Republique Algerienne Democratique et Populaire

Ministere de 1'Enseignement Superieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE AMAR TELIDJI LAGHOUAT

FACULTE DES SCIENCES ET DE L'INGENIERIE
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

_4,A^y=k=4;

MEMOIRE DE FIN D'ETUDES
En vue de l'obtention du diphime d'Ingenieur d'Etat en Biologie
Option : Genie Biologique

Thême

Effets des extraits de quelques plantes

medicinales locales sur les enzymes: a-amylase,

trypsine et lipase

Presents par : Encadre par :

· BENAROUS Khedidja YOUSFI Mohamed

n DJERIDANE Amar

Je dedie ce modeste travail a

mes parents, qui m'ont encourage,

mes freres et sours qui m'ont supporte.

Remerciements

Que toutes les personnes m'ayant permis de mener a bien ce travail de these soient assurees de ma gratitude.

Je tiens a remercier M D. Benbertal Directeur du Laboratoire des sciences fondamentales de l'Universite AMAR TELIDJI de Laghouat de m'avoir accueilli et d'avoir mis a ma disposition tout le materiel necessaire.

Je tiens a exprimer mes sinceres remerciements au Dr M YOUSFI, Maitre de conferences a l'Universite de Laghouat, responsable de cette etude, pour avoir accepte de m'encadrer, pour le choix du theme et pour avoir partici* activement a la correction de ce manuscrit afin de realiser cette etude. Ses competences techniques et son efficacite ont fortement contribue a la realisation de cette these.

Mes sinceres remerciements iront egalement a Monsieur A. Djeridane, Co-promoteur de ce memoire. Son aide et sa disponibilite ont ete des atouts precieux.

Tout au long de ce travail de longue haleine qui m' a oblige a consulter une bibliographie consequente, Un grand merci au Dr M OUI1VTEN et a M A. SARIDI pour les efforts consentis de leur part.

Mes profondes reconnaissances a l'ensemble des enseignants du departement de biologie, Universite de Laghouat pour m'avoir appris l'autonomie, la debrouille et l' auto-critique.

Une tendre pens& pour mes parents, pour leur patience, leur presence a mes cotes et leur contribution a l'elaboration de ce manuscrit.

Je tiens a remercier mon oncle M BENAROUS Belabbes pour son aide relatif aux plantes medicinales sahariennes et egalement remercier mon oncle M BENAROUS Kamal pour ses conseils appreciables.

Je remercie egalement mon oncle M LAHDEB Mohamed pour ces precieux conseils durant tout mon cycle universitaire et egalement remercier mon oncle M LAHDEB Hadj pour son soutien.

Une pens& amicale aux collegues etudiants et etudiantes du Departement Biologie pour leur soutien et leur aide.

Un grand merci a toutes les personnes qui m'ont soutenu de pres ou de loin au cours de la realisation de ce modeste travail.

Je voudrai remercier Messieurs les membres du jury d'avoir accepte d'evaluer cette

these.

Liste des figures

Figure II. 1. Squelette de base des flavonoIdes. 28

Figure III. 1. Mecanisme reactionnel de la formation du produit. 35

Figure III. 2. Graphe de Michaelis-Menten: V_o en fonction de [S]. 36

Figure III. 3. Graphe de Lineweaver-Burk: 1/Vo en fonction de 1/[S]. 37

Figure III. 4. Mecanisme reactionnel de la formation du produit en presence 38
d'inhibiteur.

Figure III. 5. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 38
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur competitif.

Figure III. 6. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 39
competitivement decrite dans la Figure 111.5.

Figure III. 7. Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. 39

Figure III. 8. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 40
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur incompetitif.

Figure III. 9. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 40
incompetitivement decrite dans la Figure 111.8.

Figure III. 10. Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. 40

Figure III. 11. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat 41
pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur non competitif.

Figure III. 12. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee 41
non competitivement decrite dans la Figure MA 1.

Figure III. 13. Structure de l'alpha amylase. 43

Figure III. 14. Les inhibiteurs : l'acarbose et l'octapeptide de la reaction catalysee par 44
l'amylase.

Figure III. 15. Structure schematique de la trypsine. 46

Figure III. 16. Voies d'activation des proenzymes et du PAR-2 par la trypsine. 48

Figure III. 17. Structure tridimensionnelle de la lipase pancreatique humaine. 49

Figure IV. 1. La poudre de chaque plante apres le broyage. 54

Figure IV. 2. Le lavage par l'hexane de deux extraits des plantes Zewadet Elkhrouf et 55
Gondale.

Figure IV. 3. Les extraits alcooliques bruts. 56

Figure IV. 4. L'acide gallique. 57

Figure IV. 5. Figure IV. 6. Figure IV. 7. Figure IV. 8. Figure IV. 9. Figure V. 1. 1. Figure V. 1. 2. Figure V. 1. 3. Figure V. 1. 4. Figure V. 1. 5.

Figure V. 1. 6.

Figure V. 2. 1. Figure V. 2. 2. Figure V. 2.3. Figure V. 2. 4.

Figure V. 2. 5.

Figure V. 3. 1. Figure V. 3.2. Figure V. 3.3. Figure V. 3.4.

Figure VI. 1.

Figure VI. 2. Figure VI. 3 Figure VI. 4. Figure VI. 5.

La courbe d'etalonnage de l'acide gallique. 57

Le spectrophotometre UV- visible de Shimadzu 1601. 57

La catechine. 59

La courbe d'etalonnage de la catechine. 59

La teneur en composes phenoliques et en flavonokles des plantes. 61

L'action de l'a- amylase sur l'amidon. 65

La courbe d'etalonnage de maltose. 66

La cinetique enzymatique de l'a amylase. 67

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme a- amylase. 67

Representations graphiques 1/V = f ([polyphenols]) de chaque extrait 68
phenolique tel que 1/V (s/ADO). ([S₃]> [S₂]> [S1]).

Le taux d'inhibition de l'a amylase avec deux concentrations 70
d'inhibiteur croissantes (Rd < [I₂]) et une seule concentration de substrat.

L'action de la trypsine sur le BAPNA. 72

La cinetique enzymatique de la trypsine. 73

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme trypsine. 73

Representation graphique 1N = f ([polyphenols]) de Foulia tel que 74
([S_i] < [S₂] < [S₃] < [S₄] < [S₅]).

77

78

78

79

84

85

86

87 88

Le taux d'inhibition de la trypsine avec une concentration fixe de 75
substrat et d'inhibiteur.

L'action de la lipase sur l'huile de maIs.

La cinetique enzymatique de la lipase.

Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne lipase. Le taux d'inhibition de la lipase avec trois concentrations d'inhibiteur croissantes ([I_i] < [1₂] < [I₃]) et une seule concentration de substrat.

.

Piegeage des ERO (R) par les flavonokles.

Elements essentiels pour l'activite antioxydante des flavonokles. La reaction entre le DPPH et l'hydroquinone.

Les graphes PI =f (C) de chaque plante.

Classement croissant des plantes selon leur EC50.

Liste des tableaux

Tableau II. 1. Tableau III. 1. Tableau IV. 1. Tableau IV. 2. Tableau IV. 3. Tableau V. 1. 1. Tableau V. 3. 1. Tableau V. 2. 1. Tableau V. 1. 2. Tableau VI. 1.

Les principales classes des composees phenoliques. Classification des enzymes selon la reaction catalysee. La couleur et l'aspect de chaque extrait phenolique. La teneur en phenols totaux des plantes investiguees.

24 42

56 58 60 69 69 75 81 90

La teneur en flavonoIdes et leur pourcentage des plantes investiguees. Le type d'inhibition et la constante d'inhibition de chaque plante.

Le pourcentage d'inhibition de chaque plante. Le pourcentage d'inhibition de chaque plante.

Le pourcentage d'inhibition de chaque plante. Les EC₅₀ de chaque plante.

Table des matieres

Introduction generale 10

Bibliographie 12

Partie bibliographique 13

I. les plantes medicinales 14

1. La phytotherapie 15

1.1. La phytotherapie, une medecine vieille comme le monde 15

1.2. La definition de la phytotherapie 15

1.3. Avantages de la phytotherapie 15

2. Les plantes medicinales 16

2.2. Importance de l'utilisation des plantes medicinales 16

2.3. Fiches monographiques des plantes investiguees 17

Bibliographie 21

II. Les composes phinoliques 22

1. Les composees phenoliques ou les polyphenols 23

2. Classification des composes phenoliques 23

2.1. Les flavonoides 28

2.2. Les proprietes des flavonoides 29

3. Dans une cellule vegetale oil se trouve chaque compose phenolique ? 29

4. Role et interet des polyphenols 30

5. Quelques exemples d'implication industrielle des composes phenoliques 30

5.1. Utilisation des tanins 31

5.2. Importance des composes phenoliques dans la qualite du bois 31

Bibliographie 32

III. Les enzymes 33

1. Historique 34

2. Definition d'un enzyme 34

3. La specificite enzymatique 34

4. La cinetique enzymatique 35

4.1. L'activite enzymatique 35

4.1.1. Reaction catalysee par une enzyme 35

4.1.2. Linearisation de l'equation de Michaelis-Menten 36

4.2. L 'inhibition enzymatique 37

4.2.1. Les inhibiteurs 37

4.2.2. Les types d'inhibition

4.2.2.1. Les inhibiteurs competitifs

4.2.2.2. Inhibition incompetitive 4.2.2.3. Les inhibiteurs non-competitifs

5. Classification des enzymes

6. Les enzymes etudies

6.1. La a amylase

6.1.1. La reaction specifique

6.1. 2. Interet de l'inhibition de l'alpha amylase

6.2. La trypsine

6.2.1. La reaction specifique

6.2.2. Interet de l'inhibition de la trypsine

6.3. La lipase

6.3.1. La reaction specifique

6.3.2. Interet de l'inhibition de la lipase

Bibliographie

La partie experimentale

IV. Extraction et quantification des composies phinoliques

1. Extraction des composes phenoliques

2. Quantification des composees phenoliques

2.1. Dosage des phenols totaux 2.1.1. La courbe d'etalonnage 2.1.2. Traitement des echantillons 2.1.3. Resultats et discussion

2.2. Dosage des flavonoides 2.2.1. La courbe d'etalonnage 2.2.2. Resultats et discussion

3. Conclusion

Bibliographie

V. Effets des extraits phinoliques sur les enzymes

a- Amylase

1. Principe de la methode

2. Procedure experimentale 3. Resultats et discussion

Conclusion

Ttypsine 71

1. Principe de la methode 72

2. Procedure experimentale 72

3. Resultats et discussion 73

4. Conclusion 75

Lipase 76

1. Principe de la methode 77

2. Procedure experimentale 77

3. Resultats et discussion 77

4. Conclusion 80

Bibliographie 81

VI. Evaluation de l'activite antioxydante 82

1. Les radicaux libres 83

1.1. Les differents types des radicaux libres 84

2. L'activite antioxydante et les antioxydants 85

2.1. L'activite antioxydante 85

2.2. Les antioxydants 85

2.2.1. Les antioxydants synthetiques 85

2.2.2. Les antioxydants naturels 86

3. Test de DPPH 86

3.1. Principe de la methode 86

3.2. Procedure experimentale 86

3.3. Resultats et discussion 87

4. Conclusion 90

Bibliographie 91

Conclusion generale 92

Index des noms latins 94

introduction

La medecine alternative ou la phytotherapie est Part de guerir par les plantes, elle est aussi la connaissance et l'utilisation de leurs proprietes therapeutiques (Philippe Sionneau, 2006). La phytotherapie suscite actuellement un renouveau d'intere^st, son efficacite est prouvee et elle est toujours vue comme un remede surtout utilise par la population rurale a travers le monde.

Les plantes medicinales sont douees de cette efficacite a cause de ses metabolites secondaires ou ses principes actifs : les composes phenoliques, les alcalokles, les huiles essentielles... Notre pays est riche de ce type des plantes qui sont utilisees en medecine traditionnelle.

Les composes phenoliques ont un effet inhibiteur sur les enzymes (M. Yousfi et al, 2006) et ils sont connus par son pouvoir antioxydant ((M. Yousfi et al, 2007), ce qui prouve leur utilisation therapeutique.

Les enzymes qui seront etudiees dans ce travail sont : l'a- amylase qui degrade les polymeres glycosidiques ce qui cause l'augmentation du taux de glucose chez les diabetiques (Myo-Jeong Kim et al, 1999), la trypsine qui coupe les liaisons peptidiques specifiques ce qui active d'autres enzymes dans le pancreas peuvent étre responsables de la pancreatite (D. Page et al, 2000) et la lipase qui degrade les triglycerides en acides gras ce qui permet leur stockage dans le tissu adipeux causant l'obesite (May Faraj et al, 2004).

Les plantes sahariennes utilisees dans cette recherche sont recoltees de la region de Laghouat, elles sont de diverses familles botaniques douees de differentes caracteristiques, apres la connaissance et l'identification de ces sept plantes, nous avons cherche si les extraits phenoliques des plantes possedent le pouvoir inhibiteur de ces enzymes ou non.

Dans ce travail, on commence par quelques connaissances bibliographiques concernant la phytotherapie et les plantes etudiees, dans un deuxieme chapitre on s'interesse aux metabolites secondaires « les composes phenoliques », dans le dernier chapitre nous avons evoque les enzymes etudies et Pinter& de leur inhibition.

L'objectif principal de ce travail est d'evaluer l'effet inhibiteur des extraits des plantes en faible concentration sur l'activite des trois enzymes cites ci-dessus et d'utiliser ces plantes comme une cure de certaines maladies.

Bibliographie

· D. Page, L. Quillien, and G. Duc, 2000, Trypsin inhibitory activity measurement:
simplifications used for pea seed, published in Crop Sci. Volume 40, pp 1482-1485.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, S. Maamri, F. Djireb, P. Stocker, December 2006, Phenolic extracts from various Algerian plants as strong inhibitors of porcine liver carboxylesterase, J Enzyme Inhib Med Chem, Volume 21, No 6, pp 719-726.

· M. Yousfi, A. Djeridane, B. Nadjemi, N. Vidal, JF. Lesgards and P. Stocker, April 2007, Screening of some Algerian medicinal plants for the phenolic compounds and their antioxidant activity, J European Food Research and Technology, Volume 224, No 6, pp 801-809.

· May Faraj, Allan D. Sniderman, and Katherine Cianflone, April 2004, ASP enhances in situ lipoprotein lipase activity by increasing fatty acid trapping in adipocytes, Journal of Lipid Research, Volume 45, 657-666.

· Myo-Jeong Kim, Soo-Bok Lee, Hee-Seob Lee, Su-Yong Lee, Jin-Sook Baek, Doman Kim, Tae-Wha Moon, John F. Robyt, and Kwan-Hwa Park, 1999, Comparative Study of the Inhibition of a-Glucosidase, a-Amylase and Cyclomaltodextrin Glucanosyltransferase by Acarbose, Isoacarbose, and Acarviosine#177;Glucose, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume. 371, No. 2, pp. 277-283.

· Philippe Sionneau, 2006, La phytotherapie chinoise moderne, p500.

Var6e

06(ioirapkque

.&so plantes

Macinaies

1. La phytotherapie

La phytotherapie, c'est l'emploi de medicaments vegetaux pour soigner les differents maux dont vous pouvez étre victime.

A travers les siecles, les hommes ont su developper la connaissance des plantes et de leurs proprietes therapeutiques.

Aujourd'hui, l'efficacite prouvee et les bienfaits incontestables de la phytotherapie pour notre sante lui ont permis d'entrer dans nos vies de tous les jours (Gildo Pastor, 2006). 1.1. La phytotherapie, une medecine vieille comme le monde

Les fruits, les racines, les plantes et autres substances naturelles ont toujours ete connues pour leurs proprietes nutritives, mais aussi pour leurs vertus curatives.

Le premier texte ecrit sur la medecine par les plantes est grave sur des tablettes en argile en caractere cuneifonne et date de la civilisation sumerierme, 3000 ans avant Jesus-Christ. Durant des milliers d'armees, la phytotherapie a constitue la principale source de remedes contre de nombreuses maladies (Larousse Encyclopedie MEMO, 1999).

1.2. Avantages de la phytotherapie

L'ethnobotanique est une discipline scientifique dont le but est de mieux cormaitre les pharniacopees traditionnelles utilisees dans certaines regions. L'inventaire partiel etabli dans divers pays par l'organisation mondiale de la sante repertorie environ 20 000 plantes medicinales. Parmi les 250 000 especes de plantes que compte actuellement notre planete, moms de 10% ont fait l'objet d'analyses chimiques fines pour detecter d'eventuels principes actifs. Une etude plus systematique des plantes medicinales pourrait se traduire par la decouverte de nouveaux medicaments utilisables.

Tous les organes d'une plante medicinale ne sont pas forcement actifs ; suivant les especes, on utilise les fleurs, les feuilles, les fruits, les tiges, les ecorces ou les racines. L'epoque et le moment de la cueillette ont une grande influence sur l'activite therapeutique, car les phenomenes biochimiques qui ont lieu dans les cellules vegetales dependent de la photosynthese et de phenomenes hormonaux qui dependent du rythme solaire.

Les substances contenues dans les plantes sont de nature chimique variee ; certaines sont solubles dans l'eau, d'autres dans l'alcool ethylique, d'autres encore dans l'huile. A partir des plantes medicinales, on peut obtenir differentes preparations : infusions, decoction, maceration dans l'alcool (teinture) ou dans l'huile (extraction huileuse, plus rare), etc. Les plantes peuvent aussi étre consommees entieres, fraiches ou seches, reduites en debris plus ou moms fins, eventuellement conditiormees en gelules. Les seves et secretions sont egalement utilisees dans certains cas. Il est enfm possible d'en extraire chimiquement des principes actifs en vue de leur utilisation therapeutique.

Certaines plantes sont inoffensives, mais d'autres, tits nombreuses (digitale, belladone, colchique, etc.), sont toxiques et ne sont utilisees que sous des formes bien contrOlees, exclusivement commercialisees en pharmacie. L'emploi inconsidere de plantes cueilles dans la nature peut aboutir a des intoxications graves, voir mortelles (Larousse Encyclopedie MEMO, 1999).

2. Les plantes medicinales

En botanique et en pharmacie, les plantes medicinales sont reconnues pour offrir, par leur administration, un effet bienfaisant et therapeutique sur l'organisme. Employees depuis la plus haute antiquite, souvent en relation avec des pratiques magiques, leurs proprietes reelles ont, a toute époque, ete exagerees, ou niees, ou deformees selon les croyances en vigueur. A l'epoque moderne, les progits de la biochimie et de l'analyse organique, ainsi que ceux de la physiologie vegetale, ont permis de commencer un tri scientifique dans la masse des actions attribuees aux simples, detruisant certaines legendes, mais etablissant solidement certains usages empiriques anciens. Il est assure que, pour obtenir des resultats utiles, it convient de se documenter au moyen d'ouvrages serieux en vue de l'identification botanique des plantes choisies et de la verification de leurs proprietes : certaines espêces ont des actions parfois differentes, et méme contraires de celles qui leur avaient ete attribuees traditionnellement. Méme pour les plantes medicinales qui repondent bien a leur renommee, le choix des varietes, celui du terrain sur lequel elles poussent, de la saison ou de l'heure du jour oil on les cueille, sont des facteurs tits importants, pouvant modifier jusqu'a 100 p. 100 la teneur en principes actifs physiologiquement (Universalis, 2006).

2.1. Importance de l'utilisation des plantes medicinales

Il est acquit que les plantes medicinales sont en mesure de soigner des maladies simples comme le rhume, ou d'en prevenir de plus importantes comme l'ulcêre, la migraine, l'infarctus en plus de certaines allergies ou affections. Si l'on y ajoute leurs vertus reparatrices, tonifiantes, sedatives, revitalisantes ou immunologiques, on mesure mieux l'aide precieuse qu'elles sont susceptibles de nous apporter au quotidien (Anonyme, 2005).

Chapitre I: les plantes medicinales

2.2. Fiches monographiques des plantes investiguees Atractylis serratuloides

Nom vernaculaire : Serr, j^mall

Famille : Compositae (Asteraceae)

Descriptions Botaniques :

Plante vivace a tiges epaisses dressees de 20 a 30 cm de haut, tres ramifiees a toutes les hauteurs, a rameaux tres feuilles.

Feuilles tres epineuses a epines jaune fonce, les fleurs Carminees.

Habitat : Pfitures semi arides, hauts plateaux, Regs caillouteux et les hamadas.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : partie aerienne (feuilles, fleurs, tiges). Mode d'emploi : Extraction des racines un latex "Loubene".

Intere^st pastoral: C'est une plante broutee par les dromadaires (Dr A. Chehma, 2006).

Astragalus armatus

Nom commun : Astragale,

Nom vernaculaire : Gondale, JI
·l

Famille : Legumineuse

Descriptions Botaniques :

Arbrisseau tres dense a rameaux dresses de taille 50 cm a 1 metre, les feuilles fraiches bien vertes avec de nombreuses petites folioles, les fleurs blanches sont nombreuses.

Habitat : la zone predesertique du Sahara septentrional. Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : racines.

Mode d'emploi : broutee par les dromadaires (Dr A. Chehma, 2006).

Astragalus vogelii fatimensis

Nom vernaculaire : Foulia, ;¹³...9ⁱ

Famille : Fabaceae.

Descriptions Botaniques :

est une plante herbacee, feuilles pennees a folioles ovales. Nombreuses petites fleurs jaunes portees sur une hampe florale. Gousses courtes, globuleuses, en forme de grain de ble et recouvertes de longs poils, la feuille est composee renfermant entre 3 et 8 folioles et terminee par une vrille ramifiee (Sahara-nature).

Habitat : Sahara central et occidental.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : partie aerienne.

Mode d'emploi : alimentation des animaux.

Haloxylon scoparium

Nom vernaculaire : Remth, eLAJ1

Famille : Chenopodiacees

Descriptions Botaniques :

Ce petit buisson dense et sombre, est tres frequent sur les regs a sols gypseux, ses fleurs sont discretes mais a la fin de l'automne, l'extremite de ses rameaux se couvre de fruits.

Habitat : Pfitures semi arides, hauts plateaux.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriennes (fleurs).

Mode d'emploi :

Phannacopee: Ses rameaux, ses feuilles et ses fleurs (en decoction, en maceration, en cataplasme), sont utilises pour les traitements des indigestions, des piqines de scorpion et des dermatoses (Dr A. Chehma, 2006).

Helianthemum lippii, Helianthemum ellipticum

Nom vernaculaire : Reguig, cliki31

Famille : Cistaceae

Descriptions Botaniques :

Arbrisseau vivace de taille 30 a 40 cm, tres rameux a feuilles sessiles couvertes de tres courts poils ce qui donne une couleur blanchfitre a la plante. L'ecorce des rameaux est egalement blanchfitre. Petites fleurs jaunes sessiles a cinq petales en grappes peu fowl-lies.

Habitat : Dans tout le Sahara.

Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriermes.

Mode d'emploi :

Phannacopee: en poudre ou en compresse, pour les traitements des lesions cutanees.

Intere^st pastoral: Elle tres appreciee par les dromadaires et les chevres (Dr A. Chehma, 2006).

Plantago ciliata

Nom vernaculaire : Lelma, U.1

Famille : Plantaginaceae

Descriptions Botaniques :

Plante herbacee annuelle de petite taille 10 a 15 cm de haut a tige tres courte, les feuilles naissent a la base de la plante, sont lanceolees etroites velues.

Fleurs petites et verddtres en epis globuleux.

Habitat : sur les sols sableux et gravillonnaires, dans les depressions et lits d'oued (Dr A. Chehma, 2006) Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriermes (fleurs).

Mode d'emploi : Elle est utilisee comme cicatrisante des blessures et pour les traitements des inflammations de la gorge et des ulceres (Dr A. Chehma, 2006).

If loga spicata

Nom vernaculaire : Zwadet Elkhrouf, 1-4)&31 U..1) Famille : Compositae (asteraceae)

Descriptions Botaniques :

Petite plante de taille 3 a 10 cm, a tige centrale dressee, emettant de nombreux rameaux couches puis releves. On rencontre plus frequemment la plante sous son aspect sec que vert.

Les rameaux sont couverts de feuilles etroites obtuses couvertes de poils appliqués. Les tres nombreux capitules floraux sont disposes en Mice tres sen-ee ce qui donne a la plante un aspect de boudin (Sahara-nature).

Les fleurs discrêtes blanc-jaunatre sont entourees de bractees devenant jaune pale brillant en sechant. Habitat : Espêce saharo-arabique, commune dans tout le Sahara, dans les sols pierreux (Dr A. Chehma, 2006). Recolte : octobre 2006.

Parties Utilisees : parties aeriennes.

Phannacopee: Ecrasee, elle est utilisee pour le traitement des lesions cutanees.

Inter& pastoral: Elle est broutee par les dromadaires.

Chapitre I: les plantes medicinales

Bibliographie

· Anonyme, 2005, Ministêre de l'Agriculture Et du Developpement Rural, Unite De Conservation et de Developpement - Batna.

· Dr Abdelmajid Chehma, juin 2006, catalogue des plantes spontanees du Sahara septentrional algerien, edition Dar Elhouda, AM mlila, p 22, 32, 66, 73, 81, 104.

· Gildo Pastor, septembre 2006, Précis de phytotherapie, edition Alpen, p 3,4.

· Larousse Encyclopedie MEMO, 1999, l^e" edition Montreal (Quebec), p182.

· Les photos des plantes sont clichees par M. M. Benarous en mai 2007 de la localite

de AM Madhi, Laghouat.

· Les plantes sahariennes sont identifiees par M A. DJERIDANE et confirme par Dr M OUINTEN et M A. SARIDI.

· Universalis Encyclopedia (CD), 2006.

· www.sahara-nature.com.

Chapitre II: les composes phenoliques

Une des originalites majeures des vegetaux reside dans leur capacite a reproduire des substances naturelles tres diversifiees. En effet, a cote des metabolites primaires classiques (glucides, protides, lipides, acides nucleiques), ils accumulent frequemment des metabolites dits « secondaires » dont la fonction physiologique n'est pas toujours evidente mais qui represente une source importante de molecules utilisables par l'homme dans des domaines aussi differents que la pharmacologie ou l'agroalimentaire. Les metabolites secondaires appartiennent a des groupes chimiques varies (alcalokles, temenes, composes phenoliques...) qui sont tres inegalement repartis chez les vegetaux mais dont le niveau d'accumulation peut quelquefois atteindre des valeurs elevees. La notion de « metabolite secondaire » resultait initialement de trois groupes d'observations : d'abord une difficulte a attribuer a ces metabolites une fonction precise dans la physiologie méme de la plante, ensuite une repartition tres inegale selon les vegetaux, quelquefois entre des especes ou varietes a l'interieur d'une méme espece, enfm une certain « inertie biochimique » car ces substances sont rarement remobilisees dans la plante apres qu'elles y ont ete accumulees (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

1. Les composees phenoliques ou les polyphenols

Le terme volyphenols» est frequemment utilise dans le langage courant et méme dans des articles scientifiques ou de vulgarisation pour designer l'ensemble des composes phenoliques des vegetaux. En fait, it devrait étre reserve aux seules molecules presentant plusieurs fonctions phenols. Ce qui exclurait alors les monophenols, pourtant abondants et importants chez les vegetaux. Donc la designation generale «composes phenoliques» concerne a la fois les mono-. di- et polyphenols dont les molecules contiennent respectivement une, deux ou plusieurs fonctions phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

2. Classification des composes phenoliques

Plusieurs milliers de composes phenoliques ont ete caracterises jusqu'a aujourd'hui chez les vegetaux. Bien qu'etant tres diversifies, ils ont tous en commun la presence d'un ou de plusieurs cycles benzeniques portant une ou plusieurs fonctions hydroxyles.

Les composes phenoliques peuvent étre regroupes en de nombreuses classes (Tableau II. 1) qui se differencient d'abord par la complexite du squelette de base (allant d'un simple C6 a des formes tres polymerisees) ensuite par le degre de modifications de ce squelette (degre d'oxydation, d' hydroxylation, de methylation...), enfin par les liaisons possibl es de ces molecules de bases avec d'autres molecules (glucides, lipides, proteins, autres metabolites secondaires pouvant étre ou non des composes phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

Tableau IL1 : Les principales classes de composees phenoliques (Jean-Jacques Macheix et al, 2005)

Parmi les composes phenoliques les flavonokles occupent une large classe.

2.1. Les flavondides

L'ensemble des flavonokles, de structure generale en C15 (C6-C3-C6), comprend a lui seul plusieurs milliers de molecules regroupees en plus de dix classes dont certaines ont une tres grande importance biologique et technologique: les anthocyanes, pigments rouges ou bleus, les flavones et les flavonols, de couleur creme ou jaune clair, les flavanes dont les produits de condensation sont a l'origine d'un groupe important de tannins et les isoflavones qui jouent un role dans la sante humaine.

Figure ILL Squelette de base des flavonokles (Abdelghafour MARFAK, 2003).

C'est d'abord la structure de l'heterocycle central et son degre d'oxydation (Figure II.1) qui pennettent de distinguer les differentes classes de flavonokles. Le cas extreme d'oxydation (le l'heterocycle central correspond aux anthocyanidines, toujours presentes en milieu acide sous forme d'un cation de couleur rouge, dit cation flavylium. Au contraire, dans le cas des flavanes (flavane-3-ols comme la catechine; flavane-3,4-diols (quelques fois denommes leucoanthocyanes car ils peuvent dormer des anthocyanes rouges sous l'action d'un acide), le cycle central est tres fortement reduit. On trouve des situations intennediaires chez les flavanones, les flavones, les flavonols et d'autres groupes. Exceptionnellement, le noyau central de la molecule peut ne pas étre totalement cyclise (chez les chalcones et molecules voisines) ou se presenter sous forme d'un cycle ne presentant que 5 sommets (cas des aurones, de couleur generalement jaune vif).

A l'interieur de chacune des classes, les variations autour du squelette chimique de base en C15 portent principalement sur trois points:

- Le degre d'hydroxylation : des differents cycles: ainsi, le cycle B est mono-hydroxyls chez le kaempferol ou la pelargonidine, di-hydroxyls chez la quercetine ou la cyanidine, trihydroxyle chez la myricetine ou la delphinidine. Il en resulte des differences de spectre d'absorption donc de couleur chez les anthocyanidines et les autres pigments.

- Le niveau de methoxylation : (groupements O-CH₃ a la place des seules fonctions phenoliques) : La methoxylation diminue l'hydrosolubilite des molecules qui, dans des cas extremes, sont alors presentes dans les exsudats de certains bourgeons (peuplier) ou liees a des structures lipidiques comme les cires de feuilles d'eucalyptus.

- Le niveau de glycosylation : en dehors de quelques exceptions (d'une part le groupe des flavanes et d'autre part quelques flavonokles excretes dans les exsudats) les flavonokles des vegetaux sont presque tous lies a des sucres. A ce titre, ils appartiennent au grand groupe des heterosides, la partie phenolique representant ici l'aglycone. Il en resulte une complication dans la nomenclature que nous expliciterons seulement dans le cas des anthocyanes. Ainsi, alors que le terme « anthocyanes » a une valeur generale (designant soit les formes naturelles glycosylees soit la molecule non glycosylee), la partie phenolique seule est designee sous le nom d' anthocyanidines (par exemple la pelargonidine ou la malvidine), alors que l'heteroside (molecule phenolique + sucre associe) prend celui d' « anthocyanine » (la pelargonine ou la malvine). Des regles semblables ou voisines sont adoptees pour les autres flavonokles (par exemple la quercetine designant l'aglycone alors que la quercitrine correspond a ce méme aglycone lie au rhamnose (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

2.2. Les proprietes des flavondides

Une des proprietes majeures des flavonokles est de contribuer a la couleur des plantes et notamment a celle des fleurs. Or, c'est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une &ape fondamentale de sa reproduction. On peut egalement noter que les flavonokles, en repoussant certains insectes par leur gout desagreable, peuvent jouer un role dans la protection des plantes.

Par ailleurs, les flavonokles presentent un intere^st therapeutique qui date de la decouverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l'Universite de Szeged (Hongrie), qui a constate que les symptOmes hemorragiques du scorbut, lies a la fragilite ou l'hyperpermeabilite des vaisseaux, etaient gueris par des extraits de paprika ou de jus de citron, riches en vitamine C et flavonokles. Cette action a ete appelee proprietes vitaminique P (P etant la premiere lettre du mot permeabilite).

3. Dans une cellule vegetale oft se trouve chaque compose phenolique ?

Une des caracteristiques des composes phenoliques, qu'ils partagent generalement avec l'ensemble des metabolites secondaires, est de montrer une repartition tress inegale chez les differentes especes vegetales et, pour une méme espece, selon la variete et le stade de developpement physiologique ; les variations sont egalement considerables selon la nature des tissus et des cellules composant le vegetal.

Les variations chimiques rapportees precedemment ont comme consequence de modifier profondement la solubilite des molecules dans l'eau et d'entrainer des modifications significatives de leur repartition dans la cellule vegetale. On observe ainsi une

compartimentation nette des composes phenoliques avec deux localisations principales bien distinctes:

- D'une part, la vacuole oil sont presents tous les composes ayant un caractere hydrophile plus ou moins marque. Ils correspondent a la plupart des formes simples decrites precedemment et a certaines formes polymerisees comme les tannins. Il faut rappeler que la glycosylation tres frequente des molecules phenoliques augmente considerablement hydrosolubilite.

- D'autre part, la paroi oil sont retrouvees la lignine et les differentes formes liees aux structures lipidiques, Dans les tissus oil la plupart des cellules sont mortes (le bois par exemple), les composes phenoliques, et en particulier les flavonokles, se retrouvent alors adsorbes sur les structures parietales. Par ailleurs, certains flavonokles simples a caractere apolaire (par exemple des formes tres methylees de flavonokles) peuvent egalement étre presents dans des exsudats a la surface de bourgeons ou de feuilles (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

4. Role et interet des polyphenols

Le role des composes phenoliques est maintenant reconnu dans differents aspects de la vie de la plante et dans l'utilisation que fait l'homme des vegetaux. Ils peuvent en effet intervenir:

· dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification. regulation de la croissance, interactions moleculaires avec certains microorganismes symbiotiques ou parasites...).

· dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique (relations avec les bacteries, les champignons, les insectes, resistance aux UV), soit directement dans la nature soit lors de la conservation apres recolte de certains vegetaux.

· dans les criteres de qualite (couleur, astringence, amertume, qualites nutritionnelles...) qui orientent les choix de l'homme dans sa consommation des organes vegetaux (fruits, legumes, tubercules...) et des produits qui en derivent par transformation.

· dans les variations de certaines caracteristiques des vegetaux lors des traitements technologiques (preparation des jus de fruits, des boissons fermentees...) pendant lesquels apparaissent frequemment des brunissements enzymatiques qui modifient la qualite du produit fini.

· dans la protection de l'homme vis-à-vis de certaines maladies en raison de leur interaction possible avec de nombreuses enzymes et de leurs proprietes antioxydantes (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

5. Quelques exemples d'implication industrielle des composes phenoliques

Comme cela vient d'être largement developpe dans les paragraphes precedents, les multiples proprietes chimiques ou biologiques des composes phenoliques donnent a ces molecules et aux plantes qui les contiennent un intere^st economique certain qui est pris en compte par les

industries agro-alimentaires et pharmaceutiques. En outre, dans certains cas egalement três importants d'un point de vue economique, les phenols naturels participent directement au developpement d'activites industrielles dont certaines bien que três anciennes, beneficient des progrês scientifiques et technologiques et de notre meilleure connaissance des proprietes chimiques de ces composes. Nous retiendrons ici deux exemples particuliêrement importants. 5.1. Utilisation des tanins

La fabrication du cuir par tannage des peaux des animaux est une activite humaine traditionnelle, déjà mise en oeuvre it y a plusieurs millenaires dans le bassin mediterraneen. Elle a utilise pendant longtemps des extraits vegetaux riches en tannins: ecorces et bois de differents arbres ou arbustes (chéne, chataignier, eucalyptus, acacia. Quebracho, etc.), fruits de myrobolan ou de differentes Cesalpiniees, feuilles de sumac, galles causees par les attaques d'insectes sur les chénes ou le pistachier... Les tannins d'origine vegetale ont cependant ete progressivement supplantes, au cours du XX^e si&le, par des «tannins» mineraux (en particulier les sels de chrome) et ne sont plus utilises que pour la fabrication de cuirs particuliers d'articles de luxe ou d'orthopedie.

Les proprietes tannantes des tannins (qu'il s'agisse de tannins hydrolysables ou de tannins condenses) sont dues a leur capacite a former des liaisons entre les fibrilles de collagêne du tissu animal, conduisant alors a un ensemble peu accessible a l'eau et en partie protégé de l'action des bacteries. Les mecanismes chimiques du tannage correspondent a une complexation irreversible des tannins avec les proteins animales.

5.2. Importance des composes phenoliques dans la qualite du bois

Une des applications directes des proprietes de la lignine reside dans l'utilisation du bois pour les constructions humaines. En effet, ce materiau presente a la fois une grande resistance mecanique et un caractêre isolant marque vis-à-vis des variations de temperature et d'humidite. Il est ainsi couramment utilise pour la realisation des charpentes, des parquets, des fermetures (portes, volets, fenétres) et des meubles. Par ailleurs, la haute valeur calorifique du bois, exploit& traditionnellement depuis que l'homme a appris a maitriser le feu, est due pour une part importante a la presence de la lignine. Ce compose a en effet une haute teneur en carbone et se revêle plus energetique que les autres constituants du bois, cellulose et hemicelluloses, et une teneur en lignine plus elevee est associee a une chaleur de combustion plus importante.

En plus de la rigidite qu'apporte la presence de lignine, deux proprietes complementaires du bois sont associees a la presence de composes phenoliques: d'une part sa durabilite et d'autre part sa couleur (Jean-Jacques Macheix et al, 2005).

Bibliographie

· Abdelghafour MARFAK, Le 12 Decembre 2003, Radiolyse gamma des flavonokles, etude de leur reactivite avec les radicaux issus des alcools : formation de depsides, p 220. (These de Doctorat), l'Universite de Limoges, Ecole Doctorale Sciences Biologie Sante, Faculte de Pharmacie.

· Borivoj Klejdus, Radka Mikelova , Jitka Petrlova ,David Potesil, Vojtech Adam, Marie Stiborovaa , Petr Hodek, Jan Vacek, Rene Kizek, and Vlastimil Kuban, 06/24/2005, Evaluation of Isoflavone Aglycon and Glycoside Distribution in Soy Plants and Soybeans by Fast Column High-Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode-Array Detector, journal of agricultural and food chemistry, Volume 53, pp 5848-5852

· Jean-Jacques Macheix Annie Fleuriet Christian Jay-Allemand, 2005, les composes phenoliques des vegetaux, un exemple de metabolites secondaires d'importance economique, presses polytechniques et universitaires romandes, p 1, p 67, p viii, p 162.

Les enzymes

Historique

Les premieres demonstrations d'une activite enzymatique dans des extraits naturels remontent au XVII' siecle, quand Reaumur d'abord et Spallanzani ensuite montrent que le suc gastrique des oiseaux est implique dans la digestion de la viande. La mise en evidence de l'activite d'autres « enzymes » se poursuit au XIX' siecle. En 1833, Payen et Persoz isolent a partir du malt une substance qui est responsable de la fermentation et qu'ils nomment diastase. Ce terme sera par la suite utilise pour designer de maniere generale toutes substances responsables de fermentation. Plus tard, le suffixe -ase a ete conserve pour designer la macromolecule responsable d'une activite enzymatique. Par exemple. L'amylase est un enzyme responsable de la degradation de l'amidon. En 1836, alors qu'il etudie les processus digestifs, Schwann isole la pepsine, une substance responsable de la digestion dans l'estomac et le premier enzyme obtenu a partir d'un tissu animal (Athel cornish-bowden et al, 2005).

Definition d'un enzyme

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un role central dans le monde vivant. Les reactions essentielles pour le fonctionnement d'un étre vivant sont trop lentes et sans lu presence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la connaissons aujourd'hui ne serait pas possible. Qu'il s'agisse de reactions simples comme la formation de bicarbonate a partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de reactions complexes comme la replication de l'ADN, chaque reaction chimique se deroulant au sein d'un étre vivant est catalysee par un ou plusieurs enzymes specifiques. Les enzymes sont des macromolecules, des proteins ou des ARN (les ARN catalytiques sont plus correctement denommes ribozymes), qui reconnaissent specifiquement certaines molecules et accelerent les reactions de transformation de ces molecules suffisamment pour que leur vitesse devienne compatible avec le fonctionnement de l'organisme. Un second role essentiel joue par les enzymes est d'assurer le couplage physique entre reactions endergoniques et reactions exergoniques et de permettre ainsi de maintenir les systemes biologiques dans des etats hors d'equilibre, egalement indispensables pour le maintien de la vie (Athel cornish-bowden et al, 2005).

3. La specificite enzymatique

Le probleme de la specificite de l'enzyme pour son substrat est au centre de l'enzymologie. C'est en effet la particularite la plus fondamentale et la plus remarquable de cette catalyse. Les enzymes sont etroitement specifiques d'une reaction chimique donne, realisee sur un type de substrat demi. La configuration spatiale du substrat est donc en quelque sorte reconnue par l'enzyme ; Ce fait est particulierement bien mis en evidence par la specificite d'action vis-à-vis des isomeres optiques. Tres generalement, les enzymes sont capables de metaboliser l'un et non pas l'autre. Une hypothese simple regroupe ces dormees : le site

reactionnel d'une enzyme possede, au moires formellement, une conformation spatiale complementaire de celle du substrat.

Le site catalytique

La fonction des enzymes est liee a la presence dans leur structure d'un site particulier appele le site actif qui a la forme d'une cavite ou d'un sillon. Les molecules sur lesquelles agit une enzyme sont definies comme les substrata de la reaction enzymatique. Chaque enzyme « recormait » specifiquement une ou plusieurs molecules de substrat selon un principe de complementarite de type cle-sen-ure, d'apres le modele statique de Fischer, grace a des sites de reconnaissance et de fixation situes a sa surface.

Le site actif est constitue d'un petit nombre d'acides amines qui le plus souvent ne sont pas contigus dans l'enchainement de la chain polypeptidique. Ces acides amines sont caracterises par une chain laterale dont a la fois la nature chimique (groupement ionisable ou polarisable) et la structure (encombrement sterique) sont particulieres (Anonyme, 2003).

4. La cinetique enzymatique

4.1. L' activite enzymatique

4.1.1. Reaction catalysee par une enzyme (Bernard Offmann, 2003)

Il y a au moires trois reactions simples:

1. Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)

2. Transformation du substrat lie (ES) en produit lie (EP)

3. Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)

k_i k₂ k₃

+s .₄,¹ ES ...₀"- 7P ...₀"- ' + P

k_d k_₂ k_₃

Figure III.1 : Mecanisme reactionnel de la formation du produit.

Leonor Michaelis et Maud Menten ont deduit de ce modele en 1913 une equation qui predit la vitesse initiale (de formation de P) en fonction de la concentration du substrat:

Equation de Michaelis-Menten

Vo = ^Vmax
^· [ S ]

[ S ] + Km

Tel que K_M est la constante de Michaelis- Menten, et V_max est la vitesse maximale de la reaction enzymatique.

Dont sa representation graphique est port& dans la figure. 111.2.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure 111.2. Graphe de Michaelis-Menten: vo en fonction de [S]

4.1.2. Linearisation de l'equation de Michaelis-Menten

Il est difficile de placer correctement a la main une hyperbole dans un graphe. On se trompe tres facilement sur la hauteur de V_max. Pour simplifier revaluation des resultats, on utilise une transformation de l'hyperbole en droite. La plus connue est la transformation en doublereciproque de Lineweaver et Burk :

1 / Vo = 1 / V_max + (KM / V_max)
· 1 / [S]

Cette equation represente une droite de pente K_M / V_max

L'intersection sur l'axe vertical est 1 / V_max et sur l'axe horizontal 1 / K_M.

11 v ₀ = ^{1 1 v}max + ^(KM ^{1 v}max ). ^{1 1} [ ^s ]

0 I 2 3 4 5

Figure III. 3. Graphe de Lineweaver-Burk: 1/Vo en fonction de 1/[S].

Cette representation permet d'estimer les constantes a l'aide de papier millimetre et d'une regle. Elle a cependant le defaut de dormer trop de poids aux valeurs experimentales les plus imprecises, celles des plus petites concentrations de substrat.

4.2. L'inhibition enzymatique

4.2.1. Les inhibiteurs

De nombreuses substances modifient l'activite enzymatique en se combinant a elle, ce qui altere la liaison de substrat et/ou son turnover. Les substances qui diminuent l'activite enzymatique de la sorte sont appelees des inhibiteurs.

Beaucoup d'inhibiteurs sont des molecules de structure voisine du substrat de leur enzyme, mais qui soft ne reagissent pas, soient elles reagissent tres lentement. De telle substance sont frequemment utilisees pour elucider la nature chimique ou conformationnelle d'un site de liaison du substrat, afin de determiner le mecanisme catalytique de l'enzyme. De plus, beaucoup d'inhibiteurs d'enzymes sont des agents chimiotherapeutiques efficaces car un analogue de substrat "non naturel" peut bloquer l'action d'un enzyme. Par exemple, le methotrexate (appele aussi l'aminopterine) ressemble chimiquement au dihydrofolate. Le methotrexate se lie fortement a la dihydrofolate reductase, ce qui l'empéche d'assurer sa fonction physiologique, la reduction du dihydrofolate en tetrahydrofolate.

Les inhibiteurs d'enzyme peuvent agir selon des mecanismes varies. Dans cette section, nous allons etudier plusieurs de ces mecanismes parmi les plus simples, et leurs influences sur le comportement cinetique des enzymes qui suivent le modele de Michaelis-Menten (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

4.2.2. Les types d'inhibition :

4.2.2.1. Les inhibiteurs competitifs

Ils se lient de maniere reversible au site actif de l'enzyme et en bloquent l'acces au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]). En general ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme inhibiteurs competitifs reciproques. Les meilleurs inhibiteurs sont souvent en fait des analogues de l'etat de transition de la reaction.

k_ilt k__i

El

Figure 111.4 : Mecanisme reactionnel en presence d'inhibiteur. Dans l'equation de Michaelis-Menten, K_M est remplace par:

Km = K _m
· {-1 + [IFK_I )

Oil K₁= k_i/k__i est la constante de dissociation de l'inhibiteur. Le K_M apparent augmente donc, it y a perte apparente d'affinite pour le substrat. Cependant un supplement de substrat peut compenser cette inhibition et la vitesse maximale Vmax reste la méme.

5 --

4 --

,-----------17:: - --

_---------

,

Kri-

Km^.

Kr_i

1

4 5 6 7 13 9

I

1

Figure 111.5. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur competitif.

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a 1/[S] = 0 : 1N _max est donc le méme, mais -1/Km est de plus en plus petit (fleches colorees), alors que la pente augmente.

Figure 111.6. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee competitivement decrite dans la Figure 111.5 Notez que toutes les droites se coupent sur l'axe

1/V₀ a 1 ^/Vmax^.

Exemples de medicaments: Le methotrexate, un analogue structurel du tetrahydrofolate, est un inhibiteur competitif de la dihydrofolate reductase, sur laquelle it se fixe 1000x mieux que le substrat naturel. C'est un medicament anticancereux (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.2. Inhibition incompetitive

Dans l'inhibition incompetitive, l'inhibiteur se lie directement au complexe enzyme-substrat, sans pouvoir se fixer a l'enzyme libre (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

k_{i 2}

E +S _NI^N''' ES -11^.- E + P 1(_{4 +1}

^kil_rt k-js

^PSI

Figure 111.7: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans ce cas, V. et K_M diminuent du méme facteur (1 + [WIC_'s), alors que K_M / V. reste inchange. L'affinite apparente de l'enzyme pour le substrat augmente donc : (Bernard Offmann, 2003).

^Villa; -- ^Vmax ^{i (1} + ^[I]1KIs )

Km = Km i ti + [1]1K_is )

0 4 b 8 10

Figure 111.8. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur incompetitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites paralleles de pente constante K_M / V.

Chapitre III: les enzymes

0

2

- 0_5

0_5

Figure 111.9. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee incompetitivement decrite dans la Figure 111.8 (Bernard Offmann, 2003).

4.2.2.3. Les inhibiteurs non-competitifs

Its se lient de maniere reversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empéchent pas l'acces. Il s'agit donc d'inhibiteurs allosteriques, c'est-à-dire agissant a un autre (allo-) site.

K1 2

E + S ..₄^10
· ES -lo^. E + P

k-1

+ I +I

k_ilt k__i kisif k-is

kli

El ₄₁^11P' ESI

k.11

Figure III.10: Mecanisme reactiormel en presence d'inhibiteur.

Dans le cas particulier oil la fixation de l'inhibiteur ne modifie pas la fixation du substrat, ou reciproquement = K_is et K_i = l'inhibiteur (dit "non-competitif pur") diminue [E]_T sans modifier la repartition entre enzyme libre et lie. Dans ce cas, c'est V. qui est remplacee par:

^vmax = ^vmax ^I (¹ + [I]/K_I )

Le K_M reste constant, mais it y a perte apparente de concentration d'enzyme, donc reduction de V..

vo

a 2 3 ! 7 B 9 10

Figure III.1 1. Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat pour une reaction de Michaelis-Menten simple en presence de differentes concentrations d'un inhibiteur non competitif (Bernard Offmann, 2003).

En double-reciproque, on obtient des droites de pentes differentes qui se croisent a -1/K_M

1.5

2

Figure 111.12. Representation de Lineweaver-Burk de l'enzyme michaelienne inhibee non competitivement decrite dans la Figure III.11 (Bernard Offmann, 2003).

5. Classification des enzymes

Les enzymes sont classees et nominees en fonction de la nature des reactions chimiques qu'elles catalysent. Il y a six classes principales de reactions catalysees par les enzymes (Tableau III.1), ainsi qu'un certain nombre de sous-classes et de sous-sous-classes a l'interieur de chaque classe. Chaque enzyme se voit assignee deux noms et une classification a quatre chiffres (Donald Voet et Judith G. Voet, 1998).

Tableau III. 1 : Classification des enzymes selon la reaction catalysee.

Classification Type de reaction catalysee

Oxydoreductases Transferases Hydrolases Lyases

Isomerases Ligases

Oxydoreduction

Transfert de groupes fonctionnels

Hydrolyse

Elimination de groupes et formation de doubles liaisons Isomerisation

Formation de liaison couplee a l'hydrolyse de l'ATP

6. Les enzymes etudiees

6.1. L'a- amylase

L'amylase a ete purifiee en 1835 du malt par Anselme Payen et Jean Persoz. Leur travail les a merles de suspecter que des substances semblables, maintenant connues sous le nom d'enzymes, pouvaient participer dans les processus biochimiques.

Elle est repandue dans tous les organismes vivants. Dans les systemes digestifs des humains et beaucoup d'autres mammiferes, elle est aussi appelee « diastase » (Encyclopaedia Britannica, 2007).

L'amylase hydrolyse l'amidon, le glycogene, et la dextrine pour former le glucose, le maltose et les dextrines.

Une alpha-amylase appelee la ptyaline est produite par les glandes salivaires, tandis que l'amylase pancreatique est secret& par le pancreas dans le petit intestin (Encyclopaedia Britannica, 2007). La Ptyaline commence la digestion du polysaccharide dans la bouche ; le processus est complete dans le petit intestin par l'amylase pancreatique, parfois appelee l'amylopsine (The Columbia Encyclopedia, 2006)

Les Béta-amylases sont presentes dans les levures, les moules, les bacteries, et les plantes, en particulier dans les grains. La 13-amylase attaque l'amylose de chain droite mais ne peut pas attaquer la majeure partie de l'amylopectine de chain en branche (Encyclopaedia Britannica, 2007).

Figure 111.13. Structure de l'alpha amylase pancreatique humaine.

Les trois domaines sont montres : le domaine A est rouge; le domaine B est jaune ; le domaine C est noir. L'ion de calcium (sphere bleue) et l'ion de chlorure (sphere jaune) sont egalement montres a proximite immediate du centre catalytique. Le ligand d'acarbose (bouleet-bdton vert) est lie au site actif. Des ligands de monosaccharide et de disaccharide (dans la representation de boule-et-bfiton) sont attaches aux accepteurs exterieurs (Minxie Qian et al, 1997).

6.1.1. La reaction specifique

Les a-amylases (a-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1) sont les enzymes omnipresentes synthetisees dans tous les genres de la vie, de poids moleculaire 50 kDa. Tous les a-amylases lient au moms un ion fortement conserve de Ca²⁺ qui est exige pour l'integrite structurale et pour l'activite enzymatique (Nushin Aghajari et al, 2002).

L'a-amylase pancreatique humaine (APH) catalyse l'hydrolyse de la liaison glycosidique a(1-4) en polymeres de glucose tels que l'amidon. L'APH est composee de 496 acides amines en une seule chain de polypeptide liee aux ions essentiels de chlorure et de calcium. L'hydrolyse de l'amidon ou les substrats se produisent avec la conservation nette de la configuration au centre anomerique de sucre, et sont censes proceder par l'intermediaire d'un double mecanisme de &placement comportant la formation et l'hydrolyse d'un intennediaire de b covalent glycosyle-enzyme (Dr. Anjuman Begum, 2007).

6.1. 2. Interet de l'inhibition de l'alpha amylase

Les amylases sont une partie de la plus large classe des enzymes hydrolytiques appelees les glycosidases, clivent les liaisons glycosidiques de l'amidon dormant les fragments de disaccharide qui sont plus tard decomposes en glucose (Figure III. 14).

OH

0

OH

HO

HO

H5

HO

(1`

-0

_Ffp,,

OH HN-4

NHO. ^HN

HN_7i

OH N_{o NH2}

NH

HN

Octapeptide lineaire

1-1C

OH

I-10

FIN

HO

HO_o

HO

acarbose

Four le traitement de diabete

Les inhibiteurs

OH

O

N

HN

H₂N

Figure III. 14. Les inhibiteurs : l'acarbose et l'octapeptide de la reaction catalysee par l'amylase (Nicola Pohl, 2005).

Les inhibiteurs des amylases ont déjà montre leur utilite en aidant les diabetiques (Franco, O.L. et al, 2002). Les niveaux de glucose des diabetiques peuvent étre contrOles apres des repas par l'administration d'un inhibiteur d'amylase tel que l'acarbose. Acarbose est un produit naturel obtenu par la fermentation et est structurellement lie au substrat d'oligosaccharide d'amylase, car jusqu'a cinq residus de glucose sont connus pour étre adaptes dans le site actif d'amylase (Machius et al, 1996). Il est interessant que certains plantes et micro-organismes produisent les inhibiteurs d'amylase qui sont bases sur des proteins plutOt que les carbohydrates. Ces proteins inhibitrices, qui s'etendent dans la taille de 32 acides amines avec 3 liaisons disulfures a plus de 19 kDa, regule l'activite d'amylase endogene, par exemple dans les grains des plantes, aussi bien que pour defendre contre les amylases digestives d'autres organismes telles que les insectes (Breuer, 2003).

On a rapporte que l'inhibition des a-amylases induit la tolerance des carbohydrates, la satiete et la perte de poids, et pour prolonger le vide gastrique. Les inhibiteurs d' a-amylase ont ainsi un potentiel therapeutique pour le traitement de l'obesite et du diabete non-insulin (Juliet A. Gerrard et al, 2000).

6.2. La trypsine

Sous le terme de trypsine immun reactive (TIR), on regroupe un ensemble de molecules qui ont en commun d'être reconnues par divers anticorps developpes contre la trypsine humaine cationique ou trypsine-1. Cette protease est issue de l'activation du plus abondant des trypsinogenes produits par le pancreas chez l'homme.

La trypsine est une protein de 201 acides amines d'un poids moleculaire de 23 kDa et qui possede quatre ponts disulfures.

La trypsine est synthetisee par les cellules acines du pancreas sous forme d'une pro-enzyme qui inactive le trypsinogene. Il existe en fait deux trypsines originaires de deux isoformes differentes du trypsinogene mais a capacites catalytiques quasi identiques. Cette activite proteolytique est tres intense ; elle se manifeste au niveau des liaisons carboxyliques de la lysine et de l'arginine.

La plus grande partie de la secretion pancreatique passe dans le duodenum mais une faible partie est retrouvee dans le serum oil elle est amen& par les voies veineuses, lymphatiques et peritoneales. Il existerait egalement une secretion endocrine. La trypsine serique peut donc representer un passage fortuit de l'enzyme dans la circulation mais aussi un recyclage enzymatique ou encore un mecanisme d'autoregulation de la synthese. Une infime proportion du trypsinogene secrete se retrouve dans la circulation sanguine, oil it est detectable par des techniques sensibles.

Le pouvoir proteolytique de la trypsine est trop intense pour qu'elle circule isolement dans la circulation sanguine. Elle se presente donc dans le serum, liee a des inhibiteurs des proteases tels que l'a_i-antitrypsine et l'a₂-macroglobuline. La trypsine developpe son activite dans les voies intestinales (0. Gaillard, 1996).

Figure 111.15. Structure par rayons X de la trypsine bovine.

Dessin de l'enzyme complexes avec son substrat polypeptidique (en vert) dont la chaine laterale d'arginine occupe la poche de specificite de l'enzyme (en pointilles bleu), la chaine des C_a, les pouts disulfures et les chains laterales de la triade catalytique, Serine 195, Histidine 57, et Aspartate 102 sont representees (D. Voet et J. G. Voet, 1995).

6.2.1. La reaction specifique

La trypsine est une enzyme de la digestion synthetisee et secret& par les cellules acinaires pancreatiques, en passant par le canal pancreatique, dans le duodenum (la partie superieure du petit intestin), elle catalyse l'hydrolyse d'une liaison peptidique d'un residu chargé positivement : l'arginine et la lysine (D. Voet et J. G. Voet, 1995).

6.2.2. Interet de l'inhibition de la trypsine

Trypsine-like proteases a serine composent une famille d'enzymes avec une importante activite. Its sont connus pour étre impliques dans beaucoup d'etats physiologiques et desordres pathologiques. Leur activite non contrOlee est nes dangereuse et mene souvent aux maladies serieuses comme emphyseme, fibrose cystique ou developpement et progression de cancer. Par exemple, l'enzyme principale dans la croissance et la metastase de tumeur est activateur plasminogen d'urokinase (uPA) appartenant a la famille de protease a serine (trypsine-type).

Dans des conditions physiologiques normales, cette enzyme joue un role essentiel dans des processus d'angiogenese mais ces resultats non contrOles d'activite dans d'enormes niveaux de la plasmine active, qui facilite le mouvement des cellules de cancer (Marcin Sienczyk et Jozef Oleksyszyn, 2004).

Formes moleculaires multiples d'inhibiteurs de trypsine (TI) et chymotrypsine (CI), qui sont des enzymes digestives typiques des insectes, des mammiferes et des micro-organismes, et subtilisine (SI), une proteinase de beaucoup de bacteries et mycetes phytopathogenique (Alexander V. Konareva et al, 2001).

La grande variete d'inhibiteurs de protease a serine sont fournies par plusieurs sources telles que les tissus, micro-organismes, plantes, etc., jouent un role important en reglant les enzymes proteolytiques. L'analyse des complexes de protease-inhibiteur aide a la comprehension du mecanisme d'action, aussi bien que pour concevoir des inhibiteurs. Les inhibiteurs de protease sont repandus en nature, variant de petites molecules, peptides aux proteins. Jusqu'ici, 18 differents inhibiteurs de protease ont ete classifies et la liste est en croissance continue. Dans la plupart des inhibiteurs de protease la boucle de reactif-site, avec la geometrie specifique, bloque le site actif et la region substrat-liante (B. Syed Ibrahim et Vasantha Pattabhi, 2005).

L'activation inadequate du trypsinogene dans le pancreas mene au developpement de la pancreatite. Une fois que la trypsine est activee, elle est capable d'activer beaucoup d'autres proenzymes digestives. Ces enzymes pancreatiques activees augmentent plus loin l'autodigestion du pancreas. La trypsine active egalement des cellules par l'intermediaire du recepteur de trypsine. Le recepteur de la trypsine est egalement connu en tant qu'un des recepteurs actives par protease, a savoir PAR-2, recemment. Les cellules acinaires et les cellules de conduction expriment PAR-2 abondant. L'activite de la trypsine dans le pancreas est contrOlee principalement par l'inhibiteur pancreatique secrete de la trypsine (PSTI), qui est egalement connu en tant que type 1 de Kazal d'inhibiteur de protease de serine (SPINK1).

PSTI est synthetise dans les cellules acinaires du pancreas et agit en tant qu'un inhibiteur normal efficace de trypsine pour empécher l'occurrence de la pancreatite. Quand le trypsinogene est active a la trypsine dans le pancreas, PSTI lie immediatement a la trypsine pour empécher davantage l'activation des enzymes pancreatiques. PSTI bloque egalement l'activation supplementaire des cellules pancreatiques par l'intermediaire du recepteur de trypsine, PAR-2 (figure III. 16).

Activation des cellules : acinaires

de conduction inflammatoires

a travers le rècepteur de la trypsine (PAR-2)

Kallikreinog6ne f Chymotrypsino gene Proelastase roc arb oxyp eptidase rop hasp holipas e A2

Kallikreine Chyrnotrypsine Elastase Carboxy-peptidase Phospholipase A2

Figure 111.16. Voies d'activation des proenzymes et du PAR-2 par la trypsine.

Une fois que la trypsine est activee, elle est capable d'activer beaucoup d'autres proenzymes digestifs. La trypsine active egalement les cellules pancreatiques et inflammatoires par l'intermediaire de PAR-2. L'activite de trypsine dans le pancreas est contrOlee principalement par PSTI. Quand le trypsinogene est active a la trypsine dans le pancreas, PSTI lie immediatement a la trypsine pour empécher davantage l'activation des enzymes pancreatiques (Masahiko Hirota et al, 2003).

6.3. La lipase

Nous obtenons des lipides de l'ingestion, du stockage, ou de la synthese. Les graisses dietetiques emulsionnees par des sels de bile, digeres par des lipases, absorbees dans le systeme de lymphe, apres elles entrent dans la circulation sanguine (Marcotte, 2005). Les lipases ont ete citees en tant qu'une des plus souples des enzymes par la plupart des scientifiques de recherches du monde. Elles sont employees dans un certain nombre de bioconversions et leurs applications peuvent étre trouvees dans les industries comme pharmaceutique, la laiterie, le detergent, le produit de beaute, le produit oleochimique et d'autres. Selon l'opinion courante de l'industrie et du milieu universitaire, it peut y avoir d'exploitation commerciale a grande echelle de ces enzymes en prochaines annees. Cette base de donnees est une compilation des donnees liees aux lipases.

Les lipases (EC 3.1.1.3, triacylglycerol lipases) sont des enzymes qui ont ete classiquement utilisees pour continuer l'hydrolyse des triglycerides avec la production concomitante des acides gras libres. Cependant ces enzymes montrent egalement l'activite catalytique vers une grande variete d'alcools et d'acides dans des reactions de synthese d'ester a condition que l'activite de l'eau soit tres basse (Dr. P. Gautam, 2006).

L'entite fonctionnelle pour l'hydrolyse des triglycerides alimentaires dans l'intestin, serait un complexe ternaire associant la lipase, la colipase et une micelle de lipides biliaires. La taille, plus que la nature chimique de la micelle serait importante. La destabilisation de l'interface

lipidique pourrait se faire par des peptides obliques de la lipase et de la colipase (Denis Lairon, 2007).

A

Figure III. 17. Structure trois dimensionnel de la lipase pancreatique humaine (Marion Ansorge-Schumacher, 2007).

6.3.1. La reaction specifique

La plupart des lipases agissent a une position specifique sur la molecule de glycerol d'un substrat de lipide (A1, A2 ou A₃). Dans l'exemple de la lipase pancreatique humaine (LPH), qui est l'enzyme principale responsable de decomposer des graisses dans le systeme digestif humain, une lipase acte pour convertir des substrats de triglycerides trouves en huiles de nourriture en monoglycerides et acides gras libres (Princeton University, 2005).

6.3.2. Interet de l'inhibition de la lipase

La lipase pancreatique est l'enzyme la plus importante pour la digestion des triglycerides. L'application d'un inhibiteur de lipase a ete examinee plus tot comme traitement pour l'obesite. Orlistat (RO 18-0647), un derive hydrogens de lipstatine derive du Streptomyces toxitricini, est un inhibiteur efficace de la lipase gastrique et pancreatique, et s'est avers étre efficace pour le traitement d'obesite. L'existence des inhibiteurs de lipase dans divers produits alimentaires a ete recherchee, et la presence de ces inhibiteurs dans les cereales, dans le son de ble, germe de ble et dans le soja a ete rapportee. Des inhibiteurs de lipase ont ete egalement cherches dans les produits naturels tels que les medecines chinoises et les diverses herbes (M Yamamoto et al, 2000). L'obesite est Fun des problemes principaux de la sante publique dans les pays developpes. On le considere comme un facteur de risque lie a la genese ou le developpement des maladies chroniques principales, y compris la maladie cardiovasculaire, le diabete, et le cancer. Aux Etats-Unis, l'obesite augmente a un taux alarmant. Le poids excessif et l'obesite sont les troubles nutritifs les plus communs aux Etats-Unis, affectant la majorite d'adultes dans le pays (Diego A. Moreno et al, 2003).

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· Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher, 08/09/2006, Hydrolases, Department of Biotechnology, Aachen University.

The Columbia Encyclopedia, 2006, Columbia University Press

.Ca par6e

Expirimenble

Chapitre IV: extraction et quantification des composes phenoliques

1. Extraction des composes phenoliques

La recolte des plantes a ete effectuee en octobre 2006, de la region de Laghouat "Sidi Makhlouf', ce sont sept plantes, elles sont sechees a l'ombre pendant sept mois.

Les parties aeriennes de ces plantes (sauf pour le Gondale, ce sont des racines) sont finement broyees puis stockees dans des sachets en papier jusqu'a l'utilisation.

La procedure suivie est celle appliquee dans le laboratoire des sciences fondamentales, elle comporte trois sous &apes:

1.1. La maceration

La masse choisie est de 5 g de chaque poudre de plante, elle est maceree dans un mélange hydro-alcoolique (methanol (CH₃OH)/eau 80/20: v/v) pendant 24 h a temperature ambiante et a l'obscurite.

Zwadet Elkhrouf

Serr

Figure IV. 1. La poudre de chaque plante aprês le broyage.

1.2. La &pigmentation

Aprês filtration des extraits hydro-alcooliques, ils subissent une evaporation sous vide dans un rotavapeur a une temperature de 60°.

La phase aqueuse de chaque extrait est la^y& un ou plusieurs fois jusqu'a l'epuisement total avec un demi-volume de l'hexane dans une ampoule a decanter afin d'eliminer toutes traces de composes apolaires (pigments, lipides, etc.).

Figure IV. 2. Le lavage par l'hexane de deux extraits des plantes "Zewadet elkhrouf' et
"Gondale".

1.3. La purification

La phase aqueuse ainsi obtenue est ensuite la^y& un ou plusieurs fois avec un volume d'acetate d'ethyle. L'addition d'un mélange de deux solutions aqueuses (4m1): sulfate d'ammonium (NH₄)₂SO₄ 20 % (m/v) et l'acide orthophosphorique H₃PO₄ 2% (m/v) facilite le passage des composes phenoliques de la phase aqueuse vers le solvant « l'acetate d'ethyle».

La phase organique obtenue est sechee sur sulfate de sodium anhydride Na₂SO₄pour eliminer toutes traces d'eau. Aprês filtration le solvant est evapore sous pression reduite a 60°C. Les extraits phenoliques obtenus sont sous forme d'une poudre ou pfite, de couleur jaune, marron et vert militaire suivant la nature de la plante, ils sont aussi peses pour calculer le rendement de chaque plante.

Le residu est repris dans 10 ml de methanol pur et conserve a --10°C dormant l'extrait phenolique purifie.

Le tableau IV. 1 presente l'aspect, la couleur et la masse de chaque extrait phenolique de chaque plante :

Tableau IV. 1. La couleur, l'aspect et la masse de chaque extrait phenolique

Figure IV. 3. Les extraits alcooliques bruts

2. Quantification des composees phenoliques

2.1. Dosage des phenols totaux

Le principe de ce dosage est adapte par Singleton et Ross (en 1965) avec le reactif de Folin -- Ciocalteu (B.I.GINER-Chavez ,1996).

Le reactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune, constitue de polyheterocycles acides contenant l'acide phosphotungestique H₃PM₁₂0₄₀ et l'acide phosphomolybdique H₃PW₁₂0₄₀ dont la reaction est :

Oxydation des phenolates --> reduction des polyheterocycles --> formation d'un complexe molybdene(Mo₈0₂₃)-tungstene (W₈0₂₃) stable bleu qui absorbe fortement a une longueur d'onde de l'ordre 760 nm. Le phenol standard utilise dans cette methode est l'acide gallique dont la formule chimique est presentee dans la figure IV. 4.

Figure IV. 4. L'acide gallique (Acide 3,4,5-trihydroxybenzoIque).

2.1.1. La courbe d'etalonnage

A partir d'une solution mere aqueuse preparee de l'acide gallique de concentration massique 0.5 g/1, des solutions filles sont ainsi preparees de concentration allant de 0.06 g/1 jusqu'a 0.28 g/1.

A l'aide d'une micropipette, 100 gl de chaque solution est introduite dans des tubes a essais, suivi de l'addition de 500 gl du reactif de Folin-Ciocalteu (10 fois dilue dans l'eau), apres 2 minutes 2 ml de carbonate de sodium Na₂CO₃ a 20% (m/v) ont ete ajoutes (favoriser un milieu alcalin pour declencher la reaction d'oxydoreduction), par la suite ces solutions sont maintenus a l'obscurite pendant 30 minutes a temperature ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution est effectuee a l'aide d'un spectrophotometre de Shimadzu 1601 (figure IV .5) a une longueur d'onde de 760 nm contre un blanc (méme solution sans la solution d'acide gallique) ce qui nous permet de tracer la courbe d'etalonnage (figure IV .6).

f -4111111F"'

Figure IV. 5. Le spectrophotometre UV-visible de Shimadzu (1601).

0

0,1

0,2

0,3

Concentration