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Bio-écologie des anophèles de part et d'autre de la falaise des Mbô et leur implication dans la transmission du paludisme d'altitude


par Billy TENE
Université de Yaoundé 1 - DEA 2007
  

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2.3.3.2. Détermination des formes moléculaires de An. gambiae s.s.

Ø 5' ... GCG C ... 3'

3' ... C GCG ... 5'

Principe : L'endonucléase Hhal (Haemophilus haemoliticus),enzyme de restriction, digèreles moléculesd'ADN et entraine leur rupture au niveau des sitesderestriction présentéecomme suit :

Protocole : Les produits de l'amplification sont distribués (10ul) dans des microtubes de 0,2ml contenant 15ul du "Master MIX" préalablement préparé sur glace (Tableau C, Annexe 1). Cet ensemble est placé à l'étuve (37°C) pendant au moins 3h ou toute une nuit.

Après digestion, on fait migrer le produit sur un gel d'agarose à 2% avec des témoins positifs (An. gambiae M et S) et le marqueur de tailles. L'ensemble sera photographié sous UV. Les tailles attendues sont 727 pb pour la forme M et 475 pb pour la forme S.

2.4. DETERMINATION DE L'INFESTATION DES ANOPHELES

La mise en évidence de l'infestation des anophèles femelles par Plasmodium a été faite par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui permet de détecter la protéine circumsporozoïte de Plasmodium (CSP) dans l'organisme des anophèles. La technique utilisée est celle de Burkot et al., (1984) améliorée par Wirtz et al., (1987).

Principe : Elle consiste à coupler la protéine CSP à un anticorps monoclonal de capture (ACm) anti-circumsporozoïte(anti-CSP) préalablement fixé sur la paroi des puits d'une plaque. Le complexe antigène-anticorps formé est ensuite révélé par un anticorps monoclonal anti-CSP couplé à la peroxydase (marqué). L'adjonction d'un substrat qui sera dégradé sous l'action de l'enzyme induit une réaction colorée visible et dont la densité optique sera mesurée par spectrophotométrie (figure 7).

Puits de la plaque

fixation

Ac

Ac : anticorps

Ag : antigène

Figure 8 :Schéma du principe de la technique "ELISA sandwich"

Protocole ELISA-CSP monospécifique : La tête et le thorax de chaque moustique sont coupés et placés dans des tubes numérotés. On y ajoute 20ul de Np40 (détergent qui facilite la destruction des tissuspar hydrolyse des protéines membranaires) et le tampon de broyage "Blocking Buffer" (BB) à raison de 2x190ul par tubes et on les broie. Ces broyats sont conservés pendant 1hà -20°C.

Chaque plaque ELISA (Plaque de Nunc à 96 puits) est sensibilisée à raison de 50ul d'ACm de capture par puits et laissée une nuità +4°C, ce qui permet l'adsorption de l'ACm sur les parois de la plaque. Le lendemain, les plaques sont vidées, puis sans les laver, 200ul de tampon BB sont mis dans chaque puits pour saturer les sites de fixation libres des ACm. Après 1h d'incubation à température ambiante, les plaques sont vidées de nouveau et 50ul du broyat de moustique sont ajoutésdans chaque puits. La colonne de négatifsne reçoit que du BB et pour les puits des témoins positifs, 50ul de protéine circumsporozoïtique de l'espèce (P. falciparum) sont utilisés (annexe 3).

Après 2h d'incubation les plaques sont vidées et lavées 2 fois au PBS/Tween20. Ensuite on ajoute une solution d'ACm conjugué à la peroxydase (50ul/puits) préparée 10 min à l'avance. Après 1h d'incubation à température ambiante, les plaques sont de nouveau vidées et lavées 4 fois au PBS/Tween 20. Le substrat préparé 5 min avant la fin de l'incubation est distribué à raison de 100ul/puits. Les plaques sont alors conservées 30 minutes à l'obscurité. La dégradation du substrat sous l'action de la peroxydase se traduit par une coloration bleue.

Cette réaction est stoppée en ajoutant 50ul d'acide sulfurique 4N par puits, ce qui change la coloration bleue en une coloration jaune. La lecture s'effectue au moyen d'un spectrophotomètre à 450 et 650 nm. L'intensité seuil des positifs est fixée à deux fois la moyenne des témoins négatifs. La composition des réactifs et les quantités utilisées sont présentées en annexe 4.

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