TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle

d) Epissage in vivo

Les cellules sont récoltées 24 heures après la transfection. La co-transfection avec le plasmide pCMV-luciférase permet la standardisation de la RT en fonction des différences observées dans l'efficacité de transfection. Une fraction aliquotée de ces cellules est utilisée pour mesurer l'activité luciférase et le reste est utilisé pour effectuer une extraction totale des ARNs. Les ARNs totaux sont préparés à partir des cellules en utilisant le protocole de purification d'ARN et d'après les instructions du fournisseur (RNeasy, Qiagen) et traité deux fois par la Dnase I (Qiagen). La qualité des ARNs obtenus est observée par migration sur un gel d'agarose dénaturant. Les isoformes de l'ARN E1A sont analysées par RT-PCR comme décrit précédemment (Hallier et coll., 1998). Un microgramme d'ARN est rétro-transcrit par la SuperscriptII transcriptase reverse du virus de la leucémie murine de Moloney (Gibco-BRL) en présence de 50 uM de dNTP et 2 picomoles du primer 3'RT E1A dans une solution de 8 ul. Environ un dixième de l'ADNc est utilisé pour la réaction d'amplification (PCR) réalisée avec la Taq polymérase ADN (Perkin Elmer) en présence de l'amorce 5'E1A marquée à son extrémité 5' par la T4 polynucléotide kinase (Boehringer) et de l'ATP P³² (Amersham) comme précédemment décrit (Hallier et coll., 1998). Le minimum de cycles PCR est utilisé (18 à 22 cycles) afin de détecter le signal dans une fenêtre de détection adéquate. Les réactions de contrôle de la RT-PCR contiennent une matrice ARN n'ayant pas subi de transcription inverse. Les produits de la RT-PCR de E1A sont mis à migrer sur un gel de polyacrylamide/urée 6 % dénaturant, autoradiographiés et quantifiés avec un système Biorad.. L'expression des protéines codées par les plasmides est vérifiée par la technique du Western Blot effectuée sur des échantillons de cellules transfectées d'où viennent les ARNs totaux.

e) Test de transactivation

La veille de la transfection, les cellules Cos-6 sont mises en puits, dans 5ml de DMEM-6% SVF décomplémenté à raison de 0,6x10⁶ par puits. Le jour suivant, le milieu est changé pour 4 ml de milieu frais. Dans chaque puits, sont ajoutés une solution de 1 ml préalablement incubée à température ambiante comprenant une solution plasmidique (TKGal, RARE-Luciférase,...), 450 ug d'eau bi-distillée en plus de 50 ul de CaCl₂ (2,5 M) et 500 ul de HBS 2X (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄ 1,2 mM, Glucose 12 mM, Hépès 50 mM).

Les cellules HL-60 sont électroporées avec une solution plasmidique équivalente.

Après une incubation de 12 heures à 37^oC, les cellules sont lavées 2 fois au PBS 1X. Un tampon de lyse (200 ul) est ajouté dans chaque puits et les cellules sont décollées à l'aide d'un grattoir. Les cellules sont récupérées dans des tubes Eppendorff, vortexées et centrifugées 2 min. à 12000g et à 4^oC. L'activité de la luciférase (selon le protocole de Luciferase Assay System, Promega, Madison, EUA) dans le lysat est mesurée dans un luminomètre et exprimée en unité arbitraire. L'activité de la -Galactosidase (selon le protocole de BM Chemiluminescence ELISA Substrate -Gal, Boehringer Mannheim, Mannheim, République Fédérale d'Allemagne) est également mesurée afin de normaliser les mesures obtenues de l'activité luciférase.