différemment les acides gras selon leur degré d'insaturation et la longueur de la chaîne carbonée. Cependant, elles sont capables d'hydrolyser une très grande variété de substrats naturels et non-naturels et de réaliser en milieu organique des réactions de synthèse. Dans cette classe d'enzymes, on trouve les lipases (EC 3.1.1.3) qui sont les plus employées par les chimistes organiciens (V. Gotor-Fernandez et al.,2006).

L'étude de cette classe d'enzyme a contribué à l'élaboration d'une enzymologie interfaciale, dont la réaction est produite en milieu hétérogène à l'interface huile-eau. Les propriétés biochimiques de cette classe d'enzymes dépendent particulièrement de certains paramètres tels que le pH ou la force ionique (R. Verger,1985).

Les lipases comme les estérases caractérisées par leur stabilités et leur activité dans des

solvants organiques sont des biocatalyseurs importants, particulièrement adaptés pour des applications industrielles (B.M. Schmidt et al.,2004).

Figure 3 : Présentation de la réaction enzymatique, qui catalyse l'hydrolyse ou la synthèse de triglycéride (K.E. Jaeger et al., 1994 ; S. Benjamin et A. Pandey,1998).

Les lipases sont omniprésentes dans la nature et peuvent être obtenues à partir de nombreuses sources, telles que les plantes, les micro-organismes et les animaux (A. Salihu et al., 2012).

Les lipases se trouvent au sein de la plante, principalement dans les graines où les trilycérides sont stockés dans des structures intracellulaires appelées oléosomes (P. Fickers et al.,2007 ; L. Casas -Goday et al.,2012). Ces derniers contiennent des lipases capables d'être utilisées dans la biotransformation des lipides dans les domaines suivants la papeteries, l'oléochimie, la farine de blé et les huiles essentielle (R.Wilfried et al.,2011).

La plupart des lipases d'origine animale sont obtenues à partir du pancréas des bovins, d'ovins, de porcs et de cochons. Malheureusement, les lipases extraites du pancréas des animaux sont rarement pures pour être utilisées dans l'industrie alimentaire. En effet, la lipase pancréatique du porc est polluée par des traces de trypsine. D'autres impuretés comprennent des virus et des hormones animales peuvent coexister avec ces enzymes (L. Casas- Godoy et al., 2012).

Les lipases sont largement répondues chez les bactéries, les levures et les champignons filamenteux ; L'intérêt des lipases microbiennes n'a cessé de s'accroitre au cours de ces dernières années principalement en raison du grand nombre d'application qu'elles offrent dans les domaines très variée (A.Rihani,2012). Ces lipases possèdent des procédés de

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

fabrication simples avec une grande stabilité vis-à-vis la température, les détergents et les enzymes protéolytiques (K.E. Jaeger et al.,1994).

Les bactéries répondues dans la production de lipases sont plusieurs, et vu que la classification des microorganismes peut changer à l'issue de nouvelles découvertes taxonomique ; le nom des lipases microbiennes souvent été modifié à titre d'exemple la lipase de Pseudomonas fluorescens est devenue lipase de Pseudomonas cepaci ; la lipase de Candida cylindracea est devenue lipase de Candida rugosa (A. Najjar,2010). La lipase de Serratia marcescens est utilisée pour la production de Méthyl-glycidate, employée dans la synthèse d'un antagoniste du calcium (A.Rihani,2012).

La lipase de Yarrowia lipolytica est en cours de développement au centre wallon de biologie industrielle et son application qui intéresse le secteur clinique (W.A.M.Alloue et al., 2008). La lipase de Mucor javanicus, utilisée dans l'extraction et le fractionnement des huiles marines extraites à partir des poissons et des algues, conduit à une diversité de molécule d'acylglycéroles et trouvent de nombreuses applications dans le domaine agroalimentaire et de la santé (M.Linder et al.,2004).

Des études quantitatives sur la production de lipase et les facteurs modifiant la libération

de l'enzyme dans le milieu de croissance, ont été décrites chez de nombreux microorganismes (tableau 3).

Tableau 3 : caractéristiques physico-chimiques des microorganisme producteurs des lipases

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

1.2.4. Mécanisme d'action des lipases

Les lipases diffèrent entre elles par le nombre d'acides aminés constituant leur structure primaire. Par exemple, la lipase de Candida rugosa contient plus de 500 acides aminés tandis que la lipase de Candida antarctica B en contient 317. Cependant, la caractéristique commune de toutes les lipases est que leurs sites actifs sont constitués de trois acides aminés, appelés la triade : sérine, aspartate ou glutamate et histidine (A.Ghanem,2007).

Cette triade d'acides aminés, ajoutée à quelques autres résidus, constitue le site actif de l'enzyme. Celui-ci est protégé par un « couvercle » qui en bloque l'accès et ne s'ouvre qu'au contact d'une phase hydrophobe pour permettre la complexation du substrat, lipide hydrophobe, et faciliter ainsi la catalyse de la réaction. Cette activation interfaciale du biocatalyseur constitue la caractéristique principale des lipases. Le mécanisme d'intervention de la triade (Ser, Hist et Asp) lors de l'hydrolyse d'un ester est donné par le schéma suivant (R.D. Schmid et al.,1998):

Figure 4 : Mécanisme d'intervention de la triade (Ser-Hist-Asp) et formation de l'acyl-

Comme le montre le schéma ci-dessus, la disposition particulière des trois résidus formant

la triade permet, dans une première étape, l'attaque nucléophile du substrat R1CO2R2 pour donner un complexe appelé acyl-enzyme avec libération de l'alcool R2OH.

Dans une seconde étape, cet intermédiaire acyl-enzyme subit une attaque nucléophile par

l'eau présente dans le milieu, régénérant ainsi l'enzyme par expulsion de l'acide R1CO2H, produit de la réaction.

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

L'idée de l'utilisation des lipases en synthèse organique était basée sur l'hypothèse que d'autres nucléophiles que l'eau pourrait attaquer l'acyl-enzyme, en particulier dans un milieu pauvre en eau comme le milieu organique. C'est ainsi que depuis le début des années quatre vingt et les travaux d'A.M. Klibanov (A. Z. Klibanov et al., 1985) s'est développée toute une chimie autour de l'utilisation des lipases en synthèse organique qu'on peut résumer comme suit :

? Interestérification: R1COOR'1 + R2COOR'2 ? R1COOR2' + R2COOR1' ? Alcoolyse: R1COOR1' + R2OH ? R1COOR2 + R1'OH

De nombreux microorganismes sécrètent des lipases dans le milieu de culture. Janda et ces collaborateurs (2005) ont criblés 1229 bactéries, levures, actinomycètes et champignons sur des plaques d'agar contenant de l'huile de Soja et de la rhodamine B et ils ont trouvé qu'environ 25 % de ces microorganismes présentent une activité lipolytique. Quelques exemples de microorganismes lipolytiques sont rassemblés et regroupés dans le Tableau 4.

La présence de lipases chez de nombreux micro-organismes leur permet d'utiliser des «sources non-conventionnelles» de carbone comme les triglycérides ou d'autres lipides

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE Tableau 4 : microorganismes producteurs des lipases

La source de la lipase	Genre	Espèce	Référence
Bactéries (grame +)	Bacillus Geobacillus Staphylococcus Clostridium Myxococcus	Bacillus sp. Geobacillus zalihae S. saprophyticus C .tetanomorphum Myxococcus xanthus	(K.M. Heravi et al.,2008) (R. Rahman et al.,2007) (Y. Fang et al.,2006) (M. Petersen & R. Daniel, 2006) (A.Moraleda-Munoz & J. Shimkets, 2007)
Bactéries (gram -)	Burkholderia Pseudomonas	Burkholderia sp P. monteilli	(Y. Matsumiya et al.,2007) (S.L. Wag et al.,2009)
Actinomycètes	Streptomyces	Str. Coelicolor	(A. Côté et al.,2008)
Champignons	Penicillium Aspergillus Rhizopus Candida	Pe. Cyclopium A. niger Rhizopus oligosporus C. rugosa	(R. Vardanega et al.,2008) (A.G. Brito-Madurro et al.,2008) (T. Iftikhar et al.,2008) (A. K. Singh & M. Mukhopadhyay , 2012)
Levures	Yarrowia Humicola	Y. lipolytica H. lanuginosa	(A. Najjar, 2010) (A. K. Singh & M. Mukhopadhyay, 2012)

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE 1.2.6. Applications des lipases et aspect biotechnologique

Les lipases extraites de souches bactériennes thermophiles sont les plus demandé dans le

domaine industriel, à cause de leur grande stabilité thermique et leur résistance aux températures élevées (M.Berekaa et al., 2009).

Le domaine d'application des lipases industrielles couvre diverses industries et

applications telles que les oléochimiques, les détergents,polymères, agro-alimentaire, pharmaceutique, déchets, cosmétiques et biodiesel (tableau 5).

Tableau 5 : Aperçu des applications industrielles des lipases (H.S.Chaudhary,2015)

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

Polymères	les lipases peuvent être utilisées pour aider à la production de polymères, tels que le polyester, le PLA (polylactide), le PCL (polycaprolactone) et bien d'autres, en alternative aux réactions catalysées chimiquement (Pollet, 2015).
Transformation des aliments	les lipases sont utilisées dans les produits laitiers pour le développement des arômes, mais également dans la transformation d'autres aliments, tels que les produits carnés, les aliments cuits au four, la transformation du beurre de cacao, etc.
Pâtes et papiers	Pâtes et papiers: La présence de composants hydrophobes (principalement des triglycérides et des cires) dans le bois est préjudiciable à de nombreux processus de production de papier et de pâte, et les lipases peuvent être utilisées pour éliminer ces triglycérides indésirables.
Secteurs médical et pharmaceutique	En raison de leur grande spécificité, les lipases peuvent être utilisées pour produire des composés pharmaceutiques actifs. Par exemple, les enzymes énantiosélectives sont utilisées comme technologie alternative à la chromatographie chirale (D.Gerard, 2015). Les lipases sont également utilisées dans la production de lysophospholipides à partir de phospholipides et dans l'extraction et la production de lipides fonctionnels (B.Lennon, 2015).
Traitement des déchets / effluents / eaux usées	Traitement des déchets / effluents / eaux usées: des lipases sont ajoutées pour éliminer les fines couches de graisses formées à la surface des réservoirs d'eaux usées et ainsi rétablir les conditions de transport de l'oxygène actif nécessaires au maintien d'une croissance optimale de la biomasse
Biodiesel	Les lipases sont utilisées pour produire du biodiesel à partir de diverses matières premières telles que l'huile de palme ou les graisses animales. Des lipases thermostables ont été développées pour optimiser l'application d'enzymes dans la production de biodiesel (P.M.Nielsen, 2016)

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

L'aspect biotechnologique de la production des lipases s'oriente aussi bien la biotechnologie blanche que vers la biotechnologie moderne , cependant dans les deux cas , l'objectif est d'une part augmenter le niveau de production ( optimisation de la culture ou par clonage de gènes) et d'autre part , cibler un caractère donné ( pH extrême ) pour s'adapter aux conditions de l'industrie pour répondre aux besoins du marché mondial des enzymes.

Du point biotechnologie moderne, nous citons quelques exemples d'applications réalisées par de nombreux chercheurs. Ainsi, la farine de graine de coton est un co-produit de l'industrie du coton, produit en grande quantité dans le monde entier. Le but est de valoriser ce sous-produit par la production de lipases Rhizomucormiehei et l'application du solide fermenté sec dans des réactions d'estérification entre l'acide oléique et l'éthanol ou le méthanol et la Trans estérification d'une huile végétale. Le solide fermenté séché était également capable de catalyser la production d'esters d'éthyle et de méthyle par des réactions simultanées de transestérification / estérification de l'huile d'acide macaúba (Macauba est une espèce de palmier oléagineux d'Amérique latine. C'est une riche source d'huile végétale avec divers avantages), avec production d'une teneur en ester d'environ 76% après 24 h. C'est la première fois que des solides fermentés produits dans la farine de graine de coton sans aucune supplémentation sont utilisés comme biocatalyseur dans les réactions d'estérification et de transestérification.(E.CG.Aguieiras et al.,2019).Egalement un autre travail de biotechnologie enzymatique (S.Hua et al.,2019) a pu isoler un gène de lipase, lipPN1, a été cloné à partir de Proteus sp. NH 2-2 et exprimé dans E. coliBL21 (DE3) pour obtenir des lipases actives pour la production de biodiesel en repliant Proteus sp. corps d'inclusion de lipase exprimés dans E. coli . De même qu'un gene lipase a été cloné à partir de Bacillus cereus et exprimé dans Escherichia coliBL21. Les résultats ont montré que L' Escherichia coli exprimant le recombinant Bacillus cereus protéine lipase qui donne une importante activité de la lipase plus élevée et la capacité dégradation de l' huile. Ces résultats suggèrent que la lipase de Bacillus cereus XN12 constitue une solution potentielle pour diminuer la pollution par les huiles alimentaires (W.Haiyan et al., 2019).

D'autres travaux de recherche (fatma et al.,2019) sur une culture bactérienne mésophile, produisant une lipase alcaline extracellulaire, a été isolée des eaux usées de lavage des gaz générées par l'usine de phosphate de Sfax du groupe chimique tunisien et identifiée comme étant la souche Staphylococcus capitis . La lipase, nommée S. capitis lipase (SCL), a été

CHAPITRE 1 : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUE

purifiée jusqu'à homogénéité à partir du milieu de culture. Le SCL a montré une stabilité significative en présence de détergents et de solvants organiques. En outre, SCL était compatible avec les détergents disponibles dans le commerce et son incorporation augmentait les performances de dégradation des lipides, ce qui en faisait un candidat potentiel dans la formulation de détergent.

Récemment (15 février 2019) une souche tunisienne Serratia sp ( W3) a été isolé et purifié. Il a été démontré que la souche W3 sécrétait une lipase non induite dans le milieu de culture. L'activité lipolytique a été optimisée à l'aide de de la méthode de Box-Behnken (BBD) de la méthodologie de surface de réponse (RSM). Le SmL purifié peut être considéré comme une lipase thermoactive. En contraste avec d'autres décrits lipases, Sml a été trouvée comme étant stable à une grande échelle de pH compris entre pH 5 et pH 12. Sml a également pu hydrolyser son substrat en présence de divers agents oxydants, ainsi que dans la présence d' agents tensio- actifs et certains commerciale détergents. Ensuite, compte tenu de l'ensemble des propriétés biochimiques du SmL, celui-ci peut être considéré comme un candidat potentiel pour des applications industrielles et biotechnologiques, telles que la synthèse de biodiesel et dans l'industrie des détergents (A.Eddehech et al.,2019) .

C'est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés à la production d'enzymes lipidiques extraites des souches bactériennes du type Actinomycètes thermophiles. L'objectif de notre travail porte sur l'optimisation des conditions de production de ces lipases. La partie expérimentale de cette étude sera développé dans les chapitres 2 et 3.

En dehors de la protéine extraite de souche bactérienne, préparé au laboratoire et dont le processus d'extraction est décrit ci-dessous, les autres produits chimiques utilisés dans la production de l'enzyme lipasique, sont d'origine commerciale (FLUKA, SIGMA ALDRICH).

Dans le cadre de la recherche de lipases microbiennes thermostables, nous avons utilisé la souche d'Actinomycète thermophile Cpt29 (Compost poulet, thermophile, isolat numéro 29), dont le gène est déposée dans la banque des gènes avec numéro d'accession KC447297,qui a été isolée dans notre laboratoire à partir d'échantillons de compost de poulet prélevés en février 2008 au niveau de l'Unité de Chaire engraissement Poulet appartenant au Groupe Avicole de l'Est (G.A.E) et la Société des Abattoirs de l'Est (S.A.E) Algérien (Wilaya d'Annaba) (S.Haberra et al.,2013) et conservée sur milieu ISP2(International Streptomyces Project) à 4°C.

L'activité lipasique a été mesurée automatiquement par l'intermédiaire d'un pH-stat piloté par un micro ordinateur ( SI ANALYTICS Titroline^® 7000).

Figure 5 : pH-stat piloté par un micro ordinateur ( SI ANALYTICS Titroline^® 7000).

Une souche d'Actinomycète thermophile (cpt29) a été utilisée pour la production des lipases du type keratinase d'Actinomadura keratinilytica strain cpt29 (figure 6). Cette souche a été précédemment identifiée et isolée dans le Laboratoire de Biochimie et de Microbiologie Appliquées (LBMA).

La souche d'Actinomycète Cpt29 est cultivée sur milieu liquide à base de tween 80. Le pH de milieu est ajusté à 8 avant stérilisation et l'incubation se fait dans des erlenmeyers stériles de 500ml contenant 100ml d'un milieu exclusivement minéral composé de : K2HPO4 (0.8g/L), KH2PO4 (6g/L), (NH4)2SO4 (1g/L), MgSO4, 7H2O (0.2g/L), CaCl2 (0.05 g/L), NaCl (3g /L) et FeSO4 (0.0001 g/L). Après ensemencement, l'incubation se fait dans un shaker thermostaté à 45°C sous agitation (150rpm) pendant 5 jours.

Après 5 jours d'incubation sur milieu liquide à base de tween80, l'activité lipolytique est mesurée dans le surnageant de culture obtenu par centrifugation à 10000×g et filtration.

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

L'activité lipasique a été déterminée, à l'aide d'un pH-stat (SI ANALYTICS Titroline^® 7000), à pH= 8 par titration des acides gras libérés avec une solution de NaOH (0,1N). Le substrat utilisé est une émulsion d'huile d'olive à 10 % (10 ml d'huile d'olive dans 90 ml de gomme arabique à 10 %).

L'activité enzymatique est exprimée en unité internationale (UI). Une unité d'activité

lipasique correspond à la libération d'une micromole d'acide gras par minute (umol/min). La cinétique et le calcul de l'activité enzymatique sont donnés automatiquement par l'appareil.

2.2.3. Récupération de la lipase

La précipitation est utilisée pour purifier partiellement et concentrer les protéines solubles dans le surnageant. L'acétone entre en compétition avec les protéines pour réagir avec les molécules d'eau. Ceci entraîne une désolvatation suivie d'une précipitation. La précipitation fractionnée des protéines a été réalisée par l'addition de l'acétone froid en faible quantité au surnageant de culture, sous agitation douce à 4°C jusqu'à de saturation (3v/v) ; après les protéines précipités sont récupérées par centrifugation à 12000×g pendant 25min, Le culot est remis immédiatement en suspension dans le minimum de tampon tris-Hcl 20mmol.

2.3. Optimisation des paramètres de cultures de la lipase

Dans toute recherche expérimentale, comme c'est le cas en biochimie, le chercheur essaye toujours de trouver la meilleure stratégie pour conduire ses expériences. Les plans d'expériences sont une méthodologie de choix pour répondre à cette préoccupation. Ils sont, en effet, applicables à toutes les disciplines expérimentales où l'on recherche le lien existant entre un gradeur mesurée, y, et des variables, xi, qui peuvent modifier sa valeur, c'est-à-dire l'étude et l'analyse de la relation y = f (xi).

Avec la méthodologie des plans d'expériences, on obtient les informations les plus fiables en un minimum d'essais. Les effets des différents facteurs intervenant dans le processus étudié, sont alors quantifiés et les conditions optimales définies. Avec le développement de l'outil informatique et l'apparition de logiciels performants, cette tache est rendue encore plus facile.

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

Lors de l'étude d'un phénomène, c'est-à-dire celle de la relation y = f (xi), le chercheur effectue des plans des expériences. Celles-ci peuvent être conduites de manière classique ou de manière planifiée, comme c'est le cas des plans d'expérience. Nous allons dans ce qui suit, présenter la méthode classique puis celle des plans d'expériences.

Une méthode classique consiste à fixer le niveau de tous les facteurs sauf un, et l'on

mesure la réponse y en fonction de différents valeurs du facteur non fixée. A la fin de l'expérimentation sur cette première variable, on peut tracer la courbe : y = f (xi), (figure 7).

Si l'on veut étudier toutes les variables il faut recommencer chacune des expériences (J.Goupy,2017). Cette méthode est coûteuse en nombre d'essai et inefficace : elle ne permet pas d'optimiser le processus ni de trouver d'éventuelles interactions entre les facteurs. Pour cette raison les expérimentateurs font appel à la méthode des plans d'expériences.

2.3.1.2. Méthode des plans d'expériences

Les plans d'expériences constituent, essentiellement, une stratégie de planification d'expériences afin d'obtenir des conclusions solides et adéquates, de manière efficace et rapide. La méthodologie des plans d'expérience se base sur le fait qu'une expérience convenablement organisée, conduira nécessairement à une analyse et à une interprétation statistique relativement simple des résultats (K.Sandrine, 2004).

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

Le choix d'une méthode d'expérimentation est tributaire d'une bonne définition de la

problématique à traiter. Tous les facteurs pouvant avoir une influence sur la réponse doivent être pris en compte dans l'établissement du plan d'expériences.

D'une manière générale, la description d'un problème, quel qu'il soit, consiste à répondre à

un certain nombre de questions que résument la méthode de SADO connue sous le nom de méthode de ?QQCQQP?( G.Sad et al.,1991).

L'établissement du plan d'expériences (J.Goupy,2017) afin d'optimiser la réponse consiste en la démarche suivante (figure 8):

Le choix du plan sera guidé par l'analyse de tous les points précédents. On distingue plusieurs types de plans :

Pour ces plans le nombre de niveaux de chaque facteur est restreint à deux et le nombre des

essais réalisés est égal à 2ⁿ (n représente le nombre de facteurs). Le modèle mathématique postulé relatif à ce plan est le suivant :

Ces plans permettent d'établir des modèles mathématiques de second degré (modèle quadratique complet).

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

De nombreux logiciels commerciaux sont spécialement conçus pour les plans d'expérience (JMP, Minitab, Statisca, etc...). Ces logiciels permettent dans un premier temps, de définir la matrice d'expérience et dans un deuxième temps le traitement des données expérimentales obtenues. Pour l'analyse des résultats de nombreuses rubriques existent dans les logiciels traitant des plans d'expériences (sommaire d'ajustement, analyse de variance, etc...) qui donnent les informations nécessaires avec une bonne appréciation des résultats (modèles obtenus).

Plus les points du graphique sont proche de la première bissectrice, plus le modèle rend assez

La pertinence de modèle est généralement vérifiée par le coefficient de détermination

(R²). Ce coefficient varie entre 0 et 1, plus il est proche de 1 plus les réponses calculées seront fortement corrélées avec les réponses expérimentales (J.Goupy, 2017).

L'analyse de variance (ANOVA) permet de comparer les variances des valeurs calculées

par le modèle et les résidus. Cette analyse constitue un test statistique (test de Fisher-Snedecor) et elle fournit les réponses aux questions suivantes (K.Sandrine, 2004):

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

? Est-ce que le modèle nous apporte quelque chose ? la régression est elle significative ?

? Est que le modèle représente bien le phénomène ? Test de validation préliminaire

Bien que les écarts entre les valeurs observées et les valeurs calculées par le modèle aient été minimisés par le choix de la méthode des moindre carrés, il faut s'assurer que localement, les résidus ne soit pas anormalement important. Tout d'abord on calcule à partir de l'équation du modèle les différents yi on obtient alors la valeur de résidus :

En résumé un meilleur ajustement du modèle est obtenu s'il rempli les conditions suivantes :

L'analyse de résultats des essais permet d'identifier une combinaison optimale des facteurs qui n'a pas forcément fait l'objet d'un essai dans le plan. Il faudra alors tester la combinaison optimale, qui n'a pas été faite dans le plan d'expérience, ce qui arrive fréquemment avec cet essai final, on rejettera ou pas le modèle proposé.

De plus, quand on arrive à l'étape de l'analyse finale, il faut vérifier le résultat obtenu par

l'analyse est plausible ou non. Dans l'essai de validation, soit l'essai confirme les informations

? Si oui, le plan d'expériences aura joué son rôle et permis de mettre en évidence les facteurs influents et/ou d'optimiser et la réponse, c'est-à-dire trouver les valeurs des facteurs qui donnent la réponse optimale

? Si non, il faudra alors examiner les conditions dans lesquelles a été oublié ou s'il ne se cache pas un effet d'interaction entre deux facteurs ou encore d'autres choses.

CHAPITRE 2 : MATERIELS ET METHODES

A ce stade, l'expérimentateur désire de l'information supplémentaire et en fonction de l'analyse du premier résultat obtenu ; il choisira sa stratégie

? Plan complémentaire : pour désaliaser les effets principaux et les interactions qui pouvaient présenter des ambiguïtés.

? Nouveau domaine : le choix d'un nouveau domaine d'étude peut provenir de plus raison le domaine initial était trop grand ou il était trop petit, le domaine initial ne contient pas des résultats intéressants.

Au cours de ce travail, nous avons cherché à optimiser les conditions de culture de la lipase extraite de la souche d'Actinomycète Cpt29. L'objectif principale de cette étude est amélioré significativement la production de l'enzyme lipasique. Pour cela nous avons fait appel à la méthodologie des plans d'expériences. Dans un premier temps nous avons testés onze paramètres expérimentaux de culture et ceci dans un but d'identifier les plus influents. La seconde étape de cette partie d'étude est l'optimisation et la modélisation de la production de cette lipase en fonction des facteurs expérimentaux de culture. Pour l'optimisation nous avons choisi la méthodologie des surfaces de réponses (RSM). Les résultats obtenus de cette étude seront interprété et discuté dans le chapitre 3.

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION

L'optimisation des conditions de culture pour obtenir une meilleure production de la lipase à partir de la souche locale Cpt29, a été mise au point à partir d'un plan de surface de réponse (RSM). Cette étude d'optimisation utilisant une approche chimiométrique a été élaborée après une étape de criblage. Cette dernière étape nous a permis de mettre en évidence les facteurs influents des conditions de cultures qui mèneront à une meilleure production de la lipase. L'approche statistique a été réalisée La démarche expérimentale se présente comme suit :

Afin de ressortir les facteurs de culture les plus influents, nous avons décidé de faire appel dans un premier temps à un plan de criblage. C'est un plan de premier degré utile pour évaluer la pertinence d'un modèle de premier degré et identifier les variables explicatives significatives qui permettent une meilleure réponse. Pour cela nous avons choisi le plan de Plackett -Burman en raison de son économie en termes de nombre d'essais. Dans notre travail nous avons décidé de prendre en compte onze facteurs potentiellement influents sur le cours de la production de la lipase. Ces facteurs ainsi que le domaine de variation, sont précisés dans le (tableau 6).

Facteur	Unité	Niveau bas (-1)	Niveau haut (+1)	Symbole
Température	°C	40	50	X1
Temps	joures	2	5	X2
Ph	/	7	9	X3
Tween 80	%	2	4	X4
[FeSO4]	g/l	0,001	0,01	X5
[CaCl2]	g/l	0,01	1	X6
[NaCl]	g/l	3	4	X7
[MgSO4]	g/l	0,1	0,2	X8
[K2HPO4]	g/l	0,7	0,8	X9
[KH2PO4]	g/l	5	6	X10
[(NH2)4SO4]	g/l	1	1,5	X11

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION ? Construction du plan de criblage et réalisation des essais ? Matrice des expériences Afin de mieux cerner le problème nous fait varié onze facteurs des paramètres expérimentaux de culture (température, temps, pH, source de carbone (Tween80), [CaCl2], [MgSO4], [K2HPO4], [KH2PO4], [NaCl], [(NH2)4SO4]). Le plan de Plackett-Burman pour onze facteurs, comprend quinze essais, dont trois au centre du domaine. Il a été l'aide du logiciel Minitab, version 16 (tableau 7). Tableau 7 : Matrice des expériences du plan de criblage.
												[FeSO4], réalisé à
Essai	X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	X11	Activité (U/ml)
1	40	2,0	9	4	0,0100	0,010	4	0,3	0,7	7	0,5	48
2	50	5,0	9	2	0,0100	1,000	2	0,3	0,7	5	0,5	89
3	40	5,0	7	2	0,0010	1,000	4	0,3	0,7	7	1,5	21
4	50	5,0	7	4	0,0100	0,010	4	0,1	0,7	5	1,5	101
5	48	3,5	8	3	0,0055	0,505	3	0,2	0,8	6	1,0	121
6	50	2,0	9	2	0,0010	0,010	4	0,3	0,9	5	1,5	31
7	50	2,0	7	2	0,0100	1,000	4	0,1	0,9	7	0,5	29
8	40	2,0	7	2	0,0010	0,010	2	0,1	0,7	5	0,5	12
9	50	2,0	9	4	0,0010	1,000	2	0,1	0,7	7	1,5	59
10	45	3,5	8	3	0,0055	0,505	3	0,2	0,8	6	1,0	103
11	40	5,0	9	2	0,0100	0,010	2	0,1	0,9	7	1,5	41
12	40	2,0	7	4	0,0100	1,000	2	0,3	0,9	5	1,5	24
13	40	5,0	9	4	0,0010	1,000	4	0,1	0,9	5	0,5	64
14	45	3,5	8	3	0,0055	0,505	3	0,2	0,8	6	1,0	118
15	50	5,0	7	4	0,0010	0,010	2	0,3	0,9	7	0,5	93

	35

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION

3.1.2. Résultats du plan de criblage et interprétation ? Traitement et analyse statistique des données

Le traitement des données a été effectué par régression linéaire multiple à l'aide du

logiciel Minitab. Les valeurs des effets et les coefficients de régression du modèle sont donnés dans le (tableau 8).

Terme	Effet	Coefficient	Probabilité (P S á = 0.05)
Constante	-	51	0,003
X1	32,00	16	0,029
X2	34,33	17	0,025
X3	08,67	4	0.260
X4	27,67	13	0,038
X5	08,67	4	0,260
X6	- 06,67	-3	0,354
X7	- 04,00	-2	0,547
X8	00,00	0	1,000
X9	- 08,00	- 4	0,287
X10	- 05,00	- 2	0,464
X11	- 09,67	- 4	0,225

Les résultats du traitement du plan de Plackett-Burman obtenus montrent que parmi tous les facteurs étudiés, seule la température, le temps et le Tween 80 qui ont une influence

significative sur la réponse au niveau de confiance choisi (á = 0,05). L'effet de cette influence schématisée par le diagramme de Pareto (figure 10).

L'examen du tableau d'ANOVA (tableau 9) montre que les effets principaux ne sont pas significatifs. Le modèle de premier degré ne peut être donc utilisé comme un modèle d'optimisation car les facteurs ne peuvent pas expliquer la réponse de façon linéaire. Le test du défaut d'ajustement qui est significatif au niveau á = 0,05 confirme cette non linéarité (Courbure avec P = 0,01 < á = 0,05 et valeurs résiduelles importantes).

En conclusion, nous avons trouvé un modèle significatif qui permet d'avoir une idée préliminaire sur l'influence des différents facteurs. Cependant, les valeurs résiduelles importantes et le manque d'ajustement observé, montrent que le modèle linéaire ne peut pas décrire correctement le phénomène étudié et que d'autres termes importants, comme des

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION

interactions ou des termes quadratiques ne doivent pas être exclus. Par conséquent, nous avons décidé de passer à un modèle du second degré du type :

La question qui se pose alors, concerne le plan de second degré à utiliser et le choix des facteurs qu'il faut maintenir dans l'étude. Parmi les nombreux plans d'expériences du second degré, nous avons choisi le plan de Box-Behnken qui ne nécessite pas un grand nombre d'essais. Nous avons choisi aussi ce plan pour la facilité de sa mise en oeuvre. Concernant le choix des facteurs, nous nous sommes basés sur les résultats du plan de criblage mais également sur des critères expérimentaux. Il ne faut pas perdre de vue que le critère expérimental, basé sur des considérations techniques et scientifiques, est toujours privilégié par rapport aux critères purement statistiques (J.Goupy, 2005).

Ainsi, parmi les onze facteurs introduits au départ dans le plan de criblage, les valeurs de

huit d'entre eux ont été fixées et les trois autres significatifs sont conservés dans le plan de Box-Behnken.

En conclusion, les trois facteurs retenus pour le plan de Box-Behnken sont la température,

le temps (t) et la source de carbone (Tween 80). Ces facteurs ainsi que le domaine de variation, sont précisés dans le (tableau 10) :

Le plan de Box-Behnken pour trois facteurs, composés de quinze essais dont trois au

centre du domaine, ainsi que la réponse expérimentale «Activité U/ml », sont donnés dans le (tableau 11) :

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 11 : Plan de Box-Behnken et les résultats expérimentaux obtenus.

Essai	X1	X2	X3	Activité U/ml
1	50	5,0	3	112
2	45	5,0	4	138
3	40	3,5	2	73
4	45	5,0	2	107
5	45	2,0	4	62
6	45	3,5	3	149
7	50	3,5	2	84
8	45	3,5	3	144
9	45	2,0	2	53
10	40	2,0	3	25
11	50	2,0	3	45
12	40	3,5	4	75
13	45	3,5	3	159
14	50	3,5	4	87
15	40	5,0	3	95

Le plan de Box-Behnken pour trois facteurs, composés de quinze essais dont trois au centre du domaine, ainsi que la réponse expérimentale «Activité U/ml », sont donnés dans le (tableau 11).

Le traitement statistique des données du (tableau 11) à l'aide du logiciel Minitab, permet d'estimer les coefficients du modèle (cf. eq.1) (tableau 12).

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET Tableau 12 : Coefficients estimés pour l'activité U/ml
			DISCUSSION
Terme	Symbole	Coefficient	Probabilité
Température	X1	39,96	0,000***
Temps	X2	126,77	0,004***
Tween 80	X3	282,54	0,008***
*TempératureTempérature**	X1²	- 0,070	0,000***
*TempsTemps**	X2²	- 7,03	0,000***
*Tween 80 Tween 80**	X3²	0,0027	0,002***
*TempératureTemps**	X1?X2	-0,01	0,854 ^NS
*TemperatureTween 80**	X1? X3	0,01	0,951 ^NS
*Temps Tween 80**	X2? X3	2,44	0,251 ^NS

*** : corrélation très hautement significative au niveau de confiance de 99% (P<0.001). NS : non significative. R² = 98,7%, R²aj. = 96,3 %.

Nous remarquons à travers l'analyse du (tableau 12) et celle de l'ANOVA (tableau 13), que les facteurs principaux et quadratiques ont des effets hautement significatifs, contrairement aux effets d'interactions entre facteurs. La non signification des interactions entre facteurs montre que l'effet d'un facteur ne dépend pas du niveau de l'autre.

Source	DL	SC	MS	F P
Régression	9	22700	22700	42 0,000***
Linéaire	3	9614	7978	44 0,001***
Carré	3	12960	12960	72 0,000***
Interaction	3	124	124	0,7	0,599 ^NS
Erreur résiduelle	5	300	300
Inadéquation de l'ajustement	3	184	184	1,05	0,522 ^NS
Erreur pure	2	117	117
Total	14	23000

*** : corrélation très hautement significative au niveau de confiance de 99% (P<0.001). NS : non significative.

A partir des résultats obtenus ci-dessus (tableau13), nous avons obtenu un modèle très hautement significatif qui met en évidence la relation entre les facteurs expérimentaux et la réponse. Le modèle obtenu après extraction des variables non significatives et négligeable, se présente comme suit :

La probabilité d'inadéquation de l'ajustement augmente de 0,522 montre que le modèle obtenu explique bien le phénomène étudié. A partir de ces résultats on procède à la validation du modèle et l'optimisation des variables explicatives.

La validation primaire du modèle consiste à s'assurer que les réponses calculées et mesurées se corrèlent significativement. Le diagramme des réponses mesurées, en fonction des réponses estimées, montre une forte corrélation entre celles-ci (figure 11). Le modèle rend, donc, bien compte du phénomène étudié.

Figure 11 : Diagramme des réponses mesurées en fonction de celles estimées.

La recherche des conditions optimales, qui permettant d'aboutir à une meilleure activité enzymatique, a été réalisée par l'analyse des diagrammes de contour (figure 12) qui sont les projections des courbes tridimensionnelles des surfaces de réponse. Ces dernières sont générées par le logiciel Minitab par la combinaison des trois facteurs.

< ⁴⁰ ⁴⁰ - ⁶⁰ ⁶⁰ - ⁸⁰ ⁸⁰ - ¹⁰⁰ ¹⁰⁰ - ¹²⁰ ¹²⁰ - ¹⁴⁰

⁴⁰ - ⁶⁰ ⁶⁰ - ⁸⁰ ⁸⁰ - ¹⁰⁰ ¹⁰⁰ - ¹²⁰ ¹²⁰ - ¹⁴⁰

Figure 12: Diagrammes de contours présentant les effets des différents facteurs sur l'activité

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION

D'après les diagrammes de contour obtenus (figure 11), il apparaît clairement que les plus fortes valeurs de l'activité lipasique (Activité > 140), sont atteintes lorsque les facteurs sont fixés à des valeurs proches de leur niveau haut de l'espace expérimental. La valeur précise de l'optimum théorique, correspondant à la valeur maximale de l'activité. Les valeurs des facteurs permettant de l'atteindre ont été déterminées à l'aide de la fonction «désirabilité» du logiciel (figure 13).

Comme le montre la (figure 13), la valeur de l'activité maximale estimée par le modèle (A = 179), correspond aux valeurs des facteurs suivants :

Ces conditions expérimentales de cultures déterminées théoriquement pour la production de la lipase issue de souche locale Cpt29 ont été par la suite appliquées expérimentalement. La valeur de l'activité trouvée expérimentalement (A = 182 U/ml) est nettement supérieure à la valeur théorique. Ce résultat valide donc le modèle obtenu.

Ces résultats obtenus montrent que la lipase extraite de souches d'Actinomycète thermophile Cpt29 est plus thermostable (Top 46°C) en comparaison la lipase Yarrowia sp. ATCC 8661 issue de souches bactériennes type Pseudomonas strains dont la température optimale de culture est évaluée à 37°C (L.Tcacenco et al .,2010 ).

Les activités de ces deux lipases ont été aussi comparées et nous avons trouvé que

l'activité hydrolytique de la Cpt 29 (182 U/mL) est relativement deux fois supérieure à celle de la lipase Yarrowia sp. ATCC 8661(106U/mL) (L.Tcacenco et al .,2010 ) .

CONCLUSION

Au cours de ce travail, nous avons étudié l'activité enzymatique d'une lipase bactérienne issue de souche locale d'Actinomadura keratinilytica strain cpt 29) extraite au laboratoire de Biochimie et Microbiologie Appliquée (LBMA) et dont la caractérisation chimique a été réalisé au sein du laboratoire de Chimie Organique Appliquée (LCOA).

La première partie de ce manuscrit est consacrée à une présentation bibliographique sur les actinomycètes en général ainsi qu'un aperçu sur les enzymes lipidiques. La seconde partie du document développe les méthodes utilisées et les résultats obtenus relatifs aux différentes étapes de ce travail à savoir l'extraction, l'isolement de l'enzyme lipidique et l'optimisation de la production de l'enzyme.

La deuxième partie de ce travail consiste à décrire les méthodes expérimentales utilisées ainsi qu'a exposé les résultats et les discussions de cette étude. La première étape concerne l'exploitation de la souche bactérienne productrice de lipases d'Actinomadura keratinilytica strain cpt29. L'opération d'identification et d'extraction d'enzyme de cette souche, est réalisée au laboratoire de Biochimie et Microbiologie Appliquée (LBMA)-université Badji Mokhtar-annaba. La seconde étape, concerne la recherche et l'étude de l'activité lipasique de cette enzyme ainsi que l'optimisation des conditions expérimentales de culture qui donne le meilleur taux de production. Cette partie du travail a été réalisé au sein du laboratoire de Chimie Organique Appliquée (LCOA), groupe Biocatalyse et Synthèse Organique (BCSO).

Au cours de ce travail, nous avons réussi à extraire des lipases de souches locales d'Actinomadura keratinilytica strain cpt29. Pour bien mener notre étude, nous avons fait appel à la méthodologie des plans d'expériences qui nous a permis d'aboutir aux résultats recherchés de manière efficace.

Les facteurs influençant potentiellement la production de cette lipase (température, temps, pH, source de carbone (Tween80), [FeSO4], [CaCl2], [MgSO4], [K2HPO4], [KH2PO4], [NaCl], [(NH2)4SO4]) et leur impact sur le fonctionnement de l'enzyme, ont été étudiés dans un premier temps avec un plan de criblage, le plan de Plackett et Burman qui nous a permis de dégager les facteurs les plus influents sur l'activité enzymatique, à savoir la température, le temps et la source de carbone (Tween 80). Les résultats de ce plan préliminaire ont également montré qu'un modèle de second degré est nécessaire en particulier pour l'optimisation de la réponse.

CONCLUSION

Nous avons alors, dans un deuxième temps, introduit les trois facteurs dégagés précédemment dans le plan Box-Behnken qui est basé sur un modèle de second degré. Nous avons pu ainsi obtenir un modèle de second degré statistiquement satisfaisant. Les valeurs des réponses estimées par le modèle sont corrélées à 99 % avec les valeurs expérimentales.

Par la suite, la recherche des conditions optimales, effectuée par la méthode des surfaces de

réponse, a permis de localiser la valeur optimale de l'activité. Celle-ci correspond aux valeurs des facteurs : T = 45,76 °C, Temps = 4,56 heures, Tween 80 = 3,24 g/l.

Ce résultat théorique a été validé par l'expérience. La valeur de l'activité enzymatique

trouvée expérimentalement dans les conditions optimales, est nettement supérieure à celle estimée par le modèle.

En conclusion, l'application de la discipline de chimiométrie utilisant la méthode des plans

d'expériences, nous a permet d'extraire de l'information pertinente et utile pour une meilleure production de la lipase issue d'Actinomadura keratinilytica strain cpt29.

A travers cette méthodologie nous avons pu définir la région du domaine expérimental où la réponse satisfait une contrainte, optimiser l'organisation des essais en déterminant les facteurs influents à partir d'un modèle et obtenir la meilleure précision possible sur la modélisation des résultats.

Ces résultats nous ont aussi permis d'évaluer la stabilité thermique et l'activité enzymatique de cette lipase en comparaison avec celles obtenues dans la littérature. La Cpt 29 se trouve plus thermostable et relativement deux fois plus active que la lipase Yarrowia sp. ATCC 8661 (L.Tcacenco et al .,2010 ).

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