I-5 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES SALMONELLES
I-5-1 ISOLEMENT DES SALMONELLES
Salmonella Typhi, Paratyphi A, B, C sont
isolés de préférence dans le sang et dans les
matières fécales des typhoïdiques (Dumas,
1958). Les Salmonella qui provoquent les
intoxications alimentaires ou des gastro-entérites aiguës sont
toujours recherchées dans les matières fécales et dans les
aliments.
La mise en évidence de Salmonella peut
être directe (technique bactériologique) ou indirecte (technique
sérologique) selon (Humbert et al., 1998).
L'analyse microbiologique
d'une denrée alimentaire est de mettre en évidence les
microorganismes responsables d'altération de la qualité marchande
et/ou sanitaire. Les méthodes d'analyse varient en fonction du type
d'aliment, du danger potentiel qu'il présente, et des
caractéristiques de conservation, consommation (cru ou cuit) et du type
de germe recherché. Les denrées alimentaires sont des milieux
favorables pour le développement d'une multitude de germes dont certains
sont pathogènes. Devant la difficulté de rechercher une
espèce bactérienne pathogène en très faible
proportion dans un produit fortement contaminé par les bactéries
les plus diverses des méthodes conventionnelles d'analyse,
d'échantillonnage et d'isolement ont été
proposées.
Plusieurs normes régissent la recherche de
Salmonella en hygiène des aliments (Humbert et al.,
1998)
ü -les normes horizontales applicables à tous les
types de produits (ISO6579 Décembre 1993) au niveau international
ü les normes sectorielles spécifiques à un
type de produit (NF V59 - 109 pour la gélatine alimentaire)
La recherche de Salmonella dans une denrée
alimentaire selon la norme ISO 6579 comporte quatre étapes
essentielles :
ü le préenrichissement
ü l'enrichissement
ü l'isolement
ü l'identification biochimique et sérologique.
I-5-1-1 Le pré-enrichissement
C'est une phase non sélective qui utilise un milieu
riche dans lequel l'échantillon est dilué au dixième
(1/10) et pour laquelle l'incubation dure une vingtaine d'heure à
35°C ou 37°C (Humbert et al., 1998). Le
Préenrichissement permet aux bactéries sublétales de
récupérer l'ensemble de leurs potentialités au terme de
leur incubation.
Les milieux utilisés sont des milieux liquides, le
plus souvent on utilise l'eau peptonée tamponnée ou le bouillon
lactosé (Humbert et al., 1998). Pour les
produits laitiers on peut utiliser la solution de Ringer ou la solution tampon
phosphate.
I-5-1-2 L'enrichissement
L'enrichissement vise à minimiser la croissance des
autres bactéries associées au prélèvement et de
poursuivre la multiplication sélective des Salmonella. 0,1ml ou
1ml de la solution de préenrichissement est transférée
dans un ou plusieurs milieux d'enrichissement (10ml de milieu).
Les milieux d'enrichissement sont classés en trois
familles (Humbert et al., 1998) :
ü les bouillons au sélénite
ü les bouillons à base de tétrathionate (le
bouillon Müller Kauffmann)
ü les bouillons qui contiennent du vert de malachite et
du chlorure de magnésium (bouillon Rapapport de Vassiliadis).
I-5-1-3 L'isolement
C'est une phase sélective qui utilise des milieux
solides coulés en boîtes de Pétri. Les milieux d'isolement
contiennent une variété d'association de facteurs
sélectifs (Humbert et al., 1998).
Les Salmonella apparaissent sous forme de colonies
caractéristiques par leur forme, leur couleur et leur morphologie.
Les milieux solides utilisés pour l'isolement
sont :
ü -le milieu de Rambach
ü le milieu Hektoen
ü la gélose Salmonella -Shigella
(gélose SS)
ü la gélose au vert brillant et au rouge de
phénol (VB-RP)
ü le milieu xylose-lysine-tergitol (XLT)
ü le milieu Compass Salmonella
ü le milieu mannitol lysine cristal violet vert brillant
ü la gélose désoxycholate citrate lactose
saccharose (DCLS)
ü la gélose Xylose Lysine désoxycholate
(XLD)
ü la gélose au sulfite de Bismuth.
En dehors des procédés de diagnostic
bactériologiques conventionnels d'autres techniques non conventionnelles
peuvent être utilisées.
Ce sont entre autre :
ü la sensibilité au phage 01 de Félix et
Callow
ü les systèmes standardisés (API 20 E,
RAPID 20 E, Entérotubes Roches, MIS entérobactéries.)
La lyse par le phage 01 (Félix et Callow) qui peut
être utilisée comme épreuve de confirmation à
l'appartenance à Salmonella ne fournit pas des résultats
positifs avec toutes les souches (Gledel and Corbion, 1991).
I-5-2 IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE
L'identification biochimique des colonies jugées
caractéristiques se fait en deux étapes :
Ø la recherche des caractères de famille,
très souvent ce sont la coloration de Gram, la présence de la
catalase, l'absence d'une cytochrome oxydase, la mobilité, le type
respiratoire, la culture sur milieu ordinaire et la fermentation du glucose
suffisent pour que les caractères différentiels soient
recherchés.
Ø la recherche des caractères
différentiels nécessite des cultures pures. On utilise à
cet effet le portoir réduit de Le Minor qui est un ensemble de cinq
milieux :
ü le milieu Kliger-Hajna
ü le milieu citrate de Simmons
ü le milieu lysine de fer ou milieu de Taylor
ü le milieu urée-tryptophane
ü le milieu mannitol mobilité nitrate.
v Le milieu Kliger-Hajna (milieu solide)
Le milieu Kliger-Hajna a une couleur rouge carmin. Ce milieu
n'est valable que pour les germes fermentaires. Il entre dans le cadre de
l'étude du métabolisme glucidique et permet l'exploitation de
quatre paramètres :
Ø La fermentation du glucose : Lorsque en
anaérobiose la souche fermente le glucose, il y a formation d'acides
organiques qui acidifient le milieu et entraînent le virage du culot du
rouge au jaune.
Ø La fermentation du lactose (sur la pente) : Elle
se traduit aussi par une coloration jaune du milieu. Cette fermentation
témoigne de la production d'une béta-galactosidase qui hydrolyse
le lactose en galactose et en glucose qui est ensuite utilisé comme
source d'énergie. Les souches qui ne produisent pas de
béta-galactosidase (lactose -) ne peuvent acidifier le milieu, par
conséquent ne peuvent faire virer la couleur de la pente qui reste
rouge. Pour les souches lactose (-), il est nécessaire de faire le test
à l'ONPG (ortho nitrophenyl-galactoside) pour confirmer qu'elles ne
sont pas productrices de béta-galactosidase. En effet certaines souches
apparemment lactose (-) au vu de la couleur de la pente, peuvent être en
réalité des souches lactose (+) qui n'arrivent pas à
faire virer la couleur du milieu parce que le lactose ne peut
pénétrer dans la cellule bactérienne et réagir avec
l'enzyme. Le test de l'ONPG (analogue de lactose) a pour but de faire
éclater les bactéries par choc osmotique dans de l'eau
distillée stérile. Dans ces conditions l'enzyme, si elle existait
dans la bactérie est libérée dans le milieu et
réagit avec l'ONPG entraînant un changement de couleur. Dans le
cas contraire un test négatif confirme que la souche était
effectivement dépourvue de béta-galactosidase.
Ø Production de gaz : Dans le processus
fermentaire du glucose, la décarboxylation du pyruvate est à
l'origine d'un dégagement de dioxyde de carbone (CO2) dont la
pression dans le tube décolle la gélose ; la souche est
ainsi dite gaz (+). Par contre les bactéries gaz (-) ne produisent
aucune trace de gaz.
Ø Production d'Hydrogène sulfuré
H2S: Elle est marquée par une coloration noire de la
gélose issue de sa combinaison avec les ions ferriques. L'absence de
production de H2S ne provoque pas de coloration noire du milieu.
v Le milieu lysine de fer ou milieu de Taylor (couleur
violet)
Il est enrichi en L-lysine et contient du glucose en faible
concentration. Ce milieu permet une étude des constituants en
aérobiose et en anaérobiose.
En aérobiose, il y'a production de lysine
désaminase (LDA) qui catalyse la désamination de la lysine pour
donner des cetoacides qui se combinent avec les sels de fer et donnent une
coloration rouge vineux à la surface de la pente.
Les souches LDA (-) par contre ne peuvent faire virer la
couleur de la pente.
En anaérobiose, le glucose, substrat
préférentiellement utilisé, est fermenté pour
acidifier le milieu. L'utilisation de la lysine comme substrat secondaire
nécessite une lysine décarboxylase (LDC) qui alors est
activée. La LDC, responsable de la décarboxylation de la lysine,
produit la cadavérine qui va alcaliniser le milieu préalablement
acidifié par la fermentation du glucose. Pour les souches LDC (+) le
milieu reste violet : tout se passe comme si la couleur violet avait
viré au jaune et est redevenu violet grâce à la LDC. C'est
pourquoi en l'absence de LDC la coloration du culot reste au stade jaune. Par
ailleurs, il peut y avoir production de H2S
révélé par la formation de sulfure de fer noir.
v Le milieu citrate de Simmons (couleur verte)
Il contient le citrate comme seul source de carbone. Les
bactéries qui seront capables d'utiliser cette source de carbone, vont
croître sur cette gélose et entraîner une variation de pH
à l'origine du virage du milieu au bleu. La gélose reste verte
pour les souches citrate (-).
v Le milieu Urée-indole (milieu liquide)
Le milieu urée-indole ou milieu
urée-tryptophane, est un milieu orange, constitué d'urée
et de tryptophane. Il permet de rechercher trois activités enzymatiques
du métabolisme protéique, à savoir l'uréase, la
tryptophanase et la tryptophane désaminase.
· L'uréase : cette enzyme hydrolyse
l'urée pour donner du carbonate et de l'ammoniac responsables de
l'alcalinisation du milieu qui vire au rose. La couleur jaune demeure pour les
souches qui ne possèdent pas d'uréase active
(uréase -). Ce milieu permet de distinguer le genre Salmonella
(uréase négative donc pas de changement de coloration)
du genre Proteus qui possède une uréase active et
fait virer le milieu au rose.
· La tryptophanase : elle dégrade le
tryptophane pour donner l'indole. Après addition du réactif de
Kovacs, le dimethyl-amino-4-benzaldehyde qu'il contient réagit avec
l'indole et forme un composé coloré en rouge (anneau rouge). Les
souches incapables de provoquer une telle réaction parce que
dépourvues de tryptophanase seront dites indole (-).
· La tryptophane désaminase (TDA) :
L'acide indole pyruvique issu de la dégradation du tryptophane par la
TDA réagit avec le perchlorure de fer III qu'on ajoute pour donner un
précipité brun foncé.
v Le milieu au glycérol (milieu liquide)
Ce milieu est très souvent ajouté aux autres
milieux du portoir de Le Minor ; il est de couleur verte. Il permet de
distinguer Citrobacter de Salmonella Les bactéries
du genre Citrobacter dégradent le glycérol en provoquant
une acidification du milieu (coloration jaune) les Salmonella ne le
dégradent pas, la coloration verte est maintenue.
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