I. MATÉRIEL
Notre étude a porté sur un échantillon de
111 donneurs de sang Tunisiens, pour le système HPA-1, 105 pour le
système HPA-2, 104 pour le système HPA-3, 102 pour le
système HPA-4 et de 100 donneurs de sang pour le système HPA-5.
Les échantillons sanguins choisis au hasard sont constitués de
donneurs de sang volontaires au (CNTS) de Tunis. Ces donneurs sont sans lien de
parenté, ne souffrant d'aucune pathologie apparente. Ils sont des deux
sexes, sont de différents âges et pourraient appartenir à
de différentes générations (l'age d'une
génération est de 25 ans).
II. MÉTHODES
Les polymorphismes des gènes des HPA-1, - 2, -3, -4 et
-5 résultant d'un SNP au niveau d'un brin codant de l'ADN, ont
été déterminés par la technique PCR-SSP.
II-1.
Prélèvement du sang
5 ml (1ml de sang renferme 30 à 50 ug d'ADN) dé
sang périphérique ont été prélevés
sur un anticoagulant EDTA, chez chaque sujet. Après
déplasmatisation, le culot globulaire a servi pour extraire l'ADN
génomique.
II-2. Extraction de L'ADN génomique
total
II-2.1. Principe :
L'ADN utilisé comme matrice d'amplification pour les
réactions PCR a été extrait par la technique du relargage
des protéines à force ionique élevée : la
technique de salting-Out (Technique au chlorure de calcium saturé)
(Miller. S. A et al., 1988). Le sang doit être initialement et
vigoureusement mélangé à une solution hypotonique pour
faire éclater les globules rouges par une solution hypotonique
(SLR : tris-HCl 10 Mm pH 7,5 ; MgCl2 5 Mm ; NaCl 10
Mm). Le lysat est centrifugé et, après élimination du
surnageant, le culot cellulaire contenant les leucocytes est traité par
une solution de lyse de GB (SLB) et une solution de protéinase
très active, la protéinase K qui digère les
protéines cellulaires. Ces dernières seront par la suite
relarguées par l'intermédiaire d'une force ionique du NaCl (6 M).
En fin, la précipitation de l'ADN génomique est effectuée
en utilisant une solution d'éthanol absolu à froid (-20 °C)
(Delpech. M et al., 1999; Raisonnier. A et al., 2002).
II-2. 2. Protocole expémental
1- Lyse des globules rouges
Après déplasmatisation de l'échantillon
sanguin, on complète les crachoirs à 50 ml avec la (SLR) en les
agitant avec le vortex afin de faciliter la lyse des globules rouges. On les
centrifuge 10 mn à 2600 trs/mn à température ambiante. On
élimine avec précaution, le surnageant. On répète
l'opération précédente 2 fois. S'il y a des
hématies qui persistent dans le culot, on effectue un lavage
supplémentaire jusqu à avoir un culot de blanc blanchâtre
dépourvu des globules rouges (sinon on met le culot au
congélateur pendant au moins 2 h). On élimine totalement le
surnageant de SLR.
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