2) Production des 4 domaines PRODH
2.1) Bilan du criblage des conditions d'expression en
microplaques
Chacun des gènes encodant les protéines PROentier,
PROcatal, PROter, et PROinser a
été cloné dans 7 plasmides
d'expression différents par recombinaison homologue. Les domaines
PROcatal et PROentier ont été exprimés dans 28
conditions expérimentales différentes (7 partenaires de
fusion, 2 souches d'expression, et 2 températures), contre 42
conditions pour les domaines PROter et PROinser (7 partenaires,
3 souches, et 2 températures). Au total, 140 cultures ont
été réalisées. Pour chacune d'elles, les
fractions contenant les protéines solubles et insolubles ont
été déposées sur gel SDS-PAGE. L'analyse
de l'expression des protéines de fusion à partir
de l'interprétation des profils électrophorétiques des
gels SDS-PAGE a été reportée, domaine par domaine, dans un
tableau récapitulatif afin de déterminer les meilleures
conditions d'expression et de solubilité pour chacune des 4
protéines.
Par souci de rendre fluide la lecture de ce manuscrit, je me
contenterai de présenter dans ce paragraphe un bilan du criblage des
conditions d'expression des 4 protéines PRODH
en microplaques. Le détail des résultats,
à savoir l'ensemble des gels SDS-PAGE et leur analyse, est
présenté en annexe. Les matériels et
méthodes, spécifiques au clonage et au criblage des
conditions d'expression des 4 protéines PRODH dans le cadre du
programme
3PM, sont également reportés en annexe.
De manière générale, les
résultats du criblage des conditions d'expression montrent que la
nature du partenaire de fusion est essentielle sur l'expression et
la solubilité des protéines hétérologues PRODH.
Ainsi, seuls les partenaires MBP et NusA permettent d'obtenir des
taux suffisants de protéine soluble, contrairement aux autres
partenaires, et notamment à l'étiquette 6xHis, qui conduisent
à la formation quasiment exclusive de corps d'inclusion. Si la
souche bactérienne et la température d'expression ne
semblent pas influencer de manière directe la solubilité des
protéines hétérologues PRODH, les criblages
de ces deux paramètres n'ont pas été pour
autant inutiles. En effet, nous avons constaté que
l'expression des domaines PRODH, en fusion avec les
meilleurs partenaires, et en souche
Rosetta cultivée à 20°C, permet dans la
plupart des cas d'augmenter de manière significative
les niveaux d'expression de protéine soluble.
Le criblage des conditions d'expression en microplaques du
programme 3PM a donc rempli son objectif. En effet, après avoir
testé en moyenne près d'une trentaine de conditions
par domaine PRODH, nous avons pu déterminer,
pour chaque domaine, au moins une condition qui permette une
expression suffisante de protéines de fusion solubles
(Tableau 4.1). Cependant, cette première étape a
également mis en évidence le caractère toxique du
domaine PROter qui laisse présager la rencontre de
difficultés lors de sa
production à grande échelle.
|
domaine
|
partenaire de fusion
|
Souche d'expression
|
Température d'expression
|
|
PROcatal
PROentier
PROter
PROinser
|
MBP
MBP
NusA
MBP
|
Rosetta
|
20°C
|
Tableau 4.1 :
Récapitulatif de la meilleure condition d'expression obtenue pour
chaque
domaine PRODH à l'issu du criblage en
microplaques.
| 
