2.6.2.4.4. Photographie et interprétation du gel
A la fin de la migration électrophorétique, les
bandes correspondant aux fragments d'ADN de tailles différentes sont
visualisées aux rayons ultraviolets grâce à la fluorescence
des molécules de BET fixées sur les fragments d'ADN. Les
différentes bandes obtenues sont comparées à celle du
marqueur de taille et des différents témoins. Ceci permet de
déterminer la taille des différents fragments d'ADN
amplifiés ou digérés. La figure 10 représente la
photographie d'un gel montrant l'identification de l'espèce An.
gambiae s.s de forme moléculaire M.
2.7. Détermination de l'infestation des
anophèles
L'infestation des anophèles femelles par Plasmodium
a été mise en évidence par la technique ELISA
(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui permet de détecter la
protéine CircumSporozoïte de Plasmodium (CSP) dans les
glandes salivaires des anophèles. Cette technique a été
mise au point par Burkot et al. (1984) puis améliorée
par Wirtz et al. (1987).
2.7.1. Principe
Il consiste à coupler la protéine CSP à
un anticorps monoclonal de capture (ACm) anti-CSP préalablement
fixé sur la paroi d'une plaque MAXISORP. Le complexe antigène
anticorps formé est ensuite révélé par un ACm
anti-CSP couplé à la peroxydase. L'adjonction d'un substrat qui
sera dégradé sous l'action de l'enzyme produit une coloration
visible et mesurable par densité optique.
2.7.2. Protocole ELISA CSP
monospécifique
La tête et le thorax de chaque moustique sont
coupés et placés dans des tubes portant le numéro du
moustique. Puis, on y ajoute 20ul de Np-40 (Nonidetp-40) pour faciliter
l'extraction des protéines circumsporozoïtiques et le tampon de
broyage à raison de 380ul de tampon par tubes. Ces broyats sont ensuite
conservés au congélateur à -20°C. Chaque plaque ELISA
est sensibilisée à raison de 50ul d'ACm de capture par puit et
laissé incuber pendant
une nuit à +4°C; cette incubation permet
l'adsorption de l'ACm sur les parois de la plaque. Le lendemain, les plaques
sont vidées de leur contenu, puis 200ul de tampon BB (Blocking
Buffer) sont mis dans chaque puit pour saturer les sites de fixation des
ACm. Après une heure d'incubation à température ambiante,
les plaques sont de nouveau vidées de leur contenu, puis 50ul de broyat
de moustique sont ajoutés dans chaque puit. Le témoin
négatif est constitué du tampon BB seul; quant aux puits des
témoins positifs, 50ul de protéine circumsprozoïtique de
l'espèce plasmodiale testée sont utilisés.
Après deux heures d'incubation les plaques sont
vidées et lavées 2 fois au PBS/tween 20. Ensuite, une solution
d'ACm conjugué à la peroxydase préparée 10 minutes
avant la fin de l'incubation est ajoutée à raison de 50ul par
puit. Après une heure d'incubation à température ambiante,
les plaques sont de nouveau vidées et lavées 4 fois au PBS/Tween
20. Le substrat composé d'un mélange (ortho-tolidine,
N,N-diméthyl formamide, tampon citrate, eau oxygénée)
préparé 5 minutes avant la fin de l'incubation est ensuite
distribué (100ul par puit). Les plaques sont ensuite conservées
30 minutes à l'obscurité. La dégradation du substrat sous
l'action de la peroxydase se traduit par une coloration bleue. Cette
réaction est stoppée en ajoutant 50ul d'acide sulfurique 4N par
puit, ce qui donne une coloration jaune. La lecture s'effectue au moyen d'un
spectrophotomètre à 450 et 650 nm. L'intensité seuil des
positifs est fixée à 3 fois la moyenne des témoins
négatifs. La composition des réactifs et les quantités
utilisées sont présentées en annexe 3.
2.7.3. Indice entomologique de la
transmission
Au cours de ce travail, aucun moustique n'a été
positif au test ELISA, par conséquent les autres indices n'ont pas pu
être calculés.
2.8. Analyse statistique
Le degré de liaison entre la densité
culicidienne (Cx. quinquefasciatus) et la pluviométrie a
été évalué par le test du coefficient de
corrélation linéaire. Elle permet d'établir les
interrelations probables entre les différentes variables. Deux
séries de variables sont plus ou moins fortement liées selon que
r est plus ou moins proche de 1, avec 0 < r < 1. Le signe plus signifie
que la relation entre variables est proportionnelle (corrélation
positive). Le signe moins signifie que la relation entre variables est
inversement proportionnelle (corrélation négative). Par
convention, si r = 1, on parlera de corrélation parfaite; et si r = 0,
on parlera de corrélation nulle.
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