Annexe 1: Préparation des milieux de culture
Préparation de la solution de Tryptose
phosphate
Dans 500 ml d'eau distillée, ajouter 29,5g Tryptose
phosphate (DIFCO)
Porter le volume à 1 L
Visser légèrement le flacon
Autoclaver à 120°C pendant 15 min
Laisser le flacon refroidir jusqu'au lendemain
Garder à température ambiante
Préparation de l'antibiotique
(Pénicilline-Streptomycine)
Pénicilline .5.000.000 UI
Streptomycine .2,5g
Filtration avec 100 ml d'eau
distillée Utilisation de 2 ml dans 1L de milieu
Préparation du milieu de culture DMEM
0%
Dans un flacon de 1L de DMEM ajouter :
50 ml Tryptose phosphate
2 ml pénicilline-streptomycine
Faire le contrôle de stérilité sur Bouillon
Trypto-caséine soja
Thioglycolate
Gélose Sabouraud
Préparation du milieu de culture DMEM
2%
Dans un flacon de 1L de DMEM ajouter:
50 ml Tryptose phosphate
2 ml pénicilline-streptomycine
20 ml de SVF
Faire le contrôle de stérilité sur Bouillon
Trypto-caséine soja
Thioglycolate
Gélose Sabouraud
Préparation du milieu de culture DMEM
5%
Dans un flacon de 1L de DMEM ajouter:
100 ml Tryptose phosphate
2 ml pénicilline-streptomycine
50 ml de SVF
Faire le contrôle de stérilité sur Bouillon
Trypto-caséine soja
Thioglycolate
Gélose Sabouraud
Préparation du milieu de culture DMEM
10%
Dans un flacon de 1L de DMEM ajouter :
100 ml Tryptose phosphate
2 ml pénicilline-streptomycine
100 ml de SVF
Faire le contrôle de stérilité sur Bouillon
Trypto-caséine soja
Thioglycolate
Gélose Sabouraud
Préparation de milieu de conservation et
conservation des cellules BHK21
Les composants du milieu de conservation sont mis dans un tube de
50ml comme suit:
DMEM .25ml
SVF .5ml
Solution d'Albumine bovine (10%) 2,5ml
Saccharose (10%) .2,5ml
L'Albumine bovine et le saccharose sont préparés
d'avance. Nous avons mélangé 1g de Saccharose et d'Albumine
bovine chacun dans un tube de 10ml d'eau distillée.
Faire le contrôle de stérilité sur Bouillon
Trypto-caséine soja
Thioglycolate
Gélose Sabouraud
Les cellules BHK21 destinées à la conservation
sont traitées par la solution de trypsine avec le milieu DMEM 5% SVF et
repartis dans des tubes de 50ml. Ces tubes sont ensuite mis dans la
centrifugeuse à 800 rpm à 4°C pendant 3 min. Le surnageant
est jeté. Le culot est reparti dans le milieu de conservation sans DMSO;
soit environ 3,6 ml, puis 0,4 ml de DMSO sont ajoutés lors de la
conservation. La solution est mélangée puis repartie dans des
ampoules à raison de 1 ml dans chaque ampoule.
Ces ampoules sont mises à : - 20°C pour une heure
- 40°C pour une journée
-70°C pendant une nuit et -170°C dans l'azote
liquide.
La conservation des cellules est une étape essentielle
dans la culture cellulaire. Les cellules conservées sont
utilisées en cas de besoin.
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