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TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à  travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle


par Eric Le Corvec
Université Paris 7 - DEA Biologie des cellules sanguines 2002
  

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III- RESULTATS

1. TLS est un co-activateur du RANC

Premièrement, nous avons analysé l'effet d'une surexpression transitoire de TLS sur l'expression d'un gène rapporteur (luciférase) sous le contrôle du promoteur RARß2 (Figure 4A). Nous avons utilisé comme modèle cellulaire les cellules hématopoïétiques HL-60. Ces cellules sont électroporées en présence de Tkßgal, pour évaluer l'efficacité de transfection et normaliser les résultats, de ßRARE-luc, utilisé comme gène rapporteur pour évaluer l'activité transcriptionnelle et de différentes quantités de vecteur d'expression de TLS, comme indiquées. pCS3, un plasmide contrôle est utilisé de telle façon que toutes les transfections aient la même quantité totale de plasmide d'expression (Figure 4). Les cellules sont récoltées 24 h après et l'activité luciférase est mesurée. Les valeurs représentent les moyennes des doublets réalisés. Des résultats similaires furent obtenus dans plusieurs expériences indépendantes.

Les résultats exprimés correspondant à l'augmentation de l'activité de la luciférase par rapport à un témoin négatif (cellules transfectées avec pCS3 seul, en absence de ligand).

Lors de la transfection en présence d'AR seul (1'), une augmentation de l'activité luciférase est observée. La co-transfection par pCS3-MT-TLS seul et RARE-luc (2 et 3) n'a pas d'effet sur l'induction de l'activité luciférase, sauf en présence d'AR (ATRA 10-6 M) (2' et 3', multiplié par 25, en présence de 5 ug et 10 uG de TLS (Figure 4B). Ces résultats suggèrent que TLS augmente l'activité transcriptionnelle induite par les récepteurs endogènes dans les cellules HL-60.

Afin de déterminer que la co-activation par TLS agit par et grâce au RANC, nous avons utilisé des cellules Cos-6 possédant peu de récepteurs aux rétinoïdes endogènes que nous avons transfectées avec les plasmides d'expression de RAR et de RXR. Les cellules Cos-6 sont donc co-transfectées au chlorure de calcium avec les plasmides TKgal et RARE, comme décrit précédemment.

Figure 4 . TLS augmente l'activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires à l'acide rétinoïque dans les cellules HL-60. A, schéma descriptif de la construction utilisée dans le test de transactivation. B, L'activation transcriptionnelle du RARE a lieu avec l'AR seul ou avec TLS de façon dépendante de l'AR dans les cellules HL-60.

Dans la Figure 5, les contrôles (1 et 4) indiquent la transactivation basale du gène rapporteur. Lors de la transfection en présence d'AR seul (1' et 4', multiplié par 40) ou avec TLS (2', 3', 5', 6' et 7'), une induction est observée. L'induction est optimale avec 2 ug de TLS (3' et 5', multiplié par 85). TLS est donc un co-activateur du complexe transcriptionnel des récepteurs RAR et RXR, dépendant de l'AR. A des quantités plus importantes, 5 ug et 10 ug de TLS (6' et 7'), une diminution de l'induction en présence d'AR, inférieure au niveau atteint en absence de TLS, est observée. Cette diminution pourrait être dû à un effet de « quenching » ou à l'effet de TLS qui, en grandes quantités, empêcherait RXR de se lier à l'ADN.

L'ensemble de ces résultats indiquent que la protéine TLS est un co-activateur de la transcription par les récepteurs à l'AR. TLS semble donc impliquée dans la voie de signalisation de l'AR.

Figure 5 A et B. TLS agit comme co-activateur du RANC, de façon dose dépendante. Les deux expériences sont réalisées indépendamment.

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