Memoire Online - Dynamique de la faune culicidienne sur le campus de l'université de Yaoundé I (Cameroun)

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET PHYSIOLOGIE ANIMALES
DEPARTMENT OF ANIMAL BIOLOGY AND PHYSIOLOGY

Présenté et soutenu en vue de l'obtention du Diplôme d'Etudes
Approfondies (DEA) en BIOLOGIE ANIMALE

KAMGANG MBOUHOM David Basile
Maître es Sciences, option : Parasitologie
Matricule : 98X310

Pour leur affection et leur encouragement, qu'ils trouvent ici le fruit des prières et des sacrifices consentis pour moi.

Au moment où j'achève la rédaction de ce travail réalisé au Laboratoire de Recherche sur le Paludisme de l'OCEAC, je ne saurais m'empêcher d'exprimer ma reconnaissance à tous ceux qui y ont contribué de près ou de loin. Je pense particulièrement à :

- Dr Jean-Jacques MOKA, secrétaire général de l'OCEAC pour m'avoir accordé un stage académique dans cette institution;

- Drs Parfait AMBENE-AWONO, Christophe ANTONIO-NKONDJIO et Josiane ETANG pour leurs critiques et leurs suggestions;

- Dr Luc SIGHA, chercheur à l'Institut de la Recherche Géologique et Minière (IRGM) pour m'avoir donné un pluviomètre ;

- monsieur Philippe BOUSSES pour ses critiques pertinentes et ses suggestions; - Dr Isabelle MORLAIS pour sa rigueur et ses conseils ;

- tous les enseignants du département de Biologie et Physiologie Végétales, du département de Science de la Terre et du département de Biologie et Physiologie Animales de l'Université de Yaoundé I pour la qualité de l'enseignement dont ils nous ont fait bénéficier tout au long de notre cursus universitaire ;

- MM. Roger BEYENE, Jean Claude TOTO et Elysée NCHOUTPOUEN pour m'avoir initié aux techniques d'échantillonnage des moustiques et à l'utilisation des clés d'identification morphologique des Culicidae ;

- MM. Jean-Pièrre AGBOR, Sylvie KEMLEU et Rose NYAMBAN pour m'avoir initié aux différentes techniques de biologie moléculaires et biochimiques ;

- MM. Philippe NWANE, Collince KAMDEM et Mouhamadou CHOUAIBOU pour leur assistance technique et leurs suggestions;

- M. Joachim ETOUNA pour sa contribution à la réalisation de la carte présentant la zone d'étude et le relevé des positions GPS ;

- tous les résidents de la cité universitaire qui ont accepté que les enquêtes se déroulent dans leur chambre ;

- mes amis Alice MADAHA, Sandrine NSANGO, Judy NGALLIAKO, Aimé TOKEMNGONG, Christian WANDJI, Emmanuel PETGA, Magloire TONDA, Fabien KANA, Maurice NKAM, Françoise MADEN, Billy TENE, Bertrand NKOUEMOU et Daniel CHOLOM pour leur encouragement;

- mes camarades NAGA-NDONGO, Guy LEUKEFACK, Solange MEYIN, Charlotte GWET, Hermine MAHOT, Virginie OLOMOU, Ida MBARGA et Emmanuel ELANGA pour leur collaboration;

- je ne saurais terminer sans exprimer ma profonde gratitude à Mlle Mireille DZUKAM pour son soutien moral et ses encouragements qui m'ont été capitales dans les moments difficiles.

2.3. Mesure des paramètres climatologiques (température, hygrométrie et pluviométrie) 22

2.6.2. Identification moléculaire des anophèles du complexe Anopheles gambiae 25

3.1.2.4 Variation des effectifs de Culex quinquefasciatus en fonction de la pluviométrie. 41

Annexe 2 : Séquences des amorces utilisées pour l'identification des espèces du complexe Anopheles gambiae et représentation schématique du test diagnostic de 3 espèces du

Figure 1 : Particularités morphologiques des principaux genres de Culicidae d'intérêt médical

Figure 2 : Morphologie générale des Culicidae adultes (Lane et Crosskey, 1993) 8

Figure 3 : Développement de Plasmodium falciparum chez l'anophèle (A1), chez l'homme

Figure 4 : Zone d'étude et localisation des points de collecte des données entomologiques 21

Figure 6 : Récolte des moustiques après pulvérisation intra-domiciliaire d'insecticide 24

Figure 9 : Cycles des températures d'une PCR pour l'identification des espèces et des formes

moléculaires d'An. gambiae s.s (Fanello et al., 2002) 29
Figure 10 : Photographie d'un gel montrant l'identification de An. gambiae s.s de forme

moléculaire M 30
Figure 11 : Distribution mensuelle des précipitations et variation de la température extérieure

et du taux d'hygrométrie sur le campus de l'Université de Yaoundé I de mars 2005 à

février 2006 35
Figure 12 : Variation mensuelle des effectifs de Cx. quinquefasciatus en fonction de la

Tableau 1 : Caractères morphologiques distinctifs des espèces identifiées (Gillies et De

Meillon, 1968 ; Gillies et Coetzee, 1987 ; Jupp, 1996) 37
Tableau 2 : Composition du milieu réactionnel d'une PCR pour l'identification des espèces

du complexe An. gambiae (Scott et al., 1993) 29
Tableau 3 : Composition du milieu réactionnel pour la digestion enzymatique de l'ADN

d'An. gambiae s.s (Favia et al., 1997) 30
Tableau 4 : Effectif et composition de la faune culicidienne échantillonnée sur le campus de

l'Université Yaoundé I de mars à décembre 2005 38
Tableau 5 : Caractérisation et localisation des différents gîtes larvaires potentiels prospectés

BSA : bovine serum albumine CDC : center for diseases control CSP : circumsporozoïtic protein dNTP : dinucléotide triphosphate

EDTA: ethylene diamine tetra-acetic acid ELISA: Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

OCEAC : Organisation de Coordination pour la lutte contre les Endémies en Afrique Centrale OMS : Organisation Mondiale de la Santé

RESUME

La lutte contre les maladies à transmission vectorielle est basée en grande partie sur le contrôle des vecteurs. Pour rendre cette lutte efficace, la connaissance de la biologie et de la taxonomie des vecteurs est indispensable.

De mars à décembre 2005, nous avons effectué un suivi longitudinal en vue d'échantillonner la faune culicidienne présente sur le campus de l'Université de Yaoundé I. Les moustiques provenaient des collectes trimestrielles des stades pré-imaginaux dans treize gîtes larvaires sur le campus et des captures mensuelles des adultes grâce au piège lumineux CDC dans quatre chambres et aux pulvérisations intra-domiciliares d'insecticides dans six chambres de la Cité Universitaire. Au total, 1213 moustiques adultes ont été capturés dont 381 au moyen de pièges lumineux et 832 issus de la faune résiduelle matinale. Au total, douze espèces culicidiennes ont été identifiées: Culex quinquefasciatus, Cx. univittatus, Cx.duttoni, Cx. guiarti, Cx. decens, Cx. chorleyi, Cx. tigripes, Cx. poicilipes, Mansonia africana, M. uniformis, Aedes albopictus et Anopheles gambiae. Les espèces Cx. chorleyi, Cx. poicilipes, Cx. guiarti et Cx. tigripes n'ont été récoltées qu'aux stades pré-imaginaux et les espèces Ma. africana et Ma. uniformis au stade adulte.

Les moustiques récoltés au stade adulte sont composés à 96,9% de Cx. quinquefasciatus. An. gambiae, le seul vecteur du paludisme identifié, ne représente que 0,5% de la faune adulte. La détermination de l'infection des anophèles par le test ELISA CSP n'a pas révélé la présence de la protéine CSP dans les glandes salivaires des femelles testées. Le faible effectif des anophèles récoltés (6 individus) ne permet pas de conclure. L'analyse par PCR des membres du complexe An. gambiae a révélé la seule présence d~An. gambiae s.s de forme moléculaire M sur le campus universitaire.

ABSTRACT

The fight against vector borne diseases is based largely on vector control. For this fight to be more efficient, knowledge of the biology and the taxonomy of vectors is needed.

From march to december 2005, we performed longitudinal survey in order to sample Culicidae fauna present on the campus of the University of Yaoundé I. Mosquito's came of the quarterly collections of immature stages in thirteen breeding sites on the campus and the monthly captures of adults using CDC miniature light traps in four rooms and by spray in six rooms of the Academic City. A total of 1213 adult mosquitoes were captured, among which 381 by CDC miniature light traps and 832 by spray. To the total twelve Culicidae species have been identified: Culex quinquefasciatus, Cx. univittatus, Cx.duttoni, Cx. guiarti, Cx. decens, Cx. chorleyi, Cx. tigripes, Cx. poicilipes, Mansonia africana, Ma. uniformis, Aedes albopictus and Anopheles gambiae. Cx. chorleyi, Cx. poicilipes, Cx. guiarti and Cx. tigripes species have been collected at the immature stages and Ma. africana and Ma. uniformis species at their adult stage.

The adult fauna are composed to 96.9% of Cx. quinquefasciatus. Only malaria vector identified is An. gambiae, it is represents just 0.5% of the adult fauna. The CSP protein has not detected in the salivary gland of anopheles by ELISA CSP test. Low sample size (6 individuals) doesn't permit to conclude. Only the M molecular form of An. gambiae was observed.

Introduction

Les Culicidae regroupent l'ensemble des insectes diptères holométaboles communément appelés moustiques. Ils occupent l'ensemble des terres émergées à l'exception du continent antarctique et de quelques îles (Mouchet et Carnevale, 1991). Ils constituent le plus important groupe de vecteurs d'agents pathogènes transmissibles à l'homme. Les mâles et les femelles se nourrissent de jus sucrés, mais seules les femelles sont hématophages dans la plupart des cas. Au cours de leur repas de sang, elles peuvent transmettre les virus ou les parasites responsables de plusieurs affections telles que les arboviroses, les filarioses et le paludisme. Quatre principaux genres Mansonia, Culex, Aedes et Anopheles sont impliqués dans la transmission de ces pathogènes dans le monde dont trois Culex, Aedes et Anopheles en Afrique (Lane et Crosskey, 1993). Les larves de moustiques se développent dans les collections d'eau dont le type est variable suivant le genre et l'espèce. La plupart des moustiques vecteurs d'agents pathogènes à l'homme sont anthropophiles (se nourrissent sur l'homme) et endophiles (se reposent dans les habitations après leur repas de sang) ou exophiles (quittent rapidement les habitations pour gagner des refuges extérieurs après leur repas de sang) (Rhodain et Perez, 1985 ; Vicens et al., 1993 ; Mouchet et al., 2004).

De toutes les affections transmises à l'homme par piqûre de moustiques, le paludisme est celle dont la prévalence est la plus élevée (OMS, 2001). Il occasionne plus d'un million de décès chaque année dans le monde, Environ 80% des cas surviennent en Afrique au Sud du Sahara et l'immense majorité des victimes se compte parmi les enfants de moins de cinq ans (OMS, 2005).

Au Cameroun, le paludisme est responsable de 35 à 45% des décès dans les centres de santé, représente 42% de la morbidité chez les enfants de moins de cinq ans, 30% des hospitalisations et 26% des arrêts maladies, 40% des dépenses annuelles pour la santé des ménages (Samé-Ekobo, 2005).

En général, la lutte contre ces maladies à transmission vectorielle repose en grande partie sur le contrôle des vecteurs. Pour qu'elle soit efficace, cette lutte doit être sélective, spécifique et orientée contre les vecteurs cibles. A cet effet, il est important de bien connaître la bioécologie et la composition de la faune culicidienne dans une région donnée afin de mettre sur pied des méthodes de lutte efficaces.

Des études menées au Cameroun ont montré que l'urbanisation influence qualitativement et quantitativement la faune culicidienne (Fondjo et al., 1992 ; Antonio-Nkondjio et al., 2005; Samé-Ekobo, 2005). De nouvelles espèces de moustiques continuent à être décrites dans le

monde, la plus récente au Cameroun est Anopheles ovengensis (Awono-Ambéné et al., 2004), vecteur du paludisme. Il est aussi connu que certains paramètres météorologiques tels que les précipitations, la température et l'hygrométrie jouent un rôle sur le développement et la répartition des espèces de Culicidae dans le monde (Rodhain et Perez, 1985 ; Mouchet et al., 2004). A cet effet, nous nous sommes proposés d'effectuer une étude détaillée de la faune culicidienne associée à un relevé des données météorologiques. Cette étude a pour objectif général la contribution à la connaissance des Culicidae sur le campus de l'Université de Yaoundé I dans l'optique d'évaluer les risques de transmission de maladies en particulier le paludisme dans ce milieu. Pour y parvenir, trois objectifs spécifiques ont été fixés:

- identifier les différentes espèces de moustiques présentes sur le campus en utilisant différentes méthodes de capture (larves, adultes) ;

- caractériser la dynamique de ces populations dans le temps par un suivi longitudinal;

- évaluer le risque d'infection palustre par la recherche des Plasmodium dans les glandes salivaires des anophèles.

Chapitre 1 : Revue de la littérature

1.1. Les Culicidae

Les Culicidae sont des diptères holométaboles (à métamorphose complète) au corps recouvert de soies allongées ou d'écailles. Ils se développent à travers les stades Suf, larve et nymphe qui sont aquatiques avant d'atteindre le stade adulte aérien. Cette famille comprend plus de 3500 espèces réparties dans le monde (Eldridge, 2005).

1.1.1. Place des Culicidae dans le règne animal

La place des Culicidae dans le règne animal d'après Lane et Crosskey (1993) est la suivante Embranchement des Arthropodes:

- ailes repliées en arrière au repos. Super-ordre des Mécoptéroïdes : - pièces buccales de type suceur ou piqueur ;

Cette sous-famille comprend 3 genres (Bironella, Chagasia, Anopheles) parmi lesquels seul le genre Anopheles à une importance médicale.

Elle comporte 29 genres. Les principaux genres d'importances médicales sont les suivants. Genre Aedes Meigen 1818 :

1.1.2. Morphologie générale des Culicidae

Ils mesurent environ 1 mm de long (Lane et Crosskey, 1993), sont déposés à la surface de l'eau par les femelles, d'abord blancs puis deviennent bruns noirâtres. Selon les genres, ils peuvent être ovoïdes et pourvus de flotteurs latéraux chez les Anopheles (Fig. 1C) ou apicaux chez les Culex (Fig. 1A) ; subtriangulaires, à l'exemple du genre Aedes (Fig. 1B) ; sphériques chez les Toxorhynchites ou ont un filament terminal (Mansonia). Ils peuvent être pondus solément ou sous forme de radeaux.

Elle présente un corps nettement divisé en trois parties: la tête, le thorax, l'abdomen. Le thorax est beaucoup plus développé que la tête et l'abdomen, ce qui permet de distinguer les larves de moustiques de celles des autres diptères. La larve est apode. La tête est constituée d'un frontoclypeus médian et de deux plaques épicrâniennes latérales. Elle présente une paire d'antennes, deux yeux et deux brosses buccales. Les pièces buccales sont de type broyeur. Le thorax n'est pas apparemment segmenté. Des paires de soies longues ou courtes, plus ou moins ramifiées, s'y insèrent. Elles sont très utilisées en systématique. L'abdomen est constitué de dix segments. Le segment dix est pourvu d'une brosse ventrale. Le segment huit porte, dans les genres autres que celui des anophèles, un siphon respiratoire, de taille variable suivant les genres. Il est long chez les Culex (Fig. 1D), court chez les Aedes (Fig. 1E) et donc inexistant chez les Anopheles (Fig. 1F).

Elle est en forme de virgule ou de point d'interrogation. Sa tête fusionne avec le thorax pour constituer un ensemble très développé appelé céphalothorax. Deux trompettes respiratoires s'ouvrent dorsalement au niveau du céphalothorax. L'abdomen est constitué de dix segments dont huit sont visibles. Le segment huit porte deux palettes natatoires pouvant elles-même s'orner de denticules ou de soies. Il existe également de nombreuses soies sur les segments abdominaux.

Figure 1: Particularités morphologiques des principaux genres de Culicidae d'intérêt médical (Lane et Crosskey, 1993)

Le moustique adulte a un corps allongé, de 5 à 20 millimètres de long (Rodhain et Perez, 1985). Le corps comporte trois parties: la tête, le thorax, l'abdomen (Fig. 2)

Elle comprend deux yeux composés, de nombreuses ommatidies s'étendant sur les faces latérales mais aussi sur une grande partie de la face dorsale et sur la face ventrale. Entre les yeux s'insèrent deux antennes constituées de 15 articles chez les mâles, 16 chez les femelles. Chez les mâles, elles portent de longs et nombreux verticilles de soies (antennes plumeuses). Chez les femelles, les soies sont plus courtes et nettement moins nombreuses (antennes glabres). En dessous des antennes et de part et d'autre du proboscis se situent deux palpes maxillaires penta-articulés. Les palpes maxillaires sont longs, dilatés ou non à leur extrémité, suivant le genre et le sexe. Les six pièces buccales, transformées en stylets vulnérants, se disposent dans une gouttière formée par le labium pour constituer la trompe vulnérante. Le labium présente à son extrémité deux languettes mobiles appelées labelles.

Il est globuleux, composé de trois segments soudés: prothorax, mésothorax et métathorax, dont chacun présente une partie dorsale (tergum) et une partie ventrale (sternum), les pièces latérales étant des pleures. Sur chacun de ces segments s'insère une paire de pattes. Le mésothorax, très développé, porte en plus une paire d'ailes, une paire de stigmates et un prolongement appelé scutellum. Le métathorax porte une paire de stigmates et une paire de balanciers (ou haltères). Les pattes comprennent du corps vers l'extrémité : la hanche, le trochanter, le fémur, le tibia et un tarse subdivisé en cinq parties dont le dernier segment porte deux griffes et parfois un empodium et deux pulvilles. Les ailes comportent trois parties: l'allule et la frange alaire, de petites tailles et l'aile proprement dite plus étendue. La membrane de l'aile, transparente, est soutenue par des nervures longitudinales et transversales qui délimitent des cellules. En outre, ces nervures portent des écailles et le bord postérieur de l'aile est orné d'une frange d'écailles. Des écailles de formes, de couleurs et de dispositions variées, couvrent également les segments thoraciques et les pattes.

Il possède dix segments, dont huit visibles. Chacun d'eux présente une partie dorsale (tergite) et une partie ventrale (sternite), reliées par une membrane souple latérale. Ces segments sont ornés de soies et d'écailles de couleur et de disposition variées (écailles absentes chez les Anophelinae). Le dixième segment porte le génitalia pour le mâle (phallosome) et les cerques pour les femelles.

Figure 2: Morphologie générale des Culicidae adultes (Lane et Crosskey, 1993)

1.1.3. Identification des Culicidae

La différenciation des espèces de moustiques peut se faire de plusieurs façons. Les méthodes les plus utilisées se basent sur l'étude des caractères morphologiques, de la cytogénétique ou sur l'analyse de l'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction).

Cette technique est basée sur l'observation de critères morphologiques discriminants. A cet effet, plusieurs clés dichotomiques d'identification des stades pré-imaginaux et imago des Culicidae ont été établies. Pour la région Afrique, Edwards (1941), Hopkins (1952), Jupp (1996) ont défini les critères taxonomiques pour les Culicinae ; Gillies et De Meillon (1968), Gillies et Coetzee (1987), Awono-Ambéné et al. (2004), ont défini pour les anophèles. Hervy et al. (1998) ont proposé une clé informatisée des anophèles afrotropicaux sous forme de CD-ROM.

Dans les cellules nourricières des ovaires des femelles semi-gravides et les glandes salivaires des larves de stade 4 des Culicidae se trouvent des chromosomes polythènes (chromosomes géants qui ont 200 à 300 fois la taille des chromosomes au début de la mitose). Ces chromosomes dits polythènes présentent une succession de bandes sombres et claires après coloration à l'orcéine. Ces bandes peuvent servir de marqueur de l'espèce (Coluzzi et Sabatini, 1967 ; Coluzzi, 1968 ; Coluzzi, et al., 1985).

La technique de la polymérisation en chaîne (PCR) a été développée à la fin des années 1980 (Saïki et al., 1985). C'est une technique d'amplification sélective d'une séquence d'ADN flanquée par deux amorces (primers) de séquence connue. Elle permet d'obtenir un grand nombre de copies d'un segment particulier d'ADN appelé ADN cible qu'il est alors possible de caractériser et d'identifier.

L'application de cette technique permet d'identifier rapidement des spécimens de moustiques collectés sur le terrain à n'importe quel stade de développement (Scott et al., 1993). Plusieurs protocoles d'identification par PCR ont été mis sur pied. A titre d'exemple: on a ceux de Scott et al. (1993) et Fanello et al. (2002) pour les espèces du complexe Anopheles gambiae

(espèces morphologiquement très voisine, voire indifférenciables, dont l'identification demande souvent l'utilisation de critères mixiologiques, cytogénétiques, biochimiques ou moléculaires), Cohuet et al. (2003) pour les espèces du groupe An. Funestus, Kengne et al. (2003) pour les espèces du groupe An. nili.

* La technique d'électrophorèse des isoenzymes est basée sur la propriété qu'ont les molécules chargées de se déplacer dans un champ électrique, en fonction de leur charge et de leur masse vers l'anode ou la cathode. Ceci est le cas des enzymes qui sont des molécules chargées qui peuvent migrer sur un support où existe un champ électrique. L'inconvénient de cette technique est qu'elle ne s'applique qu'à du matériel vivant ou congelé à l'état frais (Miles, 1979).

* La morphométrie est basée sur la taille de différents appendices des Culicidae pour leur différenciation. Les espèces An. arabiensis et An. gambiae s.s ont pu être différenciées à partir des critères morphométriques à savoir la taille légèrement plus grande de la première espèce (Petrarca et al., 1998). Mais ce paramètre ne peut pas être utilisé comme critère diagnostique permettant l'identification des individus, car la taille des moustiques adultes dépend aussi de la nutrition aux stades larvaires.

1.1.4. Rôle vecteur des Culicidae

Les Culicidae constituent le groupe de vecteurs le plus important en santé publique. Ils sont impliqués dans la transmission de nombreux agents pathogènes. Pour qu'une espèce de moustique soit considérée comme vecteur d'agents pathogènes à l'homme, elle doit permettre le développement de l'agent pathogène (compétence vectorielle); elle doit avoir une grande longévité et être suffisamment abondante localement; elle doit être anthropophile. Les principaux vecteurs appartiennent aux genres Aedes, Culex et Anopheles.

Les femelles piquent essentiellement le jour et certaines espèces de ce genre sont impliquées principalement dans la transmission d'arboviroses.

L'espèce Ae. albopictus est connue comme étant le vecteur majeur de la dengue en Asie du Sud Est (Smith,1956; Rudnick et al.,1977) et dans plusieurs autres régions: La Réunion, Hawaï, Japon, Indonésie, Seychelles, Sud de la Chine, Thaïlande et Malaisie (Sabin,1952 ; Gould et al.,1968 ; Chan et al.,1971 ; Jumali et al.,1979).

Il a été montré également qu'il est le vecteur du virus du Chikungunya (Reiter et al., 2006), de l'encéphalite japonaise, du «Ross river virus»(Mitchell et al., 1987). Hormis ces arbovirus, Ae. albopictus peut aussi transmettre les filaires telles que Dirofilaria immitis des chiens à l'homme.

Ae. aegypti est le vecteur naturel de nombreux agents infectieux (Degallier et al., 1988). Cette espèce joue un rôle essentiel dans la transmission épidémique de trois arbovirus d'importance médicale majeure: c'est le vecteur principal interhumain de virus de la fièvre jaune, de la dengue (Chritopher, 1960 ; Galliard, 1931) et de la fièvre Chikungunya (Thonnon et al., 1999). La réceptivité des souches d'élevage d'Ae. aegypti vis-à-vis des filaires Brugia malayi et Dirofilaria immitis a été démontrée (Rodhain et Perez, 1985).

D'autres espèces telles que: Ae. furcifer, Ae. opok, Ae. neoafricanus, Ae. luteocephalus permettent la transmission du virus de la fièvre jaune des primates à l'homme en Afrique de l'Ouest; Ae. africanus est le vecteur naturel secondaire de la fièvre jaune de l'homme à l'homme et les espèces Ae. polynesiensis, Ae. pseudoscutellaris, Ae. tangae et Ae. vigilax sont impliquées dans la transmission des filaires apériodiques Wuchereria bancrofti pacifica

A la différence des Aedes à activité essentiellement diurne, les femelles de ce genre piquent essentiellement la nuit et sont impliquées dans la transmission de la filariose de Bancroft et de certaines arboviroses.

L'espèce Culex quinquefasciatus est largement répandue en Afrique Sub-saharienne. Il n'a pas de rôle vecteur en Afrique de l'Ouest ainsi qu'en Afrique Centrale mais il engendre partout une forte nuisance en milieu urbain. En Afrique de l'Est, il est vecteur de la filariose de Bancroft (Hamon et al., 1967). D'autres espèces telles que: Cx. bitaeniorhynchus, Cx. annulirostris et Cx. pipiens molestus en Asie, Cx. antennatus en Afrique sont également impliquées dans la transmission de cette filariose.

En ce qui concerne la transmission des arboviroses, l'espèce Cx. tritaeniorhynchus est le vecteur de l'Encéphalite Japonaise (Lane et Crosskey, 1993; Aubry, 2005) et d'autres espèces de Culex sont vecteurs de l'Encéphalite de Saint Louis, de l'Encéphalite Equine Américaine, de l'Encéphalite de la Murray et du virus de West Nile (Aubry, 2005).

Ce genre compte environ 450 espèces connues dans le monde, mais seules 70 à 80 sont impliquées dans la transmission du paludisme humain (Mouchet et al., 2004). Certaines d'entre-elles transmettent également des filarioses (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Brugia timori) et des arboviroses.

En Afrique, les espèces An. gambiae s.s, An arabiensis, An. funestus, An. nili et An. moucheti sont considérées comme des vecteurs majeurs de paludisme à Plasmodium falciparum. D'autres espèces comme An. pharoensis, An. hanchoki, An. melas, An. merus, An. paludis, An. coustani, An. rivulorum, An. brunipes, An. mascarensis jouent un rôle secondaire ou local dans la transmission du paludisme (Antonio-Nkondjio et al., 2002 ; Fontenille et al., 2003 ; Fontenille et Simard, 2004 ; Mouchet et al., 2004 ; Antonio-Nkondjio et al., 2005). A ces vecteurs secondaires s'ajoute une nouvelle espèce vectrice, An. Ovengensis, récemment découverte au Sud Cameroun (Awono-Ambéné et al., 2004). La répartition de ces vecteurs n'est pas uniforme sur le continent. An. gambiae s.s et An. funestus sont rencontrés un peu partout en Afrique, alors que An. moucheti et An. nili sont confinés dans la région forestière et périforestière et An. arabiensis en zone de savane (Gillies et De Meillon, 1968).

Les espèces An. funestus, An. gambiae, An. nili sont aussi impliquées dans la transmission de la filariose de Bancroft en Afrique tropicale (Gillies et De Meillon, 1968 ; Lane et Crosskey, 1993). En Asie du Sud les espèces An. barbirostris, An. donaldi, An. anthropophagus sont vecteurs des filaires Wuchereria bancrofti et Brugia malayi (Lane et Crosskey, 1993).

Le virus O'Nyong Nyong en Afrique subsaharienne est également transmis par les anophèles, plus particulièrement An. funestus et An. gambiae (Gillies et De Meillon, 1968).

1.1.5. Quelques données sur la faune culicidienne du Cameroun

Les études entomologiques antérieures réalisées au Cameroun ont permis de mettre en évidence environ 300 espèces de moustiques réparties dans 14 genres au Cameroun (Rageau et Adam, 1952 ; Rickenbach et al., 1976a ; Rickenbach et al., 1976b ; Hervy et al., 1998 ; Fontenille et Toto, 2001 ; Awono-Ambéné et al., 2004). La distribution de ces espèces sur l'ensemble du territoire varie d'un écosystème à l'autre.

Les espèces Ma. africana et Ma. uniformis sont les plus connues au Cameroun. Ce sont des
moustiques anthropophiles et très agressifs (Manga et al., 1992). Ces espèces se rencontrent
partout où se trouvent de grandes étendues d'eau peuplées de plantes aquatiques qui

permettent à leurs larves de se développer. Leur présence a été signalée dans toutes les provinces du pays (Rageau et Adam, 1952 ; Rickenbach et al., 1976a)

Plusieurs espèces de ce genre sont connues au Cameroun. Cependant, celles qui méritent une attention particulière sont Cx. quinquefasciatus et Cx. tigripes. Cx tigripes est la seule espèce au Cameroun dont les larves dévorent celles des autres Culicidae (Rageau et Adam, 1952). Cx. quinquefasciatus est l'espèce responsable de la plus grande part des nuisances culicidiennes en milieu urbain au Cameroun (Fondjo et al., 1992 ; Manga et al., 1992 ; Nimpaye et al., 2001). Les gîtes larvaires de ces espèces sont presque toujours constitués de collection d'eaux chargées de débris organiques (Rageau et Adam, 1952 ; Hougard et al., 1993 ; Barbazan et al., 1997 ; Fontenille et Toto, 2001).

Plusieurs espèces d'Aedes ont été signalées au Cameroun. Les espèces les plus étudiées sont Ae. aegypti, Ae. africanus et Ae. albopictus. Ae. aegypti est une espèce très domestique. Ae. africanus est une espèce présente en milieu forestier où elle est responsable de la transmission selvatique (primates) ainsi que interhumaine de la fièvre jaune en zone rurale (Vicens et al., 1993 ; Bouchite et al., 1995). Ae. albopictus a été signalé au Cameroun en 1998 (Fontenille et Toto, 2001), et son rôle vecteur n'est pas encore connu au Cameroun. Une mise à jour récente de la distribution d'Ae. aegypti et la première carte de distribution d'Ae. albopictus au Cameroun a été récemment par Simard et al. (2005).

Les larves de ce genre se développent généralement dans les creux d'arbres, les vieux pneus, les boîtes de conserves, les creux de rocher, les aisselles de feuilles engainantes, les cabosses de cacao (Rageau et Adam, 1952; Fontenille et Toto, 2001; Nchoutpouen, 2003; Simard et al., 2005).

C'est le genre le plus important en santé publique vu son rôle dans la transmission du paludisme et de la filariose au Cameroun. Les principales espèces sont An. gambiae s.s, An. arabiensis, An. funestus, An. moucheti, An. nili. L'espèce An. gambiae s.s est représentée au Cameroun par les deux formes moléculaires M et S (Wondji et al., 2002 ; Wondji et al., 2005). Cette espèce se rencontre sur toute l'étendue du territoire, sauf sur les montagnes où elle est absente à plus de 1500 m d'altitude (Manga et al, 1993). An. arabiensis est majoritairement, voire seule, présente dans la partie septentrionale du pays (Fondjo, 1996; Wondji et al., 2005). An. funestus se rencontre un peu partout tout au long de l'année et permet de pérenniser la transmission du paludisme. An. moucheti est présent dans la région

forestière et dans la savane post-forestière où elle s'étend jusqu'au 6° de latitude Nord (Mouchet et Gariou, 1966 ; Antonio-Nkondjio et al., 2002 ; Antonio-Nkondjio et al., 2005 ; Antonio-Nkondjio et al., 2006). An. nili est rencontré principalement au Sud Cameroun. Les anophèles exploitent une grande variété de gîtes larvaires. Ainsi les espèces An. gambiae s.s et An. arabiensis préfèrent les collections d'eaux claires et ensoleillées, An. funestus les lacs et étangs à végétation dressée, An. nili les rivières et fleuves à courant rapide, An. moucheti les fleuves à courant lent (Fontenille et al., 2003).

1.2. La transmission du paludisme.

Le paludisme encore appelé malaria, est une affection due à la présence dans le sang d'un parasite unicellulaire (protozoaire) du genre Plasmodium. La transmission de la maladie d'un homme infecté à un homme sain est assurée par la piqûre d'un moustique femelle du genre Anopheles. Le cycle de développement des Plasmodium implique deux hôtes: un vertébré (homme ou animal) et un invertébré (l'anophèle femelle) chez qui se déroule le cycle sporogonique ou sexué (Fig. 3A).

En effet, lors de la prise d'un repas de sang sur un Homme infecté, l'anophèle ingère différents stades érythrocytaires du parasite (corps en rosace, schizontes, gamétocytes). Dans l'estomac du moustique, les éléments asexués sont digérés. Le gamétocyte femelle s'arrondit et donne un unique gamète femelle, le gamétocyte mâle se divise en quatre gamètes mâles mobiles, de forme filamentaire. La fécondation du gamète femelle par le gamète mâle (12) donne un zygote (13) mobile, l'ookinète qui est le seul stade diploïde du cycle. Après la division méiotique, l'ookinète (14) traverse la paroi stomacale de l'anophèle, se fixe sous la paroi épithéliale et donne l'oocyste (15, 16) dans lequel s'individualisent les sporozoïtes. Une fois libérés dans l'hémolymphe après éclatement de l'oocyste (17), les sporozoïtes gagnent les glandes salivaires (18): la femelle est alors infectante et épidémiologiquement dangereuse (Fig. 3B). Les sporozoïtes seront transmis à l'homme lors d'un nouveau repas de sang du moustique. La durée de ce cycle varie de 10 à 40 jours suivant la température extérieure et les espèces en causes (Mazier, 1991).

Figure 3: Développement de Plasmodium falciparum chez l'anophèle (A1), chez l'homme

En un lieu donné, plusieurs facteurs influencent la transmission du paludisme du moustique à l'homme. L'estimation quantitative de cette transmission se fait à travers un certain nombre d'indices mathématiques calculés à partir des données recueillies lors des enquêtes entomologiques.

Encore appelée taux d'agressivité, elle est le produit de la densité anophélienne en relation avec l'Homme (m) et du taux d'anthropophilie (a). Elle s'exprime en nombre de piqûres d'anophèles par Homme par unité de temps. Elle s'obtient en capturant les anophèles venant piquer l'homme et en divisant le nombre d'anophèles capturés par le nombre de sujets utilisés, par unité de temps.

On obtient le taux de parturité d'une population anophélienne en calculant le pourcentage de femelles pares (qui ont pondu au moins une fois) par rapport au nombre total des femelles examinées. Une population anophélienne sera d'autant plus dangereuse épidémiologique ment que son taux de parturité sera élevé. En effet, seuls les anophèles pares sont susceptibles d'être infectantes.

Il permet d'estimer la longévité des vecteurs. Pour qu'un anophèle atteigne un âge épidémiologiquement dangereux, il faut que sa longévité soit supérieure à la durée du cycle sporogonique (cycle d'incubation extrinsèque) du Plasmodium. Ce taux est fonction de la proportion de femelles pares et de la durée du cycle gonotrophique (durée en jours séparant deux repas de sang successifs). Pour une population en équilibre,

Le taux d'infection (S) est la proportion de moustiques infectés dans une population. Il s'exprime sous forme de pourcentage (nombre de moustiques infectés sur nombre de moustiques examinés fois cent)

C'est le nombre de piqûres infectantes que reçoit un homme pendant une période donnée. C'est le produit du taux de piqûre par l'indice circumsporozoïtique (ou sporozoïtique).

C'est un paramètre qui permet de caractériser la pérennité de la transmission du paludisme dans une région donnée. Selon Mouchet et al. (1993), cet indice permet de distinguer :

* les zones à paludisme stable où la forte transmission entraîne une prémunition qui n'empêche pas les habitants d'être parasités, mais limite les manifestations cliniques aux classes d'âge les plus jeunes ;

* les zones à paludisme instable où le caractère épisodique de la transmission ne permet pas le développement de la prémunition, la maladie sévissant sous forme d'épidémie mortelle ;

L'espérance de vie (E) et l'espérance de vie infectante (Ei) sont calculées à partir du taux quotidien de survie selon la formule de Mac Donald (1957).

C'est un paramètre qui permet de prévoir, dans une population donnée, la proportion d'individus qui, après la prise d'un repas de sang infectant, vivra suffisamment longtemps pour transmettre le Plasmodium. Cet indice est le plus important paramètre de la transmission du paludisme, car la diminution de la valeur de ce paramètre est l'objectif visé par les campagnes de lutte antivectorielle.

Elle est définie comme le nombre de moustiques d'une population donnée qui deviennent infectants à partir d'un sujet infectant. C'est un paramètre qui permet d'évaluer la transmission Homme/anophèle et d'estimer l'impact d'une action de contrôle par exemple.

1.3. Lutte antivectorielle

La lutte contre les vecteurs vise à rompre la chaîne épidémiologique au niveau du vecteur, en réduisant la densité de vecteurs, leur longévité, l'intensité du contact Homme vecteur et/ou en réduisant la compétence vectorielle d'une espèce vectrice. Elle peut être dirigée contre les stades larvaires ou adultes. Les principales méthodes de contrôle des vecteurs sont :

- l'enlèvement ou la destruction des petits récipients tels que les boîtes de conserve, les bouteilles, les pneus ou coques de noix de coco qui peuvent servir de gîtes larvaires. C'est la méthode préconisée pour lutter contre les larves d'Aedes (OMS, 1999) ;

- l'élimination des gîtes larvaires par le drainage des eaux ou le remblayage des zones marécageuses ou des mares stagnantes est recommandé pour la lutte contre les larves des Anopheles, mais l'efficacité de cette technique est moindre car il suffit d'une petite flaque d'eau ensoleillée pour que An. gambiae qui est le vecteur majeur du paludisme en Afrique se développe ;

- l'utilisation des toxines bactériennes s'est avérée efficace contre les larves de Cx. quinquefasciatus en Afrique équatoriale (Hougard et al., 1993; Barbazan et al., 1997) ;

- le focardage des mares, étangs, lacs contribue à diminuer le nombre de Mansonia ;

- les aspersions intra-domiciliaires d'insecticides à effet rémanent tuent les anophèles ainsi que d'autres moustiques qui se reposent dans les habitations (endophiles) ;

- l'utilisation des répulsifs (baumes ou parfums qu'on applique sur la peau ou sur les vêtements, serpentins anti-moustiques, plaquettes insecticides à vaporisateur électrique) est efficace contre les moustiques endophages et exophages ;

- les pulvérisations spatiales avec des diffuseurs d'insecticides liquides dont les vapeurs sont toxiques pour les insectes volants ; ces aérosols ont été utilisés dans les grandes campagnes de luttes contre les Aedes lors des épidémies de dengue et fièvre jaune ;

- la pose des grillages à mailles très fines au niveau des portes, fenêtres, autres ouvertures des habitations pour empêcher la pénétration des moustiques adultes endophages tels que la majorité des anophèles vecteurs (OMS, 2003) ;

- l'utilisation des moustiquaires imprégnées d'insecticides est la méthode de choix préconisée par l'initiative «Roll Back Malaria» de l'OMS et recommandée par le Programme National de Lutte contre le Paludisme au Cameroun.

Chapitre 2. Matériel et méthodes

L'étude a été menée sur le campus principal de l'Université de Yaoundé I (Fig. 4). Il est situé en plein cSur de la ville de Yaoundé, au sommet de la colline Ngoa-Ekelle au lieu dit plateau Atemengue, dans l'arrondissement de Yaoundé III, dans le département du Mfoundi, avec pour coordonnées géographiques 32 hémisphère Nord à 777873 m du méridien central et à 426826 m de l'équateur.

La superficie du campus occupée est d'environ 59 hectares, y compris les terrains de sport (DIDP).

La couverture pédologique est formée de sols ferrallitiques rajeunis avec érosion et remaniés, intimement associés à des sols minéraux bruns et à des sols peu évolués (Valerie, 1995).

La végétation est composée essentiellement de graminées. Les formations herbacées hydrophiles poussent dans les bas fonds marécageux. On note la présence d'arbustes, d'arbres fruitiers, de plantes ornementales, et d'espaces cultivables par endroits.

Le climat est équatorial de type guinéen avec en moyenne 1500 à 1600 mm de pluie par an, réparties en quatre saisons : une grande saison sèche de mi-novembre à mi-mars; une petite saison des pluies de mi-mars à fin juin ; une petite saison sèche de juillet à août et une grande saison des pluies de septembre à mi-novembre. Les températures moyennes varient entre 18,9 et 27,9°C (Suchel et Tsalefack, 1995). L'hygrométrie moyenne mensuelle est toujours supérieure à 70% (Omoko, 1984).

Le relief est accidenté avec une altitude moyenne de 750m, et un bas fond marécageux où se trouvent les étangs, les bassins de piscicultures et où sont drainées les eaux de ruissellement ainsi que les eaux usées provenant du campus (restaurant, cité universitaire, laboratoires). On note par endroit des collections d'eau stagnante, parfois très polluées et/ou riches en matière organique; un manque de système de drainage des eaux et un centre d'épuration des eaux usées non fonctionnel. Un ruisseau permanent traverse le campus.

L'étude s'est déroulée de mars 2005 à février 2006. Le choix des gîtes larvaires a été fait après la première descente sur le terrain, au cours de laquelle différents types de gîtes potentiels ont été prospectés ; tous ceux qui ont été positifs (présence de la larve de moustique) ont été retenus. Ainsi, un suivi a été fait dans 13 gîtes tous les trois mois. La capture des moustiques adultes a été faite dans 10 chambres de la Cité Universitaire, dont 4 destinées à la capture au moyen des pièges lumineux et 6 pour la capture par pulvérisation intra-domiciliaire d'insecticide. Toutes ces chambres ont été choisies au hasard au rez-dechaussée dans 6 bâtiments de la Cité Universitaire avec le consentement des occupants.

2.3. Mesure des paramètres climatologiques (température, hygrométrie et pluviométrie) - La température et l'hygrométrie : les relevés hebdomadaires ont été effectués grâce à un thermo-hygromètre enregistreur qui indique la température et l'humidité ambiante et enregistre leurs valeurs maximales et minimales, l'appareil est resté sur le site en permanence pendant toute la durée de l'étude.

- La pluviométrie : les hauteurs des précipitations ont été relevées grâce à un pluviomètre à lecture directe gradué en millimètres. Les relevés ont été faits journalièrement.

L'échantillonnage des moustiques a été fait aux stades pré-imaginaux et adulte.

Les larves et/ou les nymphes ont été collectées à quatre reprises pendant les mois de mars, juin, septembre et décembre dans treize gîtes numérotés. La position de chaque gîte a été relevée dans la projection UTM et le système géodésique WGS84, grâce à un appareil GPS portatif.

La méthode de collecte utilisée est celle du «dipping» ou trempage (Service, 1993). Elle consiste à prélever l'eau du gîte à l'aide d'une louche ou d'un petit bac, puis y observer la présence des larves de moustiques. Elles sont alors prélevées à l'aide d'une pipette et transférées dans un récipient portant le numéro du gîte et contenant l'eau du gîte. Ensuite, les larves sont transportées à l'insectarium de l'OCEAC et mises en élevage avant identification.

Deux méthodes de capture ont été utilisées: la capture au moyen de pièges lumineux du type CDC avec un volontaire dormant sous moustiquaire non imprégnée et la capture par pulvérisation intra domiciliaire d'insecticide commercial au pyrèthre.

La capture a été effectuée de mars à décembre 2005 dans quatre chambres de la cité universitaire, à raison d'une nuit de collecte par mois. Le piège lumineux CDC pourvu d'une lampe à incandescence et d'un moteur est installé à environ 1,5 m du sol, auprès d'un lit couvert d'une moustiquaire non imprégnée d'insecticide (Fig. 5). Le volontaire dort sous la moustiquaire, à l'endroit habituel de son lieu de repos. Les moustiques qui entrent dans la chambre pour le piquer sont attirés par la lumière du piège (les autres lumières de la chambre étant éteintes) ; le moteur, en faisant tourner une petite hélice, aspirera les insectes attirés pour les refouler dans une cage en tulle. Ils seront collectés le lendemain et transportés au laboratoire pour identification.

La capture a été effectuée dans six autres chambres de la cité universitaire, à raison d'une matinée par mois pendant la même période. Pour ce faire, toutes les ouvertures sont fermées pour éviter que les moustiques ne s'échappent, puis des draps blancs sont étalés au sol. Après pulvérisation des bombes insecticides du commerce (Wanfu^®), on laisse s'écouler environ dix minutes ; puis, à l'aide des pinces fines, les moustiques tombés sur les draps sont prélevés et mis dans les boîtes de pétri (référencées) (Fig. 6) et transportés au laboratoire pour identification. Cette méthode nous permet de récupérer tous les moustiques dans une pièce bien fermée et d'évaluer la composition de la faune endophile.

Figure 5 : Piège lumineux type CDC Figure 6 : Récolte des moustiques après

Les larves récoltées ont été séparées en sous familles (Culicinae, Anophelinae). Les larves de Culex tigripes ont rapidement été isolées des autres Culicinae à cause de leur action prédatrice. Ensuite, ces larves ont été mises dans des bacs couverts de tulle moustiquaire, contenant l'eau de source et portant chacun une étiquette. Sur chaque étiquette, nous avons indiqué la sous famille et le numéro du gîte. Nous passions tous les matins les nourrir avec de la farine pour alevins (Tétra Min^® Baby), et trier les nymphes qui étaient transférées dans des boîtes en verre puis placés dans une cage couverte de tulle moustiquaire, en vue de l'émergence des adultes. Ceux-ci étaient nourris avec une solution de sucre à 10%.

A l'émergence, les moustiques adultes sont tués et montés sur minutie pour identification morphologique. Sur un moustique couché dorso-ventralement, on insère une minutie montée sur paillette au centre du thorax entre les deux pattes médianes. Puis, cette paillette est épinglée par une grosse aiguille sur laquelle on insère d'autres paillettes. Sur ces paillettes, on inscrit les informations se rapportant au moustique. Le moustique ainsi monté est identifié, référencé (Fig. 7), et conservé dans une boîte de collection.

Nous avons utilisé les techniques morphologiques classiques et les tests moléculaires pour les anophèles.

Les adultes issus de l'élevage et des captures ont été examinés sous la loupe binoculaire et identifiés à l'aide des clés d'identification morphologiques établies par Gillies et De Meillon (1968) et Gillies et Coetzee (1987) pour les anophèles, Edwards (1941), Jupp (1996) et par référence aux collections de l'OCEAC pour les Culicinae. Le tableau 1 présente les caractères morphologiques distinctifs de quelques moustiques adultes. Chaque anophèle identifié est placé individuellement dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant du silicagel (dessiccateur), puis il lui est attribué un numéro. Les anophèles ainsi collectés sont conservés à - 20°C. Ils seront utilisés pour les techniques de biologie moléculaire et de biochimie au laboratoire.

Tableau 1 : Caractères morphologiques distinctifs des espèces identifiées (Gillies et De Meillon, 1968; Gillies et Coetzee, 1987; Jupp, 1996)

Espèces	Caractères distinctifs
An. gambiae s.l	Palpe à trois bandes pâles; cinq taches pâles au niveau de la costa, dont deux basales; base de la première nervure pâle; pattes tachetées.
Ae. albopictus	Scutum avec une large ligne médiane argentée qui part de la marge antérieure jusqu'à la zone préscutellaire; scutum sans tache pâle à l'angle.
Cx. quinquefasciatus	Apex du proboscis souvent pâle; sternites blancs non bandés; tergites à bande basale pâle.
Cx. duttoni	Trompe avec un anneau pâle bien défini au milieu; soie mésépimérale inférieure présente ; tarses à anneaux pâles, tibia moyen avec une bande pâle antérieure.
Cx. tigripes	Moustique de grande taille; fémurs et tibias, excepté le fémur postérieur, portent en avant une rangée d'environ 10 petites taches pâles sur fond sombre.
Cx. chorleyi	Proboscis entièrement sombre; tergite avec une mince bande basale pâle incomplète sur certains segments.
Cx. decens	Ecailles scutales uniformément brun rougeâtre, palpe entièrement sombre chez le mâle ; tergite avec une large bande basale.
Cx. guiarti	Tergite sans bande basale ; abdomen avec taches pâles baso-latérales ; flagellum 3 et 4 plus courts que les autres.
Cx. univittatus	Fémur moyen avec une ligne pâle longitudinale ; fémur moyen avec une dorsale noire s'étendant jusqu' à l'extrémité basale du fémur; tergite avec une large bande basale confluente et une tache baso-latérale.
Cx. poicilipes	Trompe avec un anneau pâle bien défini au milieu; pas de soie mésépimérale inférieure ; fémurs et tibias avec des rangées de petites taches antérieures ; tarses à anneaux pâles aux articulations.
Ma. africana	Ecailles pâles du thorax formant des taches ; face antérieure des tibias portant des taches blanches bien séparées les unes des autres.
Ma. uniformis	Ecailles pâles du thorax formant deux bandes longitudinales; taches pâles des faces antérieures des tibias plus ou moins confluentes.

Les espèces et les formes moléculaires ont été identifiées par la technique de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism); celle-ci permet de déterminer simultanément les espèces du complexe An. gambiae ainsi que les formes moléculaires M et S lorsqu'il s'agit d~An. gambiae s.s. sur la base d'un polymorphisme de séquence observé sur l'ADN

ribosomal (Fanello et al., 2002). Cette méthode résulte de la combinaison des protocoles établis par Scott et al. (1993) et Favia et al. (1997). Cette technique d'identification par la biologie moléculaire comporte plusieurs étapes: la préparation du matériel biologique, l'amplification de l'ADN par PCR, la digestion enzymatique, l'électrophorèse et la révélation des bandes.

2.6.2.1. Préparation du matériel biologique

Le moustique est sorti de son tube de conservation et déposé sur une feuille de papier. Les pattes (2 pattes) sont coupées à l'aide des pinces fines et introduites dans un microtube portant le numéro du moustique. Le reste du moustique est remis dans le tube de conservation pour d'autres fins (ELISA CSP si le moustique a été capturé au stade adulte par exemple). Les pinces sont ensuite nettoyées avec du papier essuie tout, puis la dissection du moustique suivant nécessite une nouvelle feuille de papier pour éviter une éventuelle contamination. En effet, un tout petit fragment de patte peut donner l'ADN suffisant pour être à l'origine d'une contamination.

Les ailes ou un petit fragment de l'abdomen peuvent également être utilisés comme matériel de départ.

2.6.2.2. Protocole d'amplification par PCR (Scott et al., 1993)

La polymérisation en chaîne est basée sur le principe de la réplication de l'ADN double brin lors de la mitose (Clavel, 1993). Cette réaction se fait sur plusieurs cycles comprenant chacun 3 étapes:

- la dénaturation, phase au cours de laquelle l'ADN double brin est dénaturé en simple brin par l'augmentation de la température entre 90°C et 97°C (De Bruijn, 1988 ; Innis et Gelfand, 1990). En fonction de la longueur et de la composition en bases de la séquence d'ADN cible, cette phase de dénaturation dure de 15 à 30 secondes. En général, la dénaturation de tout le génome dure 5 minutes à une température de 94°C;

A chaque cycle 2ⁿ brins d^,ADN néoformés sont produits (n = nombre de cycles)

- l'hybridation, phase de refroidissement au cours de laquelle les amorces s'apparient (ou s'hybrident) à leur séquence complémentaire sur l'ADN cible. La température d'hybridation varie entre 50°C et 72°C. Elle dépend de la séquence et du nombre de nucléotides des amorces;

- l'élongation, au cours de laquelle chaque amorce fixée sur l'un des brins va s'étendre à partir de son côté 3' par juxtaposition de nucléotides (dNTPs) par l'ADN polymérase. L'élongation des amorces se fait en sens opposé en intercalant la séquence à amplifier. Elle dure de 30 secondes à 2 minutes et se déroule à une température de 72^°C.

Ces 3 étapes sont en général répétées 20 à 35 fois (Saïki et al., 1985; Tosi et Acuto, 1992) selon les quantités d'ADN de départ.

Le milieu réactionnel a été préparé comme l'indique le tableau 1. Cette solution a été distribuée dans des microtubes à paroi fine de 0,2ml (25ul par microtube), contenant au préalable deux pattes de moustiques. Les microtubes sont ensuite fermés et placés dans le thermocycleur pour l'amplification de l'ADN. La figure 9 représente les cycles des températures de cette amplification.

2.6.2.3. Protocole de la digestion enzymatique (Favia et al., 1997)

Le milieu réactionnel est préparé comme l'indique le tableau 2. Cette solution a été distribuée dans des microtubes à paroi fine de 0,2ml (15ul par micro tube). Dans chaque micro tube, nous avons ajouté 10ul de solution d'ADN amplifié. Les microtubes sont fermés et placés dans l'étuve (37°C) pendant 3 heures au minimum ou toute la nuit. Les fragments d'ADN amplifiés sont digérés avec une enzyme de restriction (Favia et al., 1997); cette enzyme (Hhal : Haemophilus haemoliticus) coupe le fragment au niveau des sites de restriction de la manière suivante.

Ainsi, la digestion de deux ADN différents pour un locus donné produit des fragments de longueurs différents dont la migration sur un gel d'agarose à 2% permet de déterminer les formes moléculaires M et S chez An. gambiae s.s.

Figure 9 : Cycle des températures d'une PCR pour l'identification des espèces et des formes moléculaires d'Anopheles gambiae s.s (Fanello et al., 2002)

Tableau 2 : Composition du milieu réactionnel d'une PCR pour l'identification des espèces du complexe An. gambiae (Scott et al., 1993)

Réactif	Concentration initiale	Concentration finale	Volume (ul) par tube
ddH2O			19,45
Tampon (+MgCl2)	10X	1X	2,50
dNTPs	5mM	0,2mM	1,00
UN*	10uM	5pmoles	0,50
AR*	10uM	5pmoles	0,50
GA*	10uM	5pmoles	0,50
ML*	10uM	5pmoles	0,50
Taq DNA polymérase ADN	5UI/ul pattes	0,25UI	0,05
Total			25,00

dNTPs : Dinucléotide triphosphates ; UN : Amorce universelle ; AR : Amorce arabiensis ; GA : Amorce gambiae ; ML: Amorce melas ; * : Séquence et taille des bandes présentées en annexe 2 ; ddH2O : Eau bi-distillée ; UI : Unité internationale ; X : concentration de la solution tampon.

Tableau 3 : Composition du milieu réactionnel pour la digestion enzymatique de l'ADN d'An. gambiae s.s (Favia et al., 1997).

Réactif	Concentration initiale	Concentration finale	Volume (ul) par tube
ddH2O			12,00
Tampon	10X	1X	2,50
BSA	10mg/ml	0,1mg/ml	0,25
Enzyme	10UI/ul	0,1UI/ul	0,25
ADN	ADN amplifié		10,00
Total			25,00

X : Concentration de la solution tampon; BSA: Bovine serum albumin; ddH2O : Eau bidistillée ; UI : Unité internationale.

Figure 10: Photographie d'un gel montrant l'identification de An. gambiae s.s de forme moléculaire M.

MT : marqueur de taille (100 pb) ; M : forme moléculaire M (367 pb) ; S : forme moléculaire

2.6.2.4. Technique d'électrophorèse

2.6.2.4.1. Principe

La technique d'électrophorèse consiste à faire migrer, dans un gel d'agarose, l'ADN amplifié ou digéré, sous l'influence d'un champ électrique. Cette migration est fonction de la taille du fragment d'ADN. Les molécules d'ADN chargées négativement vont migrer de l'anode (-) vers la cathode (+), les molécules de haut poids moléculaires se déplaçant moins vite que les molécules de plus faible poids moléculaires

2.6.2.4.2. Préparation du gel

- un gel à 2% pour déterminer les formes moléculaires M et S d'An. gambiae s.s.

Pour préparer le gel d'agarose à 1,5% (ou 2%), nous avons mesuré à l'aide d'une éprouvette graduée 100ml de tampon TBE 1X (Tris-borate-EDTA). Dans un erlenmeyer en verre, l'agarose (1,5 ou 2g) et le tampon ont été mélangés, puis portés à ébullition sur un agitateur magnétique chauffant (250°C) pendant 2 à 4 minutes, jusqu'à l'obtention d'une solution translucide ; celle-ci a été soumise à un refroidissement progressif par trempage dans un bac d'eau froide. A l'état tiède, nous y avons ajouté 5ul de BET (Bromure d'éthidium). Après agitation, le gel a été coulé dans une cuve sur laquelle ont été suspendus deux peignes. Laissé à la température ambiante pendant une heure environ pour polymérisation, le gel est ensuite débarrassé des peignes. On peut y observer des puits où seront déposées les solutions d'ADN amplifié ou digéré. Le gel est immergé dans une cuve de migration contenant du TBE 1X.

2.6.2.4.3. Distribution des échantillons et migration électrophorétique

Sur un morceau de parafilm, ont été déposées des gouttelettes de 2ul de bleu de charge (bleu de bromophénol 0,25% + bleu de xylène cyanol 0,25% + sucrose 4% + eau distillée) qui permet de maintenir l'ADN au fond du puit et de contrôler le front de migration. Ensuite, 10ul de chaque échantillon d'ADN amplifié ou digéré ont été prélevés et mélangés au bleu de charge puis déposés au fond du puit. L'embout de la pipette servant à la distribution des échantillons à analyser a été changé après chaque dépot. Puis, ont été déposés sur chaque rangée de puits: un témoin négatif où l'ADN est remplacé par de l'eau stérile; 3ul de marqueur de taille connu (Superladder-Low); 3 échantillons témoins d'espèces: An. gambiae

s.s., An. arabiensis et An. melas lorsqu'il s'agissait de l'identification des espèces; ou des échantillons témoins des formes M et S lorsqu'il s'agissait de la détermination des formes moléculaires d'An. gambiae s.s.

Enfin, notre cuve est fermée et reliée à un générateur de courant continu (140 volts-500mA); la migration dure 45 minutes.

2.6.2.4.4. Photographie et interprétation du gel

A la fin de la migration électrophorétique, les bandes correspondant aux fragments d'ADN de tailles différentes sont visualisées aux rayons ultraviolets grâce à la fluorescence des molécules de BET fixées sur les fragments d'ADN. Les différentes bandes obtenues sont comparées à celle du marqueur de taille et des différents témoins. Ceci permet de déterminer la taille des différents fragments d'ADN amplifiés ou digérés. La figure 10 représente la photographie d'un gel montrant l'identification de l'espèce An. gambiae s.s de forme moléculaire M.

L'infestation des anophèles femelles par Plasmodium a été mise en évidence par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui permet de détecter la protéine CircumSporozoïte de Plasmodium (CSP) dans les glandes salivaires des anophèles. Cette technique a été mise au point par Burkot et al. (1984) puis améliorée par Wirtz et al. (1987).

Il consiste à coupler la protéine CSP à un anticorps monoclonal de capture (ACm) anti-CSP préalablement fixé sur la paroi d'une plaque MAXISORP. Le complexe antigène anticorps formé est ensuite révélé par un ACm anti-CSP couplé à la peroxydase. L'adjonction d'un substrat qui sera dégradé sous l'action de l'enzyme produit une coloration visible et mesurable par densité optique.

La tête et le thorax de chaque moustique sont coupés et placés dans des tubes portant le numéro du moustique. Puis, on y ajoute 20ul de Np-40 (Nonidetp-40) pour faciliter l'extraction des protéines circumsporozoïtiques et le tampon de broyage à raison de 380ul de tampon par tubes. Ces broyats sont ensuite conservés au congélateur à -20°C. Chaque plaque ELISA est sensibilisée à raison de 50ul d'ACm de capture par puit et laissé incuber pendant

une nuit à +4°C; cette incubation permet l'adsorption de l'ACm sur les parois de la plaque. Le lendemain, les plaques sont vidées de leur contenu, puis 200ul de tampon BB (Blocking Buffer) sont mis dans chaque puit pour saturer les sites de fixation des ACm. Après une heure d'incubation à température ambiante, les plaques sont de nouveau vidées de leur contenu, puis 50ul de broyat de moustique sont ajoutés dans chaque puit. Le témoin négatif est constitué du tampon BB seul; quant aux puits des témoins positifs, 50ul de protéine circumsprozoïtique de l'espèce plasmodiale testée sont utilisés.

Après deux heures d'incubation les plaques sont vidées et lavées 2 fois au PBS/tween 20. Ensuite, une solution d'ACm conjugué à la peroxydase préparée 10 minutes avant la fin de l'incubation est ajoutée à raison de 50ul par puit. Après une heure d'incubation à température ambiante, les plaques sont de nouveau vidées et lavées 4 fois au PBS/Tween 20. Le substrat composé d'un mélange (ortho-tolidine, N,N-diméthyl formamide, tampon citrate, eau oxygénée) préparé 5 minutes avant la fin de l'incubation est ensuite distribué (100ul par puit). Les plaques sont ensuite conservées 30 minutes à l'obscurité. La dégradation du substrat sous l'action de la peroxydase se traduit par une coloration bleue. Cette réaction est stoppée en ajoutant 50ul d'acide sulfurique 4N par puit, ce qui donne une coloration jaune. La lecture s'effectue au moyen d'un spectrophotomètre à 450 et 650 nm. L'intensité seuil des positifs est fixée à 3 fois la moyenne des témoins négatifs. La composition des réactifs et les quantités utilisées sont présentées en annexe 3.

Au cours de ce travail, aucun moustique n'a été positif au test ELISA, par conséquent les autres indices n'ont pas pu être calculés.

Le degré de liaison entre la densité culicidienne (Cx. quinquefasciatus) et la pluviométrie a été évalué par le test du coefficient de corrélation linéaire. Elle permet d'établir les interrelations probables entre les différentes variables. Deux séries de variables sont plus ou moins fortement liées selon que r est plus ou moins proche de 1, avec 0 < r < 1. Le signe plus signifie que la relation entre variables est proportionnelle (corrélation positive). Le signe moins signifie que la relation entre variables est inversement proportionnelle (corrélation négative). Par convention, si r = 1, on parlera de corrélation parfaite; et si r = 0, on parlera de corrélation nulle.

Chapitre 3: Résultats et discussion

3.1. Résultats

Les données pluviométriques relevées en continu sur le terrain ont montré que la distribution annuelle des pluies a été bimodale, présentant 2 pics de pluies en avril et octobre (Fig. 11). De mars 2005 à février 2006, la pluviométrie totale a été de 1164,1 mm répartie sur 123 jours. Le mois le moins pluvieux a été juillet avec 26,6 mm de pluies et le plus pluvieux octobre avec 307,1 mm.

La température a très peu varié et a oscillé autour de la moyenne de 27,8^°C. Les températures les plus élevées ont été observées en mars (38,5°C), avril (38,2°C), mai (39,2°C) et les plus basses en juillet (21,3°C) et août (21,2°C). L'amplitude thermique a été plus faible de novembre 2005 à février 2006 (< 10^°C) que pendant les huit autres mois de l'étude où elle atteint 17°C en mai 2005.

Le taux d'hygrométrie est resté constamment supérieur à 60%, atteignant un maximum de 90% en septembre. Globalement, les variations du taux d'hygrométrie sont plus importantes pendant les mois les plus pluvieux.

Figure 11 : Distribution mensuelle des précipitations et variation de la température extérieure et du taux d'hygrométrie sur le campus de l'Université de Yaoundé I de mars 2005 à février 2006

Au cours de notre étude, douze espèces culicidiennes réparties dans quatre genres ont été récoltées. Le genre Culex à huit espèces: Cx. (Culex) quinquefasciatus Say 1823, Cx. (Culex) duttoni Theobald 1901, Cx. (Culex) univittatus Theobald 1901, Cx. (Culex) guiarti Blanchard 1905, Cx. (Culex) chorleyi Edwards 1941, Cx. (Culex) poicilipes Theobald 1903, Cx. (Culex) decens Theobald 1901 et Cx. (Lutzia) tigripes Degrandpré & Decharmoy 1900; le genre Mansonia à deux espèces: Ma. (Mansonioides) africana Theobald 1901 et Ma. (Mansonioides) uniformis Theobald 1901; le genre Aedes à une espèce: Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) 1894; le genre Anopheles à une espèce : Anopheles (Cellia) gambiae s.l. Giles 1902.

La richesse spécifique culicidienne a varié avec le stade de récolte ; c'est ainsi que dix espèces ont été identifiées à partir des larves récoltées dans différents gîtes et mises en élevage et sept espèces à partir de la capture des moustiques adultes (tableau 4). Les espèces Cx. univittatus, Cx. guiarti, Cx. chorleyi, Cx. poicilipes, et Cx. decens ont été obtenues uniquement à partir des collectes larvaires. Les espèces Ma. africana, Ma. uniformis ont été obtenues seulement au stade adulte dans les chambres de la cité universitaire. Les cinq autres espèces Cx. quinquefasciatus, Cx. univittatus, Cx. duttoni, Ae. albopictus, An. gambiae ont été collectées aux stades larvaires et adulte.

Tableau 4 : Effectif et composition de la faune culicidienne échantillonnée sur le campus de l'Université Yaoundé I de mars à décembre 2005

Espèces	Méthodes de capture
	Collectes larvaires *	Moustiques adultes
	Collectes larvaires *	Pièges lumineux	Spray	Total (%)
Cx.quinquefasciatus	596	371	804	1175 (96,9)
Cx. univittatus	31	1	8	9 (0,7)
Cx. duttoni	216	5	2	7 (0,6)
Cx. poicilipes	52	0	0	0
Cx. guiarti	63	0	0	0
Cx. tigripes	60	0	0	0
Cx. decens	208	0	0	0
Cx. chorleyi	154	0	0	0
Ma. africana	0	1	1	2 (0,2)
Ma. uniformis	0	1	2	3 (0,2)
Ae. albopictus	368	1	10	11 (0,9)
An. gambiae	464	1	5	6 (0,5)
Total	2215	381	832	1213 (100)

*: Les nombres dans cette colonne représentent les effectifs de moustiques identifiés au stade adulte, après émergence à l'insectarium.

Au cours de nos prospections larvaires, 13 gîtes ont été identifiés et caractérisés (tableau 5). Le relevé précis des coordonnées GPS (Geographical Positionning System) de chaque gîte nous a permis de répéter notre échantillonnage exactement au même endroit à chacune de nos quatre visites en mars, juin, septembre et décembre 2005. Au total, 2217 moustiques ont été identifiés après émergence (tableau 4) parmi lesquels 235 ont été montés sur minutie et conservés dans une boîte de collection au laboratoire.

Pendant les quatre périodes de récolte, la richesse spécifique culicidienne a varié d'un gîte à un autre. Cependant, certaines espèces ont été présentes dans la majorité des gîtes prospectés: Cx. quinquefasciatus (12 gîtes), Cx. tigripes (8 gîtes), An. gambiae (7 gîtes), Cx. duttoni (6 gîtes). L'espèce Ae. albopictus a été retrouvée dans deux types de gîtes (creux d'arbre et vieux pneu; gîtes n 3, 5 et 7 dans le tableau 5). Tous les gîtes où An. gambiae s.l a été récoltée étaient des collections d'eau plus ou moins claires et ensoleillées (gîte n° 1, 2, 4, 8, 10, 11 et 12 dans le tableau 5). Cx. quinquefasciatus était présent dans tous les gîtes à l'exception du gîte n° 8 qui est une flaque d'eau bien claire et ensoleillée (tableau 5).

Nous avons également noté une variation de la richesse spécifique et de la positivité de certains gîtes en fonction de la date de récolte. Ainsi, 3 gîtes; 5 gîtes et 4 gîtes ont été négatifs (absence de larve) respectivement aux mois de juin, septembre, décembre sur les 13 retenus pour l'échantillonnage des stades pré-imaginaux (tableau 5). L'absence des larves de moustiques dans certains gîtes larvaires prospectés au cours de la période de récolte était liée à l'absence d'eau dans les gîtes (c'est le cas du gîte 10 et 11 aux mois de septembre et décembre), de sa mise en place récente (c'est le cas du gîte 8 au mois de juin), à l'aménagement du milieu qui aboutit à la disparition du gîte (cas du gîte 3 au mois de juin, septembre, décembre) ou à la non stagnation des eaux rendant impossible le développement des larves (c'est le cas du gîte 9 aux mois de juin, septembre et décembre).

Tableau 5: Caractérisation et localisation des différents gîtes larvaires potentiels prospectés et distribution des espèces présentes de mars à décembre 2005

1 Bordure d'étang contenant de l'eau 777174 426808 718 Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus Cx. duttoni Cx. poicilipes

2 Bassin de pisciculture à eau claire, 777106 426888 721 Cx. tigripes Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus An. gambiae

3 Vieux pneu contenant une eau 777180 426677 720 Cx. quinquefasciatus Absence de larve Absence de larve Absence de larve

4 Bac de stockage piscicole ensoleillé

contenant une eau légèrement
chargée de débris organiques.

777184 426674 719 Cx. duttoni

An. gambiae

Cx. quinquefasciatus Cx. decens

An. gambiae

Cx. quinquefasciatus Cx. univittatus

Cx. poicilipes

An. gambiae

Cx. quinquefasciatus Cx. duttoni

Cx. tigripes

Cx. poicilipes

An. gambiae

5 Creux d'arbre à terre contenant une 777494 426719 756 Cx. duttoni Cx. chorleyi Cx. decens Cx. decens

eau chargée de débris organiques à Cx. tigripes Ae. albopictus Cx. quinquefasciatus Cx. tigripes

6 Creux d'arbre à terre contenant une 777490 426719 749 Cx. duttoni Cx tigripes Absence de larve Absence de larve

8 Flaque d'eau claire bien ensoleillée 777347 426528 732 An. gambiae Absence de larve An. gambiae An. gambiae

11 Bac à fleur mal entretenu contenant 777480 426559 768 Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus Absence de larve Cx. quinquefasciatus

13 Fosse contenant les eaux usées 777732 426570 761 Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus Cx. quinquefasciatus

** Les données GPS sont géocodées dans la projection UTM (Universal Transverse Mercator) et le système géodésique WGS 84. Tous nos gîtes sont situés dans l l'altitude se donnent en mètre.

Au cours de nos dix mois de récolte, 1213 Culicidae adultes ont été récoltés composés à 96,9% de Cx. quinquefasciatus (tableau 4). Les 3,1 % restant se répartissent entre les espèces Cx. duttoni, Cx. univittatus, Ae. albopictus, Ma. africana, Ma. uniformis et An. gambiae s.l. Parmi ces moustiques, 381 ont été capturés au moyen des pièges lumineux et 832 par pulvérisation intra-domiciliaire d'insecticides.

3.1.2.4. Variation des effectifs de Cx. quinquefasciatus adultes en fonction de la pluviométrie

La figure 12 montre la variation mensuelle des effectifs de Cx. quinquefasciatus en fonction de la pluviométrie. La variation des effectifs de Cx. quinquefasciatus a été inversement proportionnelle à la pluviométrie (r = -0,57). L'association entre ces deux paramètres est statistiquement significative p (ddl=8) < 0,05. Seules les données de Cx. quinquefasciatus ont été utilisés parce que la faune culicidienne est composée essentiellement par cette espèce. Les effectifs nuls observés au mois janvier et février sont dus à un problème logistique (les bâtiments étaient fermés pour réfection).

Un total de 224 An. gambiae s.l soit 219 issus des émergences et 5 capturés au stade adulte, ont été analysés pour l'identification des espèces et des formes moléculaires. L'analyse moléculaire a montré que tous étaient An. gambiae s.s de forme moléculaire M.

La protéine CSP a été recherchée par ELISA chez tous les anophèles collectés au stade adulte (6 individus). Aucune des femelles testées n'a révélé la présence de la protéine CSP dans les glandes salivaires.

Nombre de specimens de Cx.
quinquefasciatus
adultes collect& par session de capture

Figure 12 : Variation mensuelle des effectifs de Cx. quinquefasciatus en fonction de la pluviométrie

3.2. Discussion

Notre étude a permis d'identifier douze espèces culicidiennes dont la présence avait été déjà signalée au Cameroun dans la région de Yaoundé par Rageau et Adam (1952), Rickenbach et al. (1976b), Fondjo et al. (1992), Manga et al. (1992), Nimpaye et al. (2001), Fontenille et Toto (2001), Nchoutpouen (2003), Toto et Beyene (non publié). Les espèces culicidiennes obtenues des récoltes larvaires montrent qu'elles colonisent une large gamme de gîtes. Cx. quinquefasciatus a été retrouvée dans 12 des 13 gîtes prospectés. Ces gîtes sont constitués pour la plupart par des collections d'eau stagnante chargée de débris organiques. La présence de nombreux gîtes favorables au développement des Culex se justifierait par le niveau de pollution organique du milieu. Ces observations sont corroborées par les travaux de Darriet et al. (1986) qui ont montré que la forte présence de Cx. quinquefasciatus peut être considérée comme un marqueur biologique de l'urbanisation.

La présence d'An. gambiae s.l témoigne de la bonne adaptation de cette espèce au milieu urbain. Les mêmes observations ont été faites par Robert et al., 1986 ; Trape et Zoulani, 1987 ; Fondjo et al, 1992 ; Manga et al, 1992 ; Robert et al., 2003 ; Antonio-Nkonjio et al., 2005.

L'espèce Ae. albopictus a été retrouvée dans les creux d'arbres et les vieux pneus. Ces observations confirment celles de Fontenille et Toto, 2001, Nchoutpouen, 2003, Simard et al., 2005 qui ont montré que ceux-ci constituaient les gîtes de prédilection d'Ae. albopictus au Cameroun. Ae. aegypti vecteur urbain de la fièvre jaune au Cameroun (Vicens et al., 1993) n'a pas été retrouvé dans nos échantillons. Cette situation pourrait refléter le fait que depuis l'introduction d'Ae. albopictus au Cameroun, cette espèce tend à coloniser peu à peu les gîtes larvaires jusqu'ici occupés par Ae. aegypti et à entrer en compétition avec ce dernier. Une telle situation a été observée aux Etats Unis en 1985 où l'invasion d'Ae. albopictus a remplacé totalement Ae. aegypti (Hawley, 1988). Il est important de noter qu'Ae. albopictus est le principal vecteur de la dengue qui est une maladie en expansion dans le monde (Gubler, 1998) et constitue de ce fait un risque potentiel pour le Cameroun. Ae. aegypti est actuellement présent dans la partie septentrionale du pays, où Ae. albopictus est absent (Nchoutpouen, 2003 ; Simard et al., 2005).

La richesse spécifique de la faune culicidienne récoltée au stade adulte est peu différente de celle que Manga et al. (1992) ont observé à Obili, un quartier très proche de notre zone d'étude. Les quelques divergences observées entre notre étude et celle de Manga et al. (1992) tiennent essentiellement au fait qu'un certain nombre de spécimens n'ont pas été identifiés à

Obili, aux différentes méthodes de collecte utilisées et au fait qu'Ae. albopictus n'était pas encore présente au Cameroun en 1992.

La faune imaginale est composée à 96,9% de Cx. quinquefasciatus. La forte dominance de cette espèce est liée au niveau de pollution du milieu et à l'absence de système de drainage des eaux usées qui contribuent à sa pullulation. Des observations similaires ont été faites également par Fondjo et al. (1992) à Nkolbikock un quartier de Yaoundé, Diallo et al. (1998) et Diallo et al. (2000) à Dakar au Sénégal, Robert et al. (1986) à Diaradougou au Burkina Faso qui sont tous des milieux urbanisés. Ceci concorde avec les observations faites aux stades préimaginaux.

La présence des espèces Ma. africana et Ma. uniformis s'explique par la présence de l'étang naturel renfermant des végétaux dont les parties immergées sont favorables au développement de cette espèce. La faible proportion de ces espèces dans nos échantillons par rapport à celle de Manga et al. (1992) serait liée au focardage permanent de l'étang et aux techniques de capture utilisées. L'absence de cette espèce dans les récoltes larvaires est en effet liée à son écologie, car les stades préimaginaux vivent fixés sur les parties immergées des plantes aquatiques et la méthode de récolte que nous avons employée ne permet pas de les atteindre. Aedes albopictus a une activité essentiellement diurne et exophage (Hawley, 1988) et est donc forcément sous représenté dans la capture des adultes dans cette étude axée sur la collecte de moustique actifs la nuit (capture par piège lumineux) et endophiles (spray).

En accord avec les recommandations des différents comités d'éthique nationaux et institutionnels, nous avons choisi, dans ce travail, de ne pas utiliser la technique de collecte des arthropodes hématophages anthropophiles par capture directe sur sujet humain. Nous l'avons remplacée ici par la technique de capture au piège lumineux. Sur le plan qualitatif, les résultats obtenus au cours de notre étude avec cette technique sont comparables à ceux obtenus par la technique de spray, les mêmes espèces ayant été échantillonnées avec les deux techniques. Sur le plan quantitatif, les effectifs collectés restent faibles et il nous a été en particulier impossible de détecter une transmission palustre sur le campus en dépit d'un total de 40 équivalents homme nuit de capture (4 chambres fois 10 nuits). En effet, un seul anophèle a été collecté par cette technique équivalent à 0,03 piqûre par homme par nuit (pi/h/n). En mettant ce résultat en rapport avec nos efforts de capture et celui obtenu par la technique de capture direct sur sujet humain au quartier Dakar (Yaoundé) par Nimpaye et al., 2001 malgré le fait que les conditions environnementales ne soient pas exactement les mêmes, nous remarquons qu'avec un total de 192 équivalents homme nuit de capture (8 hommes fois 24 nuits), 728 anophèles avaient été récoltés, soit 4 piqûres par homme par nuit.

An. gambiae s.l ne représente que 0,5% de la faune culicidienne adulte alors que de nombreux gîtes larvaires productifs ont été observés. L'éloignement des gîtes des chambres destinées aux captures pourrait expliquer ce faible pourcentage. Les études sur la dispersion des anophèles ont en effet montré qu'ils se dispersent très peu en zone de forte densité de population humaine (Sebatineli et al., 1986 ; Trape et Zoulani, 1987 ; Manga et al., 1992 ; Robert et al., 2003).

L'absence des espèces Cx. poicilipes, Cx. guiarti, Cx. chorleyi, Cx. tigripes et Cx. decens dans les chambres découle également de leur biologie, car ces espèces sont exclusivement zoophiles et exophiles (Jupp, 1996).

La densité culicidienne (Cx. quinquefasciatus) a été maximale au mois de juillet quand la pluviométrie a été minimale. Ceci pourrait être dû au fait qu'en période de faibles précipitations, les gîtes qui sont pour la plupart des collections d'eaux stagnantes provenant de la cité universitaire, des restaurants universitaires et de divers laboratoires sont peu perturbés et propices au développement des larves de Culicidae. La densité culicidienne faible observée en octobre résulte de l'abondance des pluies qui ont contribué au lessivage des gîtes. L'interprétation des fluctuations d'abondance des Culicidae en fonction des régimes des précipitations doit aussi tenir compte de l'intervalle de temps qui existe entre les jours de pluie et les jours de capture, car les phases de développement larvaire du moustique peuvent durer de 8 à 12 jours (Rhodain et Perez, 1985).

L'étude taxonomique des anophèles du complexe An. gambiae par la technique de la biologie moléculaire a révélé la présence d'une seule espèce, An. gambiae s.s., en accord avec les observations de Wondji et al. (2005) quant à la distribution des espèces du complexe au Cameroun. La détermination des formes moléculaires M et S d'An. gambiae s.s montre que cette zone est colonisée uniquement par la forme moléculaire M, ce qui est similaire aux observations de Wondji et al. (2005) dans la région de Yaoundé. Plusieurs hypothèses pourraient être énoncées pour expliquer la présence exclusive de la forme moléculaire M dans notre population. Il peut s'agir de l'urbanisation du milieu (car les travaux de Wondji et al. (2005) ont montré que la forme M était prédominante en milieu urbain et périurbain), l'exclusion compétitive entre les deux formes (car ces mêmes travaux ont montré que même en zone de sympatrie une forme était toujours prédominante sur l'autre), l'isolement écologique (deux formes M et S colonisent les gîtes différents pour leur développement larvaire). Il serait intéressant d'étudier l'écologie larvaire de chacune des formes dans plusieurs localités afin de clarifier cette dernière hypothèse.

La détermination du taux d'infection des anophèles a été faite par la technique ELISA. La présence de la protéine CSP n'a pas été révélée sur les moustiques testés. Le très faible effectif de moustiques adultes collectés (6 individus) ne permet aucune extrapolation et nous pouvons seulement dire que la transmission du paludisme sur le campus est en dessous du niveau de sensibilité des méthodes que nous avons employées. Cependant, le vecteur majeur, An. gambiae est bien présent et les résidents sont donc exposés a un risque potentiel de transmission du paludisme. L'importation des parasites sur le campus est très probable car la population d'étudiants est très mobile et la durée de la phase infectante d'un porteur de gamétocytes pour les moustiques est compatible avec des déplacements sur de longues distances ou de longues périodes (Bousema et al., 2004 ; Boudin et al., 2004). De plus, l'origine géographique variée de la population estudiantine et des souches géographiques de Plasmodium falciparum qu'elle est susceptible de véhiculer pourrait favoriser localement la diffusion des chimiorésistances (Shanks et al., 2005). Les travaux antérieurs menés dans certains quartiers de la ville de Yaoundé ont montré que le taux d'infestation des anophèles varie de 1,2 à 5,2% (Manga et al., 1992 ; Fondjo et al., 1992 ; Nimpaye et al., 2001). La non infection des anophèles récoltés pourrait également être liée à la parturité de ceux-ci, car seuls les anophèles pares sont susceptibles d'être infectant ; nous n'avons pas en effet étudié ce paramètre au cours de notre étude. Les études parasitologiques et sociologiques nous permettraient très certainement de préciser l'épidémiologie du paludisme sur le campus. Il est important de rappeler que des observations entomologiques similaires à celle que nous avons observées ont été faites dans d'autres villes en Afrique subsaharienne par Robert et al. (1986) à Bobo-Dioulasso (Burkina Faso); Thompson et al. (1997) à Maputo au Mozambique; Diallo et al. (1998), Diallo et al. (2000) à Dakar au Sénégal et l'étude de la parasitémie a bien révélé la présence de sujets humains infectés. Il faut retenir qu'en Afrique subsaharienne des variations importantes du niveau de transmission existent entre les villes et entre différents quartiers au sein d'une même ville (Robert et al., 2003).

Conclusion et perspectives

Le travail que nous venons de présenter a été effectué sur le campus de l'Université Yaoundé I qui est un milieu urbanisé. Il avait pour objectif général la contribution à la connaissance des Culicidae sur le campus dans l'optique d'évaluer les risques de transmission de maladies, et en particulier du paludisme, dans ce milieu.

- la transmission du paludisme est sous le seuil de détection des méthodes entomologiques que nous avons utilisées ;

- le seul vecteur du paludisme identifié est An. gambiae de forme moléculaire M. En reconnaissant le fort potentiel adaptatif de cette espèce, il y'a un risque pour le futur ;

- la présence d'Ae. albopictus est une preuve supplémentaire de l'implantation de cette espèce au Cameroun jusqu'au cSur de la ville. Cette situation pourrait entraîner des changements dans l'épidémiologie d'arboviroses (dengue, ckikungunyia, fièvre jaune) pour lesquelles il est un bon vecteur potentiel.

Les informations obtenues de cette étude permettent d'envisager de nouvelles perspectives pour la surveillance des maladies transmises par la piqûre de moustiques. Ainsi, nous pensons, qu'il sera souhaitable :

- d'intégrer des méthodes complémentaires (études parasitologiques et sociodémographiques) et d'autres méthodes entomologiques plus spécifiques pour la surveillance, en particulier en zone de faible transmission ou transmission hétérogène;

- de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation des anophèles à leur environnement pour mieux prévenir leur expansion en zone urbaine ;

- d'évaluer le rôle vectoriel d'Ae. Albopictus au Cameroun en cherchant à isoler différents arbovirus des spécimens collectés sur le terrain.

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Annexe.

Annexe 1: Photos des différents types de gîte prospectés

Annexe 2:

- Séquences des amorces utilisées pour l'identification des espèces du complexe Anopheles gambiae

- Représentation schématique du test diagnostic de 3 espèces du complexe Anopheles gambiae d'après Scott et al. (1993)

Annexe 3: Réactifs et quantité pour ELISA-CSP

-NP40/BB = Nonidet P40 pour une plaque 2ml = 25ul NP 40 + 2 ml BB (blocking buffer), agiter (préparer pour 5 plaques 10 ml + 125 ul NP 40)