Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

I.4.) Les marqueurs de poids moléculaire :

I.4.1) Marqueurs de poids moléculaire d'ADN :

2

1

Figure 4 : Marqueurs de poids moléculaire d'ADN utilisés

1: PhiX-DNA-HaeIII Markers

2: Lambda DNA-HindIII Digest

I.4.2) Marqueur de poids moléculaire de protéines :

Figure 5 : Marqueurs utilises de poids moléculaire de protéines RPN 800 (Amersham)

I.5) Les oligonucléotides:

Le couple d'amorces CH1/CH2 (Progligo) : a servi pour l'amplification par PCR et le clonage du gène Rv3874 dans le plasmide pPICZA entre les sites de restriction EcoRI et XbaI.

CH1 : CCGGAATTCGCAGAGATGAAGACC

CH2 : GC TCTAGACGGAAGCCCATTTGCGA

Le couple d'amorces AOX1F/AOX1R (invitrogen) a servi au séquençage automatique du gène Rv3874 cloné dans pPICZA.

I.6) Autres matériels :

- Les kits :

Kit de purification d'ADN à partir de gel d'agarose : Quiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Kit de purification d'ADN plasmidique (mini préparation des plasmides) :QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).

Kit de purification d'ADN plasmidique (midi préparation des plasmides) :QIAprep Spin Midiprep Kit (Qiagen).

- Appareil PCR: Perkin Elmer ,Gene Amp9700.

- Incubateur agissant thermostaté :INFORS AG , Rittergasse27, CH-4103 Bottmingen.

- Séquenceur automatique : ABI PRISM^TM 377 sequencer (PERKIN ELMER Applied Systems).

II) METHODES:

II.1) PCR :

L'extraction de l'ADNc de Rv3874, à partir du plasmide p CDNA 3, a été réalisée par PCR. En fait le couple d'amorces CH1/ CH2 a été utilisé pour amplifier le gène Rv3874, en introduisant les sites de clonage EcoRI en amont et XbaI en aval.

Les conditions de la réaction PCR sont les suivantes :

- 1à10 ng d'ADN/tube.

- Tampon 10X :5l

- dNTP(25Mm) :0,5l

- MgCl2 (25mM) : 2,5 ul

- Primer forward (20 uM) : 0.5 ul

- Primer reverse (20 uM) : 0.5 ul

- Taq poly (5 U/ul) : 0.5 ul.

- H2O qsp 50 ul.

Les cycles d'amplification sont comme suit :

- 2 min 94°C

- 30 cycles: - 30 s 94°C

- 30 s 55°C

- 30 s 72°C

- 7 min 72°C.

II.2) Electrophorèse sur gel d'agarose :

Les profils éléctrophorétiques des produits de PCR, de digestion, de mini ou midi préparation ont été analysés après électrophorèse sur gel d'agarose de 0.8 % à 1%, TAE 1 X. Les échantillons ont été contrôlés sur le gel après avoir été mélangés avec un tampon d'échantillon (50% glycérol, 10 mM EDTA et du bleu de bromophénol à 1%) à une dilution finale de 1/6.