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UNIVERSITE DE ROUEN
Ecole Doctorale Normande Chimie-Biologie
THESE
présentée par
Ludovic Carlier
pour obtenir le titre de
Docteur de l'Université de Rouen
Spécialité : Biologie Structurale et
Fonctionnelle
Production de domaines recombinants PRODH en vue de
l'analyse structurale
&
Caractérisation de la région 51-160 de la
protéine KIN17
humaine par RMN et Modélisation
Moléculaire
Soutenue le 10 Juillet 2006 devant le jury : Président
Patrice LEROUGE
Rapporteur Constantin T. CRAESCU Rapporteur Jean-Pierre SIMORRE
Examinateur Bernard GILQUIN Examinateur Laure GUILHAUDIS Directeur de
Thèse Daniel DAVOUST
préparée au Laboratoire de Résonance
Magnétique Nucléaire de
l'Equipe de Chimie Organique et Biologie Structurale (CNRS UMR
6014, IFRMP 23)
A la mémoire de ma belle-maman,
Belle tu l'as été, quand tu m'as
élevé comme ton propre fils, Belle tu l'es
restée, lorsque tu as fait face avec courage à la maladie, et
Belle, tu le seras toujours dans le coeur de tes enfants.
« Rêve de grandes choses, cela te permettra
au moins d'en faire de toutes petites » Jules Renard
(1864-1910)
Remerciements
Je tiens en premier lieu à remercier le
Docteur Constantin Craescu, Directeur de Recherche à l'Institut
Curie de l'Université d'Orsay, et le Docteur Jean-Pierre
Simorre, Directeur de Recherche à l'Institut de Biologie Structurale
Jean-Pierre Ebel de l'Université
de Grenoble, pour l'honneur qu'ils me font en
acceptant de juger ce travail. Je voudrais également remercier
le Professeur Patrice Lerouge, du Laboratoire de Structure/fonctions des
glucides de l'Université de Rouen, et le Docteur Bernard
Gilquin, du Département d'Ingénierie et d'Etude des
Protéines du CEA de Saclay, de participer à ce jury.
Voici donc le moment tant attendu des remerciements...
Après quatre années de thèse
où se sont alternés « des hauts
» et « des bas », il est temps pour moi de confirmer
une rumeur de plus en plus persistante : ces quatre années de
doctorat, et les deux sujets sur lesquels je me suis penché, n'ont
pas eu raison de ma passion pour la recherche qui en sort bien plus
ravivée. Alors, je le dis haut et fort : « la recherche, c'est
formidable ! », même si (ma famille et mes proches en
conviendront) cette passion demande parfois quelques sacrifices. J'ai eu
la chance d'avoir été accueilli dans pas moins de 4
laboratoires durant cette thèse, et d'avoir côtoyé
des chercheurs de différents horizons qui m'ont
énormément appris, tant sur le plan scientifique, que sur le plan
humain. A moi à présent de remercier toutes les personnes qui
m'ont aidées, de près ou de loin, à obtenir les
résultats présentés dans ce manuscrit. J'espère ne
pas en oublier !!!
J'exprime toute ma reconnaissance au Professeur
Daniel Davoust, Directeur de l'Equipe de Chimie organique et Biologie
Structurale de l'Université de Rouen, pour m'avoir accueilli dans son
laboratoire et m'avoir permis de réaliser cette thèse. Je vous
remercie de
la confiance que vous m'avez accordée depuis le
premier apprentissage que j'ai effectué dans votre laboratoire de RMN
dans le cadre d'un stage de maîtrise de chimie, il y a
déjà quelques années...
J'exprime mes profonds remerciements aux Docteurs
Laure Guilhaudis et Isabelle Milazzo pour avoir encadré ce
travail de thèse. Merci d'avoir partagé vos connaissances
scientifiques avec un « zouave » de mon espèce. La
qualité de vos rapports humains, le suivi constant de ce travail, et
l'émulation scientifique dont vous avez fait part, ont
largement contribué à la réussite de cette thèse :
« chapeaux bas !!! ».
Que les rencontres furent nombreuses et enrichissantes au
cours de ces quatre années! Des médecins aux modélistes,
en passant par les généticiens, les biochimistes, et bien
sûr les RMNistes, vous m'avez formé à
différentes techniques dans vos laboratoires respectifs, et
transmis un savoir extraordinaire à travers de nombreuses
discussions, qui se sont parfois prolongées au-delà des
heures réglementaires autour d'un petit verre sur une
terrasse...
? Au Laboratoire de Génétique
Moléculaire de l'EMI 9906 (INSERM U614) :
J'adresse mes remerciements au Professeur Thierry
Frébourg pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et
intégré à son équipe pendant les huit premiers mois
de cette thèse. Je remercie également le Docteur Dominique
Campion pour l'intérêt qu'il a porté à mon
travail.
Un grand merci à Hélène Jacquet-Delmulle
pour m'avoir introduit dans l'univers de
la proline déshydrogénase et de la
schizophrénie. Ton aide et ton initiation à la biologie
moléculaire m'ont été très précieux ! Merci
également à Grégory Raux d'avoir construit le premier
vecteur de surexpression de PRODH même si, à priori, nous n'avons
pas la même vision de la recherche et des relations humaines.
Je tiens à remercier très
chaleureusement le Docteur Chahrazed El Hamel qui m'a prise sous son
aile pendant mon séjour dans ce laboratoire. Je souhaite te
témoigner toute mon admiration pour l'étendue de tes
connaissances, la qualité de ton encadrement, et l'immense
gentillesse qui te caractérise.
Un grand merci à Cécile, Magalie, Nathalie,
Jackie, Audrey, Olivier, Anne, et Isabelle pour votre amitié et votre
précieuse aide. Courage Olivier, tu vas y arriver !!!
? Au Laboratoire de Marquage des Protéines du
CEA de Saclay :
Difficile d'écrire ces quelques lignes sans une
certaine émotion car mon passage au LMP a été l'occasion
de rencontrer des personnes plus formidables les unes que les autres. Mes
remerciements s'adressent tout d'abord au Docteur Roger Genet, responsable de
cette équipe, qui m'a accueilli avec sympathie et enthousiasme avant de
partir vers des fonctions ministérielles.
J'exprime ma profonde reconnaissance aux Docteurs
Muriel Gondry et Sandrine
Braud, les « deux femmes de ma thèse ». Je
ne te remercierai jamais assez Muriel pour tout
ce que tu as fait pour moi : ton écoute et
tes encouragements m'ont redonné confiance lorsque le moral n'y
était plus. Tu m'as énormément appris dans le domaine de
la protéine recombinante que tu compares si joliment à de la
« cuisine » ! Un grand merci également à
ma p'tite mamie Braud qui m'a encadré avec tout le
sérieux et la rigueur qu'on lui connaît. J'ai eu la chance de
découvrir la femme formidable qui se cachait au fond de la «
working girl », et ça vaut le détour !!! (comme quoi il ne
faut jamais se fier aux apparences).
Mon passage au LMP n'aurait pas été si
plaisant sans la présence inattendue d'un fan club de groupies
présidé par Rachel Amouroux et Muriel Bahut. Merci
beaucoup Rachel, alias « super boomeuse », pour ton amitié et
ton soutien. Tu voulais du rêve, je t'ai offert un
Mc Do, que souhaiter de mieux ??? Grâce à toi,
je me souviendrais longtemps de ce chef- d'oeuvre du cinéma
américain intitulé « independence day »... Merci ma
p'tite Muriel, alias
« Mu-Mux », pour ta bonne humeur, ta joie
de vivre, tes fous rires communicatifs, et ton accent du sud qui te va
si bien. Je remercie Marie Courçon et Cédric Masson pour leur
aide précieuse et leur sympathie de tous les instants. Je salue
également Cathy, Marianne, Mireille, Carine, Jean, Christine, et
Jean-Baptiste, ainsi que les vigiles de la FLS avec qui j'ai eu l'occasion de
partager quelques courses-poursuites (qui a dit que la recherche n'était
pas sportive ?).
? Au Laboratoire de Structure des Protéines du
CEA de Saclay :
J'exprime ma profonde reconnaissance aux
Docteurs Bernard Gilquin, Sophie Zinn-Justin, et Joël Couprie pour
m'avoir permis de travailler sur la protéine KIN17. Avoir
été encadré par vous trois est pour moi une
véritable chance, tant sur le plan scientifique, que sur
le plan humain. Merci beaucoup Joël d'avoir
élargi mon horizon à la RMN 3D et d'avoir répondu
à mes nombreuses questions avec gentillesse et disponibilité. Un
immense merci au Monsieur Modélisation Moléculaire du LSP,
en la personne de Bernard Gilquin, pour ses longues discussions
passionnées sur le programme d'attribution automatique des nOe.
Quel
bel outil ! Je reste assurément votre premier fan !
Merci beaucoup Sophie de m'avoir guidé dans la rédaction de ce
manuscrit : tu as éclairé ma lanterne à de nombreuses
reprises !
Je salue également tous les étudiants
et post-docs du LSP que j'ai eu l'occasion de côtoyer en
commençant par Albane le Maire qui a finie par ne plus confondre mon
prénom après 12 mois de collaboration !!! Plus
sérieusement, merci Albane de m'avoir accepté sur KIN17 et
pour le temps que tu m'as consacré. Spéciale
dédicace à Sandrine Caputo : tiens tiens, un Winged Helix peut
en cacher un autre... Je te remercie chaleureusement pour
ton aide spontanée, ton extrême gentillesse,
et pour m'avoir offert deux nuits dans le New York parisien. Merci
également à Gaëlle, Cédric, Nathalie, et
Virginie avec qui j'ai partagé de belles discussions.
? Au Laboratoire de Résonance
Magnétique Nucléaire de l'Université de
Rouen
J'en reviens finalement à mon laboratoire d'accueil
qui a également été le théâtre de très
jolies rencontres. J'adresse mes profonds remerciements aux Docteurs Hassan
Oulyadi et Eric Condamine qui m'ont beaucoup appris dans le domaine de la RMN
haute résolution, et pas seulement des macromolécules biologiques
! Merci au Docteur Gaël Coadou, le « nouveau venu », pour ses
conseils frais et dynamiques.
Un grand merci à Nicole Roussel, véritable
pièce maîtresse de ce labo, qui s'occupe si bien de « ses
petits étudiants » avec une immense, que dis-je ? Une
péninsule de gentillesse.
Je remercie également toutes les « vieilles
canailles » avec qui j'ai passé de très bons moments pendant
ces quatre années. Aux anciens pour commencer : Karine courchay,
merci
de m'avoir fait découvrir des endroits chaleureux
avec de la musique ringarde remixée et des lumières de toutes
les couleurs. A Michel Auvray, alias « michou »,
l'homme le plus extraordinaire que j'ai rencontré dans un labo !
Merci d'avoir réinventé la recherche : si le CNAM en recrute
encore deux comme toi, alors il peut mettre la clef sous la porte, mais il en
sortira humainement grandi !!! A Didier Rivière, alias le «
créolais », merci pour les belles parties de tennis, et comme
l'a souligné « michou », pour ta vision optimiste de la
recherche...
A Pedro Lameiras, le footballeur portugais le plus
parisien, un immense merci pour avoir partagé tes connaissances de
la RMN avec autant de générosité, et pour ton
amitié qui m'a beaucoup touchée. A Franck Paté : qui
aurait cru, lorsque nous pratiquions le tarot intensif pendant les cours de
philo en terminale, que nous arriverions à ce niveau d'étude ?
(surtout ne
le dis à personne, ce sera notre secret). A Anne
Lautrette, j'ai une révélation à te faire : je
déteste ton café ! Quoi qu'il en soit, merci beaucoup pour ta
sympathie même si au début ce n'était pas gagné ! A
Romain Thuau, mon technicien supérieur préféré,
sans aucun doute le chercheur au plus grand coeur que je connaisse. Merci ma
poule pour ton amitié sans calcul.
Je te souhaite tous mes voeux de bonheur avec la belle
Nadège que je salue au passage.
Je tiens également à exprimer toute ma
sympathie aux membres du Laboratoire de Spectrométrie de Masse
Bio-Organique pour leur gentillesse et leurs conseils judicieux : le Professeur
Catherine Lange, les Docteurs Marie Hubert-Roux, Corinne Loutelier-Bourhis, et
Héléne Lavanant, ainsi qu'Albert Marcual. Je salue
également les joyeux étudiants de ce laboratoire : Julie
Hardouin, Delphine Oursel, Thomas Vincent (félicitations pour cet
heureux événement), et le non moins gigantesque Romain
Dolé, alias « p'tit bouchon », qui gagne à être
connu et reconnu !
Enfin, je ne pouvais terminer ces
remerciements sans témoigner ma profonde reconnaissance
à mes plus fidèles proches qui m'ont
énormément soutenus pendant ces quatre années de
thèse. Un grand merci à Sammy, Aurélie, Frédo,
Greg, et mon p'tit TD pour vos nombreux encouragements et votre
amitié.
MERCI A TOUS !!!
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS
.....................................................................................................................
1
PREAMBULE
..........................................................................................................................
3
PREMIERE PARTIE
..............................................................................................................
9
PRODUCTION DE DOMAINES RECOMBINANTS PRODH EN
VUE DE L'ANALYSE STRUCTURALE
CHAPITRE I : INTRODUCTION
.......................................................................................
11
1 CONTEXTE BIOLOGIQUE
.................................................................................................
13
1.1 Le catabolisme de la proline
................................................................................................
13
1.2 Hypothèses sur les partenaires biologiques de
PRODH chez les organismes eucaryotes .. 16
1.3 Modèle de régulation du catabolisme de la
proline chez la bactérie E. coli ....................... 17
1.4 Les troubles de l'activité de PRODH chez les
eucaryotes supérieurs ................................. 21
1.5
Conclusions..........................................................................................................................
23
2 STRATEGIE D'ETUDE STRUCTURALE DE PRODH HUMAINE PAR
RMN............................... 24
2.1 Analyse bio-informatique préliminaire
................................................................................
24
2.2 Démarche
entreprise............................................................................................................
27
CHAPITRE II : EXPRESSION DES PROTEINES PRODH SAUVAGE ET
MATURE CHEZ E.
COLI.........................................................................................
29
1 PRODUCTION DE PRODH SAUVAGE
.................................................................................
31
1.1 Caractérisation de l'expression et de la
solubilité de la protéine hétérologue
................... 31
1.2 Optimisation de paramètres d'expression et
d'extraction ................................................... 33
2 PREDICTION DU PEPTIDE SIGNAL DE LA SEQUENCE PRODH HUMAINE
............................. 34
2.1 Les messages d'adressage mitochondrial
............................................................................
34
2.2 Résultats de la
prédiction.....................................................................................................
35
3 PRODUCTION DE LA PROTEINE MATURE PRO564
............................................................ 37
4 CONCLUSIONS
...............................................................................................................
38
5 MATERIELS ET METHODES
............................................................................................
40
5.1 Création des plasmides
d'expression...................................................................................
40
5.2 Production, extraction, et analyse de PRODH et PRO564
................................................. 42
CHAPITRE III : ETUDE BIO-INFORMATIQUE : SELECTION DE
3 DOMAINES
PRODH.....................................................................................................
45
1 DESCRIPTION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE PRODH DE E. COLI
.................................. 47
2 CARACTERISATION DE L'ORGANISATION DE PRODH
HUMAINE....................................... 49
2.1 Report de la structure secondaire de PutA669 sur
l'alignement initial .............................. 49
2.2 Organisation de PRODH humaine
......................................................................................
49
3 SELECTION DES 3 DOMAINES A EXPRIMER
..................................................................... 55
4 MATERIELS ET METHODES
............................................................................................
57
4.1 Recherche d'homologie de séquence
...................................................................................
57
4.2 Alignements de séquences et prédictions
structurales .........................................................
57
CHAPITRE IV : EXPRESSION DE 4 PROTEINES PRODH DANS LE
CADRE D'UN PROGRAMME DE
PRODUCTION..................................................... 59
1 STRATEGIE DE PRODUCTION DES 4 PROTEINES PRODH
................................................... 61
1.1 Stratégie générale
................................................................................................................
61
1.2 Stratégie de construction des vecteurs
d'expression ...........................................................
63
1.3 Criblage des conditions d'expression en
microplaques....................................................... 64
1.4 Production à grande échelle et obtention de
la protéine d'intérêt
...................................... 65
2 PRODUCTION DES 4 DOMAINES PRODH
..........................................................................
68
2.1 Bilan du criblage des conditions d'expression en
microplaques ......................................... 68
2.2 Production, purification, et obtention des
protéines d'intérêt
............................................. 69
3 CONCLUSIONS
...............................................................................................................
82
4 MATERIELS ET METHODES
............................................................................................
83
4.1 Production à grande échelle et extraction
des protéines .....................................................
83
4.2 Purification des protéines de fusion et des
protéines d'intérêt
............................................ 84
4.3 Clivage du partenaire de fusion par la protéase
TEV ......................................................... 85
CHAPITRE V : CONCLUSIONS ET
PERSPECTIVES................................................... 87
SECONDE PARTIE
..............................................................................................................
93
CARACTERISATION DE LA REGION 51-160 DE LA
PROTEINE KIN17 HUMAINE PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE
CHAPITRE I : INTRODUCTION
.......................................................................................
95
1 GENERALITES SUR LE MAINTIEN DE L'INTEGRITE DU GENOME
...................................... 97
1.1 Les dommages de
l'ADN......................................................................................................
97
1.2 Les systèmes mis en jeu
........................................................................................................
99
1.3 Les voies de réparation des lésions de
l'ADN .....................................................................
99
2 LA PROTEINE KIN17
...................................................................................................
101
2.1 Les propriétes de la protéine KIN17
..................................................................................
101
2.2 Organisation des domaines structuraux de KIN17
............................................................ 103
3 CONCLUSIONS
.............................................................................................................
107
CHAPITRE II : PRODUCTION ET ANALYSES PRELIMINAIRES
DU DOMAINE K2 DE LA PROTEINE HUMAINE
KIN17........................................ 109
1 PREPARATION DES ECHANTILLONS POUR L'ANALYSE RMN
........................................ 111
1.1 Sélection et optimisation du système
d'expression ............................................................
111
1.2 Obtention de K2 simplement marquée 15N
et doublement marquée 15N / 13C
.................... 115
2 CARACTERISATIONS PRELIMINAIRES
...........................................................................
122
2.1 Caractérisation de la séquence primaire et
contrôle du marquage................................... 122
2.2 Caractérisation de l'état
oligomérique
..............................................................................
123
2.3 Caractérisation de la structure secondaire et
tertiaire...................................................... 124
2.4 Etude préliminaire par Résonance
Magnétique
Nucléaire................................................ 126
3 CONCLUSIONS
.............................................................................................................
131
CHAPITRE III : STRATEGIE D'ETUDE PAR RMN ET MODELISATION
MOLECULAIRE DU DOMAINE K2..........................................
133
1 METHODE D'ATTRIBUTION DES RAIES DE RESONANCE
................................................ 137
1.1 Attribution des carbones de la chaîne principale et
des 13Câ.............................................
138
1.2 Attribution des protons 1Há et
1Hâ
......................................................................................
143
1.3 Attribution des chaînes
latérales........................................................................................
145
2 DETERMINATION DE LA TOPOLOGIE ET RECUEIL DES CONTRAINTES
STRUCTURALES ... 146
2.1 L'effet Overhauser nucléaire
.............................................................................................
147
2.2 Détermination de la structure secondaire et de la
topologie............................................. 149
2.3 Recueil des contraintes structurales
..................................................................................
153
3 MODELISATION MOLECULAIRE SOUS CONTRAINTES RMN
......................................... 155
3.1 Principe de la mécanique moléculaire
adaptée aux systèmes biologiques........................
155
3.2 Le logiciel CNS
..................................................................................................................
160
3.3 Le programme d'attribution automatique des pics nOe du
LSP........................................ 166
CHAPITRE IV : CARACTERISATION STRUCTURALE DU
DOMAINE K2 PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE ..............................
181
1 DETERMINATION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE K2 DE KIN17 HUMAINE
................ 183
1.1 Attribution des raies de
résonance.....................................................................................
183
1.2 Détermination de la topologie du domaine K2
.................................................................. 192
1.3 Calcul de la structure par Modélisation
Moléculaire sous contraintes RMN ................... 199
2 DESCRIPTION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE
K2....................................................... 204
2.1 Structure secondaire
..........................................................................................................
204
2.2 Les éléments qui composent le coeur
hydrophobe ..............................................................
205
2.3 La boucle entre les hélices H2 et H3
.................................................................................
206
2.4 L'hélice C-terminale H4
....................................................................................................
208
CHAPITRE V : RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE : QUEL EST LE
ROLE DU DOMAINE K2 DE KIN17 HUMAINE ?
............................................ 211
1 LE DOMAINE K2 DE KIN17 ADOPTE UN REPLIEMENT DE TYPE WINGED
HELIX ............. 213
2 LE MOTIF WINGED HELIX DE KIN17 EST-IL CAPABLE DE LIER
L'ADN OU L'ARN ? ........ 216
2.1 Approche structurale
.........................................................................................................
217
2.2 Approche fonctionnelle
......................................................................................................
227
3 LE MOTIF WINGED HELIX DE K2 PRESENTE UNE SURFACE
ULTRA CONSERVEE.............. 229
4 CARACTERISATION DE LA POSITION DU MOTIF PREDIT EN « DOIGT
DE ZINC » AUTOUR DU DOMAINE WINGED HELIX
.............................................................................................
232
4.1 Stratégie employée
.............................................................................................................
233
4.2 Préparation de l'échantillon de
protéine K3 simplement marquée 15N
............................. 233
4.3 Résultats de la cartographie des variations de
déplacement chimique ............................. 234
CHAPITRE VI : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
............................................... 239
ANNEXE : CRIBLAGE DES CONDITIONS D'EXPRESSION DES
PROTEINES PROENTIER, PROCATAL, PROTER, ET PROINSER ........................
247
1 MATERIELS ET METHODES
..........................................................................................
249
1.1 Construction des plasmides d'expression par recombinaison
homologue ........................ 249
1.2 Criblage des conditions d'expression en
microplaques..................................................... 253
2 RESULTATS
.................................................................................................................
254
2.1 Le domaine PROcatal
........................................................................................................
254
2.2 Le domaine
PROentier.......................................................................................................
256
2.3 Le domaine
PROter............................................................................................................
258
2.4 Le domaine PROinser
........................................................................................................
260
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
...........................................................................
263
ABREVIATIONS
1D, 2D, 3D, 4D Expérience RMN à
une, deux, trois, ou quatre dimension(s)
3PM Programme de Production et Marquage des
Protéines
ADN Acide DésoxyriboNucléique
ADNc Acide DésoxyriboNucléique
complémentaire
Ampi Ampicilline
ARN Acide RiboNucléique
ARNm Acide RiboNucléique messager
ATP Adenosine TriPhosphate
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
BER Base Excision Repair
CAM ChlorAMphénicol
CNS Cristallography and NMR System
COSY COrrelation SpectroscopY
CSD Chemical Shift Deviation (déplacement
chimique secondaire)
DC Dichroïsme Circulaire
DNase Désoxyribonucléase
DO Densité Optique
DTT 1,4-DiThioTréitol
EDTA Acide éthylène diamine
tétraacétique
ESI ElectroSpray Ionization
FAD Flavine Adénine
Dinucléotide
FADH2 Flavine Adénine Dinucléotide
réduit
FMN Flavine MonoNucléotide
GABA Acide gamma amino-butyrique
HCA Hydrophobic Cluster Analysis
HMQC Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence
spectroscopy
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
HR Homologous Recombinaison
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
spectroscopy
IMAC Immobilized Metal ion Affinity
Chromatography
INEPT Insensitive Nuclei Enhanced by
Polarisation Transfert
IPTG IsoPropyl -D ThioGalactopyranoside
IR Radiations ionisantes
1
ITD-MS Ion Trap Detector-Mass Spectroscopy
LB Luria-Bertani
MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization-Time Of Flight
MMR MisMatch Repair
MMS Methyl Methane Sulfonate
NAD+ Nicotinamide Adénine
Dinucléotide
NADH Nicotinamide Adénine
Dinucléotide réduit
NADP+ Nicotinamide Adénine
Dinucléotide Phosphate
NADPH Nicotinamide Adénine
Dinucléotide Phosphate réduit
NBT Nitro Blue Tetrazolium
NER Nucleotide Excision Repair NHEJ
Non Homologous End Joining nOe nuclear Overhauser
effect
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
PBS Phosphate Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction PMSF
PhenylMethylSulfonyl Fluoride PRODH PROline
DésHydrogénase
PVDF PolyVinylidine DiFluoride
P5C Pyrroline-5-Carboxylate
P5CDH Pyrroline-5-Carboxylate
DésHydrogénase
RMN Résonance Magnétique
Nucléaire RMSD Root Mean Square Deviation RNase
Ribonucléase
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide
Gel Electrophoresis
SMART Simple Modular Architecture Research
Tool
TCEP Tris((2-CarboxyEthyl)Phosphine)
TEV Tobacco Etch Virus
TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY
TRIS Tris(hydroxyméthyl) amino
méthane
TSP
3-(TriméthylSilyl)[2,2,3,3-2H4] Propionate
TST Tris Saline Tween
UV Ultraviolet
E. coli Escherichia coli
2
Préambule
Préambule
Les protéines sont des polymères d'acides
aminés qui, avec l'eau, représentent les
composants principaux des organismes vivants. A
l'image de l'ADN, support de l'information génétique et
de l'hérédité, elles peuvent être
considérées comme les molécules fondamentales de la vie.
Cependant, à la différence des acides nucléiques qui sont
à l'origine
de leur synthèse, les protéines se
caractérisent par une diversité fonctionnelle immense
associée à une diversité structurale considérable.
Bien que les êtres vivants n'utilisent qu'une vingtaine d'acides
aminés différents pour composer les protéines,
la grande diversité structurale de ces macromolécules
s'explique par la variabilité de l'enchaînement des acides
aminés dans la séquence primaire, qui guide
véritablement la nature du repliement. Avec l'essor de la biologie
structurale, il est aujourd'hui communément admis que la fonction d'une
protéine est intimement liée d'une part, à sa
structure tridimensionnelle, c'est-à-dire à l'organisation de
ses atomes dans l'espace, et d'autre part, à sa dynamique
intra-moléculaire, c'est-à-dire à l'amplitude des
mouvements de ses atomes. A l'heure où la caractérisation des
fonctions des protéines encodées par les génomes
constitue un défi majeur de l'ère post- génomique,
la détermination de la structure tridimensionnelle des
protéines à l'échelle de l'atome représente donc
un enjeu considérable dans l'optique d'identifier et de comprendre
leur(s) fonction(s). Cette approche, appelée « étude
structurale », a pour objet d'apporter des informations sur les
relations structure-activité, et structure-dynamique-activité,
et ainsi d'améliorer la compréhension des bases
moléculaires du rôle de ces molécules. Une telle
étude peut avoir deux objectifs différents :
- Dans le cas de protéines de fonction inconnue,
la connaissance de la structure tridimensionnelle va permettre, par
comparaison avec celles dont le repliement est proche, de proposer une ou
plusieurs activités pour la biomolécule étudiée.
- Lorsque la fonction est connue, l'objectif est d'identifier les
éléments de structure ou
les acides aminés essentiels à
l'activité dans le but de caractériser les
mécanismes réactionnels spécifiques de la
fonction. Ceci peut être initié, par exemple, en
comparant les structures native et mutée (induisant une
modification de l'activité) d'une même protéine, ou
en identifiant les sites d'interaction avec des partenaires biologiques
potentiels (ligand, substrat, cofacteur, partenaire protéique...).
C'est dans cette double optique que nous avons entrepris
l'étude structurale de deux protéines humaines : la
protéine mitochondriale proline déshydrogénase (PRODH)
qui fait
l'objet de la première partie de ce manuscrit, et la
protéine nucléaire KIN17 qui fait l'objet de
la seconde partie.
A ce jour, il existe plusieurs techniques qui offrent la
possibilité de caractériser la structure tridimensionnelle
d'une protéine. Cependant, seules la cristallographie des rayons X
et la Résonance Magnétique Nucléaire
(RMN) en solution permettent d'atteindre une résolution de
l'ordre de l'Angström qui est nécessaire pour comprendre le
fonctionnement d'objets moléculaires aussi petits que les
protéines. Quelle que soit la technique utilisée, la RMN ou la
cristallographie, le préliminaire à une étude
structurale est l'obtention d'une quantité importante
de la protéine à étudier (~ 1 umole dans 500 uL,
c'est-à-dire ~ 15 mg pour une protéine de 15 kDa) sous
forme soluble, pure, et
stable. Ces critères constituent
véritablement les exigences inhérentes à l'analyse
structurale. A l'heure actuelle, trois méthodes permettent
potentiellement de remplir ces conditions : la protéine
peut être directement extraite de son organisme naturel,
synthétisée chimiquement, ou surexprimée sous forme
recombinante dans un organisme hôte. Cependant, les
quantités obtenues par extraction sont souvent insuffisantes, et la
synthèse chimique devient difficilement réalisable pour des
polypeptides de plus de 50 acides aminés. Pour ces raisons, la
surexpression dans un système recombinant est de loin la technique la
plus utilisée, d'autant plus qu'elle permet de réaliser des
marquages isotopiques indispensables à l'étude d'une
protéine de taille élevée
(> 10 kDa) par RMN.
Les organismes de surexpression les plus courants sont les
bactéries, les levures, et les cellules d'insectes (baculovirus).
Pour des raisons essentiellement liées à sa
facilité d'utilisation, et à sa capacité à
produire des quantités importantes de protéine
marquée, la bactérie Escherichia coli est le
système le plus communément utilisé. C'est pourquoi, nous
avons entrepris de surexprimer des domaines protéiques de PRODH et KIN17
chez cet hôte bactérien. Cependant, bien que la protéine
d'intérêt soit produite in vivo, il n'est pas garanti
qu'elle adopte un repliement stable et biologiquement actif. En
d'autres termes, le comportement d'une protéine exogène
exprimée dans un organisme recombinant n'est pas
prévisible, et la préparation de l'échantillon,
véritable étape limitante de l'étude structurale, peut
demander de longues étapes d'optimisation, qui, dans certains cas,
peuvent se solder par
un échec. Ainsi, dans le cadre de ce travail de
thèse, de grandes difficultés ont été
rencontrées
pour préparer les échantillons de protéines
PRODH, ce qui n'a pas été le cas avec la protéine
KIN17 où la réussite de cette première
étape majeure a permis d'envisager une caractérisation
structurale par RMN. Par conséquent, ce manuscrit est
organisé en deux parties distinctes.
La première partie, consacrée à
la proline déshydrogénase PRODH, présente
conjointement les différentes stratégies que nous avons
employées pour surexprimer des protéines et domaines
structuraux PRODH chez E. coli en vue de l'analyse structurale, ainsi
que les résultats de la production et de l'optimisation de
l'expression de ces protéines. Le problème de la
délimitation des domaines structuraux sera notamment
évoqué. Ce travail a été réalisé
dans le cadre d'une collaboration avec le Laboratoire de
Génétique Moléculaire de l'EMI 9906 de la Faculté
de Médecine-Pharmacie de Rouen, et le Laboratoire de Marquage des
Protéines du CEA de Saclay. Les objectifs de cette étude seront
préalablement abordés
après avoir présenté l'intérêt
biologique suscité par la proline déshydrogénase PRODH.
Dans la seconde partie de ce manuscrit, je présenterai
l'étude structurale du domaine
K2 de la protéine KIN17 humaine par RMN et
Modélisation Moléculaire qui a été entreprise dans
le cadre d'une collaboration avec le Laboratoire de Structure des
Protéines du CEA de Saclay. Dans un premier chapitre, j'introduirai de
manière simplifiée et succincte le contexte biologique de la
protéine KIN17, puis les objectifs de ce travail seront exposés.
Les premiers résultats de l'étude expérimentale,
à savoir la préparation des échantillons de
protéine marquée 15N et 15N /
13C pour l'analyse par RMN, ainsi que les analyses
préliminaires, seront présentés dans le second
chapitre. Dans le troisième chapitre, sera détaillé
l'ensemble des méthodologies de RMN et modélisation
moléculaire utilisées dans cette étude. Les
résultats
de la caractérisation structurale proprement dite,
c'est-à-dire l'attribution des raies de résonance du
domaine K2, la détermination de la topologie de la
protéine, le recueil des contraintes expérimentales, et le
calcul de la structure par Modélisation Moléculaire, seront
décrits dans le chapitre 4. Les relations structure-activité du
domaine K2 de la protéine KIN17 humaine seront finalement
discutées dans le chapitre 5.
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