Memoire Online - Polymorphisme des antigenes plaquettaires humains dans la population tunisienne

POLYMORPHISME DES ANTIGENES PLAQUETTAIRES HUMAINS DANS LA POPULATION TUNISIENNE

Tu m'étais le père et l'ami conseiller. Que vous trouviez ici le témoignage de mon inaltérable amour et mon profond dévouement pour vos sacrifices, vos encouragements et vos prières qui ont été le meilleur gage de ma réussite.

Que ce travail soit le témoignage de ma gratitude pour l'amour et la sollicitude que vous avez su me prodiguer depuis toujours.

Merci à mes parents et à ma famille pour leur soutien et leur confiance indéfectibleçç

Mes chers amis Radhi, Sami, Mourad, Rabeh, Samir, Hichem, Chouaib, Mohamed et Tarek.

Mes chères amies Amani, Fatma, Neziha, Wafa, Fatma, Sana, Sameh, Nejwa, Rima, Yemina, Sessia, Abir, Nejet, Soumaya, Gleya et Kawther, Semira et Moufida.

Madame Najet MOJAAT, Professeur à la FPM & Chef service au CNTS de m'avoir accueilli au sein de leur équipe de recherche, d'avoir mis à ma disposition les moyens matériels et scientifiques pour réaliser ce travail de master.

Merci pour vos conseils, pour votre disponibilité inconditionnelle malgré un emploi du temps toujours chargé et merci pour la confiance que vous m'avez portée.

Merci au personnel du laboratoire pour l'ambiance agréable sans laquelle aucun travail serein n'est envisageable.

Remerciements particuliers à M^elle Houda KAABI pour ses coups de mains et pour ses connaissances.

A tous ceux qui ont participé à l'avancement de ce travail, et particulièrement Mr Hajjaj.

Mes remerciements s'adressent à M^me Saida BEN ARAB, professeur à la FMT en reconnaissance de l'honneur qu'elle m'accorde en acceptant de présider le jury du mémoire.

Un grand merci également au professeur Aly RAIES pour l'honneur qu'il m'accorde en acceptant de juger ce travail.

Je remercie vivement le professeur et le coordinateur du mastère de génétique et bio ressources à la faculté des sciences de Tunis, Mohamed EL GAZZAH.

FMAIT: Fetomaternal Alloimmune Thrombocytopenia/ Thrombopénie foeto-maternelle allo-immune

ISTH: International Society on Thrombosis and Haemostasis/Société Internationale de Thrombose et Hémostase

NAIT : Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia/Thrombopénies Néonatale Alloimmune

PCR-ASRA: Polymerase Chain Reaction Allele-Specefic Restriction enzyme Analysis

PNC : Platelet Nomenclature Committee/ Comité de Nomenclature des Plaquettes

PTR : Platelet Transfusion Refractorines/États réfractaires à la transfusion des PLT

VNTR : Variable Number of Tandem Repeat/ Variable Nombre de Répétition en Tandem

Les plaquettes (PLTs) sont de petites cellules sanguines anucléées. Elles sont formées et individualisées dans les mégacaryocytes. Elles jouent un rôle primordial dans l'hémostase. Comme toute autre cellule sanguine humaine, les PLTs portent à leur surface leurs propres systèmes alloantigéniques. Ces antigènes sont portés par les GPs plaquettaires majeures de la membrane et sont désignés, selon la nomenclature internationale, sous le terme de «Human Platelet Antigens» (HPAs).

Actuellement, 24 allo-antigènes, spécifiquement plaquettaires, sont définis, et sont reconnus par des sérums alloimmuns. Douze de ces allo-antigènes sont groupés dans 6 systèmes bialléliques (HPA-1,-2,-3,-4,-5, et -15) avec des anticorps sériques contre les deux allo-antigènes. Pour les 12 allo-antigènes restants, un seul allo-antigène par système est identifié par méthodes sérologiques avec l'allo-anticorps correspondant. Le polymorphisme moléculaire de ces systèmes est simple. Dans la plupart des cas, il résulte d'une substitution d'un seul nucléotide (SNP) au niveau du gène codant se traduisant par la substitution d'un seul aa au niveau de l'allo-antigène porté par la GP mature exprimée à la surface plaquettaire.

Les allo-anticorps anti-HPAs sont impliqués dans trois situations cliniques : les NAIT, le PTP et les PTR. La distribution des HPAs sur les cellules et les organes est plus large qu'on ne pensait initialement. Par conséquent, ils peuvent jouer d'autres rôles à coté de leur rôle dans l'hémostase : dans la transplantation des organes et des tissus, (antigènes mineures d'histocompatibilité) telle que la transplantation de la MO. Ils peuvent de même être impliqués dans la survenue d'accidents cardiovasculaires mortelle.

Les antigènes plaquettaires sont codés par des gènes dont l'expression est codominante et la distribution varie pour chaque population ethnique. Ils pourraient ainsi constituer des marqueurs génétiques des populations.

Notre présent travail vient compléter les études antérieures touchant au polymorphisme plaquettaire. C'est ainsi que nous nous sommes intéressés à l'étude du polymorphisme moléculaire de cinq premiers systèmes plaquettaires HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5, dans un échantillon de la population tunisienne, afin de :

- Définir les fréquences alléliques, génotypiques, phénotypiques et haplotypiques dans la population tunisienne des ces cinq systèmes de groupes plaquettaires cliniquement les plus importants.

- De comparer ces fréquences á celles rapportées dans la population tunisienne et dans d'autres populations.

- D'évaluer le risque potentiel d'allo-umminisation plaquettaire dans la population tunisienne.

I Les plaquettes sanguines

I.1 Définition

Les PLTs ou thrombocytes sont les plus petits éléments figurés du sang. Elles ont été découvertes tardivement en 1882 par Bizzozero à cause de leur petite taille puis redécouvertes en 1960s après plusieurs décennies d'oubli (Gaetano. G., 2001; Rozman. P. 2002). Ce sont des fragments cellulaires anucléés. Les PLTs naissent par le phénomène de mégacaryocytopoïèse. Leur durée de vie est courte; elles survivent dans la circulation chez l'homme pendant 7 jours environ. Malgré leur absence de capacité de prolifération et leur durée de vie limitée, ces cellules sont en nombre constant dans le sang et perpétuellement renouvelées avec une dynamique exceptionnelle.

I.2 Formation

La formation se déroule dans la MO, les PLTs sont produites à partir de la prolifération et de la différenciation des progénitures mégacaryocytaires médullaires ussus des cellules souches hématopoetiques (Hoffman. R. 1989; Vainchenker. W et al., 1995) par la mégacaryocytopoïèse. Leur nombre usuel circulant dans le sang périphérique est de 150-400.10⁹PLTs/l. Environ 2x10¹¹PLTs doivent être produites chaque jour chez l'homme adulte, chaque seconde, approximativement 2.10⁶ PLTs sont produites dans le corps humain (Beutler. E. 2001). Ce phénomène comprend plusieurs étapes :

C'est l'étape où le précurseur mégacaryocytaire passe d'un stade diploïde à une ploïdie. IL subit des doublements successifs de son ADN en moyenne de 16 N (peut arriver jusqu'à 180 N) par endomitose. Ce phénomène s'accompagne de la production d'une vaste masse cytoplasmique, qui se compartimente progressivement et se fragmente totalement en fin de maturation pour former les PLT.

La maturation des mégacaryocytes n'a lieu que dans les cellules 8N ou plus. La majorité des cellules donnent lieu à la plaquettogenèse ayant une ploïdie de 8, 16 et 32 N, avec un pic à 16 N. Un à huit milliers de PLTs naissent de chaque mégacaryocyte. La maturation est marquée par l'augmentation de la taille du cytoplasme, le développement d'un réseau de membranes cytoplasmiques appelées membranes de démarcation et de la production de granules sécrétoires, en particulier des granules á.

C'est l'étape finale. Elle correspond à la production plaquettaire par la fragmentation du cytoplasme du mégacaryocyte en PLTs par un processus dynamique très original différent d'une mitose appelée formation de proplaquettes. Contrairement aux autres étapes de la mégacaryocytopoèse qui se déroulent dans la MO, la production des PLTs intervient dans la circulation sanguine. Ce processus prend probablement place dans les capillaires du poumon (Beutler. E. 2001).

I.3 Morphologies

Les PLTs sanguines sont hétérogènes en taille et en forme, souvent arrondies ou ovalaires. Leur diamètre est approximativement de 1.5 à 3.3 micromètres. Les PLTs représentent, à l'état de repos, une forme ovalaire d'un volume plaquettaire moyen de 6 à 8 u maintenue par un réseau de microtubules. Le cytoplasme est clair, légèrement basophile et contient des granulations azurophiles.

I.4 Ultrastructure

En dépit de la simplicité de son apparence externe, la PLT a une organisation interne très complexe.

· L'environnement périplaquettaire : On trouve à la périphérie le glycocalix, il est riche en protéines de coagulation (fibrinogène, facteur V, facteur VIIIc, facteur XIII), en amines vaso-actives, en FvW et en glucides qui appartiennent surtout à la région extérieure des protéines membranaires.

· La membrane plasmique : la membrane des PLTs obéit au modèle général de mosaïque fluide. Elle constitue une zone unique dans l'anatomie plaquettaire. Elle présente la structure trilaminaire classique avec deux feuillets lipidiques de composition différentes (Chap. H. J et al., 1977; Perret. B et al., 1979). Elle est épaisse de 70 à 90 Å. À travers la bicouche s'insère une série de récepteurs spécifiques d'agents activateurs ou inhibiteurs plaquettaires. Les PLTs disposent d'un réseau de profondes invaginations qui constituent des canalicules connectés à la surface, ce sont des lieux d'échanges importants, ces invaginations constituent le système canaliculaire ouvert (SCO) qui a pour origine les restes des membranes de démarcation. Outre la réserve de membranes qu'il constitue lors du changement de forme des PLTs activées, le SCO est aussi le site de sécrétion des différents granules plaquettaires. En plus de la membrane plasmique et le SCO, le système membranaire plaquettaire est constitué du système tubulaire dense (STD). Le STD est le site majeur de stockage du Ca⁺⁺ et contient des enzymes impliquées dans la synthèse des prostaglandines. La membrane est le support d'un grand nombre de GPs. Elles ont un rôle dans la structure des PLT, un rôle fonctionnel de récepteurs vis-à-vis d'un certain nombre de molécules et un rôle de répulsion.

La couche externe du glycocalix contient des séries de molécules complexes de GPs (Mohanty. D et al., 2004), dont certaines d'ailleurs la traversent de part en part. Plus de 45 structures membranaires différentes sont identifiées chez les PLTs (Rozman. P. 2002) et plus de 50 GPs ont été également identifiées (Newman. P. J et Goldberger. A. 1991).

· Le cytoplasme : Le cytoplasme contient un cytosquelette formant plusieurs systèmes fibrillaires tels que les microfilaments à base d'actine et de myosine (White. J. G. 1969), les microtubules et les filaments intermédiaires. Le cytoplasme contient des mitochondries, des grains de glycogène, des microperoxysomes riches en catalase et trois types d'organelles de stockage majeurs (Fig. 1).

· les granules plaquettaires : formés par les granules denses, les granules á et les lysosomes. Ces granules dont le contenu est secrété durant la réaction de libération, et est nécéssaire au bon fonctionnement des PLTs (Fig. 1).

· Les microtubules : sont des structures rigides, circonférentielles, périphérique, formées de microfilaments. Ils sont responsables de la forme discoïde de la PLT au repos. Après activation plaquettaire, ils se polymérisent ce qui entraîne un changement de forme des PLTs, puis se reconstituent à l'intérieur de pseudopodes.

· Le cytosquelette : Il comprend les fibres et les filaments qui confèrent à la PLT sa forme. Ils permettent aussi au cytoplasme et aux membranes plasmiques de changer de forme.

I.5 Rôle

Les PLTs jouent un rôle primordial dans les mécanismes de l'hémostase. Elles participent à de nombreux autres processus physiopathologiques tels que, la thrombose et l'inflammation. En fait, la fonction essentielle des PLTs réside dans le maintien de l'intégrité du système circulatoire et la prévention de la perte du sang en cas de blessure, que ce soit par leur interaction avec les vaisseaux, leur participation à la coagulation et à la fibrinolyse, ou par leur rôle dans la rétraction du caillot. Ainsi, les PLTs manifestent plusieurs réponses fonctionnelles : adhésion, activation, sécrétion et agrégation qui dépendent des récepteurs glycoprotéiques de surface (Blockmans. D et al., 1995).

Figure 1. A: Ultra structure plaquettaire B : Glycoprotéines membranaire et leur ligands :

(PLT active avec le début de formation des filopodes). Les complexes protéiques sont représentes avec leurs éventuels ligands á : granules á, ABP : Actin-binding protéine, a : grain de glycogènes, Coll : collagène, D : granules dense, DTS : système tubulaire dense, GP : glycoprotéine, MTS : système microtubulaire, OCS : Système caniculaire ouvert, Vwf : Facteur Von Willibrand (D'après White et al., 1979).

II Les glycoprotéines de la membrane plaquettaire

II.1 Généralités sur les GPs

Les GPs sont importantes pour les fonctions plaquettaires. Elles sont classées de la GPI à la GPX. Et agissent en tant que récepteurs à des stimuli extérieurs pour beaucoup de protéines adhésives telles que le collagène, le FvW, l'ADP, etc (Mohanty. D et al., 2004). Parmi ces différents GPs, seulement quelques unes sont polymorphes. Les GPs majeures possèdent des chaînes polypeptidiques qui traversent la membrane de part en part. La majeure partie, sinon toutes les chaînes oligosaccharidiques des GPs, sont exposées vers la partie externe et interagissent avec l'environnement plasmatique aqueux. Récemment, elles ont été reconnues comme membres de la famille des intégrines. Qui est une vaste famille de recepteurs d'adhesion membranaire apparentés sous forme de complexes protéiques hétérodimèriques avec deux sous-unités á et â, liées de manière non-covalente (Gottschalk. K et al., 2002).

Figure 2. Association observées pour les différentes sous-unités á et â des intégrines.

De nos jours, 19 sous-unités á (orangé) et 8 sous-unités â (vert) (Fig. 2) ont été identifiées qui s'associent de manière non-covalente pour former au moins 25 hétérodimèriques áâ différents. Les sous- unités á marquées d'un astérisque (?) contiennent un domaine I. Figure modifiée d'après Shimaoka et al. (2002) (Laurent. T., 2004).

II.2 Les GPs majeures de la membrane plaquettaire

Six GPs majeures polymorphiques et immunogènes (Newman. P. J et al., 1995; Kroll. H et al., 1998) sont identifiées à la surface de la membrane plaquettaire GPs : GPIIIa (CD61), GPIIb (CD41a), GPIb (CD42b); GPIbâ, GPIa et la CD109 (Fig. 3) (Von dem Borne Aeg. K et Decary. H., 1990; Shih. M. C et al., 2003). Elles jouent un rôle vital dans la fonction des PLTs. Ces GPs portent les épitopes allo-antigéniques génétiquement déterminés qui peuvent provoquer une réponse alloimmune pendant la grossesse ou après transfusion des PLTs. De même Plusieurs polymorphismes, sont associés avec un risque élevé de thrombose artérielle (Bray. P. F, 1999; Bussel. J. B et al., 2000; Reiner. A. P et al., 2000). Un polymorphisme plaquettaire dans la région régulatrice d'un gène, par exemple, peut changer l'expression du récepteur à la surface de PLTs. De plus, les polymorphismes résulte d'une substitution d'aa peuvent changez la structure tertiaire du récepteur et par la suite une altération de la fonction adhésive des PLTs (Charakida. M et al., 2003 ; Charakida. M et al., 2003a). Les variations alléliques de ces GPs : GPIbá, GPIbâ, GPIIb, GPIIIa (CD61), GPIa et la CD109 sont les produits de six gènes, GP1BA (l7p12ter), GP1BB (22q 11.2), GP2B (l7q21.3), GP3A (l7q21-22) (Jones. D. C et al., 2003), GP1A (5q23-31) et (CD109) (Ch.6).

II.3 Les complexes glycoprotéiques majeurs

Les GPs majeures de la membrane plaquettaire sont présentes sous forme de complexes multimoléculaires qui assurent aux PLTs les fonctions adhésives indispensables au processus d'hémostase. Ainsi l'adhésion des PLTs à la matrice extracellulaire est médiée par des GPs spécifiques, habituellement groupées dans les complexes glycoprotéiques suivants

II.3.1 Le complexe GPIIb/IIIa

Le complexe GPIIb-IIIa (á_IIbß₃)/(CD41a) (Fig. 4) est un récepteur hétérodimèriques Ca⁺⁺ dépendant (Nurden. A.T. 1995). La GPIIb est associée par des liaisons non covalentes avec une chaîne de la GPIIIa pour former le complexe GPIIb/IIIa (Calvete. J. 1994). Ces deux GPs sont reliées par un pont disulfure. C'est le représentant majeur des complexes glycoprotéiques plaquettaires. Il y a approximativement 80,000 copies par PLT (Nurden. A. T. 1995; Wager. C. L et al., 1996; Gidwitz. S et al., 2004). Il est présent sur la membrane plasmique à raison 50 000 copies par PLT non activée (Aiken. M. L et al., 1986), avec un deuxième pool intra plaquettaire 30000 supplémentaires répartis essentiellement dans les membranes du SCO et au niveau de la membrane des granules á (Von dem born et al., 1991) et qui s'exprime à la surface plaquettaire après l'activation plaquettaire.

Ils constituent le récepteur des protéines adhésives et cytoadhésives telles que le vitronectine (Bray P.F et al., 1987) et le FvW (Prandini. M. H. et al., 1988), il est le principal récepteur du fibrinogène des PLTs.

La fixation du vWF et d'autres protéines adhésives au GPIIb/IIIa se fait par l'intermédiaire de la séquence RGD tripeptide (Arg-Gly-Asp) (Calvete. J. 1994). Il joue un rôle majeur dans l'agrégation plaquettaire par interaction avec l'extrémité C-terminale de la chaîne ã du fibrinogène (Jallu. V et al., 2002; Unkelbach. K. 2005).

a.1 Gène

Le gène codant pour la sous-unité 3 a été identifié au niveau de la région q 21-22 du chromosome 17 et couvre une région de 63 kb. Le gène comporte 15 exons. L'ARNm transcrit a une taille de 3.17 kb (Fitzgerald. L. A et al., 1987; Zimrin. A. B et al., 1988).

a.2 Structure protéique et fonction

La GPIIIa est formée d'une seule chaîne polypeptidique de 762 aa (Fitzgerald. L. A et al., 1987; Zimrin. A. B et al., 1988). Elle est composée de trois domaines : un large domaine extracellulaire comportant plusieurs ponts disulfures extra chaînes de l'extrémité N-terminale, fortement associé par 28 liaisons disulfures ; un domaine transmembranaire et une courte région cytoplasmique de l'extrémité C-terminale correspondant au résidu d'aa 740 à 762 (Santoso. S. A et al., 1998; Roúman. P. 2002).

Elle est associée à la GPIIb par des liaisons non covalentes calcium dépendantes pour former un complexe hétérodimérique au niveau membranaire (Jennings. L. K et al., 1982; Bray. P. F et al., 1987). Le poids moléculaire est de 95 kDa (Calvete J. 1994) dans des conditions physiologiques. C'est un récepteur pour le fibrinogène et le FvW, possède un rôle important dans l'agrégation des PLTs (Bojesen. S. E et al., 2003; Pamukcu. B. M. D et al., 2005). Elles sont impliquées dans le maintien de la structure de l'intégrine

a.3 Distribution cellulaires de la GPIIIa (CD61)

C'est l'intégrine la plus polymorphe (Metcalfe. P et al., 2003), elle porte les allo-épitopes HPA-1, -4, -6, -7, -8, (Newman. P. J et al., 1989; Santoso. S. A et al., 1994) -10, -11, Oe^a (Kroll. H et al., 1995) et Va^a. Les alloantigènes et les antigènes privés sont localisés sur les différents domaines de la GPIIIa, qui apparaît donc très immunogène : HPA-1 et HPA-10 sur le domaine terminal, HPA-4 sur le domaine de liaison des ligands, HPA-6 et Oe^adans le domaine riche en répétition cystéine et HPA-8 et HPA-11 dans le domaine extra-cellulaire C-terminale (Santoso. S. A et al., 2002) (Tableau II).

Les polymorphismes des gènes de la GPIa C⁸⁰⁷T et de la GPIIIa (Pl^A1/A2) peuvent causer le thromboembolisme artériel (Santoso. S. A et al., 1999a). La région riche en Cys (50-kD) de la GPIIIa est fréquemment une cible d'auto-anticorps dans la thrombocytopénie idiopathique (Kekomaki. R et al., 1991).

La GPIIIaest distribuée sur les PLTs (Phillips. D. R et al., 1988; Boldt. B et al., 1997), les mégacaryocytes, les monocytes, les macrophages et sur des cellules de l'endothélium.

a.1 Structure et expression du gène

Le gène codant ITGA2B couvre une région de 17,2 kb et comportant une trentaine d'exons (Poncz. M et al., 1987; Lanza. F et al., 1990; Poncz. M et Newman. P.J. 1990). Les gènes codant pour les deux GPIIb (ITGA2B) (Cong. N. V et al., 1988) et GPIIIa (ITGB3) qui sont localisés sur le bras long du chromosome 17 (q21=>23) sont approximativement physiquement proches (Sosnoski. D. M et al 1988; Bray. P. F et al., 1988 ). Ils sont situés côte à côte dans un seul segment de 260-kb (Bray. P. F et al., 1988; Sosnoski. D. M et al., 1988; Rosa. J. P. et al., 1988; Thornton. M. A et al., 1999). L'expression simultanée du GPIIb et du GPIIIa pourrait dépendre de la proximité physique (Bray. P. F et al., 1988).

a.2 Structure protéique

La GPIIb, a une structure de dimère avec deux sous-unités á et â. La molécule non réduite a une Mm de 142 kDa (Bray. P. F et al., 1987). C'est une protéine transmembranaire avec une chaîne lourde extracellulaire de 125 kDa et une chaîne légère de 23 kDa. Le domaine transmembranaire est relié par un pont disulfure. Il y a 50 000-80 000 copies par PLT.

a.3 Distribution cellulaires de la GPIIb (CD41)

Elles sont spécifiques de la lignée mégacaryocyto-plaquettaire et sont distinctes pour la sous-unité á dans les autres tissus normaux (Bray. P.F et al., 1987).

II.3.2 Le complexe GPIb-V-IX (CD 42)

a.1 Structure

C'est un complexe transmembranaire équimoléculaire qui comprend 2 molécules Ibá, 2 molécules Ibâ, 2 molécules IX, et une molécule V : (Ibá Ibâ/IX)₂ V₁ (un ratio de 2 :2 :2 :1) produites par des gènes distincts (Bussel. J. B et al., 2000). Ces sous-unités possèdent des traits structuraux semblables et appartenant à la famille des GPs riches en Leu (Lopez. J. A et al., 1994; Shen. Y et al., 2000). Les GPIbá et GPIbâ sont liées par une seule liaison de covalence disulfure et sont liées par des liaisons non covalentes à GPIX et à GPV.

La majeure partie du complexe GPIb-IX-V est extra-cellulaire (fig. 5). Il y a approximativement 25 000 copies de GPIb/IX sur une PLT non activée (Lopez. J A. et al., 1994; Ware. J. 1998; Cauwenberghs. K et al., 2001) et 12 000 copies de GPV par PLT. Ce complexe est un récepteur du FvW nécessaire aux premières étapes de l'adhésion des PLTs aux parois du vaisseau lésé. Chacune des GPs possède un segment hydrophobe pour l'insertion dans la membrane (Berndt. M. C et al., 2001).

a.2 Rôle du complexe GPIb-IX-V

C'est le principal récepteur responsable de l'adhésivité plaquettaire (Afshar-Kharghan. V et al., 1999). La partie intra cytoplasmique du complexe GPIb-IX-V joue un rôle majeur dans l'activation de l'intégrine á_IIbß₃ induite par la liaison GPIbX-FvW. La fonction d'adhésion au sein de ce complexe est totalement assurée par la GPIbâ.

Son rôle est prépondérant dans la microcirculation, et elle est essentielle pour le maintien de l'hémostase primaire normale. La GP Ibá est fonctionnellement dominante de ce complexe. Le ligand se fixant sur la GPIb impliqué dans l'adhésivité plaquettaire est le FvW (Lopez. J. A. 1994; Chester. Q et al., 2000).

Les GPIbá, GPIbâ, GPIX et GPV sont toutes déficientes ou affectées dans le syndrome thrombocytaire hémorragique sévère : syndrome de Jean Bernard et Soulier, avec désordres de saignement (Ruggeri. Z. M. 1991; Kelly. M. D et al., 1994).

L'organisation définitive du complexe n'est pas élucidée, la figure 6 correspond donc à une représentation schématique hypothétique, prenant en compte la stoechiométrie du complexe et l'association préférentielle de GPV à GPIb (Nathalie. H. 2004).

a. La glycoprotéine Ib; GPIb (CD42b)

Cette GP hétérodimérique de haut poids moléculaire 160 kDa, riche en carbohydrate (Lopez. J. A. et al., 1988), la plus riche en acide sialique. Elle appartient à la famille des protéines riches en répétitions Leu. Le fragment extra cytoplasmique de la GPIb est de 140 kDa. Elle est composée de deux chaînes polypeptidiques (Iba ou Ibá /Ibb ou Ibâ) : une large sous unité á reliée par un seul pont disulfure à une petite sous unité â (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992; Murata. M et al., 1992; Aramaki. K. M. et Reiner. A. P. 1999). La GPIbá a pour Mm de 143 kDa avec 610 aa) et GPIbâ (CD42c, avec 181 aa) forment un complexe avec le GP IX (CD42a) (160 aa), elles sont associées par des liaisons non covalentes (Wu. G et al., 1996) en se reliant à la GPV (Ruggeri. Z. M. 1991; Lopez. J. A. 1994; Charakida. M et al., 2003).

C'est une protéine transmembranaire avec sept répétitions en tandem de 24 aa (Lopez. J. A et al., 1988). Elle possède dans sa partie externe les récepteurs à la thrombine (Wicki. A. N et Clemetson. K. J. 1987; Katagiri. Y et al., 1990), avec une très forte affinité et un site de fixation par sa partie N-terminale du FvW (Handa. M et al., 1986) qui joue un rôle essentiel dans l'adhésivité des PLTs. La GPIbá a pour ligands aussi ámâ2 et plusieurs autres facteurs de la coagulation (facteur XI, facteur XII, ... .). Les sites de liaison pour ces ligands sont situés dans le domaine globulaire N-terminal, constitué des 282 premiers aa. Ce domaine comprend 7 séquences riches en Leu et Tyr sulfates. La partie intra cellulaire de GPIbá comprend 20 aa (Lopez. J. A. 1988; Berndt. M. C. et al., 2001).

- GPIbâ

· Gènes (GP1BA, GP1BB)

GPIbâ est la plus petite sous-unité (24-kDa) (Ruggeri. Z. M. 1991) du complexe GPIb-V-IX (Kelly. M. D et al., 1994; Roth. G. J. 1994). La région terminale du GPIbâ contient une séquence riche en Leu de 24 aa. Cette région est suivie par un segment transmembranaire de 25 aa et une région intracellulaire de 34 aa à l'extrémité carboxylique terminale (Lopez. J. A. 1988; Berndt. M. C et al., 2001).

· Structure

· Distribution cellulaires de la GPIbâ

Les molécules ont été identifiées sur les PLTs et les mégacaryocytes. Les GPIbâ se trouvent aussi au niveau des cellules endothéliales (Roth. G. J. 1994). La GPIb s'aperçoit d'ailleurs sur des cellules de l'épithélium vasculaire, l'erythroleukemia (Rajagopalan. V et al., 1992) et tonsilare.

b. La glycoprotéine V (GPV) (CD 42 d)

a.1 Structure

La GPV est associée de manière non covalente à la GPIbá, la GPIbâ et la GPIX pour former le complexe GPIb-V-IX (Chester. Q et al., 2000). Elle est de poids moléculaire de 83 kDa. La fonction exacte de la GPV n'est pas connue.

La GPV, est immunogène et des anticorps circulants ont été détectés lors des thrombopénies. Des polymorphismes de la GPV ont été observés dans une population normale. Leur gènes codants (GP5*) sont localisés sur le Chr 3q29 (Yagi. M et al., 1995).

a.2 Distribution cellulaires de la glycoprotéine V

La GPV est fortement exprimée à la surface des PLTs dont l'expression tissulaire est restreinte à la lignée mégacaryocytaire et est exprimée dans les étapes tardives de la différentiation de ces cellules.

Le complexe GPIb-IX-V est majoritairement exprimé par la lignée mégacaryocytaire. Son expression par l'endothélium, expression inductible en réponse aux cytokines, reste controversée (Berndt. M. C et al., 2001).

c. La glycoprotéine GPIX

La GPIX (CD42a, Mm 20 kDa) est formée par une seule chaîne leur gène (GP9*) est localisé sur le chromosome 3q21 (Yagi. M et al., 1995).

II.4 Les complexes glycoprotéiques mineurs

II.4.1 Complexe Ia-IIa ou á2â1 (analogue à VLA-2)

Le complexe Ia-IIa ou á2â1 (analogue à VLA-2) est un hétérodimère constitué d'une chaîne á2 et d'une chaîne â1. Membre de la famille des intégrines qui sert comme un récepteur majeur pour le collagène chez les PLTs (Chadderdon. R.C et al., 1999; Santoso. S. A et al., 1993b) et chez d'autres types cellulaires. En plus de son rôle dans l'adhésion plaquettaire au matrice extracellulaire, la GPIa/IIa sert de médiateur d'adhésions plaquettaires au collagène fibrillaire (type I et III) ou non fibrillaire (type IV et VI). Leur fonction dépend des ions Mg²⁺ (Staatz. W. D. et al., 1989). Il y a approximativement 800-2800 copies de GPIa/IIa par PLTs et ne possèdent pas de stock interne secrété (Clemetson. K. J. 2001 Roúman P. 2002).

a.1 La glycoprotéine GPIa

La GPIa joue un rôle de récepteur pour le collagène au sous endothélium elle exige les ions Mg⁺⁺(Staatz. W. D et al., 1989). Elle est formée d'une chaîne polypeptidique unique. Et comporte une distribution des résidus Cys et des domaines de liaison des cations. La majeure caractéristique de GPIa est la présence de 191 aa (domaine I) qui contient les sites potentiels pour l'interaction avec le collagène (Santoso. S. A et al., 1993). Le nombre estimé des molécules GPIa à la surface des PLTs est de 1842 (Pischel. K. D et al., 1988).

La GPIa est codée par le gène ITGA2, localisé sur le bras long du chromosome 5 (5q23-q31) (Takada. Y et Hemler. M. E. 1989; Jaspers. M et al., 1991). La densité de GPIa-IIa à la surface des PLTs varie selon les polymorphismes nucléotidiques dans le gène ITGA2 (Kunicki. T. J et al., 1997).

a.2 La glycoprotéine GPIIa (CD29)

Elle est formée d'une chaîne polypeptidique unique. Elle participe à l'adhésion comme récepteur de collagène et à l'activation des PLTs. Le nombre estimé des molécules GPIIa est de 4926. La GPIIa correspond à la chaîne â VLA avec Mm (145 kDa). La GPIIa forme des complexes hétérodimérique avec GPIc, GPIa (Pischel. K. D et al., 1988).

II.4.2 Complexe Ic-IIa

Le complexe Ic-IIa (analogue à VLA-5) impliqué dans l'adhésion à la fibronéctine.

II.4.3 Le complexe GPIc*/IIa/VLA-6

· Structure du gène

Le gène codant, formé par 32 exons, est porté par le chromosome 6. L'ADNc de la CD109 est formé de 4335 pb ( http://www.gene.ucl.ac.uk/).

· Structure et fonction protéique

La CD109 est un glycosylphosphatidylinositol-isoforme monomérique (GPI) ancré à une GP de poids moléculaire de 170 à 180 kDa (Brashem-Stein. C et al., 1988) et de 1445 aa. C'est une protéine à 3 domaines. La CD109 est ancrée à la membrane par un groupement phosphatidyl inositol (Smith. J.W et al., 1995). Bien que sa fonction précise n'est pas encore connue, elle a été identifiée comme un nouveau membre de la famille des macroglobulines (á2M)/C3, C4, C5 des protéines contenant des thio-esters (Lin. M et al., 2002).

Elle est capable d'intervenir dans des interactions covalentes cellule-substrat et cellule-cellule. Elle joue un rôle dans la présentation d'antigène par les cellules T et dans l'interaction des cellules B et T. De cette façon, la CD109 peut jouer un rôle dans l'hèmatopoiese et l'hémostase primaire (Lin. M et al., 2002). L'expression du CD109 sur les PLTs est faible : approximativement 2000 #177; 400 molécules par PLT activée par la thrombine (Schuh. A. C. 2002), mais il existe une variabilité d'expression significative entre les individus (Berry. J. E et al., 2000). La congélation ne permet pas de conserver cette molécule CD109 (Cardone. J. D. B et al., 2004).

· Distribution cellulaire de la CD109

Elle a été décrite d'abord sur les PLTs et les cellules T activées (Suciu-Foca. N et al., 1985; Murray. L. J et al., 1999). On l'a identifié par la suite sur les cellules endothéliales (Murray. L. J et al., 1999), sur un sous-ensemble de progéniteurs primitifs de la MO, sur les cellules souches hématopoïétiques (Sutherland. D. R et al., 1991; Schuh. A. C. 2002), sur les monocytes, sur les granulocytes, sur les cellules CD34⁺(Kelton. J.G et al., 1990) et sur plusieurs lignées de cellules tumorales cultivées (Smith. J.W. 1995).

III IMMUNOLOGIE PLAQUETTAIRE

III.1 Définition des allo-antigènes plaquettaires

Les allo-antigènes sont des variétés antigéniques qui différencient les individus d'une même espèce. Ils constituent des allotypes, qui sont codés par différents allèles que possèdent certains individus d'une même espèce ce sont donc des marqueurs génétiques.

III.2 Les allo-antigènes communs avec d'autres cellules

Plusieurs antigènes plaquettaires sont partagés avec d'autres cellules sanguines : érythrocytes; les lymphocytes (Bussel. J. B. 2000; Matei. D. E. 2002).

1- Les antigènes tissulaires HLA

Seuls les antigènes HLA de classe I classique HLA-A,-B,-C (principalement A et B) sont détectables sur les PLTs des sujets normaux. Cependant, chez certains patients de purpura auto-immun, des antigènes HLA-DR ont été mis en évidence (Boshkov. I. K et al., 1992). On a d'abord supposé que les antigènes HLA étaient adsorbés sur les PLTs à partir d'antigènes solubles plasmatiques (Kao. K. J. 1988). Mais il a été montré que les antigènes HLA pouvaient être synthétisés ; on a pu isoler de l'ARNm spécifique des antigènes HLA-I dans les PLTs (Santoso. S. A et al., 1993).

2- Les antigènes des groupes sanguins

Les antigènes du système (A, B, O) (antigènes de Groupe A.B.H), (Von dem Borne. A et Decary. F. 1990) Lewis (antigènes Le^a Le^b), MN (antigènes M. N), l'antigène P et I peuvent être présents à la surface plaquettaire. Ces antigènes peuvent être soit adsorbés à partir du plasma et sont alors présents sur les structures glycolipidiques, soit être partie intégrante des GPs plasmatiques telles que la GPIb, la GPIIa, la GPIIIa, la GPIIb (Santoso. S. A et al., 1991).

III.3 Les allo-antigènes spécifiquement plaquettaires

1- Définition

Ces antigènes sont exprimés d'une manière prédominante sur les PLTs. Ils ont été décrits pour la première fois en 1959 (Van Loghem. J. J et al., 1959; Mohanty. D et al., 2004). Ils ont été découverts suite à des observations cliniques de NAIT ou des cas de PTP. Ils sont localisés sur l'une ou l'autre des six GPs plaquettaires majeures Ia, Ibâ, Ib, IIb, IIIa et la CD109, mais la GPIIIa porte la majorité de ces alloantigènes (Von der Harst. D et al., 1994). Certains de ces antigènes peuvent être exprimés sur d'autres cellules mais à un degré moindre que sur les plaquettes. Ces épitopes immunogènes sont responsables d'accidents d'alloimmunisation foeto-maternelles (Shibfata. Y et al., 1986; Chantrain. C et al., 2000) et post-transfusionnelles (Coffe. C et al., 1995; Crow. C, 1999), après grossesse ou transfusion incompatible à la manière des groupes sanguins et des allo-antigènes du systèmes alloantigèniques d'histocompatibilité HLA (Von dem borne et al., 1995; Simpson. E et al., 1997). De tel alloanticorps serait à l'origine de troubles hémorragiques (Newman. P. J. 1994; Boldt. B et al., 1997).

2- Nomenclature des antigènes spécifiquement plaquettaires

Initialement, les antigènes plaquettaires étaient définis comme étant des groupes sanguins à partir des sérums des patients allo-immunisés (Tseng L.H et al., 1999; Kao. K.J et al., 1996) et portaient les noms des patients chez qui ces allo-anticorps ont été découverts. Habituellement, ils sont mis en évidence à l'aide de sérums provenant de malades ayant présenté un purpura post-transfusionnel ou des mères d'enfants atteintes de thrombopénie néo-natale (Chabrenaud. J. L et al., 1995).

De ce fait, plusieurs antisérums découverts indépendamment, portaient différents noms de patients (exemple : Zw et P1^A,Bak et Lek, Yuk et Peu...) (Tableau III).

Pour pallier à ces différentes appellations, Von dem Borne et Decary en 1990 ont proposé un système simplifié dans lequel, chaque allo-anticorps spécifique d'un allo antigène était désigné par le numéro de l'allo-antigènes plaquettaire HPA correspondant ; ainsi l'allo-antigènes P1^A (Zw) (Van Loghem. J. J et al., 1959) est désigné par HPA-1 (Newman P. J. 1994). Et les systèmes plaquettaires sont classifiés dans le système immunogénétique (Dem. Borne. A. E et Décary F., 1990). Santoso et Kiefel ont révisé la nomenclature en 1998 dans le but d'éviter les confusions concernant ces systèmes (Santoso. S. A et Kiefel. V. 1998). Cette nomenclature était moins compliquée que la précédente, donnant les données essentielles sur les nucléotides polymorphes aussi bien que les polymorphismes correspondant aux aa au niveau protéique.

En 1990, the Working Party on Platelet Serology a décidé de formuler un nouveau système de nomenclature basé sur les points suivants :

· Les systèmes antigéniques spécifiquement plaquettaires seront nommés HPA (human platelet alloantigens).

· Les différents systèmes antigéniques sont numérotés chronologiquement selon leur date de découverte.

· On identifie actuellement six systèmes dialléliques. Les formes alléliques seront indiquées alphabétiquement par ordre de leur fréquence dans la population : l'allèle a est le plus fréquent et l'allèle b est le plus faible (Von dem Borne A .k et Decary. F., 1990).

A côté de ces 6 systèmes pour qui on a identifié des anticorps sériques contre les deux allo-antigènes, d'autres systèmes n'ont été identifiés par la sérologie qu'avec un seul allo-antigène. Une désignation W est alors ajoutée après le nom de l'antigène (après le chiffre arabe) si un allo-anticorps contre l'antigène antithétique n'a pas été rapporté (Metcafle. P et al., 2003).

· L'inclusion de nouveaux systèmes HPA devrait être approuvée par The Working Party (Koutsogianni. P. 2004).

Plus tard, en 2003, le Comité de Nomenclature des Plaquettes (PNC) a été créé comme une plate-forme de collaboration entre les groupes qui travaillent sur les PLTs (Platelet Working Party) de la Société Internationale de Transfusion Sanguine (ISBT) et la sous-commission scientifique de l'immunologie plaquettaire de la (ISTH). Ce comité sera le gardien pour la nomenclature des systèmes plaquettaires HPA (Von dem Borne A .k et Decary. F., 1990a).

· Un allo antigène spécifiquement plaquettaire n'est dit HPA que quand sa base moléculaire est définie.

· Les nouveaux antigènes ne seront inclus dans la table de la nomenclature des HPA que lorsque l'approbation du PNC est obtenue. Et avant que le PNC ne donne sa décision, il tient compte des conditions suivantes :

(i) l'allo-antigènes devrait être génétiquement déterminé. Une base de données devrait être fournie : de préférence, la séquence d'ADN ou au minimum la séquence d'ADNc.

(ii) L'association entre la mutation génétique et la réactivité des allo-anticorps avec les formes alléliques des protéines spécifiques par des méthodes immunologiques.

(iii) Au moins deux laboratoires de référence doivent confirmer les données sérologiques et moléculaires.

(iiii) Le laboratoire de contribution devrait fournir une base de données sur la population étudiée. Un pedigree avec les individus de la famille index et/ou d'autres familles serait d'une valeur additionnelle.

(iiiii) Le laboratoire de contribution devrait faire tous ses efforts pour que les échantillons sanguins soient disponibles aux laboratoires pour l'établissement des lignées cellulaires lymphoblastoides (Metcalfe. P et al., 2003).

3- Polymorphisme et transmission génétique des HPAs

A présent, 24 HPAs allo-antigènes spécifiquement plaquettaires ont été définis sérologiquement à l'aide d'allo-anticorps allo-immuns correspondants, dont seulement 12 sont groupés dans six systèmes bialléliques (HPA-1,-2,-3,-4,-5,-15) avec des anticorps sériques contre les deux allo-antigènes. D'autres systèmes antigéniques rares ou privés sont aussi détectés avec un seul allo-anticorps correspondant. La base moléculaire de 22 antigènes parmi les 24 définis sérologiquement est résolue. Pour les 21 HPAs, la différence entre les 2 allèles est due à la substitution d'un seul nucléotide (SNP) au niveau du gène codant (Metcalfe. P et al., 2003 ; Bugert. P et al., 2005). Sera à l'origine de la substitution d'un seul aa aux niveaux de l'une des six GPs majeurs, matures de la membrane plaquettaires (Koutsogianni. P. 2004). L'antigène HPA-14w constitue la seule exception puisque son polymorphisme est obtenu par une délétion de trois nucléotides, il en résulte la perte d'un seul aa. Donc la plupart de ces polymorphismes est un seul point de mutation de l'allèle de type sauvage (Newman. P. J et Valentin N., 1995; Santoso. S. A et al., 1999). Tous les allo-antigènes spécifiques aux PLTs sont hérités par codominance autosomale (Kulkarni. B et al., 2002).

4- Les différents allo-antigènes spécifiquement plaquettaires

Le système HPA-1; (P1A, Zw)

L'antigène Duzo, appelé également (PLA, Zw), a été identifié en 1959 par Van Loghem (Van Loghem. J. J et al., 1959), il est désigné par HPA-1 (Newman. P. J et al., 1985). C'est le système plaquettaire le plus important cliniquement (Williamson. L. M et al., 1998).

L'expression bialléliques de HPA-1 donne les antigènes allèles HPA-1a (Pl^Al) (GP3A*01) et HPA-1b (Pl^A2) (GP3A*02) qui différent par un SNP 196T>C sur l'exon 2 du gène codant ITGB3/GP3A. Ce SNP cause une substitution Leu₃₃/Pro₃₃ de l'extrémité N-terminale de la GPIIIa mature (Tableau IV). Ce qui donne des différences considérables dans les structures secondaires des deux formes alléliques (Newman. P. J et al., 1989).

Cette substitution mène à la formation de l'épitope HPA-1 (Goldberger. A et al., 1991; Honda. S et al., 1995), est localisée à l'apex Cys26-Cys38 du boucle AB du domaine PSI (Xiong. J.P et al., 2004; Santoso. S. A et al., 2006). Les déterminants antigéniques sont localisés en outre sur un fragment non carbohydraté de 17-23-kDa (Newman. P. J et al., 1985; Van Der Shoot. C. E et al., 1986). Les aa de 1 à 66 (Barron-Casella. E.A et al., 1999) et de 288 à 490 contribuent à la formation de l'épitope HPA-1a. Il est possible que la séquence 288-490 maintienne la boucle Cys²⁶-Cys³⁸ dans une orientation appropriée par rapport au reste de la molécule â₃ et de cette façon elle maintient la présentation antigénique adéquate dans cette boucle (Honda. S et al., 1995).

L'analyse de l'ADN génomique d'un individu a révélé la présence d'un nouveau SNP C¹⁷⁵G dans le gène ITGB3 qui conduit à une substitution Leu³³Val pour donner un troisième allèle HPA-1(ITGB3*001.1) (Fig.6). La mutation naturelle Leu₃₃Val peut interrompre quelques épitopes HPA-1a. Ces conclusions fournissent l'évidence pour une réponse humorale hétérogène contre l'antigène HPA-1a qui peut avoir la possibilité d'être impliqué dans les désordres de NAITP.

La mutation C>G de l'ADN_C de l'intégrine â3 en position 175 (â3-Leu33; HPA-1a) et le résultat d'un nouveau variant allélique différent ITGB3*001.1 codant pour Val³³. La mutation T>C à la position 176 résultat d'un allèle ITGB3*002 qui code pour Pro³³ (HPA-1b) (Santoso S. A et al., 2006).

L'Arg 93 du GPIIIa contribue à la formation de l'épitope HPA-1a au niveau des cellules B (Watkins. N. A et al., 2002). Un nouveau SNP G³⁷⁶A du gène codant ITGB3 est le résultat d'une substitution d'un seul aa Arg⁹³Gln au niveau de l'intégrine â₃ remplaçant l'allèle Leu33 (Watkins. N. A et al., 2002).

La réponse humorale de l'antigène HPA-1a est hétérogène (Valentin. N et al., 1995). Les anticorps Anti-HPA-1a produits par les réponses immunes peuvent mener à la destruction des PLTs (Mueller-Eckhard. C et al., 1989; Okamoto. N et al., 1998) dans les désordres cliniques tels que NAIT (Blanchette. V. S et al., 2000), le PTP et aux transfusions des les PLTs. En plus de ces désordres immunologiques, le polymorphisme du système HPA-1 est associé à plusieurs autres maladies. D'ailleurs, l'altération de la structure moléculaire de la GPIIIa au niveau des allèles HPA-1 peut affecter la fonction du GPIIb/IIIa.

De même, le polymorphisme du HPA-1b est associé au risque de la thrombose coronaire (Weiss. E.J et al., 1996; Kadir et al., 1999; Kroll. H et al., 2001).

Des différences dans la prédominance de ces désordres génétiques ont été observées chez les différents groupes ethniques. Carlsson et al., en 1997 ont montré qu'il n y'a pas association entre le polymorphisme HPA-1 et l'IS (Carlsson. L. E et al., 1997). De même, van Goor et al., en 2003 ont prouvé que la relation entre l'allèle HPA-1b et ce désordre est incertaine (Van Goor. M.L.P.J et al., 2003). Cependant, Jimmy Lim et al en 2003 ont affirmé que ces allèles peuvent être associés positivement à l'IS (Jimmy Lim et al., 2003). Le polymorphisme Pl^A est associé à l'agrégation accrue des PLTs (Huang. T et Mervyn. A. S. 2003). Ainsi l'agrégation plaquettaire joue un rôle central dans la pathogénie de la thrombose aiguë, dans la maladie des coronaires, l'IS et les maladies artérielles périphériques (Ulrich. H. F et al., 2003). De ce fait, l'étude faite par Weber et al en 2002 a démontré une hyperréactivité considérable des PLTs chez les malades avec l'artère coronaire.

L'allo-antigène HPA-1a et le plus impliqué dans les cas de NAIT, que les thrombopénies néonatales résultantes sont profondes et que ça donne les formes les plus sévères. En plus des trois principaux désordres cliniques, le polymorphisme de HPA-1a été identifié comme un facteur héréditaire du risque thrombotique (Weber. S et al., 2002) tel que l'IM (Weiss. E. J et al., 1996; Walter et al., 1997; Zotz. R. B et al., 1998; Nauck. M. S et al., 1999; Mathew. J. G et al., 2001; Hohlagschwandtner. M. M. D et al., 2003). Le génotype Pl^A1/A1 est associé avec la CAD sévère chez des malades caucasiens de la région nord de la Pologne (Gruchala. M et al., 2003). Normalement, les homozygotes Pl^A1/A1 ont un risque hémorragique plus élevé (Morawski. W. MD. PhD. M et al., 2005).

Les individus qui portent l'allèle HPA-1b paraissent avoir un haut risque pour les événements cardio-vasculaires (Weiss. E. J et al., 1996; Wagner. K et al., 1998; Carter. A. M et al., 1996; Vijayan. K. V et al., 2000; Santoso. S. A et al., 2002). Ainsi en 1996, Weiss et al été les premiers à démontrer la grande prédominance de l'allèle Pl^A2 dans l'IM chez les malades. Ce même allèle constitue un risque pour les maladies de l'artère coronaire (Weiss. E. J et al., 1996) (Jimmy Lim et al., 2003). Il peut être associé positivement avec des complications thrombotiques d'athérosclérose tels que l'IS. Quelques études ont aussi montrés des résultats contradictoires (Korral et al., 1997; Ghosh. K et al., 2002). Un rare polymorphisme GPIIIa ^{Leu 40/Arg 40} est lié à l'antigène 1b (Walchshofer. S et al., 1994).

Le polymorphisme Pl^A1/A2 est fortement associé avec les maladies ischémiques cardio-vasculaires et l'IM aigu (Weiss. E. J et al., 1996; Feng. D. M. D et al., 2001; Huang. T et Mervyn. A. S. 2003; Bojesen. S. E et al., 2003; Lopes. N. H. M et al., 2004). Le variant allélique PI^A2 est un facteur héréditaire du risque des événements coronaires aigus (Lim et al., 2003) et au restenosis (Kastrati. A. M. D et al., 1999).

Il y a une interaction entre le polymorphisme des fumeurs Pl^A2 et le CAD (Lopes. N. H. M et al., 2004). Les porteurs de l'allèle Pl^A2 sont considérablement protégés contre SAH.De même, ces allèles réduisent largement le risque de SAH (Iniesta. J. A et al., 2004). Les malades qui portent ces allèles présentent de plus grands anévrismes, mais l'extension de leur hémorragie et le niveau clinique sont considérablement inférieurs quand on les compare avec les malades HPA-1a/a (Juan. A et al., 2004). Il est remarquable que l'allèle HPA-1b paraît réduire la sévérité de l'hémorragie chez les malades avec Thrombasthénie de Glanzmann (Ghosh. K et al., 2002; Juan. A et al., 2004) ou l'athérosclérose comme il peut réduire le risque et la sévérité de l'hémorragie subarachnoid (Iniesta. J. A et al., 2004; Corral. J et al., 2004). Le système HPA-2; (Ko, Sib)

Il a été décrit pour la première fois par Van der Weerdt en 1961. C'est un système di-allélique localisé sur un domaine globulaire de 45 kDa du coté N-terminal du de la GPIbá (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1989; Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992). Les deux formes alléliques (HPA-2a ou Ko^b et HPA-2b ou Ko^a ou Sib^a) sont dus à une substitution d'un seul nucléotide SNP (C/T Cyt/Thy (ACG)/ (ATG)) (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992a) dans l'exon 2 en position 434 du gène codant GP1BA. Ce polymorphisme se traduisant par une substitution d'un seul aa 145 Thr/Met qui se trouve dans le cinquième LRR (Murata. M et al., 1992).

Le polymorphisme du système HPA-2 pourrait être lié génétiquement à deux autres polymorphismes : les polymorphismes VNTR (Simsek. S et al., 1994; Afshar-Kharghan. V et al., 1999; Chester. Q et al., 2000) et les polymorphismes de Kozaki (Kozak polymorphism) (Afshar-Kharghan. V et al., 1999; Chester. Q et al., 2000).

Le polymorphisme HPA-2 est en déséquilibre de liaison avec le polymorphisme de VNTR (Deckmyn. H et al,. 2004) auquel il est fortement lié. Le HPA-2a (Thr¹⁴⁵) est associé au VNTR-C et au VNTR-D alors que l'allèle HPA-2b (Met¹⁴⁵) est lié au VNTR-A et au VNTR-B (Simsek. S et al., 1994; Aramaki. K. M. et Reiner A. P. 1999). En effet, les allèles avec une ou deux répétitions sont liés à l'isoforme Thr (HPA-a), alors que les allèles avec trois ou quatre répétitions sont liés à l'isoforme Met (HPA-b) (Ulrichts. H et al., 2003). Tandis que d'autres études de génotypage des PLTs étaient contradictoires en montrant un effet fonctionnel provoqué par ce dimorphisme (Mazzucato et al., 1996; Boncler et al., 2002; Jilma-Stohlawetz. P et al., 2003; Deckmyn. H et al., 2004). Les distributions alléliques de la GPIbá VNTR et HPA-2 diffèrent considérablement selon les différentes populations. Par exemple, l'allèle VNTR-A est trouvé presque exclusivement en Asie de l'est (Aramaki. A K. M. et Reiner. A. P. 1999).

Ces polymorphismes influent sur la structure et le niveau d'expression de la GPIbá qui possède un effet potentiel sur les maladies thrombotiques.

L'exposition au non soi des formes allo-antigèniques du système HPA-2 au cours de la grossesse ou après transfusion peut mener à la formation des allo-anticorps qui peuvent causer la NAITP (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992), PTR (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992a) et le PTP (Chester. Q et al., 2000).

De même, le rapport entre les allèles HPA-2b et VNTR-B est considéré comme un facteur à risque thrombotique pour les maladies cardio-vasculaires (Aramaki. K. M. et Reiner. A. P. 1999), ce qui suggère que ces variantes ont pu évoluer, au moins en partie, à cause de la pression sélective pour activer l'hémostase (Aramaki. K. M. et Reiner. A. P. 1999). Des études récentes ont montré qu'il existe une association des génotypes HPA-2a/2b ou HPA-2b/2b avec L'IS ou avec des maladies cardio-vasculaires. D'ailleurs, c'est parce que le polymorphisme HPA-2 est localisé près des sites de fixation du FvW et la thrombine qu'il pourrait causer une variation conformationnelle dans la structure de GPIbá qui peut affecter le site de liaison des ligands.

Le système HPA-2 fait modifier la conformation au niveau de la région aa-1-59 de GPIbá, ce qui résulte en une interaction plus forte du FvW avec HPA-2a (Ulrichts. H et al., 2003). L'association entre le polymorphisme VNTR et les événements thrombotiques est vague parce que GPIbá est aussi un récepteur pour P-sélectine, Mac-1, FXI, FXII et le kininogène de haut poids moléculaire. Le polymorphisme HPA-2 pourrait affecter aussi ces interactions qui pourraient être à la base de risques thrombotiques (Ulrichts H et al., 2003).

Un nombre limité d'études ont démontré une association entre les allèles Met¹⁴⁵ (VNTR A ou B) et le risque des maladies cardio-vasculaires (Murata. M et al., 1992; Murata. M et al., 1997; Gonzalez-Conejero. R et al., 1998; Murata. M et al., 1998) tandis que d'autres études n'ont pas trouvé cette association (Carlsson. L. E et al., 1997; Carter. A. M et al., 1998). Dans une étude récente le HPA-2 Met/VNTR-B a été associé à des événements importants de l'IM et la mort des vieillards malades (Mikkelsson. J et al., 2001).

Les études ont des contradictions dans la répartition du risque de polymorphisme du complexe GPIb/IX/V dans différents groupes ethniques. Chez les populations européennes, le génotype VNTR B/C est associé à une augmentation du risque des maladies de l'artère coronaire dans la population espagnole, mais aucune association n'a été détectée chez la population française (Mercier. B et al., 2000). En outre, Chez les Américains, le génotype VNTR C/C est associe avec un risque faible des événements coronaires (Murata. M et al., 1998; Afshar-Kharghan. V et al., 1999a). La présence de l'allèle VNTRB possède un risque significatif de NAION (Salomon. O et al., 2004).

Le système HPA-3

Le système antigénique Bak^a/Bak^b a été décrit pour la première fois en 1980 par Von dem Borne et al suite à un cas de NAITP. C'est un système bi-allélique localisé sur la chaîne lourde de la GPIIb (Van der Schoot., 1986; Lyman et al., 1990). Les deux -allèles HPA-3a et HPA-3b ce diffèrent par un SNP près de l'extrémité 3' de l'ARNm Au niveau de l'ADN, ce SNP est localisé dans l'exon 26 (Lyman. S et al., 1990) en position T₂₆₂₁G (Unkelbach. K et al., 1995) du gène codant ITGA2B. Ce polymorphisme correspond à la substitution de l'aa Ile/Ser⁸⁴³ du coté C-terminal de la GP mature (Zain et al., 2002; Metcalfe. P et al., 2003) dans les derniers 29 aa de la chaîne lourde de GPIIb (Djaffar. I et al., 1993) (TableauIII). Le déterminant antigénique est localisé sur un fragment de 76 et 60 Kd de cette chaîne à l'extrémité riche en proline (Kieffer. N et al., 1984).

Le système HPA-3 est impliqué dans l'induction de la NAIT, le PTP (Lyman. S et al., 1990 ; Kickler TS. 1988) et PTR (Steffensen. R et al., 1996; Liu T.C et al., 2002; Wiwanitiki., 2005). L'allèle Ser⁸⁴³ augmente l'agrégation des PLTs in vitro et diminue la rétractation du caillot en comparaison avec des PLTs qui ne possèdent pas cet allèle (Honda. S et al., 1985).

Reiner et al ont rapporté un risque élevé de l'MI chez les femmes qui possèdent au moins une copie de l'allèle Ser⁸⁴³. Ce risque est présent seulement dans un sous-groupe de femmes possédant des facteurs supplémentaires du risque cardio-vasculaire (femmes fumeuses, hypercholestérolémie ou avoir une histoire de famille avec IM) (Reiner. A. P. et al., 2001).

Kroll et al ont démontré que le dimorphisme T₂₆₂₂G de la GPIIb ne constitue pas un risque majeur ni pour le CAD ni pour l'AMI (Kroll. H et al., 2001; Hato. T. M. D et al., 1997). Le polymorphisme de délétion de 9 pb localisée au niveau de l'intron 21 du gène codant pour la GPIIb et le polymorphisme de l'antigène HPA-3b sont liées (Peyruchaud. O et al., 1995).

Le système HPA-4

C'est un système allo-antigénique di-allélique, les deux allèles HPA-4a et HPA-4b correspondent respectivement aux antigènes (Pen^a, Pen^b/Yuk^a,Yuk^b) (Friedman. J.M et Aster. R. H., 1985; Shibata. Y et al., 1986). Ces antigènes sont localisés au niveau de la GPIIIa (Furihata. K et al., 1987). Le polymorphisme de ce système est déterminé par un seul SNPG⁵²⁶ A⁵²⁶ au niveau de l'exon 4 : du gène codant ITGB3 (Tableau III). Les deux formes alléliques diffèrent par un seul aa 143 (Arg/Glu) au niveau de la GP mature (Wang. R et al., 1991; Wang. R et al., 1992).

Le système HPA-4 est le seul qui coïncide avec un domaine fonctionnel connu (Wang Wang. R et al., 1992). Il est situé dans la zone de fixation du ligand riche en Leu (Kuipers., 1992). Ces polymorphies causent un changement structural considérable dans la sous-unité Ibá, en affectant le site de fixation du FvW (Ulrichts. H et al., 2003).

Il a été démontré que seulement les anticorps anti-HPA-1a et anti-HPA-4a sont capables d'inhiber l'agrégation des PLTs respectivement avec des antigènes HPA-la (Van Leeuwen. E. F et al., 1982) et HPA-4a (Furihata. K et al., 1987).

Le système HPA-5; (Br, Zav)

Deux antigènes HPA-5a et HPA-5b appartiennent à ce système et correspondent aux antigènes Br^b, Zav^b (HPA-5a) et Br^a, Zav^a (HPA-5b) (Woods V. L. Jr et al., 1989; Santoso. S . A et al., 1989; Santoso. S . A et al., 1989a; Kiefel. V et al., 1989). L'SNP G/A¹⁶⁴⁸ dans l'exon 13 du gène codant ITGA2 donne lieu à une substitution d'un seul aa Glu⁵⁰⁵(GAG: Br^a)/Lys⁵⁰⁵(AAG: Br^b) (Tableau III). Le Glu⁵⁰⁵Lys est localisé entre le premier et deuxième site potentiel de fixation du calcium au niveau de la GPIa (Santoso. S. A et al., 1993b; Kalb. R et al., 1994; Simsek. S et al., 1994a; Juji. T et al., 1999).

L'alloimmunisation contre le HPA-5 est associée aux NAIT (Kiefel et al., 1988; Mueller-Eckhardt. C et al., 1989; Bettaieb. A et al., 1991; Kiefel et al., 1991), le PTP (Christie. D. J et al., 1991) et les PTR (Bierling et al., 1989). L'antigène HPA-5b est le deuxième parmi tous les allo-antigénes impliqués dans la pathogénie de la plupart des cas de NAIT (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989; Kaplan. C et al., 1991; Kretzschmar. E. 2001) et les cas de PTP (Christie. D. J et al., 1991; Kretzschmar. E. 2001).

L'antigène HPA-5a est un déterminant dans les cas de NAIT (Mueller-Eckhardt. C et al, 1989; Kaplan. C et al, 1991; Kretzschmar. E. 2001). Le polymorphisme HPA-5 est aussi en rapport avec des maladies immunes telles que le purpura thrombocytopénique idiopathique aigu (Castro al., 2000; Kretzschmar. E. 2001). Dans une grande étude, Kroll et al (2000) trouvez une association entre le dimorphisme HPA-5 dans un sous-groupe de patient peu risqué avec les maladies de l'artère coronaire. Le génotype HPA-5a/b était considérablement inférieur chez les malades avec le diabète de type 2 et chez les non diabétiques ASO-Positifs que chez les contrôles. Ces conclusions suggèrent que l'études génétiques de HLA, NA et HPA pourraient être utiles à comprendre la pathogénie du diabète de type 2 et ASO (Nomura. S et al., 2006).

La résistance contre l'allo-immunisation anti-HPA 5b pourraient être conférés par l'allèle DRB1*0301 (Koutsogianni. P. 2004). Une corrélation entre l'allo-immunisation anti HPA-5 et HLA-DRW6 a été observée (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989).

Hallé et al., 2005 ont montré dans les populations caucasiennes une association entre l'allo-immunisation anti HPA-5b et un motif Glu-Asp en position 69-70 porté par la chaîne DRb1 des molécules HLA-DR dont DR12 et DR13, antigènes fréquents dans les populations d'Afrique sub-saharienne (Hallé. L et al., 2005).

Le système HPA-15 (Gov)

Le système antigénique plaquettaire HPA-15 a été décrit en 1990. C'est un système biallélique (Gov^a, Gov^b) (Kelton. J.G et al., 1990) exprimé par la GP CD109 (Smith. J.W et al., 1995). Les deux allèles HPA-15a et HPA-15b se diffèrent par un SNP (A/C) en position 2108 de la séquence codante. Le codant 703 change de TAC (Gov^a) à TCC (Gov^b), il résulte alors une substitution d'un seul aa Tyr/Ser⁷⁰³ au niveau de la protéine mature. Ce polymorphisme (SNP) Tyr/Ser ⁷⁰³ se localise au niveau des trois derniers nucléotides du coté de l'extrémité 5' de l'exon 19 et correspond à la fin de l'intron 18 (Schuh. A .C et al., 2002).

L'immunisation anti-Gov après transfusions ou grossesses a été rapportée en 1997 (Bordin. J.O et al., 1997). Les allo-anticorps réactifs aux PLTs sont impliqués dans le développement de la NAIT (Bordin. J. O et al., 1997; Kroll. H et al., 1998), en particulier chez les malades qui reçoivent des transfusions multiples des PLTs (Ertel. K et al., 2005), le PTP (Kelton. J. G et al., 1990) et les PTR (Kelton. J.G et al., 1990) (Skouri H et al., 2003 ; Skouri H et al., 2005), de même ils sont impliqués dans la transplantation d'organes ou de la MO et sont associés à l'hémorragie cérébrale et l'hémiplégie (Berry. J.E et al., 2000). Les anticorps Gov ont été associés plus fréquemment aux PTR qu'a la NAIT (Berry. J.E et al., 2000). Malgré son importance, le rôle des antigènes Gov dans la destruction des PLTs par les allo-anticorps n'a pas encore été défini. Aucune association entre le développement d'une allo immunisation anti-Gov et un haplotype HLA de classe II particulier n'a été mise en évidence (Mérieux et al., 2004).

Le système HPA-6

Les deux allo-antigènes de ce système correspondent aux antigènes (Ca^a, Tu^a). Il dérive de la substitution A¹⁵⁶⁴/G¹⁵⁶⁴ (CAG)/(CGG) conduisant à une substitution Arg⁴⁸⁹/Glu⁴⁸⁹ au niveau de la GPIIIa mature. Ce système rare est impliqué dans la NAIT (Wang. R et al., 1993 ; Kekomäki S et al., 1993).

Le système HPA-7 (Moa)

Ce système est composé de deux antigènes. La substitution nucléotidique C¹²⁶⁷/G¹²⁶⁷ est le résultat d'une substitution d'un seul aa Pro⁴⁰⁷/Ala⁴⁰⁷au niveau de la GPIIIa mature (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1993). Ce système rare est impliqué dans la NAIT ( Kroll. H et al., 1990)

Le système HPA-8- (Sra)

C'est un système di-allélique correspondent à l'antigène (Sr^a). Ils sont localisés sur la GPIIIa au niveau de la région riche en répétition Cys (Santoso. S. A et al., 2002) sur un fragment, de masse moléculaire de 68Kd (Kroll. H. 1999). La substitution T²⁰⁰⁴/C²⁰⁰⁴conduit à une substitution d'un seul aa Arg⁶³⁶/Cys⁶³⁶au niveau de la GP mature.

Le système HPA-9 (Maxa)

Une substitution d'un SNP G₂₆₀₃A se produit au niveau du gène de structure ITGA2B dans l'exon 26, entraînera une substitution d'un aa Val/Mét 837 sur la chaîne lourde de la GPIIb lors de la traduction. Le système Max^a est proche du HPA-3 (Lyma et al., 1990) (SNP G²⁶⁰³A/HPA-9 en amont du SNP T²⁶²²G/HPA-3 de 19 bp), d'ailleurs il existe une association génétique entre leurs polymorphismes et Max^a est une variante de l'allèle HPA-3b. L'antigène Max^a doit être pris en considération dans les PTR aussi bien que dans les cas de NATP et de PTP (Noris. P. S et al., 1995).

Le système HPA-10, (Laa)

C'est un système di-allélique localisé sur la région N-terminale du GPIIIa. La substitution d'un seul aa Arg⁶²/Glu⁶²au niveau du GP mature, résulte d'une substitution d'un seul SNP G²⁸¹/A²⁸¹ au niveau de l'exon 3 de l'ADNc du gène codant. Cette mutation est responsable de l'expression de l'épitope La^a impliquée dans la réponse immune à médiation humorale qui a pour conséquence la NAIT(Peyruchaud. O et al., 1997).

Le système HPA-11 (Groa)

C'est un antigène privé localisé sur la GPIIIa (Simsek. S et al., 1994a). Ce système est composé de deux antigènes qui différent par un seul nucléotide G¹⁹⁹⁶ (CGT)/A¹⁹⁹⁶ (CAT)au niveau du gène codant se traduisant par une substitution d'un seul aa Arg⁶³³/His⁶³³. Gro^aest identifié suite à un cas de NAIT (Simsek. S et al., 1994b). La mutation observée est en amont de 3 aa de la mutation Arg⁶³⁶Cys (HPA-8/Sr) suggère que cette région de la GPIIIa est susceptible pour les mutations (Simsek. S et al., 1997). Les polymorphismes des deux SNPs T²⁰⁰⁴/C²⁰⁰⁴et G¹⁹⁹⁶/A¹⁹⁹⁶sont proches, ce qui montre que le système Sr^a(Arg 636 Cys) (Santoso. S. A et al., 1994) est associé à l'antigène Gro^a(Simsek. S et al., 1997).

Le système HPA-12 (Lya)

C'est un système à deux allèles, qui diffèrent par un seul SNP G/A (GGG/GAG) en position 141 de la séquence codante. Il résulte alors une substitution d'un seul aa Gly⁵/A Glu¹⁵au niveau du domaine N-terminal de la protéine mature GPIbâ (Sachs. UJH et al., 2000). Le système Ly^a est responsable de cas sévères de NAIT (Kiefel et al., 1995).

Le système HPA-13 (Sita )

L'allo-antigène Sit^a est de faible fréquence (1/400 dans la population allemande) car il s'agit d'une mutation récente. Il a été identifié chez un cas de NAITP sévère. Le polymorphisme nucléotidique C₂₅₃₁-T₂₅₃₁ au niveau de l'exon 20 du gène codant donne lieu à un dimorphisme protéique qui se traduit par une substitution de l'aa polaire, la Thr₇₉₉, en un résidu hydrophobe non polaire, la Met₇₉₉ qui est responsable de la formation du déterminant allo-antigénique Sit^a, localisé sur la GPIa mature (Muller-Eckhard. C et al., 1994). L'analyse de la structure exon-intron a permis de définir le site polymorphique sur l'exon 20 avec une longueur de 142 bp.

Le système HPA-14(Oea)

Ce système de faible fréquence est porté par la GPIIIa. La délétion de 3 pb AAG en positions 1929-1931 au niveau de l'exon 10 conduisant à une délétion Lys⁶¹¹ est responsable de la formation de l'épitope (Oe^a) (Kekomäki et al., 1992; Kekomäki et al., 1993) et de l'altération de l'isoforme GPIIIa (Pl^A2). La délétion Pro33 Lys₆₁₁GPIIIa pourrait subir des changements conformationnels et se lie au fibrinogène d'une manière similaire à l'isoforme 33 Lys Pro 611. Par contraste avec tous les autres antigènes de faibles fréquences, l'isoforme Lys 611 a été associé à l'antigène HPA-1b, et non avec l'allèle HPA-1a.

Ces dernières années, plusieurs groupes ont rapporté que le polymorphisme de GPIIIa n'intervient pas seulement dans les réactions immunologiques, mais peut être aussi un facteur de risque dans le développement des maladies coronaires (Santoso. S. A et al., 2001).

Le système HPA-16

Le Duv^aest un antigène de faible fréquence. Les deux allo-antigènes se diffèrent par un seul SNP C/T en position 517 de la séquence codante. Il résulte alors une substitution d'un seul aa Thr¹⁴⁰/Ile¹⁴⁰ au niveau de la protéine mature GPIIIa. Le système Duv^a+est impliqué dans la NAIT (Jallu. V et al., 2002).

3 - Les antigènes rare définis seulement par la sérologie

D'autres allo-antigènes, ont été aussi définis sérologiquement, mais leur base moléculaire n'est pas encore bien élucidée (Johson-Hopson. C. N et al., 2003). Sont des allo-antigènes privés. Les allo-antigènes Va^a (GPIIb/IIIa) et Mou^a (GP inconnue) (Kekomaki. R et al., 1992; Masters. R et al., 1998). Les allo-antigènes Nak^a (Yamarnoto N. et al., 1994) et Vis, sont portés par la GPIV (Tomiyama. Y et al., 1990; Wyler. B et al., 1990; Yamamoto. N et al., 1990) alors que l'allo-antigènes Pe^a est situe sur la GPIbá et l'allo-antigènes Pl^t est localise sur la GPV.

Tableau II : identification génomiques et protéiques des polymorphismes des HPAs (Koutsogianni. P. 2004).

Antigènes	GPs	HGNC	Locus	Référence de la séquence	Nucléotide polymorphe	protéine mature	Précurseur
HPA-1	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	176T > C	L33P	L59P
HPA-2	GPIbá	GP1BA	2811	NM_000173	482C > T	T145M	T161M
HPA-3	GPIIb	ITGA2B	3674	NM_000419	2621T > G	I843S	I874S
HPA-4	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	506G > A	R143Q	R169Q
HPA-5	GPIa	ITGA2	3673	NM_002203	1600G > A	E505K	E534K
HPA-6w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	1544G > A	R489Q	R515Q
HPA-7w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	1297C > G	P407A	P433A
HPA-8w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	1984C > T	R636C	R662C
HPA-9w	GPIIb	ITGA2B	3674	NM_000419	2602G > A	V837M	V868M
HPA-10w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	263G > A	R62Q	R88Q
HPA-11w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	1976G > A	R633H	R659H
HPA-12w	GPIbâ	GP1BB	2812	NM_000407	119G > A	G15E	G40E
HPA-13w	GPIa	ITGA2	3673	NM_002203	2483C > T	T799M	T828M
HPA-14w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	1909_1911 del AAG	K611del	K637del
HPA-15	CD109	CD109	135228	NM_133493	2108C > A	S682Y	S703Y
HPA-16w	GPIIIa	ITGB3	3690	NM_000212	497C > T	T140I	T166I

Systèmes	Antigènes	Noms alternatifs	GPs	Polymorphisme nucléotidique	Polymorphisme d' aa	Date de découverte
HPA-1	HPA-1a HPA-1b	Zw^a, PIA¹	GPAIIIa	T¹⁹⁶ C¹⁹⁶	Leucine³³ Proline³³	1959
HPA-2	HPA-2a HPA-2b	Ko^b Ko^a, Sib^a	GPIbá	C⁵²⁴ T⁵²⁴	Threonine¹⁴⁵ Methinine¹⁴⁵	1961
HPA-3	HPA-3a HPA-3b	Bak^a, Lek^a Bak^b	GPIIb	T²⁶²¹G²⁶²¹	Isoleucine⁸⁴³ Serine⁸⁴³	1980
HPA-4	HPA-4a HPA-4b	Yuk^b, Pen^a Yuk^a, Pen^b	GPIIIa	G⁵²⁶ A⁵²⁶	Arginine¹⁴³ Glutamine¹⁴³	1985
HPA-5	HPA-5a HPA-5b	Br^b, Zav^b Br^a, Zav^a, Hc^a	GPIa	G¹⁶⁴⁸ A¹⁶⁴⁸	A.Glutamique⁵⁰⁵ Lysine⁵⁰⁵	1988
HPA-6	HPA-6bw	Ca^a, Tu^a	GPIIIa	A¹⁵⁶⁴ G¹⁵⁶⁴	Arginine⁴⁸⁹ Glutamine⁴⁸⁹	1992
HPA-7	HPA-7bw	Mo	GPIIIa	C¹²⁶⁷ G¹²⁶⁷	Proline⁴⁰⁷ Alanine⁴⁰⁷	1992
HPA-8	HPA-8bw	Sr^a	GPIIIa	T²⁰⁰⁴ C²⁰⁰⁴	Arginine⁶³⁶ Cysteine⁶³⁶	1993
HPA-9	HPA-9bw	Max^a	GPIIIa	G²⁶⁰³ A²⁶⁰³	Valine⁸³⁷ Methionine⁸³⁷	1995
HPA-10	HPA-10bw	La^a	GPIIIa	G²⁸¹ A²⁸¹	Arginine⁶² Glutamine⁶²	1996
HPA-11	HPA-11bw	Gro^a	GPIIIa	G¹⁹⁹⁶ A¹⁹⁹⁶	Arginine⁶³³ Histidine⁶³³	1996
HPA-12	HPA-12bw	Iy^a	GPIb	G¹⁴¹ A¹⁴¹	Glycine¹⁵ A.Glutamique¹⁵	1999
HPA-13	HPA-13bw	Sit^a	GPIa	C²⁵³¹ T²⁵³¹	Threonine⁷⁹⁹ Methionine⁷⁹⁹	1999
HPA-14	HPA-14bw	Oe^a	GPIIIa	? AAG^1929-1931	Lysine⁶¹¹
HPA-15	HPA-15a HPA-15b	Gov^b Gov^a	CD109	C²¹⁰⁸ A²¹⁰⁸	Serine⁷⁰³ Thyrosine⁷⁰³	2000
HPA-16	HPA-16bw	Duv^a	GPIIIa	C⁵¹⁷ T⁵¹⁷	Threonine¹⁴⁰ Isoleucine¹⁴⁰	2002
		Va^a	GPIIb/IIIa
		Pl^t	GPV
		Vis	GPIV
		Pe^a	GPIbá
		Dy^a	38 KD GP
		Mou^a	inconnu

CD : terme définissent les antigènes de surface des lymphocytes (reconnus grâce à des anticorps monoclonaux) et qui caractérisent des étapes de la différenciation dans les organes centraux et, éventuellement des fonctions de ces cellules.

III.3.1 Fréquences alléliques des systèmes HPA-1-5 chez les différentes populations

Beaucoup d'études rapportent les fréquences d'allo-antigènes plaquettaires dans différentes populations. La plupart des études des polymorphismes alloantigèniques ont analysé seulement les fréquences de quelques HPAs, surtout les systèmes HPA-1 à HPA-5. Mais peu d'études ont été exécutées sur les antigènes de faible fréquence après qu'ils aient été identifiés dans des familles individuelles. D'après ces études, on remarque que les données précédentes chez les populations autre que les blancs sont rares (Covas et al., 2000). Et que les fréquences des systèmes HPAs varient dans différentes populations (Santoso. S. A et al., 1993; Kim. H. O et al., 1995; Klüter. H. 1996; Cardone. J. D. B et al., 2004). Des variations simples de type mendélien peuvent être observées au sein d'une même population aussi bien qu'entre distinctes populations. Chaque population se caractérise par ces fréquences géniques pour chaque système (Tableau IV). D'ailleurs on note, dans quelques pays, généralement en Asie (Taiwan, les Philippines, l'Indonésie, la Chine, le Japon, la Corée, le Vietnam), un grand taux de stabilité raciale vu qu'ils n'ont pas eu d'échanges de gènes avec d'autres populations. Par contre, d'autres populations présentent des exemples types pour leur diversité ethnique et leur mélange racial tel que les tunisiens (Moojat. N et al., 1999 ; Saadi H et al., 2006). La fréquence des allèles HPA-a est plus élevée que celle des allèles HPA-b presque chez toutes les populations.

La fréquence de l'allèle HPA-1a est élevée chez les Brésiliens, les Amérindiens et dans la République Centrafricaine, par conséquent l'allèle b est absent chez ces populations. La fréquence de l'allèle HPA-1b varie de 0 (Amérindiens) à 0,330 (Grèce) (Cavas et al., 1997; Castro et al., 1999; Cavas et al., 2000; Hallé. L et al., 2005). Chez les asiatiques, la fréquence de l'allèle HPA-1a est élevée (0.8-0.9983) (Arabie Saoudite-Taiwan). La fréquence de l'allèle HPA-2a varie de 0,607 à la République centrafricaine à 0,975 au Philippines. La fréquence de l'allèle HPA-2b est élevée chez les africains (0,393 République Centrafricaine).

Les fréquences des allèles HPA-3a et HPA-3b sont élevées chez toutes les populations étudiées. Les fréquences des allèles HPA-3b sont plus élevées que celles des allèles HPA-3a ; en Grèce 0,595/0,405, au Vietnam 0,514/0,486 et en Indonésie 0,539/0,461. Dans la république centrafricaine, les fréquences alléliques HPA-3a et HPA-3b sont égales (0,500). L'allèle «b» du système HPA-4 est extrêmement rare (dem Borne, Décary et al., 1990; Mueller-Eckhardt. C et al., 1990; Roúman. P. 2002). Cette fréquence est estimée à 0-0.115 (0.115 pour les tunisiens) (Saadi H et al., 2006) chez toutes les populations.

La fréquence de l'allèle HPA-5b est élevée chez les africains (0,125 à 0,405) comparativement à celle observée chez les asiatiques et les européens. La fréquence de l'allèle HPA-5b dans l'Asie varie de 0,005 (Indonésie) à 0,155 (Arabie Saoudite). Chez les européens HPA-5b varie de (0,050) (Finlande) à (0,150) Grèce. Chez les américains la fréquence de l'allèle HPA-5a est élevée chez les brésilien (Castro et al., 1999). On remarque, d'après ces études, que les fréquences des antigènes HPA-1b, -2b, -3b,-5b, pour la plupart des populations, sont élevées. Les données sur la prévalence d'antigènes plaquettaires dans une population donnée est essentielle pour le diagnostic des cas des NAIT, pour l'organisation des programmes de screening pour les femmes à risque de FMAIT, pour les consultations génétiques et pour la provision de la thérapie pour les malades avec des anticorps anti-HPA (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989; Bussel.B. J et al., 1997; Roúman. P. 2002). Excepté leur impact pratique sur la provision des transfusions des PLTs, elles pourraient contribuer aussi à la compréhension des rapports évolutionnaires et offrent des informations sur les expansions démographique (Cavalli, Piazza., 1993; Roúman. P. 2002).

Tableau IV Fréquences alléliques des HPA-1,-2, -3, -4 et -5 chez différentes populations ( http://www.ebi.ac.uk/ipd/):

Pays	HPA-1a	HPA-1b	HPA-2a	HPA-2b	HPA-3a	HPA-3b	HPA-4a	HPA-4b	HPA-5a	HPA-5b	référence
Tunisiens	0,824	0,176	0,800	0,200	0,707	0,293	1,000	0,000	0,875	0,125	Présente étude
Tunisiens	0.73	0.27	0.680	0.320	0.765	0.235	0.885	0.115	0.665	0.335	Saadi H et al., 2006
Autrichiens	0,852	0,148	0,918	0,082	0,612	0,388	1,000	0,000	0,892	0,108	Holensteiner et al., 1995.
Autriche	0,830	0,170	0,870	0,130	0,620	0,380			0,920	0,080	Macher et al., 2004.
Bénin	0,896	0,104	0,708	0,292	0,679	0,321	1,000	0,000	0,818	0,182	Hallé et al., 2005.
Brésil	0,903	0,097	0,810	0,190	0,666	0,334	1,000	0,000	0,876	0,124	Castro et al., 1999.
Brésil	1,000	0,000	0,821	0,179	0,757	0,243	1,000	0,000	1,000	0,000	Castro et al., 1999.
Cameroun	0,907	0,093	0,763	0,237	0,614	0,386	1,000	0,000	0,746	0,254	Hallé et al., 2005.
Rép.centraf-ricaine	1,000	0,000	0,607		0,500	0,500	1,000	0,000	0,595	0,405	Hallé et al., 2005.
Congo	0,904	0,096	0,776	0,224	0,596	0,404	1,000	0,000	0,732	0,268	Hallé et al., 2005.
Croatie	0,830	0,170	0,880	0,120	0,640	0,360			0,890	0,110
République du czech	0,830	0,170	0,900	0,100	0,590	0,410			0,930	0,070	Korinkova et al., 1999
Danemark	0,830	0,170	0,920	0,080	0,630	0,370	1,000	0,000	0,920	0,080	Steffensen et al., 1998.
Polynésie française	0,975	0,025	0,913	0,087	0,599	0,401	1,000	0,000	0,975	0,025	Hallé et al., 2001.
France	0,880	0,120			0,650	0,350			0,830	0,170	Mérieux., 1997.
Français	0,848	0,152	0,920	0,080	0,620	0,380	0,992	0,008	0,874	0,126	Mérieux., 1997.
Grèce	0,670	0,330	0,750	0,250	0,405	0,595			0,850	0,150
Irlande	0,882	0,118	0,934	0,066	0,624	0,376	1,000	0,000	0,912	0,088
Italie	0,850	0,150	0,890	0,110	0,610	0,390	1,000	0,000	0,900	0,100	Mazzucco et al., 2000.
Luxembourg	0,869	0,131	0,933	0,067	0,616	0,384			0,902	0,098
Maroc	0,748	0,252	0,818	0,182	0,682	0,318	1,000	0,000	0,861	0,139	Ferrer et al., 2002.
Berbères (Maroc)	0,747	0,252	0,817	0,182	0,682	0,317	1	0,0	0,8616	0,1383	Ferrer et al., 2002
Algérie	0,827	0,173							0,837	0,163	Mercies et al., 1997.
Tunisiens	0,750	0,250			0,694	0,306			0,779	0,221	Mojaat. N et al., 1999.
Pologne	0,824	0,176	0,901	0,099	0,582	0,418	1,000	0,000	0,944	0,056	Rzewek et al., 1998.
Macédonie	0,865	0,135	0,852	0,148	0,578	0,422			0,909	0,091	Pavkovic et al., 2006.
Slovénie	0,832	0,168	0,899	0,101	0,667	0,333			0,892	0,108	Rozman. P et a.l, 1999.
Espagne	0,810	0,190	0,900	0,100	0,650	0,350	1,000	0,000	0,880	0,120	Muñiz-Diaz et al., 1998.
Suisse	0,809	0,191	0,918	0,109	0,591	0,407	0,997	0,000	0,934	0,066	Boehlen et al., 2003.
Taiwan	0,997	0,003	0,960	0,040	0,575	0,425	0,998	0,002	0,985	0,015
Vietnam	0,986	0,014	0,953	0,047	0,486	0,514	1,000	0,000	0,972	0,028	Hallé et al., 2001.
Le Pays de Gales	0,825	0,175	0,902	0,098	0,607	0,393	1,000	0,000	0,903	0,097	Sellers et al., 1999.
Caucasiens	0,810	0,190	0,915	0,085	0,520	0,480	1,000	0,000	0,905	0,950	Legler et al., 1996.
Arabie Saoudite	0,800	0,200	0,805	0,195	0,880	0,120	0,970	0,030	0,845	0,155	AL-SHEIKH et al., 2000.
Taiwan	0,998	0,002	0,961	0,039	0,595	0,405	0,998	0,002	0,981	0,019	SHIH. M. C et al., 2003.
Thaïlande	0,985	0,015	0,938	0,062	0,507	0,493	1,000	0,000	0,963	0,037	SHIH. M. C et al. , 2003.
Philippines	0,980	0,200	0,975	0,025	0,530	0,470	0,995	0,005	0,965	0,035	SHIH. M. C et al., 2003.
Danemark	0,831	0,169	0,917	0,083	0,626	0,374	1,000	0,000	0,922	0,079	Steffensen et al., 1996.
Pays Bas	0,846	0,154	0,934	0,066	0,555	0,445	1,000	0,000	0,902	0,098	SIMSEK, et al., 1993.
Finlande	0,860	0,140	0,910	0,090	0,590	0,410			0,950	0,050	Kekomaki et al., 1995.
Allemagne	0,820	0,180	0,920	0,080	0,635	0,365			0,900	0,100	Chen et al.1997.
Allemagne	0,840	0,160	0,930	0,070	0,6 0	0,400			0,920	0,080	Arlsson et al., 1997.
Allemands	0,846	0,154	0,934	0,066	0,555	0,445	1,000	0,000	0,902	0,098	1993
Américains (Noirs)	0,920	0,080	0,820	0,180	0,630	0,370	1,000	0,000	0,790	0,210	Kim et al., 1995.
Américains	0,890	0,110	0,920	0,080	0,670	0,330	1,000	0,000	0,890	0,110	Kim et al., 1995.
Amérindiens	1,000	0,000	0,957	0,042	0,27-0,75	0,25-0,73			1	0	Cavas et al., 1997; Cavas et al., 2000.
Corée	0,988	0,012	0,923	0,770	0,555	0,445	0,990	0,010	0,978	0,022	Seo et al., 1998.
Chine	0,995	0,005	0,975	0,025	0,525	0,475	1,000	0,000	0,965	0,035	Chang et al., 1998.
Indonésiens	0,991	0,009			0,461	0,539	0,997	0,003	0,954	0,046	Santosos. S et al. 1993.
Indonésiens	0,991	0,009	0,939	0,061	0,505	0,495	1,000	0,000	0,995	0,005	SHIH. M. C et al., 2003.
Japonais	0.998	0.002	0.898	0.102	0.594	0.406	0.990	0.010			Tanaka et al., 1995.
Japonais	0,990	0,010	0,910	0,090	0,715	0,285	1,000	0,000	0,980	0,020	Legler et al., 1996.
Aborigènes	0,992	0,008			0,937	0,063			0,847	0,153	Chen et al., 1997.
Australiens	0,838	0,162			0,648	0,352			0,930	0,070	Chen et al., 1997.

III.3.2 Les allo-antigènes les plus impliqués dans les immunisations inter-humaines

La probabilité, pour développer une réponse allo-immune chez les individus, dépend des fréquences des antigènes qui peuvent varier d'une population à une autre. Parmi tous les systèmes alloantigéniques HPAs, le HPA-1a et le HPA-5b sont les plus immunogènes (Newman. P. J et al., 1989; Watkins. N. A et al., 2002); ils sont le plus souvent impliqués dans le processus d'allo-immunisation. En effet, les anticorps anti HPA1-a et HPA5-b sont impliqués respectivement dans 80% et 10% des cas d' incompatibilité foeto-maternels (Boldt. B et al., 1997). En Europe et en Amérique, ces deux anticorps sont impliqués respectivement dans 78 % et 19% des cas de NAIT (Newman. P. J., 1994; Kaplan. C. 2001; Kaplan. C. 2002; Davoren. A et al., 2002). Les anticorps dirigés contre l'antigène Br(a)/(HPA-5b) est le deuxième fréquemment impliqué dans les cas de NAIT chez les européens (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989).

De même, 75% des cas de NAIT chez les blancs ont pour cause l'immunisation contre l'antigène HPA-1a (Van Loghem. J. J et al., 1959; Noris. P. S et al., 1995; Krol. H, Kiefel et Santoso. S. A 1998; Santoso. S. A 2002) et on la retrouve dans plus de 90% des cas de NAIT (Kaplan. C. 2003). Moins fréquemment la réponse immune est induite par une sensibilisation contre l'antigène HPA-5b, alors que rarement il est causé par d'autres allo-antigènes (Marcelli-Barge. A et al., 1973; Shibata. Y et al., 1986; Kekomki et al., 1993; McFarland. J.Y et al., 1993). Au Japon, où la quasi-totalité de la population est HPA-1a positif (PLA1 positif), le système HPA-5 est le plus souvent impliqué dans les cas de NAITP (Juji. T et al., 1999). De même pour l'antigène HPA-4b.

D'après les résultats trouvés par Miadi N et al., 2003 en Tunisie l'antigène HPA-1a est le plus immunogène suivi par HPA-5b et HPA-3b (Miadi N et al., 2003).

Les travaux de Berry et al. (2000) sur des échantillons avec des cas de NAIT, de PTP ou de PTR montrent que les systèmes antigéniques HPA-15 et HPA-5 possèdent une immunogénécité similaire (Berey. J.E et al., 2000; Cardone. J. D. B et al., 2004). L'immunisation contre le HPA-15b est élevée (Panzer. S et al., 1995), et l'allo-antigène HPA-15b pourrait être plus immunogène que l'allo-antigène HPA-15a (Berry. J.E et al., 2000). André C et al 2002 ont montré que la fréquence d'alloanticorps Gov, surtout chez les malades PTR, est élevée avec une fréquence dépassée seulement par ceux dirigés contre l'antigène (HPA-l). Les anti-Gov sont apparus plus souvent en cause dans les PTR, cependant la fréquence d'allo-immunisation de HPA-15 chez les malades PT était considérablement plus élevée que celle chez les mères avec FNAIT (3,0% contre 0,22%). Le HPA-15 représente 6,2 ? des cas d'allo-immunisations anti-plaquettaires. Le nombre des anticorps anti-Gov^b observés est très proche de celui des allo-anticorps dirigés contre les allo antigènes à faible immunogénécité (anti HPA-2b et -3a). Ces observations indiquent que l'allo-immunisation contre HPA-15 devrait être considérée comme une cause de thrombocytopénie immune, en particulier chez les malades qui reçoivent de multiples transfusions plaquettaires (Ertel. K et al., 2005).

III.3.3 Les allo-antigènes les moins fréquemment impliqués dans les immunisations inter-humaines

Sont les antigènes rares ou privés tel que : HPA-4b, HPA-6bw, HPA-7bw, HPA-8bw, HPA-9bw, HPA-10bw, Duv^a, Va^a.

III.4 Étude de polymorphisme plaquettaire

Le typage sérologique est une méthode communément utilisée (Bessos. H et al., 1996). Plusieurs méthodes sérologiques et moléculaires ont été utilisées lors de l'exploration des propriétés biologiques des systèmes plaquettaires (Juji. T et al., 1999a).

III.4.1 Méthodes de phénotypage sérologique

Habituellement les allo-antigènes plaquettaires sont mis en évidence à l'aide d'antisérums provenant de malades ayant présenté un PTP ou des mères d'enfants atteints de NAIT (Chabrenaud. J. L et al., 1995). Plusieurs techniques peuvent être utilisées, telles que l'agglutination (Teramura et al., 1996), la fixation du complément, l'immunofluorescence ou encore les essais radio immunologiques. Parmi les techniques les plus utilisées pour la recherche des anticorps anti-plaquettaires, on cite la cytométrie en flux, le MAIPA test (Weiss. H. J et al., 1995; Cardone. J. D. B et al., 2004) et l'ELISA (Honda. S et al., 1995; Barron-Casella. E.A et al., 1999; Garner et al., 2000).

La technique d'immunofluorescence a été adaptée à la cytométrie en flux qui permet une interprétation objective de l'intensité de fluorescence. Elle permet de combiner une appréciation quantitative de l'antiglobuline fixée et une analyse qualitative de la fluorescence.

Pour cette technique, on utilise souvent une Ig de chèvre anti-IgG humaine marquée à la fluorescéine. Pour chaque série il faut inclure des sérums ne contenant pas d'anticorps anti-plaquettaires et des sérums contenant des anticorps antiplaquettaires et des sérums contenant des anticorps antiplaquettaires. Les cellules sont analysées par un automate, avec un seuil de négativité et de positivité pré-établi.

La cytométrie en flux est particulièrement adoptée à l'étude des GP, aussi bien dans le cadre des syndromes hémorragiques que des états thrombotiques.

La cytométrie en flux et rapide pour rendre le résultat et la possibilité de travailler sur des volumes sanguins très faibles.

La technique de MAIPA est utilisée pour le dépistage et l'identification des allo-anticorps spécifiquement plaquettaires (Kiefel et al., 1987; Metcafle et al., 1997a; Berry. J.E et al., 2000). Elle est sensible et spécifique et aide à l'identification de nouveaux systèmes allo-antigèniques plaquettaires (Simsek. S et al., 1994; Noris P. S et al., 1995; Berry. J.E et al., 2000 ). Cette technique est extrêmement utilisée par l'ensemble des laboratoires d'immunologie plaquettaire et est considérè comme le test de référence pour le dépistage et l'identification des anticorps antiplaquettaires.

Le principe de ce test repose sur la capture des antigènes plaquettaires par des anticorps monoclonaux, chaque anticorps reconnaîtra l'un des complexes glycoprotéiques polymorphes GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V et GPIa/IIa. C'est un test sensible est facile a interpréter. Ainsi, il n'y pas d'interférence des anti-HLA.

Cette technique consiste à identifier les allo-anticorps suivant leur réaction avec telle ou telle GP plaquettaire pour ceci après lyse des PLTs on fait migrer les GPs sur un gel de polyacrylamide, puis il y'aura transfert de ces GPs sur une membrane de nitrocellulose. Ces GPs immobilisées peuvent réagir avec les anticorps présents dans le sérum ou le plasma. L'immunoblotting a l'avantage d'être un test très sensible (Emily A et al., 1999) et de grande valeur si l'antigène est inconnu (Kaplan. C. 1988).

III.4.2 Méthodes de Typage moléculaire

Plusieurs techniques de typage des systèmes plaquettaires HPAs basées sur l'étude de l'ADN ont été développées (Drzewek. K et al., 1998; Seo. D. H et al., 1998; Liu T.C et al., 2002). Contrairement aux méthodes décrites ci dessus ces méthodes de typage décrivent le polymorphisme au niveau de l'ADN. L'introduction de la PCR (Newman. P. J et al., 1989; Arlet., 2003) a rendu la technique de typage moléculaire directe et rapide. Pour surmonter les limites des testes de phénotypage HPA sérologiques, plusieurs techniques basées sur l'ADN sont valables (Meyer. O et al., 1999; Kretzschmar. E. 2001).

La plupart des techniques basées sur la PCR ont été développées pour étudier les SNPs responsable des HPAs (Hurd. C. M et al., 2002).

La PCR-RFLP (Newman. P. J et al., 1989; Chen. C. H et al., 2004), est la première technique PCR utilisée (Von Dem Borne et Decany., 1990; Carl. B et al., 2000; Shih. M. C et al., 2003). C'est une méthode fiable, sensible et facile à exécuter (Hatzidimitriou Gr. Zoulas D et al., 2001).

Elle permet d'identifier le polymorphisme au niveau des sites de restriction des endonucléases au niveau de l'allèle. L'ADN, est digéré par des enzymes de restriction. La coupure de l'ADN se fait en un site particulier reconnu par l'enzyme, il existe alors un polymorphisme de restriction allèle spécifique. Chaque enzyme reconnaît une séquence d'ADN qui lui est spécifique. Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, elles sont capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l'intérieur d'un acide nucléique. Pour les deux variants alléliques HPA-a et HPA-b, elle consiste en une amplification moléculaire de la région polymorphe du gène codant. Le produit d'amplification est soumis à une digestion enzymatique. Le produit de digestion est visualisé sur un gel de polyacrylamide afin de déduire le génotype correspondant.

Selon le nombre de bandes générées, il y aura la déduction de l'allèle existant puis le génotype du sujet en question.

On l'appelle aussi PCR-SSP ou PCR-ASP; c'est la technique de choix de typage plaquettaire. Cette technique est bien adaptée à l'urgence et aux petites séries (Metcalfe. P et Waters. A. H. 1993; Skogen. B et al., 1994; Kjaer et al., 2002). La PCR-SSP est utilisées pour la première fois pour le typage des antigènes HLA (Olerup et Zetterquist., 1992; Hato. T. M. D et al., 1997), pour le groupage érythrocytaire (Lee et al., 1995; Cavanagh. G et al., 1997) et récemment pour le typage des systèmes HPAs (Cavanagh. G et al., 1997). Elle a l'avantage d'être sensible, rapide, (Kroll. H et al., 2001a) de pouvoir faire l'amplification de tous les systèmes en même temps (Klüter. H et al., 1996; Lyon et al., 2002). La simplicité et l'exactitude de cette méthode chez les malades et les donneurs recommandent son application répandue.

Cette technique est basée sur le principe que l'amplification par la Taq Polymérase, elle n'est effective que lorsque l'amorce est parfaitement complémentaire de la séquence de l'ADN cible. Les couples d'amorces sont définis pour être spécifiques d'un seul allèle. Dans des conditions très précises de PCR, le couple d'amorces spécifiques permet l'amplification des séquences cibles (résultat positif), tandis que les couples d'amorces non complémentaires ne donnent pas d'amplification (résultat négatif). Après la PCR, les fragments d'ADN amplifiés sont séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose et visualisés par coloration avec le BET sous lumière UV. L'interprétation des résultats PCR-SSP est basée sur la présence ou l'absence de fragment spécifique amplifié. C'est pourquoi un couple d'amorces de contrôle interne est intégré dans chaque réaction PCR. Ce couple d'amorces témoin amplifie une région conservée du gène de l'hormone HGH humaine par exemple qui est présente dans tous les échantillons d'ADN et permet de vérifier l'intégrité de la réaction PCR.

La PCR-SSCP, est une technique très performante de génotypage moléculaire des systèmes plaquettaires. Cette technique est caractérisée par sa rapidité et sa sensibilité, simplicité comme elle est applicable pour une large série (Fujiwara. K et al., 1995). Par comparaison à la PCR-SSP. Elle repose sur le principe suivant : lorsqu'un segment d'ADN double brin est dénaturé par la chaleur, puis refroidi brutalement, les brins restent séparés. Si on les soumet ensuite à une électrophorèse non dénaturante dans un gel de polyacrylamide faiblement réticulé, chaque brin se renaturé sur lui-même, et prend une conformation spécifique conditionnant sa migration électrophorétique. Une variation de séquence aussi minime qu'une mutation ponctuelle peut se manifester par cette différence de conformation.

C'est en 1991 que Holland et al. Montrent que l'activité exo nucléasique 5' 3' de l'ADN polymérase de Thermus aquaticus peut être utilisée lors de la PCR pour le clivage d'une sonde marquée, spécifique d'une séquence cible. L'hybridation de la sonde crée un signal fluorescent proportionnel aux produits de l'amplification.

En 1992, Higuchi et al. Mettent au point un système en temps réel qui détecte les produits de PCR dès leur accumulation. Ce système est base sur le marquage de l'ADN par le BET qui a la propriété de s'intercaler dans la molécule nouvellement synthétisée. La détection est possible grâce a une camera CCD reliée a un logiciel informatique.

En 1993, Lee et al. Créent la sonde Taq man dont l'hydrolyse par l'activité 5' 3' exonucléasique de la Taq polymérase produit un signal émis vers une camera CCD collectrice. Ce système apporte un énorme progrès par rapport aux autres méthodes de PCR classique qui ne donnaient que des valeurs approximatives de la quantité d'amplifiat à la fin de la réaction

La PCR quantitative en temps réel exige seulement les produits PCR standard et le matériel (Nauck. M. S et al., 1999; Jone. D. C et al., 2003). Comme la PCR classique la PCR quantitative a le même principe, sauf que cette deuxième méthode exige une sonde interne en plus des deux amorces. La sonde est un oligonucléotide complémentaire de l'un des brins de ;la séquence cible, à laquelle elle s'hybride pendant la phase d'hybridation, aussi bien que les amorces. Cette sonde est doublement marquée elle possède à son extrémité 5' une molécule fluorescente (reporter), et à son extrémité 3' un autre fluorochrome (quencher). A l'état initial, aucune fluorescence n'est émise, puisque la proximité du Quencher provoque un transfert d'énergie de résonance du Reporter vers le Quencher, ce qui inhibe l'émission du fluorochrome Reporter. Ensuite, si la séquence cible d'ADN est présente, la Taq polymérase catalyse la polymérisation à partir deux amorces hybridées sur les deux brins d'ADN dénaturé.

Quand la Taq polymérase rencontre la sonde hybridée elle la clive nucléotide après nucléotide grâce à son activité 5' 3' exonucléasique. La molécule Reporter est alors libérée, et sa fluorescence devient détectable. Ainsi, à chaque cycle d'amplification, lors de l'étape d'extension, une molécule de Repoter est libérée pour chaque molécule d'ADN amplifiée. La fluorescence est enregistrée en temps réel, individuellement pour chaque tube réactionnel grâce à un réseau de fibres optiques (faisceau laser) qui acheminent le signal émis vers une caméra collectrice. Elle est normalisée par rapport à un fluorochrome présent en quantité constante dans la réaction.

Rn représente l'intensité de fluorescence émise.

Rn = (Rn⁺) - (Rn^-), Rn⁺ étant l'intensité d'émission du Reporter/intensité d'émission du Quencher, et Rn^- le même rapport mesuré avant la réaction PCR.

Chaque échantillon est caractérisé par son cycle seuil Ct, c'est-à-dire le délai nécessaire pour que la fluorescence dépasse un seuil fixe correspondant au nombre des cycles de PCR á partir desquels se différencie la valeur d'intensité de la fluorescence du bruit de fond.

Il est mesuré pendant la phase exponentielle de la réaction lorsque les réactifs sont présents en quantité non limitante, d'où la précision et la reproductibilité de ces mesures.

Il a été démontré que le Ct est inversement proportionnel à la qualité initiale d'ADN cible : plus le Ct est faible plus le nombre de copies d'ADN cible présent avant l'amplification est important.

La spécificité de la technique dépend bien de la région étudiée et du choix des amorces et de la sonde, mais elle est accrue puisque la fluorescence n'est émise que si la sonde est hybridée à la cible puis clivée lors de l'extension. Cette technique est également théoriquement très sensible. On parvient en effet à mesurer un cycle seuil pour un échantillon très faible dont l'amplification commence seulement en fin de réaction, alors qu'il aurait été indécelable par une technique de quantification en point final.

Outre la spécificité et la sensibilité de la quantification, les avantages majeurs de la technologie Taq man sont la précision et la reproductibilité de la mesure, ainsi qu'une très large gamme de détection.

Cette précision est dûe au fait à la quantification de la séquence cible qui est déterminée par le cycle seuil Ct calculé pendant la phase exponentielle de la réaction et non pendant la phase stationnaire, comme c'est le cas dans la PCR semi-quantitative classique ou la quantification des produits de la PCR se fait a la fin de la réaction. La PCR quantitative en temps réel est basée sur la détermination du Ct à partir duquel la fluorescence devient détectable. Il a été démontré de façon formelle que c'est ce cycle seuil qui est dépendant de la quantité ou qualité d'ADN initial. A tous ces avantages s'ajoute la rapidité.

Cette technique possède un très large champ d'application puisque tout ARN (avec une étape préalable de transcription inverse) ou ADN cible d'intérêt peut être aisément quantifié.

La technologie Taq man est déjà utilisée avec succès dans des domaines très variés de la biologie, particulièrement en virologie pour la mesure de la charge virale d'un grand nombre de virus tels que le virus des Hépatites B et C ; en bactériologie, pour quantifier l'amplification génique dans les cancers de sein ; ou pour l'étude du polymorphisme.

La PCR quantitative est par ailleurs utilisée dans l'étude de l'expression des gènes en général. C'est une méthode idéale pour le diagnostic de routine et la prévention des conditions clinique associées (mismatching) aux HPAs. Elle peut être aussi utilisée dans l'étude des populations et pour la recherche d'autres effets potentiels de ces polymorphismes ; par exemple, leurs rôles comme antigènes d'histocompatibilité dans la transplantation (Kekomaki. S et al., 2001; Jone. D. C et al., 2003), leurs effets sur le fonctionnement des intègrines et leurs associations possibles avec les maladies cardio-vasculaire (Weiss. E. J et al., 1996; Zotz. R.. B et al., 1998; Ardissino et al., 1999; Kroll. H et al., 2000; Mikkelsson. J et al., 2001; Jone. D. C et al., 2003). Récente, cette technique à grande sensibilité et à forte exigence peut être optimisée pour fournir la résolution maximale à faible coût et peut être mise à jour pour inclure d'autres allèles HPAs de faibles fréquences, aussi bien aux allo-antigènes plaquettaires génétiquement caractérisés tel que le système Gov (Schuh. A. C et al., 2002).

Cette technique permet d'obtenir directement la séquence des gènes et de mettre en évidence des mutations ponctuelles. Elle est utilisée pour détecter des nouveaux systèmes HPAs (Santoso. S. A et al., 2006) en cas d'obtention des produits PCR anormales de point de vue tailles d'amplicons. Comme elle peut être utilisé pour faire l'alignement des séquences obtenues avec un BLASTN (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), comparant les séquences obtenues à toutes les séquences nucléotidiques connues, déposées dans plusieurs banques de données.

Il existe différentes méthodes de séquençages, tel que la méthode de séquençage enzymatique par les di-désoxynucléotides développé à l'origine par Sanger et la méthode chimique de Maxam et Gilbert.

Le séquençage repose sur le principe de méthode de Sanger. Le marquage des fragments d'extension est réalisé en 3' par l'incorporation de di-déoxynucléotides triphosphates (ddNTPs) fluorescents. Son principe est de réaliser, à partir d'un point fixe, des copies incomplètes de la matrice d'ADN interrompues au hasard. L'élongation de la chaîne est ainsi arrêtée à cause de l'absence d'une extrémité 3' OH libre, ce qui aboutit a l'obtention de fragments marqués de différentes tailles. On utilise un mélange de 4 fluorophores correspondant chacun a une des quatre bases.

Au cours de l'électrophorèse, la lecture se fait en temps réel à travers une fenêtre de détection, après extraction des fluorophores par un laser biochromatique. En effet, la machine (séquenceur) intègre les données de migration et les transforme en éléctrophorogrmmes sous forme de pic de couleurs différentes et correspondant aux bases distinctes

1) D'étudier les bases moléculaires en réalisant le génotype des systèmes plaquettaires HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 sur un échantillon de la population Tunisienne.

2) D'estimer les fréquences géniques, génotypiques et phénotypiques des systèmes plaquettaires HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 sur cet échantillon.

3) D'étudier l'équilibre de la population tunisienne pour les loci des cinq premiers systèmes HPAs.

6) De comparer les résultats trouvés avec ceux rapportés dans la population tunisienne et d'autres populations.

I. MATÉRIEL

Notre étude a porté sur un échantillon de 111 donneurs de sang Tunisiens, pour le système HPA-1, 105 pour le système HPA-2, 104 pour le système HPA-3, 102 pour le système HPA-4 et de 100 donneurs de sang pour le système HPA-5. Les échantillons sanguins choisis au hasard sont constitués de donneurs de sang volontaires au (CNTS) de Tunis. Ces donneurs sont sans lien de parenté, ne souffrant d'aucune pathologie apparente. Ils sont des deux sexes, sont de différents âges et pourraient appartenir à de différentes générations (l'age d'une génération est de 25 ans).

II. MÉTHODES

Les polymorphismes des gènes des HPA-1, - 2, -3, -4 et -5 résultant d'un SNP au niveau d'un brin codant de l'ADN, ont été déterminés par la technique PCR-SSP.

II-1. Prélèvement du sang

5 ml (1ml de sang renferme 30 à 50 ug d'ADN) dé sang périphérique ont été prélevés sur un anticoagulant EDTA, chez chaque sujet. Après déplasmatisation, le culot globulaire a servi pour extraire l'ADN génomique.

II-2. Extraction de L'ADN génomique total

II-2.1. Principe : L'ADN utilisé comme matrice d'amplification pour les réactions PCR a été extrait par la technique du relargage des protéines à force ionique élevée : la technique de salting-Out (Technique au chlorure de calcium saturé) (Miller. S. A et al., 1988). Le sang doit être initialement et vigoureusement mélangé à une solution hypotonique pour faire éclater les globules rouges par une solution hypotonique (SLR : tris-HCl 10 Mm pH 7,5 ; MgCl₂5 Mm ; NaCl 10 Mm). Le lysat est centrifugé et, après élimination du surnageant, le culot cellulaire contenant les leucocytes est traité par une solution de lyse de GB (SLB) et une solution de protéinase très active, la protéinase K qui digère les protéines cellulaires. Ces dernières seront par la suite relarguées par l'intermédiaire d'une force ionique du NaCl (6 M). En fin, la précipitation de l'ADN génomique est effectuée en utilisant une solution d'éthanol absolu à froid (-20 °C) (Delpech. M et al., 1999; Raisonnier. A et al., 2002).

1- Lyse des globules rouges

Après déplasmatisation de l'échantillon sanguin, on complète les crachoirs à 50 ml avec la (SLR) en les agitant avec le vortex afin de faciliter la lyse des globules rouges. On les centrifuge 10 mn à 2600 trs/mn à température ambiante. On élimine avec précaution, le surnageant. On répète l'opération précédente 2 fois. S'il y a des hématies qui persistent dans le culot, on effectue un lavage supplémentaire jusqu à avoir un culot de blanc blanchâtre dépourvu des globules rouges (sinon on met le culot au congélateur pendant au moins 2 h). On élimine totalement le surnageant de SLR.

2- Lyse des leucocytes

Au culot des blancs, on ajoute 600 ul de (SLB : tris-HCl 10mM pH 7,5 ; EDTA-Na₂ 10 mM ; NaCl 50 mM ; SDS 0,2%) pour la micro méthode afin de solubiliser les membranes des leucocytes et de la protéinase K à raison de 20 mg/ml. La suspension obtenue, fortement agitée, et incubée une nuit à 42°C ou 3 heurs à 56°C sous agitation. Après refroidissement à température ambiante, on ajoute à l'extrait 200 ul du NaCl (6 M).

3- Précipitation des protéines

La suspension obtenue est vortexée vigoureusement jusqu'à avoir un aspect laiteux. Cette dernière est par la suite centrifugée 30 mn à 15000 trs/mn afin de précipiter les protéines. On obtient ainsi une phase inférieure organique contenant les débris (protéines, lipides...), une phase supérieure aqueuse contenant l'ADN et l'interface contient en majorité des protéines et peu l'ADN. Le surnageant, contenant l'ADN dispersé, est récupéré dans un tube de 5 ml.

4- Précipitation de l'ADN

On ajoute un volume égal d'éthanol à haute force ionique (95%) au surnageant récupéré précédemment. On laisse l'ADN se précipiter par agitation douce en retournant délicatement le tube jusqu'à ce que les filaments d'ADN forment une méduse; on récupère l'ADN dans un tube Eppendorf (0,5 ml) ; la méduse d'ADN ainsi condensée est lavée 3 fois à l'éthanol 70% afin d'éliminer les traces de sels : à chaque lavage, ajouter 1 ml l'éthanol 70% afin d'éliminer les traces de sel et elle est séchée dans un lyophilisateur pendant 30 mn.

5- Dissolution de l'ADN

L'ADN séché est solubilise dans un volume d'eau distillée qui sera choisi en fonction de la taille de la méduse. Cette solubilisation nécessite une agitation continue pendant une nuit a 42 °C. Après dissolution complète, la DO de la solution d'ADN obtenu est mesurée à 260 nm et à 280 nm afin de déterminer la concentration et la pureté de l'ADN extrait. L'ADN dissout peut être conservé à +4°C pendant quelques jours ou à - 20°C pour une conservation à plus long terme. D'ailleurs, l'ADN pure se conserve à - 20 °C, plus de 10 ans.

6- Estimation de la concentration de l'ADN

La méthode de spectrophotométrie est utilisée pour une quantification précise de l'ADN. Ainsi, la concentration en ADN est déterminée par mesure de la DO au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 260 nm pour des solutions diluées au 1/50 ou 1/100, sachant que l'ADN a un spectre d'absorption en UV maximum à 260 nm. Ce spectre d'absorption est proportionnel à la concentration de l'ADN (une unité de densité optique (DO) à 260 nm correspond à 50ug d'ADN double brin ou à 25ug ADN ou d'ARN simple brin par ul) en tenant compte de la dilution réalisée.

L'estimation de la concentration de l'ADN est déterminée selon la formule suivante :

7- Estimation du degré de pureté d'ADN

La mesure de la DO à 280 nm sert à détecter les éventuels contaminants. La pureté de l'échantillon est testée par comparaison des DO à 260 nm et à 280 nm et cela pour détecter toute contamination protéique. Ainsi les protéines absorbent à 280 tandis que l'ADN absorbe à 260nm. Une préparation d'ADN est dite pure si elle présente un rapport de DO 260/DO 280 entre 1.4 et 1.7.

8- Préparation des dilutions d'ADN

C'est une étape pré-PCR. On fait diluer un volume de la solution mère d'ADN dans de l'eau bidistillée afin d'obtenir une concentration finale de 100 ng/ul. Cette concentration est optimale pour les réactions d'amplification moléculaire.

Dans le but de faire le génotypage des cinq systèmes HPAs, six couples d'amorces (sens et anti-sens) ont été utilisés : un couple d'amorces pour amplifier une région du gène HGH, les autres pour amplifier les régions spécifiques sont complémentaires à la séquence à amplifier. Toutes ces amorces sont de type séquences spécifiques (SSP), elles sont capables de détecter les versions alléliques des différents gènes codants. Dans notre étude, la Taq a été diluée dans le tampon 1X a partir d'une solution mère dont la concentration est de 5 U/ ul.

II-3. Mise au point de la réaction PCR-SSP

Dans le but de faire le génotypage des cinq systèmes HPAs, six couples d'amorces sens et anti-sens) ont été utilisés : un couple d'amorces pour amplifier une région du gène HGH. Les autres pour amplifier les régions spécifiques sont complémentaires à la séquence à amplifiés. Toutes ces amorces sont de types séquences spécifiques (SSP), elles sont capables de détecter les versions alléliques des différents gènes codants.

Dans notre étude, la Taq a été diluée dans le tampon 1X a partir d'une solution mère dont la concentration est de 5U/ul.

Nous avons utilisé une méthode basée sur la réaction de (PCR-SSP) comme décrite par Cavanagh et al. (Metcafle et al., 1993; Cavanagh. G et al., 1997), avec quelques modifications. La mise au point de la PCR a nécessité un changement chaque fois d'un paramètre, afin d'optimiser et choisir le protocole standard pour chaque technique. Plusieurs paramètres peuvent constituer des éléments critiques pour le succès de la technique d'amplification. Une gamme de MgCl₂ doit être testée afin de déterminer la concentration optimale du magnésium permettant une bonne amplification. En effet, une forte concentration en ions Mg⁺⁺peut engendrer des polymérisations aspécifiques, alors q'une faible quantité diminue le taux d'amplification. Les autres composants de la PCR peuvent aussi influencer le déroulement de la polymérisation. Le pH doit rester constant et correspondre au pH optimal de l'enzyme utilisée. De même, la température de dénaturation de l'ADN matrice, de l'hybridation et de l'élongation peuvent être des facteurs limitants. Le chois des séquences oligonucléotidiques servant comme amorces (% en GC) peut constituer à son tour un paramètre essentiel intervenant surtout au moment de l'hybridation conduisant a la formation de structures secondaires.

Cependant, nous avons rencontré des difficultés pour l'amplification de tous les allèles, à cause de l'amplification non spécifique car ces systèmes ont exigé des conditions optimales pour leur amplification. Ces difficultés ont été résolues par une légère modification de la technique utilisée par Cavanagh et al. Nous avons donc essayé d'améliorer la spécificité de la PCR-SSP en augmentant la concentration du magnésium MgCl₂ de 1,5 mM à 2,5 mM dans le mélange de la réaction finale.

Chaque système bi-allélique est analysé à l'aide de deux couples d'amorces spécifiques auxquels est ajouté un couple d'amorces monomorphiques servant de témoin d'amplification. Des ADN de référence portant les différents allèles testés auparavant sont nécessaires et ont été obtenus à partir d'individus typés par PCR et avec d'autres méthodes. Au cours de la mise au point, nous avons choisi des températures d'hybridation Th spécifiques pour l'amplification des systèmes HPA-1 et HPA-3 (55°C), HPA-2 et HPA-5 (56°C) et (63°C) pour le système HPA-4. Les Tm des amorces des allèles HPA-1a /HPA-1b (62 °C /64 °C) et HPA-3a /HPA-3b (64 °C /66 °C) sont supérieures aux températures d'hybridation. Quant au Th du système HPA-4 (63°C) et au Th HPA-5 (56°C), ils sont supérieures au Tm (62°C pour HPA-4 et 42°C pour HPA-5. Concernant le système HPA-2, le Th (56 °C) est inférieur au Tm (64°C). Nous savons que les réactions d'extension d'amorce sont faites à des températures proches, mêmes supérieures aux Tm des amorces qui en conséquence pourraient ne pas avoir le temps de s'hybrider correctement et ainsi provoquer le décrochage de l'enzyme après son arrivée. Néanmoins, nous avons trouvé de bons résultats avec des Th < Tm pour les trois systèmes HPA-1, HPA-2 et HPA-3. Nous avons choisi des températures d'hybridation spécifiques identiques pour les systèmes HPA-1 et HPA-3 (55°C) et pour les systèmes HPA-2 et HPA-5 (56°C). Ainsi, nous pouvons amplifier les deux systèmes HPA-1 et HPA-3 ensemble et les deux systèmes HPA-2 et HPA-5 ensemble avec le même programme PCR.

Nous avons utilisé les mêmes concentrations du mix pour tous les systèmes sauf pour les primers spécifiques. En fait, nous avons utilisé la concentration 0,35 mM pour les trois systèmes HPA-1, HPA-2, et HPA-4, tandis qu'on a augmenté cette concentration à 0,5 mM pour les systèmes HPA-3 et HPA-5.

Préparation des dNTPs : Pour préparer le stock des dNTPs, on mélange volume à volume les quatre solutions mères (100 mM) contenant chacune un type de base (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), ce qui donne une concentration de 25mM correspondant à chaque

dNucléotides. La solution subira une dilution pour obtenir la concentration adéquate de 2Mm (20ul + 920ul d'eau bidistillée). Ce mélange préparé dans un tube eppendorfs (1,5ml) est conservé à -20°C pour des utilisations ultérieures.

Préparation de la solution de MgCl2 : On mélange volume à volume MgCl₂ à une concentration initiale de 25 mM et l'eau distillée pour obtenir une solution de MgCl2 dont la concentration est de 12,5 mM.

Préparation des solutions d'amorces : les amorces oligonucléotidiques nous ont été fournies sous forme solubilisée. Les solutions mères d'amorces doivent être diluées dans des tubes eppendorfs (1,5ml) pour avoir une concentration de 2 ; 3,5 ou 5 uM suivant le type d'amorce puis conservées à -20°C pour des utilisations ultérieures 10X concentrées. IL faut faire attention à toute contamination possible.

Pour chaque réaction PCR, on utilise une paire d'amorces spécifiques à chaque système HPA (sens et anti-sens). Ils doivent être apportés en excès afin de favoriser leurs liaisons aux brins d'ADN dénaturés plutôt que celles des brins d'ADN entre eux. Un deuxième couple d'amorces désignées à l'amplification d'une région du gène HGH, gène monomorphe codant l'hormone de croissance chez l'homme, a été utilisé comme contrôle de qualité (contrôle interne) pour les différentes étapes d'extension d'ADN pour vérifier l'efficacité de la réaction d'amplification témoignant le succès de la réaction PCR.

Les amorces utilisées sont comparées aux séquences connues dans la base de données NCBI selon les étapes suivantes :

On a deux boites on colle la séquence de l'amorce (forma fasta) dans l'une et celle du gène dans l'autre et on clique sur le bouton Align.

Tableau V : Les différents couples d'amorces utilisés pour l'amplification spécifique des systèmes HPA -1 à 5 (Cavanagh. G et al., 1997).

Après la mise au point on prépare, dans un tube eppendorf, un master mix (tampon, dNTP, les primers, MgCl₂) pour le typage de 100 échantillons, pour des raisons de bonne conservation du produit, un aliquot est préparé selon les besoins. Ces tubes doivent être conservés au congélateur dans le but d'éviter la congélation et la décongélation des produits.

A chaque fois qu'on fait le typage, on laisse le master mix à température ambiante jusqu'à la décongélation puis on ajoute la Taq diluée dans le tampon 1X pour obtenir un super mix qui doit être réparti dans des tubes PCR à raison de 8ul/tube.

De grandes précautions doivent être prises vis à vis de la Taq polymérase qui demande à être conservée à -20°C sans écart de température afin d'éviter sa dégradation.

En dernière étape, on ajoute à chaque tube PCR 2ul d'ADN à 100ng/ul des échantillons à tester. Le tout est mélangé doucement pour ne pas altérer l'enzyme. Le volume final est de 10 ul contenant au moins 200 ng d'ADN génomique. Les facteurs limitants l'amplification sont l'épuisement des amorces et celui des nucléotides. La spécificité d'amplification d'une séquence donnée sera directement liée a celle des amorces choisies. Pour chaque PCR, un tube sans ADN (à la place de l'ADN, on met de l'eau distillée), qui sert comme témoin négatif, permet de s'assurer de l'absence de contamination. Il faut bien choisir de «bons» témoins positifs et négatifs. Puis, on amplifie l'ADN.

Nous avons adopté la technique PCR-SSP : c'est la technique la plus utilisée pour l'étude du polymorphisme allélique des gènes des différents systèmes HPAs. Elle a l'avantage d'être une méthode en une seule étape où la spécificité de primer simplifie la détection du produit amplifié. C'est une technique simple, rapide et précise (Skogen B et al. 1994). Cette méthode exige des conditions particulières d'amplification pour les différents systèmes.

Chaque série d'amplification comporte différentes étapes selon un programme bien déterminé. Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube PCR qui sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thérmocycleur. L'amplification est effectuée en 30 cycles qui sont précédés par une étape de dénaturation de 5 mn à 95°C qui rend la dénaturation initiale efficace. Elle consiste en une minute de dénaturation à 95°C, une minute d'hybridation à une température spécifique pour chaque système et une minute d'extension à 72°C. Les Thyb (température d'hybridation) mises au point pour chaque couple utilisé pendant la réaction d'amplification sont mentionnées dans le (Tableau VIII). A la fin, ces cycles sont suivis d'une étape d'élongation de 7 min à 72°C afin que la polymérase termine la synthèse des brins qu'elle n'a pas eu le temps de finir pendant les cycles précédents. Cette étape fixe donc la fin de l'élongation et achève ainsi la réaction PCR. Ces cycles sont réalisés automatiquement dans un thérmocycleur Perkin Elmer 2700 programmé pour effectuer les cycles suivants. La température d'hybridation «Thyb »

III. Contrôle de l'amplification

III-1 Électrophorèse sur gel d'agarose (Delpech. M et al. 1999).

L'ADN, après extraction cellulaire et amplification par PCR, peut être analysé sur gel d'électrophorèse.

Le contrôle des produits PCR se base sur le principe de la séparation et l'identification des fragments d'ADN amplifié des éventuels fragments non spécifiques en fonction de leur taille et leur purification des restes des réactifs d'amplification dans un champ électrique homogène. Les ADN sont des macromolécules polyanioniques uniformément chargées négativement, la charge relative de l'ADN étant constante. De ce fait, l'ADN peut migrer dans un champ électrique de la cathode (-) vers l'anode (+) dans un tampon de migration 1X, soit dans du TAE ou dans du TBE.

Les échantillons sont mélangés à un colorant, le bleu de bromophénol de masse moléculaire faible par rapport au fragment d'ADN pour marquer le fond de migration et de les suivre au cours de l'électrophorèse. Pour nous, le tampon est coloré par un colorant vert le green. Il s'avere inutile d'utiliser un autre colorant lors de l'électrophorèse.

On additionne aussi au gel le BET, réactif intercalant qui se fixe entre les bases nucléiques à l'intérieur de la double hélice. Cette molécule naturellement non fluorescente présente une fluorescence orange lorsqu'elle est intercalée entre les bases nucléiques et après excitation aux longueurs d'ondes ultraviolettes.

Après migration, on place le gel au dessus d'un éclairage ultraviolet qui servira à exciter les molécules de BET* fixées aux molécules d'ADN, lesquelles vont émettre une lumière rougeâtre visible et photographiable, permettant de visualiser la position des fragments d'ADN sur le gel.

Le contrôle a été réalisé par électrophorèse horizontale sur un gel d'agarose à 1,5%, colorés par le BET on ajoute 0,45 g d'agarose à 30 ml de tampon TBE 1X (Tris-Boric-EDTA). Le mélange est porté à ébullition sous agitation jusqu'à dissolution totale de l'agarose et l'obtention d'un liquide transparent. Après refroidissement, on additionne 10 ul de BET*. On fait couler 30 ml de gel doucement à l'horizontale dans un bac à électrophorèse muni d'un ou de plus de peignes de 8 dents selon le nombre d'échantillons déposés, dont les empreintes formeront des puits au sein du gel servant au dépôt des échantillons à tester aussi bien pour le marqueur de taille et le témoin négatif. On laisse le gel se refroidir jusqu'à ce qu'il durcisse. Le gel polymérisé est recouvert de 10 ml de TBE 1X et le peigne est retiré.

III-2 Électrophorèse et visualisation des produits d'amplification

On procède, enfin, à l'étape de révélation des produits amplifiés. La spécificité des bandes observées sur gel est confirmée à l'aide des marqueurs de tailles M. Les produits PCR doivent être visualisés afin de vérifier l'efficacité de l'amplification et de déterminer le génotype des échantillons étudiés. Pour cela, les 10 ul de chaque produit d'amplification des échantillons sont déposés lentement dans les puits du côté de la cathode selon l'ordre des échantillons dans les tubes PCR. Un marqueur de taille de poids moléculaire connu est déposé aussi en parallèle avec les échantillons préalablement mélangés avec du bleu de bromophénol qui permet de suivre leur migration au cours de l'électrophorèse pour estimer la taille des amplicons.

Le gel de migration est recouvert de 20 ml de tampon basique TBE 1X, de telle manière à assurer un contact entre l'anode et la cathode. Après diffusion dans le gel, l'électrophorèse est démarrée à 120V, 50 mA pendant 10 à 20 minutes. Cette durée dépend toutefois de la taille des fragments amplifiés.

A la fin de l'électrophorèse, le gel est visualisé, puis photographié au dessus de l'éclairage UV qui servira à exciter les molécules de BET fixées aux molécules d'ADN, lesquelles vont mettre une lumière rougeâtre visible, mais surtout photographiable pour vérifier la visualisation puisque le BET permet de visualiser sous UV les fragments d'ADN ainsi que la position des fragments du marqueur de taille qui doit apparaître sous forme de bandes fluorescentes. Cette analyse permet de vérifier la spécificité de la séquence amplifiée. Pour cela, on doit s'assurer de la taille de la bande correspondante à cette séquence, ce qui permet de déterminer des génotypes et de vérifier que le produit PCR du témoin négatif ne montre pas de bande amplifiée pouvant correspondre à une contamination par un ADN étranger. Les réactions ne sont considérées positives que lorsque le contrôle positif (contrôle interne) est amplifié. Selon la présence ou l'absence de la bande amplifiée, on peut déduire le génotype de chaque individu. Par exemple, pour le génotype a/a, on observe une bande spécifique qui correspond à l'allèle a et l'absence de la bande correspondant aux produits amplifies spécifique à l'allèle b. Pour tous les échantillons, on observe la présence de bandes qui correspondent au HGH (contrôle interne).

IV. ANALYSES STATISTIQUES

Cette étude statistique a été menée dans le but de déterminer la distribution des fréquences alléliques, génotypiques, phénotypiques, les fréquences haplotypiques et le déséquilibre de liaison des cinq premiers systèmes plaquettaires dans l'échantillon étudié. Elle nous permet d'étudier l'équilibre de la population Tunisienne pour les locus étudies en utilisant l'approche de H-W.

Les moyens statistiques que nous avons utilisés sont les suivants : Les tests statistiques et le logiciel SAS.

1. Calcul des fréquences géniques et génotypiques en cas d'équilibre panmictique :

Il s'agit de la proportion des différents allèles d'un gène dans une population.

Chaque individu, étant diploïde, à 2 loci pour chaque système plaquettaire, soit en tout 2N loci pour tout l'échantillon. Donc, les allèles présents dans les loci sont l'allèle a et l'allèle b.

Les individus aa ont deux allèles a, les individus ab ont un seul allèle a et un seul allèle b, ceux qui ont le génotype bb n'ont évidemment aucun allèle a. La fréquence de l'allèle a c'est donc la proportion de l'allèle a parmi tous les gènes de la population qui peuvent occuper le locus (a, b). De même, q est la proportion des allèles b. puisque le locus (a, b) est nécessairement occupé soit par a soit par b et que ces éventualités sont mutuellement exclusives, on a donc en cas d'équilibre : p ₊ q ₌ 1

Les fréquences des deux allèles a et b sont obtenues par les formules suivantes :

Donc il s'agit de calculer le nombre de sujets présentant un allèle donné qu'on divise par le nombre total des allèles dans chaque locus : chaque individu possède deux allèles dans un locus donné.

Soit l'échantillon étudié de N individus et on a 3 génotypes (aa) n₁, (ab) n₂ et (bb) n₃

Les fréquences génotypiques observées sont obtenues par un comptage direct. On calcule le nombre de sujets présentant un phénotype donné qu'on divise par le nombre total de sujets étudiés. Les fréquences génotypiques calculées : sont estimées à partir des fréquences alléliques en se basant sur la loi de H-W :

Il est appelé aussi intervalle au risque d'erreur á. Cet intervalle a une probabilité de 1-á de contenir la vraie valeur (inconnue) d'un paramètre donné. Pour un %, l'IC (à 95%, au risque d'erreur 5%) est calculé de la manière suivante :

Cet intervalle nous permet de dire que, pour un échantillon de N individus, les résultats sont fiables à #177; IC pour un résultat caractéristique à un % d'erreur de 5%.

Une hypothèse génétique s'étend d'ordinaire à plusieurs classes de génotypes. Pour l'estimer, nous avons besoin d'un test qui nous permette d'associer une probabilité aux écarts observés dans un échantillon par rapport aux fréquences attendues et de décider si les écarts relèvent ou non du seul hasard. Ce test doit également tenir compte de la taille de l'échantillon et du nombre de variables (degrés de liberté). Le test appelle du ÷² satisfait à ces exigences.

ü Test chi-deux ( ÷² ) : La valeur x²est calculée enappliquant la formule

Nous avons : n-1 degrés de liberté (dl) pour fixer, au hasard, les valeurs de n classes d'une expérience. Dans notre cas, on a 3 génotypes. Ainsi, nous aurons : 3-1 =2 degrés de liberté.

Limitation de l'utilisation du Test chi-deux : L'utilisation du Test chi-deux pour l'analyse des résultats d'expérience génétique a deux limitations importantes. (1) Les éléments du calcul doivent être les effectifs de classe eux-mêmes et non les pourcentages ou les proportions déduites de ces effectifs. (2) On ne doit pas l'utiliser quand une des classes a un effectif théorique inférieur a 5.

Cette correction n'entraîne habituellement qu'une légère diminution de la valeur du ÷², mais elle peut jouer un rôle important au voisinage de la valeur critique.

1) Le SAS. On a utilisé ce logiciel dans le but de comparer les fréquences alléliques des HPAs étudiés à travers les différentes populations.

2) L'Arlequin. Pour calculer les fréquences haplotypiques et le déséquilibre de liaison :

RESULTATS DE L'AMPLIFICATION PAR PCR DES ALLELES : (GP3A*1/ GP3A*2), (GP1BA*1/GP1BA*2), (GP2B*1/GP2B*2), GP3A*1/GP3A*3 et GP1A*1/ GP1A*2

Les profils électrophorétiques des figures représentent des exemples des génotypes HPA-1, -2, -3, -4, et -5 détectés sur gel d'agarose. Les produits amplifiés sont de tailles distinctes : Les bandes les plus lourdes sont les bandes les plus lentes et elles correspondent aux produits amplifiés du contrôle positif HGH de taille (429 pb). Cette bande doit être présente dans chaque échantillon étudié pour permettre de vérifier l'intégrité de la réaction PCR. Concernant les bandes spécifiques, la bande la plus légère correspond au produit amplifié des amorces (90 pb) du système HPA-1 qui migre le plus rapide. Les bandes spécifiques au HPA - 4 (120 pb), ensuite par la bande spécifique HPA-5 (246 pb), puis HPA-2 (258 pb) et enfin par la bande spécifique HPA-3 (267 pb).

Figure 8: Profil éléctrophorétique des amplifications du système HPA-1 en gel d'agarose à 1.5%.

Les puits : M = marqueur de Taille, a = allèle (a), allèle (b), T = témoin négatif (eau distillée). La bonde supérieure présente dans tous les puits correspondants aux produits amplifiés des amorces de contrôle interne HGH. Les bondes inférieures correspondantes aux produits amplifiés des amorces spécifiques des allèles a/b

Figure 9: Profil éléctrophorétique des amplifications des systèmes HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 en gel d'agarose à 1.5%.

L'électrophorèse sur gel d'agarose montrant les 4 systèmes HPAs. Les puits 1 et 2; 3 et 4; 5 et 6; 7 et 8 sont pour les systèmes HPA-2 (258 pb), -3 (267 pb), -4 (120 pb), et-5 (246 pb), respectivement. Le puit 9 contient le marqueur de taille Chaque couple montre des génotypes identiques HPA-2 (a+b-), HPA-3(a+b-), HPA-4 (a+b-) et HPA5 (a+b-). Noter que la bande migrant plus faiblement représente le produit d'amplification de témoin d'amorces positif HGH (429pb).

Analyse statistique de la répartition des fréquences géniques, et phénotypiques des cinq systèmes plaquettaires étudiés

Chaque système est gouverné par un couple d'allèles codominants (a, b). L'allèle a est l'allèle fréquent, il est dit sauvage et il correspond à la synthèse de l'antigène HPA-a. L'allèle b est l'allèle rare, il est dit mutant et il correspond à la synthèse de l'antigène HPA-b. Ces systèmes sont déterminés par des gènes autosomaux.

Les résultats de typage obtenus chez 111 pour le système HPA-1, 105 pour le système HPA-2, 104 pour le système HPA-3, 102 pour le système HPA-4 et 100 donneurs pour le système HPA-5, sont donnés dans le tableau VIII:

On remarque d'après ces données une distribution irrégulière des différentes formes alléliques. Les fréquences des allèles HPA-a sont plus élevées, pour tous les systèmes, que celles des allèles HPA-b. Les allèles HPA-1a, HPA-2a, HPA-3a, HPA-4a et HPA-5a ont les valeurs respectives de 0,824; 0,8; 0,707; 1 et 0,875. Les allèles HPA-1b, HPA-2b, HPA-3 b, HPA-4 b et HPA-5 b ont les valeurs respectives de 0,176; 0,2; 0,293; 0 et 0,125. D'après ces données, on remarque l'importance des fréquences des allèles HPA-b pour les quatre systèmes HPA-1, 2, 3 et 5. D'ailleurs, la fréquence de l'allèle HPA-3b (0,293) est plus élevée que celles de tous les autres allèles, elle est suivie par les allèles HPA-2b (0,2), HPA-1b (0,176) et HPA-5b (0,125).

Figure 10: Représentation graphique de la distribution alléliques des systèmes HPA-1, -2,- 3,-4 et-5 dans l'échantillon étudiée de la population tunisienne

Les génotypes HPAs les plus communs en Tunisie sont les homozygotes (a/a) : HPA-1 (a⁺b^-), HPA-2 (a⁺b^-), HPA-3 (a⁺b^-), HPA-4 (a⁺b^-) et HPA-5 (a⁺b^-) (Voir tableau ci-dessous). On remarque que le système HPA-4 est homogène, tous les individus sont des homozygotes du génotype HPA-4a (aa). Les homozygotes (b/b) sont faibles en comparaison avec les homozygotes (a/a). On met en évidence une fréquence élevée des génotypes homozygotes HPA-3b/b (10,576%) suivi par le génotype b/b du système HPA-5 (de 3 %), le génotype b/b du système HPA-2 (de 2,857 %), et enfin le génotype b/b du système HPA-1 (de 2,702 %) contrairement aux génotypes b/b et a/b du système HPA-4 qui sont totalement absents.

Tableau XI : Fréquences génotypiques en % des systèmes HPA-1, -2, -3, -4 et 5

génotypiques des cinq premiers systèmes HPA dans l'échantillon étudié de la population tunisienne

Lorsqu'un système à deux allèles est en situation de codominance, chacun des trois génotypes diploïdes s'exprime par un phénotype distinct et il existe une correspondance parfaite entre génotype et phénotype. Ainsi, les systèmes plaquettaires se transmettent par codominance et les deux allèles vont s'exprimer d'une manière équivalente chez les hétérozygotes. Les phénotypes sont déduits des génotypes correspondants, c'est pourquoi les fréquences génotypiques sont égales aux fréquences phénotypiques en %. Il existe donc trois phénotypes pour les quatre systèmes HPA-1,-2 -3 et 5 : [aa], [ab] et [bb]. Tandis que pour le système HPA-4 il existe un seul phénotype : [aa].

Pour tirer des estimations valables et pour que ces estimations aient un sens biologique, certaines conditions doivent être remplies lors du prélèvement de l'échantillon afin d'obtenir un échantillon représentatif.

Considérons que l'effectif de l'échantillon est infiniment grand et que les unions se font totalement au hasard (panmixie) sans mutation ni migration ni sélection, c.á.d les génotypes HPAs n'influencent pas le choix du conjoint et les différents génotypes sont également viables et féconds (ils sont neutres du point de vue de la sélection naturelle, les individus sont supposés avoir la même espérance de vie pour les gènes HPAs et ne présentent aucune mortalité différentielle). Dans notre cas, le test ÷² n'est applicable que pour le système HPA-3 dont les effectifs des trois classes sont supérieurs à 5.

On suppose que la population tunisienne est à l'état panmictique pour le locus du système HPA-3.

Les effectifs observés et les effectifs théoriques attendus d'après H-W pour les génotypes du système HPA-3 sont présentés dans le tableau XII.

Il est évident que l'adéquation entre effectifs observés et effectifs théoriques est très bonne : elle n'est pas parfaite à cause des fluctuations statistiques aléatoires des effectifs observés des divers génotypes et qui doivent normalement se traduire par des erreurs négligeables.

Pour vérifier cette hypothèse, on utilise un test statistique qui permet de quantifier l'ajustement aux valeurs attendues : c'est le test chi-deux : ÷².

Il est évident que pour le système HPA -3, l'adéquation entre les effectifs observes et les effectifs théoriques est très bonne : elle n'est pas parfaite à cause des fluctuations statistiques aléatoires des effectifs observés des divers génotypes et qui doivent normalement se traduire par des erreurs négligeables. Pour vérifier cette hypothèse, on utilisé un test statistique qui permet de quantifier l'ajustement aux valeurs attendues : c'est le test chi-deux : ÷²

P > 0,05 et le ÷² calculé= 0,893 < ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-3.

÷² (corrigé) = 0,736< ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-1.

÷² (corrigé) = 0,0735< ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-2.

÷² (corrigé) = 2,53 < ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-5.

Dans notre cas, il est inutile de faire un ÷² pour le système HPA-4 pour voir que les effectifs réels ne sont pas statistiquement différents de ceux prévus. Donc, l'hypothèse est vraisemblable et la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-4.

Haplotype : L'ensemble des allèles de deux loci ou plus situés sur un même chromosome sont dits en cis sur ce chromosome est appelé un haplotype. Le nombre d'haplotype possibles est égal au produit du nombre d'allèles pour chaque gène. Les différents allèles d'un haplotype ont d'autant plus tendance à coségréger, à la méiose, que les locus des différents gènes sont physiquement proches sur ce chromosome, c'est-à-dire, génétiquement liés

Le déséquilibre de liaison : Certaines associations de spécificités a et b sont plus fréquemment associées que ne le voudrait le hasard. Elles sont dites en déséquilibre de liaison. En absence de liaison statistique entre deux allèles a, b (de fréquences respectives P_a et P_b) à deux loci différents, la fréquence du gamète portant ces deux allèles sera P_aP_b.

On appelle déséquilibre de liaison ou (delta Ä), l'écart entre la fréquence observée P_abde l'haplotype ab et la fréquence attendue P_aP_b

Pour 1 degré de liberté (ddl) au seuil á = 5% la valeur de ÷² estde 3.84 à partir de cette valeur de ÷², on dit que l'association est significative et que les deux antigènes sont en déséquilibre de liaison.

Haplotypiques des HPA-2 et HPA-3 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

D'= relative linkage disequilibrium ; paramètre qui mesure la force de l'association haplotypique

Haplotypiques des HPA-1 et HPA-2 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

Haplotypiques des HPA-1, HPA-2 et HPA-3 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

Ø Estimation du risque d'alloimmunisation antiplaquettaire chez la population tunisienne :

La population tunisienne est en équilibre de H-W. Elle subit un cycle de reproduction panmictique.

Chez l'homme, chaque système plaquettaire HPA est contrôlé par un gène autosomique codominant (a, b) où les allèles vont s'exprimer d'une manière équivalente.

Les fréquences alléliques et génotypiques sont les mêmes dans les deux sexes, c.á.d. tous les adultes reproducteurs possèdent une fertilité égale. La fréquence des zygotes de la génération suivante est calculée en faisant les produits des fréquences gamétiques comme le montre le tableau suivant de rencontre des gamètes.

Les mères qui peuvent donner des descendants à risque allo-immune ont des génotypes (aa) ou (bb) et les pères sont de génotypes (aa), (ab) ou (bb) (transmission par codominance). Les mères de génotypes (ab) possède les deux allèles a et b donc leurs descendants ne sont pas à risques (Tableau XVII).

Tableau XVII Les fréquences génotypiques des désendants entre différentes unions parentales.

Lorsque les pères et les mères sont de même génotypes (aa) ou (bb) ? le risque est nul.

Lorsque les mères de génotypes (bb) et les pères sont de génotypes (aa) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de p²q².

Lorsque les mères de génotypes (aa) et les pères sont de génotypes (ab) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de ½ (2p³q).

Lorsque les mères de génotypes (bb) et les pères sont de génotypes (ab) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de ½ (2pq³).

Lorsque les mères de génotypes (aa) et les pères sont de génotypes (bb) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de p²q².

Donc d'après le tableau XVII, les fréquences génotypiques attendues des descendants á risque allo-immune sont :

Les résultats obtenus sont une réalité biologique car toutes les conditions envisagées ci-dessus sont réalisées. Dans les conditions de H-W, les fréquences d'allo-immunisation se maintiennent constantes de génération en génération.

En se basant sur ces résultats, on remarque que le taux d'immunisation est variable selon l'antigène considère et qu'un nombre élevé de grossesses (jusqu'à 21,528 (20,7 %) pour le HPA-3) serait incompatible pour les allo-antigènes HPAs dans la population d'étude.

Figure 15: Fréquence théorique des descendants à risque allo-immuns en (%) pour les cinq premiers systèmes chez la population d'étude.

Les HPAs sont des allo-antigènes spécifiquement plaquettaires génétiquement déterminés. Chaque système est codé par un gène bi-allélique d'un seul locus. Les allèles sont indiqués alphabétiquement par ordre de leur fréquence. L'allèle «a» est le plus fréquent, l'allèle «b» est le plus rare. Le polymorphisme de la plupart de ces systèmes est dû à une substitution d'une seule paire de bases au niveau du gène codant.

Nous nous sommes intéressés dans notre étude aux cinq premiers systèmes : HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 qui se présentent dans l'échantillon étudiée sous les formes alléliques suivantes : HPA-1a, HPA-1b ; HPA-2a, HPA-2b; HPA-3a, HPA-3b; HPA-4a, HPA-5a, HPA-5b.Ces allo-antigènes sont immunogènes et sont impliqués dans la pathophysiologie de la thrombopénie allo-immune qui peut être impliquée dans des syndromes cliniques bien décrits tels que la NAIT et le PTP, mais aussi chez des malades multi-transfusés qui sont réfractaires à la thérapie de la transfusion plaquettaire. Ces systèmes jouent le rôle d'antigènes d'histocompatibilité dans la transplantation d'organes aussi bien que leurs associations avec les maladies cardiaques, la thrombose coronaire et les événements cèrebro-vasculaires. Les données sur la prédominance des antigènes plaquettaires dans une population donnée sont essentielles pour le diagnostic des cas des NAITP immunes, pour la planification des programmes de criblage pour des femmes en danger de FMAIT, pour la consultation génétique et pour la thérapie des patients avec fourniture des anticorps anti-HPA (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989; Bussel. J. B et al., 1997; Roúman. P. 2002). Excepté leur impact pratique sur la provision des transfusions des PLTs. Elles contribuent également à la compréhension des rapports évolutionnaires et offrent des informations sur les expansions démographiques (Roúman. P. 2002). En effet les allo-antigènes spécifiquement plaquettaires constituent des marqueurs génétiques.

Le génotypage des HPAs peut être utile pour le diagnostic, pour la thérapie et la prévention des syndromes thrombocytopénques allo-immunes telles que la NAIT et le PTP (Nauck. M. S et al., 1999), ainsi que dans les traitements de differentes maladies (Liu T.C et al., 2002) et dans la prévision des composants du sang en HPAs pour ces malades (Hatzidimitriou. Gr et al., 2001; Ficko. T et al., 2004).

Le typage des allo-antigènes plaquettaires ont été tout d'abord identifiés par des techniques sérologiques telles que l'ELISA, la cytométrie en flux, la technique du MAIPA (Kiefel V et al., 1987; Okomato N et al., 1998) et l'agglutination plaquettaire.

Le typage sérologique des HPAs en pratique courante est bien développé (Kekomäki., 1995; Chang. Y. W et al., 1998). Mais au fil des années, on a remarqué qu'il a plusieurs inconvénients.

D'abord, la présence à la fois d'anticorps leucocytaires humains et d'anticorps de groupes sanguins. Le système HPA-1, présente un risque de confusion (Okamoto. N et al., 1998). De plus, on a remarqué qu'il y a un manque d'alloantiserums bien caractérisés et des difficultés d'obtenir du sérum de typage de bonne qualité (Simsek et Von Dem Borne., 1994; Cavanagh. G et al., 1997), qui sont dus à la faible immunogénécité des HPAs et la contamination de ces sérums par des anticorps anti-HLA (Killick. S. B et al., 1997). Les difficultés et l'insuffisance d'obtenir des PLTs qu'on observe chez les malades avec thrombocytopénie (Boldt B et al., 1997) et chez les foetus (NAIT) rend le diagnostic difficile et peut affecter le foetus pendant le prélèvement du sang. Le phénotypage ne peut pas être réalisé pour tous les antigènes plaquettaires car on ne dispose pas d'allo-anticorps correspondants. De plus les techniques de typage sérologique présente plusieurs inconvénients ; le test de MAIPA où le risque d'un résultat négatif est élevé, qui est dû à la compétition des anticorps humains avec des anticorps monoclonaux de capture, en plus ce test nécessite une quantité de PLTs significative, et il est de réalisation longue et délicate. Ainsi que la mise en évidence des allo-anticorps maternel n'étant pas toujours facilement mis en évidence (Santoso. S . A et al., 2003).

Les méthodes de typage basées sur l'ADN sont devenues plus exactes (Kluter et al., 1996; Legler TJ et al., 1996; Bein G. H et KLuter. H. 1997; Chang. Y. W et al., 1998), plus performantes, plus rapides et sont plus préférables de ce fait, plus utilisables que les méthodes sérologiques conventionnelles. Ainsi, l'amplification de l'ADN génomique par PCR élimine le besoin des PLTs et exige seulement un petit nombre de cellules nucléées de différentes sources telles que le liquide amniotique ou la villosité chorionique pour tester les cas de NATP foetale (Boldt. B et al., 1997). Elle permet aussi d'obtenir des résultats même dans les cas de thrombopénie extrême (Cavanagh. G et al., 1997). En fait, plusieurs techniques de génotypage moléculaire basées sur la PCR se sont développées (Meyer. O et al., 1999). On cite parmi elles : La PCR allele-specefic oligonucleotide (Bray. P. F et al., 1994), PCR-ASRA : allele-specefic restriction enzyme analysis (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992; Simsek S et al., 2003 ; Kalb. R et al., 1994), PCR-SSCP : single-strand conformation polymorphism (Jin. Y et al., 1993; Skogen. B et al., 1994; Peyruchaud. O et al., 1995), PCR-PHFA : preferential homoduplex formation (Fuijawara et al., 1996), PCR-OLA : Oligonucleotide ligation assay (Zotz. R. B et al., 1997) (Nauck M. S et al., 1999). La PCR-RFLP (Unkelbach. K et al., 1995), RT-PCR: (Simsek et al., 1997), La PCR-SSP : sequence-specefic primers (Lyou. J.Yi et al., 2002 ; Jones. D. C et al., 2003). Cependant, toutes ces méthodes ont des inconvénients, d'ailleurs elles exigent un processus étendu de post-amplification, y compris l'électrophorèse (ASRA, SSP, SSCP, PHFA (Nauck M. S et al., 1999).

La PCR en temps réel est une méthode idéale pour le diagnostic de routine et la prévention des conditions cliniques associées aux HPAs. Elle peut être utilisée dans l'étude des populations et pour la recherche d'autres effets potentiels de ces polymorphismes ; par exemple, leurs rôles comme antigènes d'histocompatibilité dans la transplantation (Kekomaki. S et al., 2001; Jones. D. C et al., 2003), leurs effets sur le fonctionnement des intègrines et leurs associations possibles avec les maladies cardio-vasculaires (Weiss. E. J et al., 1996; Zotz. R. B et al., 1998; Ardissino et al., 1999; Jones. D. C et al., 2003).

Il est essentiel de combiner les analyses phénotypiques et génotypiques pour éviter une erreur de typage plaquettaire et rendre un diagnostic erroné dans le cadre d'un processus d'allo-immunisation. Il reste important de signaler que les résultats de typage, dans quelques cas, peuvent être confirmés par le séquençage direct.

La méthode adoptée dans notre étude est la PCR-SSP. Elle est simple, exacte et rapide (Chang. Y. W et al., 1998) car elle se fait en une seule étape (á la différence des autres techniques laborieuses comme la RFLP qui exige une étape post-amplification par digestion enzymatique). De plus, la spécificité des primers facilite la détection du produit amplifié (Kulkarni. B et al., 2005). Elle est également fiable, très sensible, complète et reproductible à faible coût. Elle a aussi la possibilité d'être appliquée sur les liquides amniotiques, ce qui mènera à un typage plus étendu et plus complet des antigènes plaquettaires et facilitera le diagnostic exact des thrombocytopénies allo-immunes et la prévision de produits du sang pour ces malades. De même, elle offre la valeur particulière dans l'identification rapide des donneurs des PLTs convenables pour les patients qui exigent la transfusion des cellules plaquettaires. Ce qui explique le fait qu'elle soit utilisée pour la routine en cas de génotypage rapide dans les laboratoires et pour les études de recherches de génétique des populations à grande échelle. De même, elle peut être mise à jour pour inclure d'autres allèles HPA de faible fréquence aussi bien que d'autres allo-antigènes plaquettaires génétiquement caractérisés (tel que le système Gov). Cette technique est optimisée dans notre laboratoire pour fournir une résolution maximale à coût minimum.

Pourtant, cette méthode présente quelques inconvénients. Un inconvénient majeur de cette méthode est que des conditions PCR différentes ont été exigées pour définir chaque paire d'allèles (Skogen. B et al., 1994; Tanaka. S et al., 1995 ; Cavanagh. G et al., 1997). De même, l'amplification des deux allèles exige deux tubes séparés ce qui nous coûte plus de dépenses et de temps (Boldt. B et al., 1997). De plus, la PCR-SSP est un processus dynamique qui exige des conditions optimum pour assurer une amplification spécifique.

De nombreux facteurs peuvent affecter l'efficacité de la PCR : erreurs de pipetage, mauvaise qualité de l'ADN, présence d'inhibiteurs... . Ainsi, le protocole associé au produit doit donc être rigoureusement respecté. L'échantillon d'ADN extrait va fournir la matrice pour l'amplification spécifique, d'où l'importance de sa qualité. La concentration et la pureté doivent se situer dans la limite des valeurs précisées dans le protocole. Il est important de noter que le BET utilisé pour la coloration de l'ADN est cancérigène potentiel et que tous les produits à base de sang doivent être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Toutefois, aucune méthode d'analyse connue ne peut garantir que des produits dérivés du sang humain ne transmettent pas d'agents infectieux. De même, il faut faire attention à l'UV susceptible d'affecter la peau et les yeux. Cependant, pour installer un programme de criblage, la PCR en temps réel serait préférée parce qu'elle prend moins du temps et évite l'utilisation de BET et l'UV.

D'après les résultats obtenus, nous avons remarqué que les fréquences des antigènes plaquettaires varient entre les différents systèmes chez l'échantillon étudié de la population tunisienne. Ainsi, bien que les fréquences alléliques HPA-a soient élevées pour les cinq systèmes HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5, on note que les fréquences des allèles HPA-b sont importantes pour les quatre systèmes polymorphes HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5 contrairement au système mineur HPA-4 qui est monomorphe où l'allèle b est totalement absent chez cet échantillon. Ce qui prouve que la population tunisienne est manifestement hétérogène et que notre population est à haut risque d'allo-immunisation pour ces 4 systèmes HPA-1, 2, 3 et 5.

En effet, la Tunisie a ses propres distributions alléliques et génotypiques des systèmes HPAs qui lui sont spécifiques. D'ailleurs, les résultas obtenus montrent que la population tunisienne est hétérogène. Elle se caractérise par un haut taux de mélange ethnique. Un fait d'état qui peut être expliqué par beaucoup de raisons géographiques, historiques et sociales.

D'autre part, La Tunisie occupe une zone géographique stratégique. Elle s'ouvre sur la Méditerranée au nord et à l'est. Elle tend par le sud vers le Grand Sahara et l'Afrique. Ainsi, la Tunisie est vue comme un point de liaison entre l'Europe et l'Afrique et entre l'est et l'ouest. C'est pour ces raisons qu'elle a été une cible de conquêtes et de migrations de toutes les directions; d'abord les Phéniciens, puis les Romains et les Byzantins, ensuite les Arabes, les Turcs, la colonisation française jusqu'à l'apparition de l'état national moderne.

Ainsi, le peuplement de la Tunisie est issu de la migration de populations venues de tous les endroits (introduction de nouveaux géniteurs). Les tribus berbères (Amazigh) ont assisté à des échanges culturels et génétiques avec les autres populations et civilisations qui se sont soldés quelquefois par le refus et la révolte et par l'acceptation, l'entraide et l'échange jusqu'à la dissolution dans d'autres cas. Ces échanges entre la population autochtone et les peuples venant de l'extérieur ont joué un rôle majeur dans l'enrichissement génétique de la population.

Du coup, on parle de la diversité du peuple tunisien, un peuple où vivent des personnes de plusieurs origines.

Parmi ces peuples qui ont vécu en Tunisie on cite : Les berbères, les phéniciens, les romains, les arabes, les turcs, les andalous (mourisquioun), les africains noirs et les juifs (Hmida S et al 1995).

De plus, ce mélange peut être expliqué par la transmission des gènes entre individus appartenant à ces différents groupes ethniques par voie de reproduction sexuée (le mariage).

Bref, la population tunisienne d'aujourd'hui est un ensemble d'origines berbères, arabes, africaines et européennes. Ce qui lui procure une propriété de mixage.

L'investigation génétique réalisée nous a permis d'étudier l'équilibre de la population Tunisienne pour les locis des systèmes HPAs étudiés. D'ailleurs, cet équilibre a été vérifié en utilisant l'approche décrite par H-W. L'application de la loi H-W nous a permis de constater que l'échantillon étudié est en équilibre panmictique pour les locis précités. Cet équilibre s'explique par l'absence de grandes sélections orientées contre les génotypes HPAs (a/b) malgré l'existence de quelques cas de mort des nouveaux nés thrombopéniques à la naissance ou dans les heures qui suivent. Cet équilibre a pour origine probable l'absence de sélection orienté contres l'un des différents génotypes et les flux géniques qui sont en grande partie très anciens. De plus, la prévention, la prise en charge des thrombopénies chez les nouveaux nés et les patients polytransfusés et la thérapie des conditions cliniques dues à l'immunisation plaquettaire sont bien développés en Tunisie ; ce qui intervient directement dans la diminution des cas de mort.

La probabilité pour développer une réponse allo-immune chez les individus dépend des fréquences des antigènes qui peuvent varier d'une population à une autre.

La différence entre les fréquences alléliques (a et b) des systèmes HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5 montre que la population tunisienne est à haut risque d'allo-immunisation.

D'après nos résultats, nous avons trouvé que le système mineur HPA-4 n'est pas polymorphe et que l'allèle 4b est absent chez notre population, ces résultats suggèrent que le HPA-4 n'a pas d'importance clinique.

De même, nous avons observé la forte présence de HPA-3b suivi respectivement par HPA-2b, HPA-1b et HPA-5b.

Le système HPA-3 est donc le plus polymorphe, ce qui signifie que cette population a un plus gros risque d'allo-immunisation pour ce système. Ce système est en principe à implications cliniques importantes. Théoriquement parlant, plus le degré de polymorphisme dans un système antigénique est haut, plus il est cliniquement important, bien que ce ne soit pas toujours vrai. Il existe d'autres importants facteurs qui contribuent dans ce phénomène dont l'immunogénicité et l'accessibilité de l'antigène à l'anticorps formé.

Selon les résultats trouvés par Miadi N et al., 2003 lors de son étude sur 860 femmes tunisiennes enceintes dans son mémoire de DEA : "L'allo-immunisation anti-HPA chez les femmes enceintes tunisiennes : étude prospective", l'allo-immunisation réelle chez la population tunisienne est relativement élevée (0,34 %). Par contre, nos résultats ont donné les valeurs théoriques des fréquences des descendants à risque allo-immuns en (%) suivantes : 14,5 pour HPA-1, 16 pour HPA-2, 20,7 pour HPA-3, 10,9 pour HPA-5.

Nous remarquons que nos résultats théoriques pour l'allo-immunisation chez l'échantillon étudiés de la population tunisienne sont trop supérieurs à ceux trouvés par Miadi. N et al, une telle différence serait due à ce que l'allo-immunisation dépend de plusieurs autres facteurs.

D'ailleurs, le taux d'immunisation varie selon l'antigène considéré et dépend, en partie, de la fréquence relative des antigènes dans la population, de leur immunogénicité (l'immunogénicité de la protéine est liée à un polymorphisme naturel de la GP ou à la structure particulière de la molécule), de leur distribution cellulaire et tissulaire.

L'immunogénicité est déterminée, en partie, par quatre propriétés de l'immunogène : son caractère étranger (le degré de l'immunogénicité d'un antigène dépend du degré de son caractère étranger), sa taille moléculaire, sa capacité à être apprêté et associé à une molécule du CMH à la surface d'une cellule présentatrice de l'antigène ou d'une cellule du Soi altérée et enfin sa composition et sa complexité chimique. D'ailleurs, chaque protéine est caractérisée par ses propriétés physiques. Lorsqu'un des aa qui forme une protéine est remplacé par un autre, ce remplacement influe sur les propriétés physiques de cette dernière. Cinq aa (l'acide glutamique, l'acide aspartique, l'arginine, la lysine et l'histidine) présentent des chaînes latérales ionisables qui donnent à la protéine une charge nette caractéristique, dépendant du pH du milieu environnant. Des substitutions d'aa peuvent remplacer directement l'un de ces aa chargés, ou bien une substitution neutre près de l'un de ceux-ci peut affecter le degré d'ionisation de l'aa chargé, ou encore, une substitution au niveau de la jonction de deux hélices á peut entraîner une légère modification de la configuration tridimensionnelle du polypeptide replié. Dans tous ces cas, la charge nette du polypeptide sera modifiée car la charge nette d'une protéine n'est pas simplement la somme de toutes les charges individuelles de ses aa, mais elle dépend également de leur exposition au milieu liquide qui les entoure.

Quel que soit le système considéré, l'absence d'un antigène chez la mère ne signifie pas nécessairement qu'elle développera un anticorps lors d'une ou de plusieurs grossesses incompatibles.

Ainsi le développement de NAIT dépend également du type de HLA de la mère; néanmoins, le nombre de grossesses dans lesquelles le foetus est en danger pour la NAITP.

Il sera donc important de suivre l'allo-immunisation anti-HPA pour tous les systèmes, et si nécessaire, de rechercher une éventuelle implication des antigènes HLA. La capacité d'établir une immunisation foeto-maternelle est associée au phénotype HLA-II de la mère.

L'allo-antigène plaquettaire le plus immunogène dans la thrombocytopénie est la forme leucine 33 de la GPIIIa (Giffin. H. N et Ouwehand. W. H., 1995). L'allèle HPA-1a (Pl^A1) est responsable de la plupart des cas de purpura post transfusionnel et de thrombocytopénie néo-natale allo immune dans la population caucasienne (Okamoto. N et al., 1998).

Le polymorphisme Pl^A1/Pl^A2 pourrait être en déséquilibre de liaison avec beaucoup d'autres polymorphismes (Marian et al., 1996). Une corrélation entre l'allo-immunisation anti HPA-1a et l'haplotype HLA-B₈, DR₃(HLA-DRB3*0101) (Williamson. L. M et al., 1998) est fréquemment observée. L'allo-immunisation HPA-1a est fortement associée au génotype de type maternel HLA de classe II DRB3*0101 (phénotype DRW52a) (Décary. S. F et al., 1991) et/ou DQB1*0201 (Décary et al., 1991; L'Abbé. D et al., 1992; Cohen et al., 1995; Homans. A. 1996; Chantrain. C et al., 2000 ; Murphy et al., 2002; Koutsogianni. P. 2004). Pour les personnes de génotypes Leu33 négatifs (Pro33 homozygote), HLA DRB3*0101-positifs, l'exposition du forme Leu33 est très immunogène (Watkins. N. A et al., 2002). Les phénotypes HLA DRw6 est associés à l'allo-immunisation des antigènes HPA-5b (Bra) (Muller-Eckhard. C et al., 1989a). L'allo-immunisation maternelle contre l'antigène HPA-6b (GPIIIa-GIn489) peut être associé au différent haplotype CMH de classe II, c.-à-d. HLA-DRB1*1501, DQA1*0102, DQAB1*0602 (Westman. P et al., 1997).

Ces antigènes sont considérés comme marqueurs d'un haut risque d'allo-immunisation plaquettaire dans notre population, et c'est pour cette raison qu'on est appelé alors à y faire attention dans le cas de grossesse ou de transfusion du sang et des transplantations d'organes et de MO. Ces données sont d'importance majeure et elles ne doivent pas être négligées lors des cas des la NAIT, le PTP, en cas de greffe d'organes et essentiellement dans les traitements des différents cas des maladies associées aux implications cliniques résultant de l'incompatibilité plaquettaire telles que l'hémorragie cérébrale et l'hémiplégie des génotypes HPAs (a/b) qui présentent une allo-immunisation. C'est pourquoi Flug et al., (1994) ont proposé que toutes les femmes en grossesse soient testées pour leur système HPA-1 car les femmes HPA-1b homozygotes ont un risque très significatif pour la NAIT et le PTP (Okamoto. N et al., 1998).

De plus, ces résultats permettent la comparaison entre les sous populations aussi bien qu'entre les populations.

Une variable fondamentale en génétique des populations est la fréquence à laquelle les allèles sont présents au niveau du locus donné. La fréquence d'un allèle donné dans une population peut être modifiée par mutation (le taux de la mutation est défini comme la probabilité qu'une copie d'un allèle change de forme allélique en une génération. Supposons que la totalité d'une population soit homozygote pour a et que les mutations transformant cet allèle en b se produisent à un taux de 1/100 000), la sélection et la migration des gènes. Il est ainsi pour les systèmes HPAs. D'ailleurs, les fréquences des systèmes HPAs varient chez les différentes populations. Et chaque population est caractérisée par ses fréquences géniques. Ainsi, chaque apport extérieur d'un allèle a ou b a la chance de perturber la constitution génétique de la population.

Les êtres humains ne s'unissent pas au hasard puisque les groupes ethniques et les populations diffèrent les uns des autres par les fréquences génétiques et présentent des taux élevés d'endogamie, non seulement au sein des principales populations mais aussi dans les ethnies locales. Les Danois et les Italiens différent par la fréquence de leurs groupes plaquettaires. Les Italiens épousent des Italiennes et les Danois, des Danoises, de sorte que les unions ne se réalisent plus au hasard, même si ce n'est pas intentionnellement, en ce qui concerne les systèmes plaquettaires ainsi que d'autre antigènes tels que les groupes sanguins ABO.

Tableau XVIII : Fréquences des allèles HPA-1 à 5 dans quelques populations africaines

On note, d'après le tableau XVIII, que les fréquences alléliques des systèmes HPA-1 les plus proches de celle de la tunisie sont respectivement : l'Algérie suivie du Bénin. Pour le système HPA-2 on note que la fréquence allélique est voisine à celles du Maroc, les berbères Marocains, puis du Congo et du Cameroun. Pour le systéme HPA-4, la Tunisie possède des fréquences alléliques HPA-4a qui varient de (1 à 0,885) et par conséquent, l'allèle HPA-4b varie de (0 à 0,115) (Saadi H et al., 2006; présente étude). On remarque, d'après ces résultats, que la Tunisie présente les fréquences des allèles HPA-4b les plus élevées (0,115) comparée à celles obtenues avec les autres études. Ceci peut être attribué aux techniques utilisées dans cette étude (Saadi H et al., 2006). Pour les systèmes HPA-3 et HPA-5 les fréquences alléliques sont très proches de celles observées chez les berbères Marocains et les Marocains. Cela s'explique par le fait qu'une partie de notre population est d'origine berbère et aussi par l'immigration d'un certain nombre d'algériens et de marocains à notre pays. Pourtant, on a remarqué une certaine différence avec les fréquences alléliques rapportées dans les pays africains subsahariens. Les pays subsahariens présentent des valeurs élevèes pour le HPA-1a, en comparaison avec ceux du nord du continent. Il existe toujours un échange génique plus ou moins important entre populations voisines.

Tableau XIX Fréquences alléliques HPA-1 à 5 dans quelques pays européens.

D'après la comparaison des frèquences des differents systèmes etudiés faite à l'aide du logiciel SAS, on remarque que les valeurs rapportées chez l'Espagne et la Suisse sont les plus proches de celles observées chez notre population. Cela peut etre demontré par les relations historiques trés anciennes qui ont relié la Tunisie et l'Espagne.

Tableau XX Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 dans quelques populations asiatiques :

D'après la comparaison des frèquences des differents systèmes etudiés faite à l'aide du logiciel SAS, on note que, de tous les pays asiatiques, l'Arabie Saoudite présente les fréquences les plus proches de celles rapportés chez la population Tunisienne. Cela s'explique par l'appartenance des deux populations frères au cadre de communauté arabo-musulmane l'origine arabe de la plus part des tunisiens.

Tableau XXI Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 dans quelques pays américains.

Après comparaison des fréquences alléliques des systèmes étudiés, on signale que les fréquences du système HPA-2 chez la population tunisienne sont très proches de celles observées chez les Américains Noirs.

Tableau XXII: Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 chez quelques pays de l'Océanie.

On remarque que les fréquences alléliques du système HPA-1 rapportées chez la population Australienne sont proches de celles de la population Tunisienne.

On a remarqué d'après les comparaisons des fréquences alléliques des systèmes HPAs entre les différentes populations que quelques populations vivant dans les mêmes régions ont des fréquences très proches pour quelques systèmes. De même, d'autres populations appartenant à des régions tout à fait distinctes pourraient aussi avoir des fréquences proches. Par exemple, on s'aperçoit que pour le système HPA-2 les fréquences observées chez la population tunisienne sont très proches de celles rapportées chez les Américains Noirs malgré la distance qui sépare la Tunisie de l'Amérique et l'absence de forte relations historiques directes entre ces deux pays.

Il nous été montré que, pour les populations africaines, les fréquences alléliques du Cameroun sont les plus proches de celles trouvées chez la population tunisienne. C'est le cas de l'Arabie Saoudite pour les populations asiatiques et de l'Espagne pour les populations européennes.

Bien que les polymorphismes du gène de quelques marqueurs génétiques tel que le polymorphisme du gène de l'inhibiteur l'acétylcholinestérase, (Wiwanitkit. V. 2003; Wiwanitkit. V. 2005), parmi les populations dans les mêmes régions a été démontré, nous n'avons pas trouvé cette observation dans le polymorphisme des gènes HPAs. Décisivement, c'est tout à fait difficile d'utiliser les gènes HPAs comme marqueurs génétiques pour déterminer la ressemblance entre les différentes populations. Bien qu'il y ait une légère variation entre les populations, ce n'est pas une différence discrète.

Ces études du polymorphisme plaquettaire parmi les différentes populations fourniraient de nouvelles données pour l'hématologie géographique, ces études qui si loin ont été basées sur les polymorphies érythrocytaires, leucocytaires et du sérum.

Cette étude nous a permis de montrer que la population tunisienne est à l'état d'équilibre panmictique pour les locis des systèmes étudiés selon la loi de H-W.

Les données présentes indiquent que la population tunisienne se caractérise par un haut taux de mélange ethnique, ce qui montre que notre population fait face à un haut risque d'allo-immunisation anti-plaquettaire pour les systèmes : HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5.

L'étude du polymorphisme allélique des HPAs s'est avérée importante pour les études génétiques, biologiques et anthropologiques. D'ailleurs, elle permet la déduction du flux des gènes et la constitution génétique de la population, mais surtout la prédiction du risque d'allo-immunisation anti-plaquettaire. Elle aidera à anticiper la dimension et les causes de la NAIT dans notre communauté par la définition des allo-antigènes les plus probables qui soient impliqués dans ce phénomène.

Ce travail nous a permis de montrer la nécessité de vulgariser le génotypage des antigènes plaquettaires afin de réduire la survenue de l'allo-immunisation transfusionnelle ou foeto-maternelle d'origine plaquettaire. D'ailleurs, pour une population donnée, la connaissance des fréquences alléliques nous fournit des informations précises concernant les conditions cliniques spécifiques telles que la NAIT et le PTP, sur les capacités du diagnostic de la NAIT, la prévention de l'hémorragie intracrânienne des foetus et nous procure plus d'informations pour des traitements exacts des transfusions plaquettaires incompatibles. Ainsi la caractérisation du système plaquettaire à l'origine de l'incompatibilité foetomaternelle est susceptible d'améliorer la connaissance de la distribution géographique de cette affection et sa prise en charge.

Ainsi, les pédiatres, les biologistes et les spécialistes en santé publique, les obstétriciens et les personnels de la médecine transfusionnelle sont appelés à exploiter ces résultats dans leurs laboratoires et services pour le diagnostic définitif des cas de NAIT et PTP et leur traitement pendant la période néo-natale. D'ailleurs, l'agrément reçu pour la réalisation de tests de diagnostic prénatal dans le domaine des thrombopénies et thrombopathies lui permet de participer directement à la prise en charge de grossesses à haut risque.

Au cours de ce stage, j'ai pu faire un pas de plus en direction du monde de la recherche en m'immergeant dans la vie d'un laboratoire, en observant son fonctionnement, ses difficultés et ses bons moments. Cette expérience me fut très enrichissante et a confirmé mon goût pour la recherche scientifique.

Durant ce stage, je n'ai fait que commencer le travail que je devrais continuer par la suite. Car je me propose de poursuivre et d'approfondir cette étude en :

- Elargissant la taille de population et en introduisant d'autres sous populations comme les berbères, les noirs et les juifs. Ainsi, l'échantillon devient représentatif et les résultats qui seront obtenus seront proches de la réalité. Cela nous permettra d'évaluer plus précisément la signification clinique des systèmes HPA en Tunisie.

- Introduisant des malades incluant les cas de (NAIT), de PTP et de PTR pour dégager le ou les systèmes les plus impliqués dans ces réactions immunologiques.

- L'étude de la distribution des fréquences des HPAs et leurs associations avec NAIT, PTP et les autres désordres.

- La recherche des valeurs réelles du risque d'alloimmunisation chez notre population on introduisant les autres facteurs qui intervient dans les phénomènes d'alloimmunisation.

- Etudiant l'association des antigènes HPAs et les antigènes HLA pour déduire l'implication de ces deux systèmes dans les réactions alloimmunes tel que l'association entre l'alloimmunisation anti HPAs et l'haplotype DRB13*.

- Etudiant les fréquences alléliques des différents gènes des systèmes HPA qui restent et donc de définir l'haplotype des systèmes plaquettaires en Tunisie par la mise en oeuvre d'autres techniques telle que la PCR en temps réel.

- La recherche de nouveaux antigènes plaquettaires à travers l'étude de l'ADN des nouveaux nés et des patients qui montrent des réactions alloimmunes post transfusionnelles par le séquençage et par la comparaison de l'ADN étudié avec les séquences d'ADN fournies par les banques de donnés disponibles.

- L'étude de la toute nouvelle mutation découverte par Santoso en 2006 Leu33Val de l'intégrine â3 chez la population tunisienne qui peut être impliquée dans les cas de NAITP.

- Entrer en coopération avec d'autres groupes de spécialistes tunisiens et étrangers/d'origines différentes en la matière non seulement à l'échelle régionale mais aussi nationale et internationale car cela est indispensable à la progression des connaissances et des techniques dans les domaines d'immunologie plaquettaire, de biologie moléculaire et d'immuno-pathologie plaquettaire au cours de la grossesse et de son retentissement foetal, qui évoluent sans cesse.

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