IV.5 Purification des immunoglobulines
IV.5.1 Précipitation des globulines par les sels
Les immunoglobulines précipitent quand on augmente la
force ionique du milieu à l'aide de sels. En présence de 30-50 %
de sulfate d'ammonium (ou de sodium) les globulines précipitent alors
que l'albumine reste en solution. Le culot de globulines est repris dans un peu
d'eau distillée et dialysé.
IV.5.1.1 Précipitation par le sulfate d'ammonium
saturé
Dans un Erlen dissoudre à chaud environ 400-450 g de
sulfate d'ammonium dans 1/2 litre d'eau distillée (figure 8). Laisser
cristalliser à froid (réfrigérateur) pendant quelques
jours. La solution saturée a un pH d'environ 5,5 : elle peut être
neutralisée avec une solution de soude ou d'ammoniaque (facultatif).
Comme tampon de dialyse, on pourra utiliser un tampon phosphate
(du PBS, par exemple).
Figure 10. Techniques de purification des
immunoglobulines : précipitation par les sels (source.
[14]).
IV.5.2 Précipitation par le sulfate de sodium
A la place de sulfate d'ammonium, on peut utiliser du sulfate de
sodium pour précipiter les immunoglobulines et se débarrasser de
l'albumine :
- Précipiter les immunoglobulines à
température ambiante : à un volume d'antisérum (ou milieu
contenant des immunoglobulines) ajouter 2-3 volumes de solution de sulfate de
sodium 0,25 g/ml. Centrifuger et éliminer le surnageant.
- Laver le précipité 1 ou 2 fois avec du sulfate de
sodium 0,18 g/ml.
- Dissoudre le précipité dans un petit volume de
tampon et dialyser à froid dans ce tampon : le tampon peut être du
PBS.
IV.5.3 Précipitation par le rivanol
Le procédé est les suivant :
- Ajuster le pH du sérum à 8-8,5.
- Préparer extemporanément une solution de
rivanol à 0,4% (poids/volume) dans de l'eau distillée. Ajouter
goutte à goutte sous agitation 3,5 volumes de cette solution de rivanol
à un volume de sérum.
- Centrifuger 20-30 min à 10 000 G.
- Récupérer le surnageant qui contient les
immunoglobulines.
- Dissoudre le culot avec de l'eau. Précipiter à
nouveau cette solution au rivanol, centrifuger et récupérer le
surnageant qui contient les immunoglobulines non extraites lors de la
première précipitation.
- Réunir les 2 surnageants. Ajouter du bromure de
potassium à saturation (54,48 g / 100 ml) afin de précipiter le
rivanol sous forme de bromure de rivanol.
- Filtrer sur tissu "Miracloth" ou sur papier filtre Whatman pour
enlever le bromure de rivanol.
- Pour concentrer les immunoglobulines, on pourra poursuivre par
une précipitation au sulfate d'ammonium suivie d'une dialyse dans du
PBS.
IV.5.4 Purification par chromatographie d'échange
d'ions
Les immunoglobulines (Ig) ont le pH le plus
élevé des protéines sériques : à pH 8 elles
présentent une charge nette positive ou nulle. Les autres
protéines sériques ont au contraire une charge nette
généralement négative : elles sont donc retenues sur une
colonne chargée positivement, alors que les Ig passent librement (fig.
11).
Équilibrer le gel de DEAE (DiEthylAminoEthyl) Cellulose ou
Sepharose dans du tampon Tris-HCl 0,01 M pH8 [14]. Les
protocoles suivants peuvent être utilisés :
· Chromatographie sur colonne
(fig. 11) : il consiste à :
- Équilibrer le gel de DEAE (DiEthylAminoEthyl)
Cellulose ou Sepharose dans du tampon Tris-HCl 0,01 M pH8
[14].
- Verser le gel de DEAE Cellulose ou Sepharose dans une
colonne de chromatographie. Le volume doit être suffisant pour adsorber
les protéines sériques (compter un minimum de 1 ml de gel par 100
mg de protéines).
- Charger l'antisérum ou les globulines
prépurifiées (par exemple par précipitation au sulfate
d'ammonium) sur la colonne. Éluer avec du tampon Tris-HCl pH 8 contenant
0,5M de NaCl. Récupérer le pic et son épaulement qui
contiennent les immunoglobulines.
· Technique "batch" (fig.
11)
On peut aussi, beaucoup plus simplement, mélanger le
gel et la solution à purifier dans un tube que l'on centrifuge. On
récupère les immunoglobulines dans le surnageant.
Figure 11. Techniques de purification des
immunoglobulines : chromatographie d'échange d'ions (source.
[14]).
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