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Efficacité biocide de deux extraits des plantes à action biocide (tephrosia vogelii et zingiber officinale) sur la croissance in vitro de mycosphaerella fijiensis, agent causal de la maladie des raies noires du bananier


par Jol MUKENDI
Université de Kinshasa RDC - Ingénieur agronome phytotechnicien 2011
Dans la categorie: Biologie et Médecine
   
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UNIVERSITE DE KINSHASA

251661312

FACULTE DES SCIENCES AGRONOMIQUES

Département de Phytotechnie

B.P 117 KIN XI

Efficacité de deux extraits de plantes à action biocides (Tephrosia vogelii et Zingiber officinale) sur la croissance in vitro de Mycosphaerella fijiensis , agent causal de la maladie des raies noires du bananier

Par :

MUKENDI Joël

Gradué en Sciences Agronomiques

Mémoire présenté et défendu en vue de l'obtention du titre d'Ingénieur Agronome.

Orientation : Phytotechnie

Directeur: Professeur Adrien KALONJI MBUYI

Année académique : 2010-2011

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES ii

LISTE DES FIGURES iii

LISTE DES TABLEAUX iv

DEDICACES v

REMERCIEMENTS vi

RESUME vii

INTRODUCTION 1

CHAPITRE I : REVUE DE LA LITTERATURE 4

I.1. Généralités sur la Cercosporiose noire du bananier 4

I.1.1. Historique et répartition géographique 4

I.1.2. Agent pathogène 4

I.1.3. Symptomatologie 5

I.1.4. Epidémiologie 7

I.1.4.1. Infection 8

I.1.4.3 Période d'incubation 8

I.1.4.4 Conidiophores et conidies 8

I.1.4.5 Périthèces et les ascospores 8

I.1.4.6 Capacité d'adaptation 9

I.1.5. Dégâts 9

I.1.6. Stratégies de lutte 9

I.2. Aperçu sur les plantes bio pesticides utilisées 10

I.2.1. Tephrosia vogelii 10

I.2.2. Zingiber officinale 11

CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES 13

II.1. Matériel 13

II.1.1. Matériel végétal 13

II.1.2. Matériel de laboratoire 13

II.2. Méthodes 13

II.2.1. Identification du M. fijiensis sur les échantillons récoltés 13

II.2.2. Isolement de M. fijiensis sur milieu PDA 14

II.2.2.1. Préparation de milieu de culture pour isolement 14

II.2.2.2. Mise en culture de Mycosphaerella fijiensis 14

II.2.3. Purification de souches 14

II.2.4. Ensemencement du M. fijiensis sur milieu de culture incorporé de jus de plante 15

II.2.4.1. Préparation de milieu 15

II.2.4.2. Extraction et incorporation du jus de plantes biopesticides dans le milieu de culture 15

II.2.5. Paramètres observées 16

CHAPITRE III. RESULTATS ET DISCUSSION 17

III.1.1. Identification de Mycosphaerella fijiensis sur les feuilles de bananier infectée 17

III.1.2. Effet de l'extrait de Tephrosia vogelii sur la croissance radiale de Mycosphaerella figiensis 18

III.1.3. Effet de l'extrait de Zingiber officinale sur la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis 19

III.1.4. Effet de mélange d'extraits de Tephrosia vogelii et Zingiber officinale Mycosphaerella fijiensis 20

III.1.5. Effets comparatifs des extraits de Tephrosia vogelii et Zingiber officinale sur la croissance radiale moyenne de Mycosphaerella fijiensis 21

III .1.6. Pigmentation du milieu de culture ensemencé 23

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 24

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 25

ANNEXES 29

LISTE DES FIGURES

Figure 1. : Stade des tirets

Figure 2 : Stade des lésions

Figure 3 : Stade de nécroses aux centres

Figure 4 : Stade de desséchement

Figure 5 : Stade de nécroses isolées

Figure 6 : Stade des nécroses coalescentes

Figure 7 : Cycle infectieux de Mycosphaerella fijiensis

Figure 8 : Images des feuilles de Tephrosia vogelii

Figure 9 : Rhizomes de Zingiber officinale

Figure 10 : Observation microscopique des conidies et conidiophores de Paracercospora fijiensis phase anamorphe de M. fijiensis isolés sur les feuilles de bananier infectées

Figure 11 : Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de Tephrosia vogelli.

Figure 12 : Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de Z. officinale.

Figure 13 : Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de mélange Tephrosia vogelii et Z. officinale.

Figure 14 : Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de Z. officinale et de T. vogelii et de mélange de deux jus.

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Pigmentation du milieu de culture ensemencé

DEDICACES

A mes très chers Parents Clément MUKENDI NKONKU et Rose BAKANKINA, pour tant d'amour, soutien tant spirituel, moral que financier et sages conseils.

A mes frères et soeurs : Dr. Mike MULUMBA, Ir. Olivier TSHIBANGU, David TSHIASUMA, Didier NKASHAMA, Emmanuel KABENGELE, Angel KULONDI, Ruth MUENDA, Nicole KAPINGA, Isabelle MASENGU, Rebecca KASSA.

A mes neveux et nièces : Israël MWAMBA, Winner MAMBA, Rose BANKAKINA et Isabelle MUSHIYA pour votre assistance et affection indescriptibles.

Joël MUKENDI

REMERCIEMENTS

Nous signons par ce travail la fin de notre deuxième cycle d'études universitaires en Sciences Agronomiques à l'Université de Kinshasa. De ce fait, nous voudrions remercier toute personne qui de près ou de loin a contribuée à notre formation et à la réalisation de ce travail.

Nous remercions, en premier lieu, l'Eternel Dieu, le Maitre de temps et des circonstances. Ensuite, les autorités académiques ainsi que le corps professoral et administratif de l'Université de Kinshasa en générale et de la Faculté des Sciences Agronomiques en particulier.

Nous présentons notre sentiment de gratitude à l'endroit du Professeur Adrien KALONJI MBUYI WA MBOMBO qui en dépit de ses multiples occupations a bien voulu assurer la direction de ce travail.

Nous remercions également la Clinique des Plantes de Kinshasa (CPK) et le Centre Agronomique et Vétérinaire Tropicale de Kinshasa (CAVTK), particulièrement l'Ir. Lyna MUKWA FAMA TONGO et Monsieur Max MULAND KAYIJ. Nous n'oublions pas le Professeur Patrick TSHILENGE DJIM KANANA, les ingénieurs Marcel MUENGULA, Luc LUNKANDA et Greg MAMBA pour leur encadrement, encouragement et conseil scientifique.

Nous tenons à exprimer toute notre reconnaissance à Guthrie BASOLO LUVILUKA, Alain ILUNGA KABASELE, Tantine BOLEMBO, Alva BAMANA, Danny LOFINDA, Cédric KALONJI, Dier NDEMI, Daddy KEGBA, Fabrice IMPION, Christian MOSEMBO, Ruth BADUBAYE, Niclette MFUTU, Gradie MUHONGO, Guelord NSUANDA, John MAKADI, Laurent NDIMA, Fils LUWAWU, Lama MUNUNGANI, Fifi KUMUTIMA, Fiston MPIEBAM, Rodrigue MIKWENE et Jean Claude MUWO.

Que toutes les personnes non citées, dans ce texte mais ayant apportée une contribution tant matérielle, morale que financière au long de notre parcours de formation, trouve, ici, le couronnement de ses efforts et notre sincère gratitude.

RESUME

Le bananier est la quatrième grande culture au monde. En République Démocratique du Congo, elle occupe en termes d'importance, la troisième place après le manioc et le maïs. Ces dernières années sa culture est menacée par les maladies virales, bactériennes et fongiques qui ont entraîné l'usage abusif des pesticides de synthèse. Le souci de la protection de l'environnement, de la protection de la santé des consommateurs a conduit à l'adoption des alternatives à l'usage des pesticides chimiques. La lutte biologique au moyen des extraits des plantes ou des organismes vivant est de plus en plus utilisée pour diminuer l'incidence des affections du bananier. L'objectif de la présente étude a été de tester l'efficacité de deux extraits des plantes à action biocide sur la croissance in vitro de Mycosphaerella fijiensis, agent causal de la maladie des raies noires du bananier.

Les essais in vitro menés par ensemencement de M. fijiensis sur des milieux de cultures contenant des quantités différentes de Tephrosia vogelii, de Zingiber officinale et de la combinaison des extraits de T. vogelii et Zingiber officinale (50% et 50%) ont montré qu'à une quantité 0,5 ml du mélange d'extrait de Tephrosia vogelii et Zingiber officinale, ainsi qu'à celle de 3ml de l'extrait de Tephrosia vogelii, la croissance du champignon est nulle. Deux tendances ont été ainsi remarquées : la première tendance renseigne que, pour les extraits incorporés séparément : plus la quantité augmente et moins s'observe le développement du champignon. Tandis que la seconde tendance indique que, pour le mélange des extraits de Z. officinale et T. vogelii, plus la quantité augmente et plus on observe une croissance radiale du champignon M. fijiensis. L'étude n'a pas permis d'en trouver une explication du mécanisme d'action.

INTRODUCTION

Le bananier (Musa sp.) est une plante essentiellement alimentaire cultivé pour son fruit consommé comme banane fraiche (banane dessert) ou cuite (banane plantain et autre banane à cuire) ou même consommé comme fritte. Mûre, la banane peut servir à la fabrication de la farine. Verte, elle est utilisée pour préparer des cossettes séchées, mais aussi on y extrait du jus (Mboho, 2007).

La banane est un fruit hautement énergétique (Anonyme, 2010a). Selon Sivirihauma (2008), les fruits de banane contiennent entre 25 et 30 % d'eau, 1.6% des protéines, 0.5% des lipides, 25% des glucides et 0.8% de cendres. Les bananes sont riches en Ca, P et en vitamines A, B et C. Elle contient certains composés vitaminés U (contre les ulcères) et la sérotonine qui augmente la pression sanguine.

La banane constitue non seulement un aliment, mais aussi une véritable source de revenu (Teycheney et al., 2007). Nyabyenda (2005) indique que sur le plan africain, la production de bananes et plantains est assurée principalement par l'Ouganda, le Rwanda, la République Démocratique du Congo (RDC) et le Cameroun. Cependant, on assiste depuis quelques décennies à une diminution de la production dans les grandes zones productrices. Selon Lassoudière (2010), en 1971, la production africaine de bananes et plantains représentait 47% (soit 9,5Mt) de la production mondiale, a baissé jusqu'à atteindre 29 % (soit 31,1Mt) en 2005. Ce qui se traduit par une baisse de 18% d'apport de la production africaine dans la production mondiale.

Cette baisse de production est liée d'une part au non respect des pratiques phytosanitaires, à la baisse de fertilité du sol, à l'utilisation des techniques culturales non appropriées, à l'absence des cultivars résistants et à la dégénérescence des cultivars ; et d'autre part, à l'explosion des maladies et ravageurs (Ndungo, 2008). D'après Jones (2000a), les maladies et ravageurs constituent une menace grandissante pour les petits et grands producteurs, et peuvent provoquer des pertes catastrophiques. Selon le même auteur, des nombreux systèmes de production de bananes sont menacés par des épidémies provoquées par des champignons phytopathogènes.

Parmi les maladies qui menacent la culture de banane, la maladie des raies noires (MRN) ou Cercosporiose noire causée par Mycosphaerella fijiensis est la contrainte la plus dévastatrice et la plus agressive rencontrée chez le bananier (Stierle et al., 1991 ; Mourichon et al., 1997 ; Ploetz et Pegg 2000 ; Champion, 2009). Les attaques de la MRN se traduisent par la diminution de la surface photosynthétique des feuilles, provoquant ainsi le mûrissement précoce des fruits et des pertes de rendement atteignant parfois 50% (Mourichon et al., 1997).

La lutte contre la MRN est essentiellement chimique. Cependant, cette méthode de lutte a un coût élevé et la fréquence d'application entraîne l'apparition des souches résistantes aux fongicides. En plus, l'impact des traitements a des profondes répercussions sur l'environnement et sur la santé humaine (Anonyme, 2010a). L'agent pathogène a un potentiel élevé d'adaptation à des conditions nouvelles de climat, fongicides ou de génotypes de la plante hôte (Ploetz, 2000). Ceci est amplement démontré par la perte d'efficacité de certains groupes de fongicides chimiques tels que les triazoles et benzimidazoles utilisés dans la lutte chimique (Guzmán et al. 2000 ; Romero, 2000).

La recherche de nouveaux produits d'origine naturelle ne polluant pas l'environnement et disponible à moindre coût représente un élément important de l'agriculture durable (Sanchez Rodriguez et al., 2002). Actuellement, des chercheurs et producteurs travaillent ensemble pour développer des solutions alternatives et innovantes permettant de réduire l'utilisation des pesticides dans la protection des bananeraies (Anonyme, 2010b).

Des études antérieures menées sur des biopesticides ont démontré des vertus biocides de plantes telles que Zingiber officinale et de Tephrosia vogelii dans la lutte contre quelques champignons comme Alternaria solani (Luyeye, 2010) sur la tomate, Helminthosporium oryzae sur le riz, Colletotrichum gloesporiodes sur le manguier, et Cercospora sp. sur l'arachide (Stoll, 2002). L'hypothèse de cette étude se fonde sur le fait que si les champignons précités ne peuvent se développer sur des milieux de culture contenant des extraits de Z. officinale et T. vogelii, il est également vrai que M. fijiensis ne peut s'y développer.

Le présent travail s'est fixé comme objectif d'évaluer l'efficacité des extraits de Z. officinale et T. vogelii sur la croissance Mycosphaerella fijiensis en culture in vitro. Outre l'introduction, notre travail est subdivisé en trois chapitres. Le premier chapitre traite de la revue de la littérature, le second chapitre développe le matériel et méthodes, et le troisième chapitre présente les résultats et leur discussion. A la lumière des résultats obtenus, une conclusion et quelques suggestions mettront un point final au présent travail.

CHAPITRE I. REVUE DE LA LITTERATURE

I.1. Généralités sur la maladie des raies noires du bananier

I.1.1. Historique et répartition géographique

La maladie des raies noires a été identifiée pour la première fois aux îles Fidji en 1963 (Rhodes, 1964), il semble que cette maladie ait été présente bien avant en Asie et dans le Pacifique. Certaines études sur la diversité de cette espèce pathogène indiquent une origine en Papouasie-Nouvelle Guinée. Après sa découverte au Honduras en 1972, la maladie s'est disséminée dans toute l'Amérique Centrale et dans le Nord de l'Amérique du Sud. Elle est également présente en Afrique, en Asie, dans le Pacifique et une partie des Caraïbes. Sur le continent africain, M. fijiensis a été observé d'abord en Zambie en 1973, puis s'est répandu dans plusieurs pays d'Afrique de l'Est, de l'Ouest et Centrale. Elle est présente dans toutes les basses terres tropicales humides (Ploetz et Pegg 2000). L'aire de répartition de Mycosphaerella fijiensis s'étend progressivement à toutes les zones de production de bananes (Ploetz et Pegg, 2000; Mourichon, 2003).

En République Démocratique du Congo (RDC), Sebasigari et Stover (1988) avaient signalé la présence de la MRN dans la région montagneuse de l'Est du Zaïre. Classiquement, dans les zones de basses altitudes où est déjà présente l'espèce M. musicola, l`extension de M. fijiensis conduit, dans un premier temps, à une période de coévolution des deux espèces sur le même hôte, suivie par un remplacement de Mycosphaerella musicola par Mycosphaerella fijiensis. Toutefois, l'activité parasitaire de M. fijiensis (durée d'évolution des symptômes, sporulation) diminue progressivement en altitude, la maladie de Sigatoka (MS) se maintient, ainsi, dans les seules régions d'altitude (Fouré et Lescot, 1988 ; Mourichon et Fullerton, 1990 ; Mouliom Pefoura et Mourichon, 1990).

I.1.2. Agent pathogène

La Maladie des Raies Noires (MRN), aussi connue sous le nom de Cercosporiose noire ou Black Sigatoka est causée par un champignon ascomycète Mycosphaerella fijiensis (Ploetz et Pegg 2000 ; Mourichon, 2003) appartenant à la famille des Mycosphaerellacae. II est hétérothallique et présente une forme imparfaite Cercospora fijiensis décrite récemment comme Paracercospora fijiensis (Deighton, 1976). Cette forme asexuée permet, grâce à la morphologie des conidiophores et des conidies, de le distinguer de l`autre espèce : Cercospora musae ou Paracercospora musae, agent responsable de la maladie de Sigatoka jaune(MS) ou Cercosporiose jaune (Deighton, 1979).

I.1.3. Symptomatologie

En champs, il est parfois difficile de distinguer sur base des symptômes externes, la MRN et la MS. Ceux-ci ne permettent pas d'établir clairement quelle est celle qui a la plus forte incidence quand les deux coexistent. Au microscope, M. fijiensis et M. musicola se distinguent principalement par les caractéristiques morphologiques différentes de leurs stades anamorphes, en particulier au niveau des conidiophores et des conidies. Paracercospora fijiensis possède sur ses conidiophores et conidies, des cicatrices appelées « hile », absentes chez Pseudocercospora musae (Aguirre et al., 1998b). Généralement, après une période d'incubation, les symptômes de la MRN présentent 6 stades évolutifs (Mourichon, 2003).

La durée d'évolution des symptômes (du stade 1 au stade 6) est très variable, généralement de 21 à 120 jours, et dépend du cultivar, du stade de la plante hôte et de l'environnement. Dans le cas d'une attaque très violente, on peut ne pas observer tous ces stades. Une forte densité de stade 2 sur le limbe peut provoquer, par coalescence, l'apparition de plages nécrotiques et le dessèchement rapide de la feuille (Mourichon, 2003 ; Fouré, 1982). La répartition des symptômes sur les feuilles est assez variable. L'attaque a lieu souvent en bout de feuille, symétriquement à la nervure centrale. On peut observer toutefois une densité élevée de tirets le long du bord du limbe gauche. La densité des stries et des taches, réparties symétriquement et situées près de la nervure centrale, diminue lorsqu'on s'éloigne de cette dernière. Fréquemment, des taches à différents stades sont observées sur une même feuille. L'évolution est variable mais peut être très rapide dans le cas de variétés très sensibles à la Cercosporiose noire (Mourichon, 2003).

Les différents stades peuvent se résumer comme suit : au stade 1, on observe sur la face inférieure du limbe de la 3ème ou 4ème feuille totalement déployée, des petits points anguleux brun rouge, de 0,5 mm de diamètre ; au stade 2, ces points deviennent des tirets parallèles aux nervures secondaires, mesurant 1 à 2 mm, plus visibles sur la face inférieure des feuilles (Figure 1). Les tirets présentent des contours bien définis et délimités (selon les cultivars) de coloration brun rouge. Ce stade est très visible lorsque la feuille est observée par transparence ; au stade 3, les tirets s'allongent et changent de couleur pour former des lésions nécrotiques à halo jaune et centre gris clair (Figure 2) ; au stade 4, les tirets s'élargissent et deviennent des taches fusiformes ou elliptiques entourées d'une zone brun clair ; au stade 5, le centre noir des taches se nécrose (Figure 3) ; au stade 6 (stade terminal de croissance du champignon), le centre des taches se dessèche, tourne au gris clair, s'entoure d'un anneau noir étroit bien défini encerclé d'un halo jaune vif (Figures 4, 5 et 6). La feuille se dessèche mais les taches restent visibles car le halo noir persiste (Mourichon, 2003).

Fig. 2. Stade de lésions

Fig. 1. Stade des tirets

Fig. 3. Stade de nécrose au centre

Fig. 4. Stade 6 : stade de dessèchement

Fig. 6. Stade des nécroses coalescentes à la face supérieure de la feuille

Fig. 5. Stade des nécroses isolées à la face supérieure de la feuille

I.1.4. Epidémiologie

Le M. fijiensis se propage par trois modes: le transport de matériel végétal infecté (des rejets infectés et des feuilles malades utilisées dans l'emballage de nourriture ou d'autres produits), la dissémination d'ascospores (produites lors de la reproduction sexuée) et la dissémination de conidies (produites lors de la reproduction asexuée) (Gauhl et al., 2000). Alors que les conidies se dispersent surtout sur de courtes distances, sur la plante elle-même et sur les plantes avoisinantes, les ascospores viables peuvent être transportées par le vent sur quelques centaines de kilomètres (Parnell et al., 1998). La libération d'ascospores est forte en temps de pluie du fait de la présence d'une pellicule d'eau résiduelle à la surface des feuilles, dont la face inférieure présente plus de nécroses. Les feuilles sèches qui restent collées à la plante représentent donc une excellente source d'inoculum (Gauhl, 1994). En ce qui concerne la température, on estime que les ascospores de M. fijiensis germent entre 10 et 38 C, sachant que la température optimum de germination est de 27 C et que la vitesse relative de croissance des tubes germinatifs diminue fortement pour des températures inférieures à 20 C (Pérez, 1996). Pour ce qui est de l'effet du vent, Stover (1984) et Gauhl (1994) ont observé que la concentration des conidies dans les plantations est plus élevée dans les couches d'air les plus basses que sur le feuillage alors que la concentration des ascospores dans l'air est la même ; ceci confirme l'importance des ascospores dans le cycle de la maladie (Figure 7).

Fig. 7. Cycle infectieux du M. fijiensis (Mourichon et al., 1997)

I.1.4.1. Infection

Les spores (conidies et ascospores) germent 2 à 3 heures après leur contact avec une surface foliaire humide. Dans des conditions artificielles, de l'eau libre est nécessaire à l'infection par les ascospores. Pour les conidies, une humidité relative est suffisante. Les températures minimale, optimale et maximale pour la mise en place du processus infectieux sont respectivement de 12°C, 27°C et 37°C. Aucun développement n'a lieu en dessous de 11°C et au dessus de 38°C (Mourichon, 2003).

I.1.4.2. Période d'incubation

Une fois l'infection établie, des hyphes de M. fijiensis émergent des stomates de la surface inférieure des feuilles et colonisent les stomates. La durée d'incubation la plus rapide en conditions favorables est de 10 à 14 jours, mais varie considérablement en fonction des variétés hôtes. La durée de l'incubation est également fonction des conditions climatiques (Mourichon, 2003).

I.1.4.3. Conidiophores et conidies

Les conidies sont des spores fragiles et leur durée de vie ne peut excéder 2 à 3 semaines tandis que, les ascospores sont plus adaptées à des périodes de conservation restant toutefois inférieures à 3 mois. Les conidiophores et les conidies sont produits du stade 2 jusqu'à l'apparition des premières nécroses (stade 4). Ils se développent dans des conditions d'humidité élevée. Les conidies sont détachées des conidiophores par l'eau principalement (rosée, pluies) et plus rarement le vent. L'eau est le principal moyen de dissémination des conidies d'une plante à l'autre (Mourichon, 2003).

I.1.4.4. Périthèces et les ascospores

Selon Mourichon (2003), les périthèces sont abondants dès les stades 4 et 5. Leur production est généralement plus importante sur la face supérieure des feuilles. Les ascospores sont éjectées des périthèces pendant les périodes de pluie ou pendant la nuit avant l'aube au moment de la rosée (alternances périodes sèches / humides). Les conditions de survie sont mal connues.

I.1.4.6 Capacité d'adaptation

Le M. fijiensis présente un niveau important de diversité génétique. Cette diversité est liée à l'important niveau des recombinaisons que lui confère son mode de reproduction sexuée très présente dans la nature. Cette propriété est une caractéristique biologique très importante, pouvant se traduire par une plasticité de cette espèce et donc une adaptabilité à différents environnements (Mourichon, 2003).

I.1.5. Dégâts

La Maladie des raies noires (MRN) provoque une importante diminution de la surface photosynthétique par un dessèchement généralisé du système foliaire. Elle affecte beaucoup de cultivars résistants à la Cercosporiose jaune ou Maladie de Sigatoka (MS), tels ceux du sous-groupe des bananiers plantains (AAB). Dans les cas extrêmes où le cultivar est très sensible, toutes les feuilles du plant peuvent être détruites avant que le régime ne mûrisse. Les bananiers survivent mais les rendements sont très faibles et les régimes mûrissent prématurément et de façon inégale. La réduction de la durée de vie verte rend le transport et la conservation des fruits improbables (Mourichon, 2003).

La MRN et la MS peuvent entraîner une défoliation sévère, mais étant donné que M. fijiensis est plus pathogénique sur une plus grande gamme d'hôtes, la MRN revêt un caractère de gravité plus important que la MS. Les maladies de feuilles font mourir les feuilles, réduisent le poids de régimes et fruits de bananes ; les régimes affectés par le mûrissement prématuré au champ contiennent des mouches du fruit qui réduisent davantage leur valeur commerciale (Tshilenge, 2010). Les pertes de production dues au M. fijiensis peuvent atteindre, dans certains cas, plus de 50 % (Mourichon et al., 1997).

I.1.6. Stratégies de lutte

Dans les exploitations bananières, le traitement contre la MRN est fortement dépendant des fongicides. Leur action est complétée par quelques pratiques culturales telles que l'élimination des feuilles et rejets attaqués, le drainage, le contrôle des mauvaises herbes et la nutrition minérale, visant à réduire les sources d'inoculation et à éviter la réunion de conditions favorables au développement de l'agent pathogène (Marín et Romero, 1992). L'emploi des fongicides systémiques permet de lutter efficacement contre cette maladie dans les plantations commerciales, mais leurs effets sur l'environnement restent préoccupants. La solution la plus appropriée à long terme est certainement la résistance génétique, surtout pour les petits exploitants qui ne peuvent avoir accès à une lutte chimique pour des raisons économiques (Mourichon et al., 1997).

I.2. Aperçu sur les plantes bio pesticides utilisées

I.2.1. Tephrosia vogelii

Connu sous le nom vernaculaire de Bwalu, mbaka (kongo), Bubawu (Tshiluba), Tephrosia vogelii est aussi appelé plante à poissons, appartient à la famille de Fabaceae. C'est un buisson largement répandu en Afrique tropicale, où il est utilisé comme plante de jachère afin d'améliorer la fertilité du sol et de limiter l'érosion (Stoll, 2002). Le Tephrosia vogelii (figure 8) est un arbuste très ramifié d'environ 4 m de hauteur. La plante fixe l'azote et n'a pas besoin d'inoculation préalable (Latham et Konda, 2006).

Cette plante peut être cultivée en haie avec un espacement de 1 m (Stoll, 2002). On peut le planter directement dans un champ en utilisant de nouvelles graines (Latham et Konda, 2006).

Figure 8. Images des feuilles de Tephrosia vogelii

Les feuilles moulues sont utilisées comme stupéfiant pour le poisson, ainsi le poisson reste comestible. Les feuilles mortes représentent une bonne source d'azote. En Zambie, on laisse cet arbre en jachère pendant trois ans ; le rendement des cultures est alors élevé. Au Malawi, la culture de Tephrosia en jachère pendant un an a donné un rendement qui a augmenté de 20%. Après deux ans de jachère, le rendement a augmenté de 40 % (Latham et Konda, 2006).

Les feuilles contiennent des flavonoïdes qui ont des effets marqués sur le développement et le comportement des insectes. Les parties de la plante possédant des propriétés insecticides sont les feuilles et les racines. Les teneurs les plus élevées en principes actifs sont observés dans les feuilles et varient d'une plante à l'autre (Stoll, 2002). Selon le même auteur, les modes d'action de T. vogelii sont : anti-appétant, insecticides, acaricides, ovicides, toxiques pour les poissons ; toxicité par contact et par ingestion.

Les feuilles et les graines sont des insecticides efficaces contre les aphides, les thrips et les insectes qui perforent la tige du maïs. (Stoll, 2002).

I.2.2. Zingiber officinale

De son nom usuel Tangawisi (lingala), gingembre (français), Zingiber officinale est une plante dressée, herbacée, persistante, appartenant à la famille de Zingiberaceae. Cette plante peut atteindre 1 m de hauteur et pousse à partir d'un rhizome (figure 9) Elle est souvent cultivée comme une plante annuelle et est récoltée 9 à 10 mois après sa plantation (Latham et Konda, 2006).

Le gingembre est connu en Asie où sa culture est répandue depuis de milliers d'années. Il s'accommode à un grand nombre de types de sols. Ses feuilles sont étroites et linéaires, avec l'extrémité rétrécie et terminant en pointe. Les fleurs sont jaunes verdâtres avec des parties pourpre foncées. Le gingembre est planté à partir d'un morceau de racine fraîche ayant au moins un bourgeon. L'espacement entre les plantes est de 20 à 30 cm. On le plante à une profondeur de 7 cm. Les nouvelles pousses apparaissent après 10 ou 20 jours. Les rhizomes sont épais, lobés et de couleur jaune. Les parties de la plante possédant des propriétés fongicides sont les rhizomes. Le gingembre est utilisé comme fongicide, insecticide et nématicide (Stoll, 2002).

Figure 9. Rhizomes de Zingiber officinale

Le plant est mûr quand les feuilles deviennent jaunes. Les racines fraîches sont sucées ou mâchées pour calmer la soif. La racine possède également des vertus aphrodisiaques. Dans d'autres contrées, la racine est principalement utilisée comme condiment (Latham et Konda, 2006).

CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES

II.1. Matériel

II.1.1. Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé dans cette étude était constitué d'une part, des échantillons de feuilles de bananier et plantain présentant les symptômes de la MRN, et d'autre part, des rhizomes de Z. officinale et des feuilles de T. vogelii. Les feuilles de bananier plantain ont été récoltées sur le site de Kinsiona, situé au quartier Kimwenza dans la commune de Mont-Ngafula. Les feuilles échantillonnées étaient constituées de 2 dernières feuilles déployées et de la feuille cigare. Sur les feuilles échantillonnées, les tissus végétaux ont été récoltés sur les zones situées au niveau du front d'avancement des symptômes (zone d'attaque du champignon). Les échantillons ont ensuite été placés dans des enveloppes type kraft et acheminés au laboratoire de la Clinique des Plantes de Kinshasa (CPK) pour les analyses.

II.1.2. Matériel de laboratoire

Les matériels de laboratoire utilisés étaient constitués de milieu de culture PDA (Potato dextro agar), le microscope, Bi-oculaire, la hotte à flux laminaire, l'autoclave, l'étuve, la balance de précision, les lames porte-objet, les lames couvre-objet, les boîtes de Pétri en verre, les erlenmeyer, une pipette, les scalpels , le bec bunsen, le bleu de lactophenol, l'alcool éthylique, la streptomycine sulfate, le mortier, l'eau distillée.

II.2. Méthodes

II.2.1. Identification du Mycosphaerella fijiensis sur les échantillons récoltés

Sur les échantillons, l'identification du M. fijiensis a été rendue possible grâce à la méthode de scotch suivant les étapes ci-après :

- A l'aide d'un binoculaire, bien observer la surface du tissus malade ;

- Poser un morceau de scotch sur l'échantillon, gratter légèrement et retirer doucement le scotch de manière à prélever les structures observées à la loupe binoculaire ;

- Sur une lame porte-objet, déposer une goutte de bleu lactophenol et déposer le morceau de scotch contenant les structures prélevées, puis y rajouter une seconde goutte de bleu lactophenol et couvrir la solution avec la lame couvre-objet ;

- Chauffer l'ensemble de la préparation à la flamme et observer la lame chauffée au microscope ;

- Fixer l'image du champignon sur un microscope et observer les structures (conidies et conidiospores) du champignon au moyen des fiches d'identification CMI (Commonwealth Mycological Institute) et des compendiums d'identification des agents phytopathogènes.

II.2.2. Isolement de M. fijiensis sur milieu PDA

II.2.2.1. Préparation de milieu de culture pour isolement

Le milieu de culture pour l'isolement était préparé avec 9,75g de PDA mélangé à 250 ml d'eau, dans un erlenmeyer. La solution a été autoclavée à 125°C pendant 15 minutes et 1,4 bar. Après l'autoclavage, 0,025g de streptomycine ont été dissouts dans 250ml de milieu préalablement préparé. Le mélange a été secoué et bien mélanger. Sous hotte à flux laminaire, le milieu de culture a finalement été coulé sur des boîtes de Pétri et immédiatement emballer et placer au frigo, à 4°C pour sa solidification pendant 48 heures. L'ajout de la streptomycine sulfate visait à éviter la contamination du milieu de culture par des bactéries.

II.2.2.2. Ensemencement de Mycosphaerella fijiensis

Après identification du M. fijiensis, des fragments de feuilles de 1 cm de diamètre préalablement nettoyés à l'alcool éthylique puis rincés à l'eau distillée, ont été déposés sur milieu de culture PDA dans les boîte de Pétri. Les boîtes de Pétri contenant le milieu de culture sur lesquelles l'agent pathogène a été isolé, ont été placées dans un étuve à 30 °C pendant une semaine en vue de favoriser la croissance mycélienne.

II.2.3. Purification de souches

Après croissance du champignon, de nouveaux milieux de culture ont été préparés pour servir au repiquage. Ce dernier visait à obtenir une culture pure du M. fijiensis ; il a été réalisé en prélevant un morceau de culture PDA contenant le mycélium du champignon et en le déposant dans des nouvelles boites de Pétri contenant des milieux de culture nouvellement préparés.

II.2.4. Ensemencement du M. fijiensis sur milieu de culture incorporé de jus de plantes

II.2.4.1. Préparation de milieu

Nous avons utilisé presque la même procédure détaillée ci-haut mais, cette fois-ci en utilisant 4 erlenmeyer avec 4,875 g de milieu de culture PDA, 125ml d'eau distillée, chacun.

II.2.4.2. Extraction et incorporation du jus de plantes biopesticides dans le milieu de culture PDA

Les jus de Z. officinale et T. vogelii ont été obtenus grâce à la méthode d'extraction suivante :

- Nettoyer les rhizomes de Z. officinale et feuilles de T. vogelii ;

- Eplucher les rhizomes de Z. officinale, puis prélever 20 g de rhizomes et 20 g de feuilles de T. vogelii ;

- Broyer séparément les 20 g de rhizomes de Z. officinale et les 20 g de feuilles de T. vogelii dans le mortier en porcelaine ;

- Ajouter 100ml d'eau distillée dans le mortier et extraire le jus en pressant les particules des feuilles et rhizomes broyés;

- Récolter à l'aide d'une pipette, le jus ainsi extrait et mettre séparément, dans un tube à essai, le jus de chacune de plantes et du mélange;

- Les jus des plantes extrait ont été incorporé dans 125ml de milieu PDA de manière séparée puis en mélange, suivant les quantités de 0,5ml, 1ml, 2ml et 3ml et coulé dans des boîtes de pétri.

- Les fragments des mycéliums du champignon M. fijiensis issu de la culture pure ont ensuite été ensemencés dans le milieu PDA (préparé comme indiqué précédemment) dans lequel on y avait incorporé les extraits des plantes (Z. officinale et T. vogelii).

Pour évaluer l'action fongicide des différents extraits des plantes à différentes quantités, un témoin (milieu PDA sans incorporation) avait été utilisé. Les milieux ensemencés ont été mis en observation durant une période de 5 semaines.

II.2.5. Paramètres observés et analyses statistiques

Pour évaluer l'efficacité de deux extraits des plantes sur la croissance in vitro de Paracercospora fijiensis phase anamorphe de Mycosphaerella fijiensis, la croissance radiale à la 1ère , 2ème, 3ème, 4ème et 5ème semaine après ensemencement a constitué la variable observée.

La prise des mesures sur la croissance radiale était effectuée hebdomadairement sur la face inférieure de la boîte de Pétri, du centre vers la périphérie.

En vue de comparer les différents traitements, les différentes quantités des traitements utilisées et apprécier l'effet de chacun d'eux sur la croissance, les différentes données récoltées sur la croissance radiale du champignon ont été soumises à l'analyse de la variance en utilisant le logiciel statistix 8 (Free version). Le test de la plus petite significative ou the Least Significant Difference (LSD) a servi à la comparaison des moyennes au seuil de probabilité de 5%. Excel (office 2007) a servi à la présentation de certains résultats.

CHAPITRE III. RESULTATS ET DISCUSSION

III.1.1. Identification de Mycosphaerella fijiensis à partir des feuilles de bananier infectée

Après 5 semaines d'ensemencement, les mycéliums ont été abondants formant ainsi une colonie noire, du centre vers la périphérie de la boîte de Pétri. Les observations microscopiques ont révélé la présence de conidies et conidiophores de Paracercospora fijiensis phase anamorphe de Mycosphaerella fijiensis à partir des échantillons des feuilles infectées et après les isolements. Les observations sur les morphologies des conidies ont révélé que la présence des hiles (points d'insertion) bien marqués sous formes des deux point noires sur une des ses extrémités (figure 10).

Figure 10. Observation microscopique des conidies de Paracercospora fijiensis phase anamorphe de M. fijiensis isolées partir des feuilles de bananier infectées

III.1.2. Effet de l'extrait de Tephrosia vogelii sur la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis

La figure 11 rapporte la croissance radiale de M. fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé d'extrait de T. vogelii.

Figure 11. Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de Tephrosia vogelii

A la lecture de la figure 11, il apparaît qu'une allure progressive de croissance radiale pour les quantités 0,5ml, 1ml et 2ml qui tout s'est stabilisé à 4cm de développement à la 5ème semaine. A la quantité 0,5ml on a noté une croissance de 0,5cm à la première semaine suivie de 1,1cm ; 1,2cm ; 2,2cm respectivement, à la 2ème, 3ème et à la 4ème semaine. A la quantité 1ml on a noté 0,3cm à la première semaine suivie de 0,5cm, 0,8cm et 2cm respectivement, à la 2ème, 3ème et 4ème semaine. Pour la quantité de 2ml, nous avons enregistré un développement de 1cm à la 4ème semaine qui se stabilise à 4 cm. Tandis qu'à 3ml la croissance du pathogène était nulle. Alors que sur le témoin, nous avons enregistré une croissance de 0,8cm à la première semaine suivie de 1,4cm de la deuxième jusqu'à la 5ème semaine.

III.1.3. Effet de l'extrait de Zingiber officinale sur la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis

La figure 12 présente la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture incorporé de jus de Zingiber officinale.

Figure 12. Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de Zingiber officinale

De l'analyse de cette figure il ressort une croissance progressive du champignon à toutes les quantités d'extraits incorporés au milieu PDA. Il a été remarqué un début de croissance mycélienne dès la première semaine après ensemencement sur presque toutes les quantités soit 1,8cm pour la quantité 0,5ml ; 1cm pour 1ml et 0,6cm pour 2ml y compris le sur le témoin soit 0,8cm. Sauf sur la quantité de 3ml, à laquelle le développement du champignon n'a été remarqué qu'à la 3ème semaine avec une croissance de 1cm et s'y stabilise jusqu'à la 5ème semaine. Il est aussi à noter qu'une stabilité de croissance du champignon a été remarquée sur le témoin à partir de la 2ième semaine avec 1,2cm et à la quantité de 0,5ml et 1ml à partir de la 4ème semaine jusqu'à la 5ème semaine avec une taille de 4cm.

III.1.4. Effet de mélange d'extraits de T.Vogelii et de Z. officinale sur la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis

La figure 13 ci - après présente la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture incorporé de mélange d'extraits de T. vogelii et Z. officinale.

Figure 13. Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA incorporé de jus de mélange Tephrosia vogelii et Zingiber officinale

De l'analyse de la figure 13 ci - haut, il ressort qu'à la quantité de 0,5ml la croissance du champignon est nulle de la 1ère à la 5ème semaine après ensemencement suivie de la quantité 1ml du 1ère à la 2ème semaine. Une croissance progressive du pathogène aux quantités 2ml et 3ml dès la 1ère semaine avec une croissance respective de 1,2cm et 1cm et sur le témoin avec une croissance de 0,8cm à la première semaine suivie de 1,4cm, taille à la quelle la croissance s'est stabilisée. Donc, une croissance qui tend à progresser au fur et à mesure que la quantité de jus augmente. Et, il a lieu de noter une croissance du champignon de 0,8cm à la quantité 1ml de jus à partir de la 3ème semaine suivie 1cm à la 4ème et 5ème semaine.

III.1.5. Effets comparatifs des extraits de T. vogelii et de Z.officinale sur la croissance radiale moyenne de Mycosphaerella fijiensis.

La figure 14 présente la croissance radiale moyenne de M. fijiensis sur différentes quantités d'extraits des plantes à actions biocides de toutes les semaines d'observation après l'ensemencement.

Fig.14. Croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu PDA incorporé de jus de Z. officinale et de T. vogelii et de mélange de deux jus

A la lecture de la figure 15, il apparaît que la croissance radiale moyenne du champignon M. fijiensis dépend de la quantité d'extraits de plantes utilisées. Avec la quantité 0.5 ml, nous avons enregistré une croissance radiale de 3.18 cm dans le milieu incorporé de Z. officinale et 1.8 cm dans le milieu incorporé de T. vogelii et une croissance nulle dans le milieu incorporé du mélange d'extraits. A la quantité 1 ml, la croissance radiale du M. fijiensis était de 2.86 cm chez Z. officinale, suivie de 1.52 cm chez T. vogelii et 0.56 cm pour le mélange Z. officinale et T. vogelii. Lorsqu'on incorporait 2 ml de jus, nous avions noté une croissance radiale de 2.16 cm chez Z. officinale, 2.32 cm pour le mélange Z. officinale et T. vogelii, et 1 cm chez T. vogelii. L'incorporation de 3 ml d'extrait dans le milieu PDA correspondait une croissance radiale à 2.6 cm pour le mélange Z. officinale et T. vogelii, et 0.6 cm pour Z. officinale ; alors que chez T. vogelii la croissance du champignon était nulle.

Chez le témoin qui est le milieu PDA utilisé sans incorporation, nous avons enregistré une croissance de 1,28 cm du champignon Mycosphaerella fijiensis.

L'analyse de la figure 14 indique de manière générale deux tendances. La première tendance renseigne que, pour les extraits incorporés séparément : plus la quantité augmente et moins s'observe le développement du champignon. La seconde tendance indique que, pour le mélange des extraits de Z. officinale et T. vogelii, plus la quantité augmente et plus on observe une croissance radiale du champignon M. fijiensis.

Ces deux tendances peuvent être dues à l'effet synergique entre les deux extraits qui, en combinaison, ils parviennent à inhiber la croissance mycélienne de Paracercospora fijiensis forme anamorphe Mycosphaerella fijiensis, à une faible quantité. Tandis que, isolés, ils en parviennent qu'a des quantités élevées.

Il a été observé aussi que le développement du champignon dans le milieu témoin est moindre en comparaison aux milieux incorporés des extraits des plantes. Ce constat peut s'expliquer par le fait qu'en laboratoire, certains parasites perdent leur pathogénicité lorsqu'ils sont repiqués maintes fois sur un milieu synthétique (Corbaz, 1990).

Au seuil de probabilité de 5%, l'analyse de la variance a révélée une différence significative entre les différents traitements (LSD = 0.63) et entre les différentes quantités de traitements utilisées (LSD = 0.85). Ce qui montre que les plantes à action biocide utilisées possèdent une efficacité in vitro remarquable sur la croissance de Mycosphaerella fijiensis.

L'hypothèse évoquée sur le fait que Mycosphaerella fijiensis ne peut également pas se développer sur des milieux de culture contenant l'extrait de Z. officinale et T. vogelii, comme d'autres champignons précités s'est confirmer, au regard des résultats obtenus.

L'extrait de Tephrosia vogelii paraît plus efficace, au regard de résultats obtenus, par rapport à celui de Zingiber officinale sur la croissance de Mycosphaerella fijiensis. En ce que, nous avons enregistré la croissance nulle du champignon à la quantité 3ml de l'extrait de Tephrosia vogelii pendant toute la période d'observation contrairement au Zingiber officinale où, même en croissance tardive, à certaines quantités, le champignon s'est quand même développé (figure 13). En plus, le Tephrosia vogelii avait dominé même sur la pigmentation du milieu lors de l'incorporation dans le milieu de culture PDA.

III.1.6. Pigmentation du milieu de culture ensemencé

Les résultats relatifs à la pigmentation du milieu de culture ensemencé sont illustrés par le tableau 1.

Tableau 1. Pigmentation du milieu de culture ensemencé

Traitements

Pigmentation

Témoin

Blanchâtre

Z. officinale

Jaune

T. vogelii

Brunâtre

Z. officinale + T. vogelii

Brunâtre

L'analyse du tableau 1 montre que la pigmentation du milieu de culture PDA était de coloration blanchâtre pour le témoin et jaune pour le milieu incorporé d'extrait de Z. officinale. Les milieux incorporés de T. vogelii et celui incorporé du mélange Z. officinale + T. vogelii étaient brunâtre. Cette pigmentation renseigne sur la concentration du produit. A l'examen de ce résultat le Tephrosia vogelii parait prédominant, en affectant la coloration du milieu de culture. Ce qui pourrait expliquer dans une certaine mesure, l'efficacité observée de Tephrosia vogelii contre le développement de Paracercospora fijiensis phase anamorphe de Mycosphaerella fijiensis.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La présente étude visait à évaluer l'efficacité des extraits de Z. officinale et T. vogelii sur la croissance in vitro de M. fijiensis, agent responsable de la maladie des raies noires du bananier. La méthodologie utilisée visait d'ensemencer le champignon M. fijiensis sur un milieu PDA incorporé des extraits des plantes précitées. Quatre différentes quantités d'extrait de Z. officinale et T. vogelii et un témoin (sans incorporation) avaient été utilisées à cet effet.

Les résultats de cette étude ont révélée que la croissance du M. fijiensis est affectée par l'incorporation d'extrait des plantes. En générale, la croissance radiale du champignon a présenté deux tendances. La première tendance renseigne que pour les extraits incorporés séparément, plus la dose augmente et moins s'observe le développement du champignon. La seconde tendance indique que pour le mélange des extraits de Z. officinale et T. vogelii, plus la dose augmente et plus on observe une croissance radiale du champignon M. fijiensis.

A la lumière de la première tendance évoquée par les résultats de cette étude, on retiendra que le Z. officinale et le T. vogelii regorgeaient une activité fongicide pouvant être exploité dans la lutte contre le M. fijiensis. L'analyse de la seconde tendance révélée par nos résultats pourrait s'expliquer par la neutralisation réciproque ou à la synergie des effets fongicides par les substances contenues dans les deux plantes utilisées.

L'hypothèse évoquée sur le fait que Mycosphaerella fijiensis ne peut également pas se développer sur des milieux de culture contenant l'extrait de Z. officinale et T. vogelii, comme d'autres champignons précités s'est confirmer, au regard des résultats actuels.

Les résultats de cette étude s'avèrent intéressants dans la mesure où il met en évidence la possibilité d'utiliser le Z. officinale et le T. vogelii dans la protection biologique du bananier contre le M. fijiensis agent causal de la maladie des raies noires. De ce fait, nous suggérons d'autres études qui s'attèleront sur l'efficacité de ces extraits de plantes aux différentes autres quantités contre le même pathogène, les molécules actives de ces plantes qui agissent sur le nuisible, les mécanismes d'action et à la préparation des formulations des produits à base de ces plantes ainsi que, le mode de leur utilisation en champ.

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Annexes

Evolution comparative de la croissance radiale de Mycosphaerella fijiensis sur le milieu de culture PDA, Zingiber officinale, Tephrosia vogelii et mélange (Zingiber officinale et Tephrosia vogelii)

Durée d'observation : 5 semaines

 

Croissance radiale (cm)

 

Traitements

Doses
(ml)

1ère Sem

2ème Sem

3ème Sem

4ème Sem

5ème Sem

Somme

Moyenne

PDA

0

0,8

1,4

1,4

1,4

1,4

6,4

1,28

PDA+

Zingiber

officinale

0,5

1,8

2,8

3,3

4

4

15,9

3,18

1

1

2,3

3

4

4

14,3

2,86

2

0,6

1, 4

2

2,8

3

10,8

2,16

3

0

0

1

1

1

3

0,6

PDA+

Tephrosia

vogelii

0,5

0,5

1,1

1,2

2,2

4

9

1,8

1

0,3

0,5

0,8

2

4

7,6

1,52

2

0

0

0

1

4

5

1

3

0

0

0

0

0

0

0

PDA+ mélange (Z. et T.)

0,5

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0,8

1

1

2,8

0,56

2

1,2

2

2,4

3

3

11,6

2,32

3

1

2,1

3

3

4

13,1

2,62