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Utilisation comparée de la gélose chocolat à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la culture de trois espèces bactériennes méningées

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par Antoine A. & Fêmi Jacques H. DANSOU & SETONDJI
Université d'Abomey- Calavi au Bénin - Licence professionnelle en analyses biomédicales 2008
  

Disponible en mode multipage

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RÉPUBLIQUE DU BÉNIN

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE (MESRS)

UNIVERSITE D'ABOMEY-CALAVI (UAC)

ECOLE POLYTECHNIQUE D'ABOMEY-CALAVI (EPAC)

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

Option : Analyses Bio-Médicales (ABM)

POUR L'OBTENTION DU

DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

UTILISATION COMPAREE DE LA GELOSE CHOCOLAT A BASE
D'HEMOGLOBINE EN GRANULEES ET DE LA GELOSE CHOCOLAT
A BASE DE SANG DE MOUTON DEFIBRINE POUR LA CULTURE
DE TROIS ESPECES BACTERIENNES MENINGEES

Présenté et Soutenu par : Sous la Direction de :

Antoine A. DANSOU

&

Jacques F. SETONDJI

Tuteur:

Mr François HOUNSOU Inspecteur d'action sanitaire A1 Laboratoire Central/ SNLSP MINISTERE DE LA SANTE

Superviseur :

Dr Honoré BANKOLE Microbiologiste Maître-Assistant du CAMES EPAC/UAC

Composition du jury :

Président :

Pr Frédéric LOKO, Enseignant à l'EPAC

Membres :

Dr Honoré BANKOLE, Enseignant à l'EPAC Dr Lordson DOSSEVI, Enseignant à l'EPAC

Date de soutenance : 23 Septembre 2008

Année Académique 2007-2008
1ère promotion

Utilisation comparée de la gélose chocolat à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la culture de trois espèces bactériennes méningées

AU SEIGNEUR DIEU

Tout fut par toi et pour toi

Bénis sois-tu Père

Donne-moi de trouver dans l'exercice de mon métier, la force et le courage de continuer. Amen.

A mon papa DOSSOU Dansou

« Que de privatisation pour tes enfants ». Je sais que tant que je t'aurai, je ne manquerai ni de courage, ni de volonté pour de meilleurs succès. Puisse Dieu te garder afin que tu jouisses des fruits de ce travail. Je t'aime papa.

A toi ma mère DJIVO Azondékon

Tes conseils sont restés pour chacun de tes enfants la force d'une réussite certaine de la vie. Aujourd'hui encore un de tes rêves se réalise. Puisses-tu jouir des fruits de ce travail.

Je t'aime très fort.

A mon grand frère DOSSOU Gilbert

Vous qui avez connu des privatisations, de sacrifices pour que ma vie soit meilleure ; qui avez été ravi de mon affection alors que la route m'était encore largue pour la concrétisation de vos rêves. Recevez toute mon affection et ma reconnaissance à travers ce travail qui est également le votre.

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A mes frères et soeurs, particulièrement : DOSSOU Roger, DOSSOU Albertine, DOSSOU Albert, DOSSOU André que ce travail soit pour vous un exemple à dépasser. Je compte sur vous.

A toi DOSSOU Catherine

Je demeurerai toujours très sensible à tes gestes. Je te prie d'accepter ma reconnaissance la plus sincère.

A mon oncle DOSSOU Adoundjo

Toute ma reconnaissance. Vos prières m'ont beaucoup aidé.

A tous mes amis particulièrement SETONDJI Jacques, HOUNSA Sahib et HOUNDJENOU Guy-Martin.

DANSOU A. Antoine

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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et Jacques Fêmi SETONDJI

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A Dieu le Père tout Puissant

Je ne saurai jamais te remercier pour ton amour et ta protection sur ma personne. Ce rapport est avant tout ta conception, ta volonté. Aide-nous à faire davantage mieux.

A la mémoire de mon père SETONDJI Jacques Que je ne peux sans cesse regretter l'absence. Que ton âme repose en paix.

A la mémoire de ma mère GASSOGBE Marcelline Qui pendant toute sa vie s'est battue pour notre réussite. Bon repos dans l'éternel

A toi DANSOU Antoine

Nous avons su nous comprendre malgré nos multiples difficultés.

A mes frères et soeurs

Que le Dieu Tout Puissant guide vos pas à accomplir davantage vos rêves.

A tous mes oncles, tantes, cousins et cousines Merci pour votre sollicitude et vos conseils.

A tous mes enseignants des cours primaire, secondaire, et universitaire

Profondes reconnaissance.

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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et Jacques Fêmi SETONDJI

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A tous mes amis (es)

Recevez ici l'expression de mon affection.

SETONDJI F Jacques H.

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Nous exprimons avec déférence, notre reconnaissance à l'Eternel Dieu, la source intarissable de notre vie, pour tous ses bienfaits.

A notre superviseur Dr BANKOLE Honoré, Maître Assistant du CAMES EPAC/UAC

Pour avoir accepté de superviser notre travail en dépit de vos multiples occupations.

Tous les enseignants de L'Ecole Polytechnique d'Abomey-Calavi (EPAC) particulièrement ceux du Département de Génie de Biologie Humaine (GBH) pour avoir contribué à notre formation.

A vous notre tuteur de stage, Mr HOUNSOU François malgré vos multiples occupations, vous avez toujours été disponible à nous écouter. Votre simplicité, votre patience, votre dévouement à la tâche, votre amour du travail bien fait et votre esprit de synthèse font de vous un tuteur prestigieux, respecté et respectable. Profonde gratitude.

A Mme HOUNWANOU Agnès pour la qualité de l'éducation que vous nous avez donné tout au long de notre stage.

A Mr DJOSSOU Emmanuel, nous vous remercions pour nous avoir accepté comme vos enfants.

A tout le personnel du Laboratoire Central

Pour l'esprit de fraternité qui a régné tout au long de notre stage.

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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et Jacques Fêmi SETONDJI

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RESUME

La présente étude a eu pour objectif d'apprécier la capacité de la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné par rapport à la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées, à permettre la culture de certaines espèces bactériennes exigeantes.

Pour ce fait les souches de Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influanzae b ont été mises en culture sur les deux types de gélose chocolat.

Toutes les trois souches bactériennes ont montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de gélose chocolat.

Il est alors possible de substituer la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées à la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Mots clés : gélose chocolat, hémoglobine en granulées, sang de mouton défibriné

SUMMARY

The purpose of this study was to appreciate the perfomance of the chocolate gelose with defibrine blood of sheep compared to that of chocolate gelose with heamoglobin in granule, during the culture of certain species of exacting bacterium.

Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae and Heemophilus influenzae b stumps were used.

All the three stumps of bacterium have shown same density of colonies for the same suspension of bacterium on the two different kinds of chocolate gelose.

Thus, it is possible to substitute the chocolate gelose with defibrine blood of sheep to the chocolate gelose with heamoglobin in granule.

Keys word: chocolate gelose, heamoglobin in granule, defibrine blood of sheep

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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et Jacques Fêmi SETONDJI

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LISTE DES ABREVIATIONS

UAC : Université d'Abomey-Calavi

EPAC : Ecole Polytechnique d'Abomey-Calavi

DEDTS : Direction des Explorations Diagnostiques et de la Transfusion Sanguine

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

LCR : Liquide Céphalo Rachidien

CO2 : Dioxyde de Carbone

NaCl : Chlorure de Sodium ORL : Oto-Rhino-Laryngologie

Hib : Haemophilus influenzae type b

pH : Potentiel d'Hydrogène CTA : Cystine-Trypcase Agar TSA : Trypcase-Soja

PNUD: Programme des Nations Unis pour le Développement

UNICEF: Fonds des Nations Unies pour l'Enfance

PBS : Soluté Salin tamponné au Phosphate

% : pourcent

%o : pourmille

g : gramme

mL : millilitre

uL : microlitre

mm : millimètre

mm3 : millimètre cube

g/L : gramme par litre °C : degré Celsius

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Affection à évoquer en fonction du nombre de leucocytes dans le LCR.

Tableau II : Germes pouvant être isolés dans le LCR.

Tableau III : Récapitulatif des germes utilisés.

Tableau IV : Densités des colonies de Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné. Tableau V : Densités des colonies de Neisseria meningitidis W135 "deuxième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné. Tableau VI : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné. Tableau VII : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "deuxième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné. Tableau VIII : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "troisième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné. Tableau IX : Densité des colonies de Streptococcus pneumoniae sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Tableau X : Densités des colonies de Haemophilus influenzae sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

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LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Réalisation de suspension et des dilutions à 10-1 et 10-2 Figure 2 : Culture obtenue avec Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné Figure 3 : Culture obtenue avec Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées

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La plupart des techniques bactériologiques : isolement,

identification, conservation, numération des bactéries exigent l'utilisation des milieux de culture. Leur étude est indispensable pour le bactériologiste qui devra choisir les milieux de culture les mieux adaptés aux recherches envisagées et aux exigences des bactéries en causes, interpréter avec un maximum de précision et d'exactitude les résultats obtenus [6].

Certaines souches responsables de la méningite : Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, bactéries fragiles et exigeantes, ont longtemps posé aux bactériologistes des problèmes pour leur isolement et leur conservation en particulier à partir des produits polymicrobiens. Actuellement, la plupart des fabricants présentent pour l'isolement de ces germes des milieux d'excellente qualité soit sous forme « prêt à l'emploi », soit à préparer à partir de base déshydratée, soit encore sous forme précoulée en boite de Pétri. Pour ces différents germes certaines conditions particulières demeurent indispensables pour obtenir leur culture.

Au cours de notre stage dans la section bactériologique au laboratoire central nous avons remarqué qu'après l'examen direct avec l'étude cytologique et la coloration de Gram pour la recherche des bactéries dans le LCR, il ensemence soit la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulés "commercialisée" soit la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné stérile "maison". Pour des raisons économiques nous avions choisi faire une étude sur l'utilisation comparée de la gélose chocolat "commercialisée" et la gélose chocolat "maison" pour la culture de trois espèces méningées car la gélose commercialisée revient plus chère au laboratoire.

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Ainsi pour bien poursuivre notre réflexion, nous nous sommes fixés des objectifs ci-après :

Objectif général

Substituer la gélose chocolat "commercialisée" à la gélose chocolat "maison".

Objectifs spécifiques

1-Cultiver Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae sur la gélose chocolat "commercialisée" et la gélose chocolat "maison".

2-Evaluer et comparer les cultures sur les deux milieux.

Après quelques généralités sur le cadre de travail, le LCR et les milieux de cultures, tour à tour seront exposés la méthodologie suivie, les résultats obtenus et la discussion qui en découle ; ensuite la conclusion et les perspectives que suscite cette étude. Une liste de références bibliographiques complètera le document.

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I- PRESENTATION DU LABORATOIRE CENTRAL [5]

Le Laboratoire Central fait office du siège du Service National des Laboratoires de Santé Publique, l'un des quatre services de la Direction des Explorations Diagnostiques et de la Transfusion Sanguine (DEDTS). Il constitue la tête de pont de tous les laboratoires de santé publique du Bénin et est logé dans l'enceinte du Ministère de la Santé. Il est chargé de :

· développer et pratiquer toutes les méthodes d'analyses biologiques dans un but de diagnostic et de recherche ;

· organiser et mettre en oeuvre toutes les enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en général et des maladies transmissibles en particulier ;

· pratiquer toutes les analyses de santé publique (hygiène et environnement) en collaboration avec les structures concernées ;

· assurer l'organisation des stages pratiques des agents en provenance des structures agréées de formation ainsi que le recyclage, la formation en cours d'emploi des techniciens de laboratoire d'analyses biomédicales.

Il est constitué des sections suivantes : Biochimie, Bactériologie, Hématologie, Sérologie, Parasitologie, Hygiène des Eaux et Aliments.

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II- RAPPELS PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LCR

II-1- DEFINITION DE LCR [3]

Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide clair qui baigne les méninges. Il occupe les quatre ventricules cérébraux et le canal de l'épendyme. A l'état normal, il est clair comme eau de roche.

II-2-EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LCR

II-2-1-Observation lors du prélèvement [8]

Il est nécessaire, tout d'abord, d'estimer la pression avec laquelle s'écoule le liquide lors du prélèvement. Il peut être hypertendu et s'écouler plus rapidement, en gouttes pressées, voir en jet au moment où on retire le mandrin, dans les méningites, les arachnoïdites, les blocages ventriculaires ; il est normotendu s'il s'écoule en goutte à goutte.

II-2-2-Aspect du liquide céphalo-rachidien [2]

-Liquide clair :

· Normalement un LCR se présente comme un liquide limpide, incolore, « eau de roche »

· Un liquide clair peut cependant être pathologique car une réaction cellulaire importante est nécessaire pour créer un trouble visible à l'oeil

nu. (Plus de 300 éléments cellulaires par mm3)

-Liquide trouble, soit légèrement opalescent, louche « eau de riz », soit grisâtre, purulent ou même de teinte verdâtre pouvant déjà évoquer une étiologie pneumococcique. C'est le signe d'une réaction leucocytaire importante. Elle traduit généralement une méningite bactérienne.

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-Liquide hématique, sanglant ou simplement rosé. Le sang peut provenir :

· de la piqûre d'un vaisseau au moment de la ponction, le premier tube est alors plus coloré que les deux autres,

· d'une hémorragie méningée, les trois tubes sont également colorés.

Si tout le LCR a été prélevé dans un seul tube, laisser sédimenter les hématies ou centrifuger légèrement.

· Le liquide surnageant est limpide et incolore avec des caillots au fond du tube, il s'agit d'une piqûre accidentelle.

· Le liquide surnageant est légèrement rosé avec un caillot hématique non coagulé constitué d'hématies pouvant être remises en suspension ; il s'agit d'une hémorragie méningée.

-Liquide xanthochromique : c'est-à-dire jaune et transparent. Cet aspect peut traduire :

· une hémorragie méningée ancienne

· une compression médullaire

· ictère grave.

II-3-EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DU LCR

II-3-1-Examen cytologique du LCR [2]

L'examen cytologique vise à l'étude quantitative et qualitative des éléments de la réaction cellulaire, il doit être réalisé le plus tôt possible après le prélèvement car les cellules se lysent rapidement. Ces cellules sont généralement des leucocytes mais d'autres éléments cellulaires peuvent être observés. Il regroupe la numération des éléments figurés (leucocytes et hématies) et l'établissement de la formule leucocytaire.

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Normalement, il y a moins de 3 leucocytes/mm3 dans le LCR. La numération est effectuée avec la cellule de Malassez. Elle consiste surtout à faire une étude quantitative des leucocytes dont la présence en nombre élevé (>5 leucocytes/mm3), détermine un liquide pathologique. Un tel résultat nous conduit à l'établissement de la formule leucocytaire à partir du culot de centrifugation (2000tours/minutes pendant 10 minutes). Cette étude qualitative offre deux alternatives :

· Soit la formule est à prédominance des polynucléaires neutrophiles : il s'agit des méningites suppurées.

· Soit la formule est à prédominance des lymphocytes : il s'agit essentiellement des méningites virales, des méningites tuberculeuses, sans oublier les méningites bactériennes.

La présence du sang dans le LCR fausse le résultat de l'examen car les leucocytes auront été amenés par le sang.

Si le LCR est vraiment sanglant, la numération est impossible. S'il est simplement rosé, un peu hématique, on peut néanmoins reconnaître la présence de leucocyte témoin d'une infection. Pour cela, comparer le nombre des leucocytes et celui des hématies trouvés dans le LCR. Si leur rapport est le même que dans le sang périphérique du sujet, les leucocytes ont été exclusivement apportés par le sang. Si les globules blancs sont en grand nombre, il traduit une inflammation méningée.

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Tableau I : Affection à évoquer en fonction du nombre de leucocytes dans le LCR [8]

Nombres de leucocytes/mm3 Affections à évoquer

5 à 200/mm3 Trypanosomiase

10 à 100/mm3 Méningite tuberculeuse (début)

100 à 1000/mm3 Méningite tuberculeuse (phase

aiguë)

10 à 400/mm3 Syphilis (phase nerveuse)

10 à 1000/mm3 Méningite à pneumocoque

200 à 1000/mm3 Méningite à Haemophilus

influenzae

1000 à 2000/mm3 Méningite à méningocoque

II-3-2-Examen bactériologique

L'examen bactériologique comporte deux étapes :

-L'examen microscopique direct est un temps essentiel, toujours réalisable sur place. Associé à l'examen cytologique précédent il fournit un maximum de renseignements.

-La culture bactériologique est réalisable seulement dans un laboratoire
auquel on adressera le LCR. Les réponses toujours tardives et les
résultats aléatoires, dépendent en partie des conditions du transport et

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surtout de sa rapidité. Le laboratoire confirme la nature du germe et détermine sa sensibilité aux antibiotiques.

L'examen bactériologique est orienté par l'aspect du LCR et par l'examen cytologique.


· Liquide trouble

L'examen cytologique montre le plus souvent un LCR riche en polynucléaires plus ou moins altérés. Cependant l'examen cytologique de certains LCR louches révèle parfois une lymphocytose. Il s'agit des méningites lymphocytaires à forte réaction cellulaire.

*Recherche directe des germes

Colorer par la coloration de Gram une des lames préparées par l'étalement du culot de centrifugation. Examiner à l'objectif à immersion. Les germes sont parfois très rares, L'observation doit être prolongée et minutieuse. Sa négativité n'élimine pas une étiologie bactérienne. [2]

Les germes les plus fréquemment rencontrés sont :

-Les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) ; cocci Gram positifs, lancéolés en flamme de bougie, groupés en diplocoques, en courtes chaînettes, un halo clair visible autour des corps bactériens traduit l'existence d'une capsule polysaccharidique définissant plus de 84 sérotypes. Les germes sont toujours abondants et accompagnés de polynucléaires. Les pneumocoques sont des hôtes habituels des voies aériennes supérieures ; Ils colonisent fréquemment le rhino-pharynx et déclenchent de fréquentes infections des voies aériennes (otites, sinusites). Les bactéries peuvent parfois être disséminées par voie sanguine et donner des méningites, des péritonites, des arthrites, des endocardites. Sa croissance nécessite des milieux enrichis [4].

-Les méningocoques (Neisseria meningitidis) : cocci Gram négatifs, groupés en diplocoques « grain de café » intra ou extra-cellulaires, peu

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nombreux, souvent rares sur un fond de polynucléaires intacts ou altérés. C'est un germe fragile (froid, dessiccation) qui croît sur milieux enrichis en présence de CO2. C'est une bactérie capsulée, possédant une capsule polysaccharidique permettant de distinguer 12 sérogroupes (A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z, 29E et W135). Neisseria meningitidis est une

bactérie strictement humaine, retrouvée dans le rhino-pharynx transmise par voie aérienne. A partir d'un portage dans le rhino-pharynx très fréquent durant l'hiver, la bactérie peut passer dans le sang dans un faible pourcentage de cas (septicémie) et gagner les méninges, produisant une méningite [4].

Une méningite purulente dans laquelle on ne trouve pas de germe, doit faire suspecter une étiologie méningococcique [2].

- Bacilles de Pfeiffer (Haemophilus influenzae), petits bacilles Gram négatifs, coccobacillaires intra ou extra-cellulaires. Haemophilus influenzae est un bacille fragile, croissant sur milieux enrichis. Il possède une capsule polysaccharidique avec 6 sérotypes (a, b, c, d, e et f). Le sérotype b est celui qui pose de loin le plus de problèmes de Santé Publique car il est le principal responsable d'infections invasives (méningites, pneumonie, septicémie, arthrites....). Les autres sont responsables surtout d'otites. Haemophilus influenzae est une bactérie strictement humaine, transmise par voie aérienne. Les bactéries colonisant le rhino-pharynx peuvent induire des infections ORL (otorhino-laryngologie) très fréquentes et parfois pulmonaires (otites, sinusites, épiglottites, pneumonies). Les bactéries peuvent disséminer par voie sanguine chez quelques enfants donnant une septicémie isolée (rare) souvent infectant les méninges (méningites) ou éventuellement les

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articulations (arthrites). L'association de forme coccobacillaires, de bâtonnets et de formes longues est relativement fréquente. [4]

Rappelons que cette méningite à Haemophilus influenzae est l'apanage des enfants de 3 mois à 3 ans [2].

D'autres germes peuvent être observés :

- Les staphylocoques, cocci Gram positifs, réguliers de forme et de taille groupés en amas caractéristique (grappe de raisin).

- Les streptocoques, cocci Gram positifs plus ou moins réguliers, disposés en chaînettes.

- Les entérobactéries : bacilles Gram négatifs.

- Les listeria : bacilles Gram positifs de petites tailles non sporulés, non capsulés, isolés, groupés par pair ou en petits « amas palissadiques », intra ou extra-cellulaires. [2]

Tableau II : Germes pouvant être isolés dans le LCR [8]

Groupe

Gram

Aspect

Germe

 
 

Souvent abondants lancéolés,

 

Cocci

 
 
 
 

+

par deux ou en courtes
chaînettes capsulés

Pneumocoque

Cocci

 

Souvent rares, en grains de

 
 

-

café, intra ou extra cellulaires

Méningocoque

Bacille

 
 

Haemophilus

 

-

Intra ou extra cellulaires

influenzae

Cocci

 
 
 
 

+

Régulier en amas

Staphylocoque

Cocci

+

En chaînette

Streptocoque

 

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Bacille + Isolé ou en palissade, intra ou Listeria

extracellulaire


· Liquide clair [2]

L'examen cytologique montre le plus souvent des lymphocytes, parfois quelques polynucléaires.

- LCR clair à lymphocytes prédominants :

Deux étiologies dominent :

" Les méningites virales, de loin les plus fréquentes.

" Les méningites tuberculeuses, relativement rares.

Il ne faut pas omettre la possibilité d'une méningite bactérienne au début. Le

diagnostic est orienté par le contexte clinique et relativement par les examens biochimiques.

Si on soupçonne une tuberculose méningée : effectuer une coloration de Ziehl-Neelsen sur une des lames d'étalement du culot de centrifugation à la recherche des bacilles tuberculeux acido-alcoolorésistants. Ce sont des bacilles fins, grêles gardant la coloration de la fuchsine, le plus souvent isolés ou en petits amas. En raison de leur rareté, cette recherche doit être minutieuse et prolongée.

- LCR avec polynucléaires prédominants : Il s'agit d'une méningite à réaction cellulaire faible :

" Soit parce qu'on se trouve à un stade très précoce de la méningite purulente. L'examen minutieux du culot de centrifugation après coloration de Gram, doit s'efforcer de découvrir le germe en cause.

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v' Soit il s'agit d'une méningite purulente décapitée par une antibiothérapie.

III- IDENTIFICATION DES PRINCIPAUX GERMES DE LA MENINGITE BACTERIENNE [7]

III-1- IDENTIFICATION DE Neisseria meningitidis

On obtient de bon résultat avec des cultures de 18-24 heures. Toujours vérifier la pureté de la culture par une coloration de Gram. Au Gram les méningocoques se présentent comme des diplocoques négatifs ressemblant à des grains de café. Faire si nécessaire des repiquages pour obtenir une culture pure. La recherche de l'oxydase se fait à partir des colonies obtenues sur gélose au sang par le test de Kovac ; on possède ensuite au sérogroupage.

-Test de l'oxydase de Kovac

Le test de l'oxydase permet de mettre en évidence un cytochrome oxydase. Le chlorhydrate de tétraméthyl-p-phenylène diamine est oxydé en un composé violet par les bactéries qui possèdent le système cytochrome C dans leur chaîne respiratoire.

Réalisation du test

A l'aide d'une anse jetable en plastique ou un bâtonnet de bois, prélever un fragment de la colonie et l'étaler sur une bandelette de papier filtre imprégnée. Ne pas utiliser d'anse à nichrome qui peut donner un faux positif.

Lecture des résultats

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Une coloration violette qui apparaît dans les dix secondes indique une réaction positive. Des réactions plus tardives peu probables avec Neisseria meningitidis. Ce test, utile pour identifier Neisseria meningitidis, peut aussi être positif avec d'autres espèces du genre Neisseria, ainsi qu'avec d'autres espèces bactériennes non apparentées.

-Identification du sérogroupe de Neisseria meningitidis

On connaît actuellement 12 sérogroupes, définir par leurs polyosides capsulaires : A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z, Z' (29E) et W135.

A, B, C, W135 et Y sont les sérogroupes les plus fréquemment isolés au cours des méningites à méningocoque. Le sérogroupe A est la cause la plus fréquente en Afrique et en Asie suivi du sérogroupe C. Les immunsérum pour la détermination des groupes de Neisseria meningitidis sont disponibles dans le commerce.

Réalisation du test

-Nettoyer une lame à l'alcool. Diviser la lame en trois zones de 10 x 4 mm à l'aide d'un crayon gras ou autre marqueur.

-Porter 10 ul de formol à 0,5% salé au bas de chacune des trois zones. -Prélever un fragment de colonie à la surface d'une gélose au sang à l'aide d'une anse stérile, d'une aiguille ou d'un bâtonnet stérile. Emulsionner pour obtenir une suspension légèrement opalescente.

-En haut de chacune des trois zones de la lame, Ajouter 10 ul de chacun des immunsérums choisis dans deux des zones et 10 ul de soluté salin ou de PBS (non formolé) dans la troisième pour servir de témoin. -Mélanger chacun des antisérums et le soluté salin avec la suspension à tester, imprimer à la lame un mouvement de balancier pendant une à deux minutes (le temps peut varier en fonction du fournisseur de l'antisérum). Lire sous un bon éclairage et au dessus d'un fond noir.

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Lecture des résultats

L'agglutination doit se produire avec un seul des immunsérums et pas avec le soluté salin. L'agglutination en soluté salin caractérise les souches autoagglutinables. L'agglutination avec plusieurs immunsérums en absence d'agglutination avec le soluté salin caractérise les cultures polyagglutinables. L'absence d'agglutination avec l'un ou l'autre des immunsérums et avec le soluté salin caractérise une souche non groupable. Ces résultats sont rares avec l'isolement fraîchement obtenu du LCR ou du sang, mais peuvent se voir occasionnellement. Conserver les immunsérums et le soluté salin PBS au réfrigérateur à 4°C quand ils ne sont pas utilisés.

III-2-IDENTIFICATION DE Streptococcus pneumoniae

Sur gélose au sang et gélose chocolat, les colonies de Streptococcus pneumoniae sont petites, grisâtres, muqueuses (en gouttes de rosée) entourées par une zone verdâtre d'hémolyse alpha. Une loupe grossissement 3fois ou un microscope (30x-50x) permet de distinguer les pneumocoques des streptocoques "viridans" alpha hémolytiques. Les types de colonies sont bombés quand elles sont jeunes, mais après 24-48 heures le centre des colonies de pneumocoques se déprime alors que les colonies de streptocoques "viridans" gardent leur apparence. Pour optimiser les résultats, il est recommandé de toujours incuber les boites sous CO2.

-Test de sensibilité à l'optochine

Identification présomptive de Streptococcus pneumoniae consiste à examiner la sensibilité de la souche à l'optochine.

Réalisation du test

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-Toucher une colonie suspecte alpha hémolytique avec une anse stérile et ensemencer en stries sur la gélose au sang.

-Déposer un disque à l'optochine ou un disque "p" de 6mm de diamètre (contenant 5ug d'éthylhydrocupréine) à l'extrémité de la strie, là où a commencé l'ensemencement. Trois ou quatre colonies peuvent être testées sur la même boite.

-Incuber 18-24 heures à 35°C dans un incubateur à C O2 ou sous une

cloche à bougie.

Lecture des résultats

Les souches alpha hémolytiques présentant une zone d'inhibition supérieure à 14mm sont des pneumocoques. Les souches alpha hémolytiques sans zone d'inhibition sont des streptocoques "viridans"

III-3-IDENTIFICATION DE Haemophilus influenzae

Des petits bacilles ou coccobacilles Gram négatifs, qui ne se cultivent qu'en présence des facteurs x et v, qui poussent sur gélose chocolat et pas sur gélose au sang, qui ont une odeur âcre d'indole et n'agglutinent pas avec un immunsérum anti-méningocoque peuvent être Haemophilus influenzae. En absence de vaccination, la plupart des cas de méningite à Haemophilus influenzae sont de sérotype b.

-Détermination du sérotype l' Haemophilus influenzae

La réalisation du test est comparable à celle décrite pour Neisseria meningitidis, si ce n'est le choix de l'immunsérum. Les isolements de Hib présumés seront testés à la fois avec l'immunsérum anti Haemophilus influenzae type b, un antisérum vis-à-vis de l'un des autres types et un soluté salin. Une forte réaction positive avec l'immunsérum anti-b et l'absence de réaction antisérum dirigé contre un autre type et le soluté

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salin sont des éléments de présomption en faveur de Haemophilus influenzae type b (Hib). Si l'isolement n'est pas agglutiné par l'antisérum anti-b, il faut le tester avec un antisérum polyvalent. En cas de positivité, tester les sérums monovalents (a, c, d, e, f) pour déterminer le sérotype. Si le résultat est négatif, la souche est probablement non typable. La mise en évidence des besoins en facteur x et v est nécessaire pour confirmer l'identification de Haemophilus influenzae ou envisager une autre espèce de l'Haemophilus.

Réalisation du test

-Faire une suspension opalescente de bactéries dans 10ul de formol à 0,5% salé, après une nuit d'incubation sur gélose chocolat.

-Transférer une anse (5ul) de la suspension bactérienne sur une lame nettoyée à l'éthanol divisée en trois zones.

-Dans chacune des zones ajouter respectivement un même volume d'un antisérum anti-Hib, d'un antisérum spécifique d'un type différent, et de soluté salin.

-Mélanger avec un bâtonnet et agiter doucement la lame par un balancement pendant une minute.

Lecture des résultats

Seules les réactions d'agglutination nette sont considérées comme positives. Les bactéries sont alors agglutinées et le liquide de suspension paraît clair. Si une souche réagit avec plus d'un antisérum, elle est considérée comme non typable.

IV- LES MILIEUX DE CULTURES

IV-1-DEFINITION

Les milieux de culture sont des supports nutritifs stériles qui permettent aux microorganismes placés à leur contact d'y trouver les

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divers éléments nécessaires à leur croissance : source de carbone, source d'azote, aliment énergétique, oligo-éléments.

IV-2-MODE GENERAL DE PREPARATION [6]

Pour se procurer les milieux de culture qui lui sont nécessaires le bactériologiste a le choix entre diverses possibilités, choix tenant compte :

-de l'équipement du laboratoire en personnel et en matériel,

-du rythme d'utilisation,

-du prix de revient,

-de la nature du milieu,

-des possibilités d'approvisionnement.

Sont actuellement commercialisés :

· Des milieux « prêts à l'emploi », conditionnés en boite de Pétri (milieu précoulé) ou en tube ; pour les laboratoires de petite ou moyenne importance cette solution permet une organisation simple et rationnelle du travail avec une bonne garantie de qualité.

· Des milieux « prêts à l'emploi », non conditionnés sous leur forme définitive, mais en flacon de 30mL à 1L ; le coût est moins élevé que précédemment, les délais de conservation de milieux plus longs, mais il faut prévoir un service de préparation plus important et surtout des possibilités de stockage.

· Des milieux déshydratés qui réunissent un grand nombre d'avantages : leurs constituants apparaissent assez constants d'un lot à l'autre, en raison de la fabrication à grande échelle ; la conservation est

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aisé sous un encombrement restreint ; la préparation simplifiée peut être confiée à un personnel moins spécialisé. Un large choix des milieux est proposé, permettant ainsi une excellente adaptation des méthodes bactériologiques aux buts envisagés.

IV-3- QALITE DU MILIEU DE CULTURE [6]

Certaines qualités sont indispensables à un milieu pour favoriser le développement bactérien ; elles concernent :

-La composition : Les éléments de cultures doivent contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l'entretien des microorganismes et assimilable par eux :

> Aliments essentiels azotés et carbonés

> Eléments minéraux

> Facteurs de croissance (métabolites essentiels que la bactérie est incapable de synthétiser)

> Facteurs stimulants ou facteurs de départ dont la présence accélère le rythme de la multiplication bactérienne

-Le pH : En général les bactéries ne se développent qu'à un pH voisin de la neutralité (7 à 7,6). Certaines espèces non pathogènes pour l'homme oxydent le thiosulfate et la soude en acide sulfurique et se développent à un pH voisin de O. A l'opposé il y a des bactéries qui hydrolysent l'urée et qui sont productrice d'ammoniaque et qui tolèrent des pH très alcalin.

Certaines espèces pathogènes tels que les pseudomonas et les vibrions se développent en milieu alcalin à l'opposé nous avons les lactobacilles qui sont les bactéries de la flore de doderlin qui se multiplie au pH 6,3 à 6,5.

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-L'isotonie : Elle comprend pour la plupart des milieux à celle d'une solution de NaCl à 9%o.

-Le potentiel redox : En ce qui concerne le potentiel d'oxydo-réduction, les bactéries ont des exigences strictes, en rapport avec le type respiratoire.

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I- MATERIEL

I-1- MATERIEL BIOLOGIQUE

Les échantillons utilisés sont des souches pures des principaux germes méningés sous surveillances par l'OMS au Bénin. Ces germes sont conservés dans du lait écrémé à 10% au congélateur à -30°C dans la section de bactériologie du Laboratoire Central. Ces germes sont recensés dans le tableau ci-après :

Tableau III : Récapitulatif des germes utilisés

Germes Nombre de souches

2

Neisseria meningitidis W135

3

Neisseria meningitidis Y

1

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae 1

I-2- AUTRE MATERIEL -Balance

-Bec bunsen

-Bouteille à gaz

-Autoclave

-Etuve

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-Vortex (agitateur)

-Minuterie -Bain-marie -Microscope -Congélateur -Réfrigérateur -Huiles à immersion

-Violet de gentiane

-Lugol

-Fuchsine -Alcool

-Eau physiologique

-Eau distillée

-Boite de milieu déshydraté

-Hémoglobine en granulées

-Sang défibriné stérile de mouton

-Polyvitex (vitamine)

-Eau de robinet.

-Pipettes stériles de 2mL

-Pipettes stériles de 10mL

-Marqueurs -Cuillères

-Anse

- Pinces

- Lames

-Lamelles -Bougie

-Jarre

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-Portoirs pour les tubes

-Poire à pipeter

- Seringues

- Tubes

-Baguette

-Râtelier

-Allumette

-Eprouvette graduée de 500mL -Casserole

-Flacons propres stériles

-Boites de Pétri

-Bande de contrôle de stérilité -Stylo à bille

- Etiquettes

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II- METHODES

II-1- TECHNIQUE DE PREPARATION DE LA GELOSE CHOCOLAT

II-1-1- A partir du trypcase-soja et de l'hémoglobine en granulées

La gélose trypcase-soja est utilisée à double concentration.

-Mettre en suspension 16g de la gélose TSA dans 200mL d'eau distillée dans une casserole et bien homogénéiser.

-Chauffer à l'aide de la flamme du bec bunsen jusqu'à la dissolution complète en agitant fréquemment avec une baguette.

-Laisser bouillir 1 à 2 minutes.

-Repartir la solution dans des flacons stériles.

-Mettre en suspension dans un flacon stérile 4g d'hémoglobine en granulées soluble dans 200mL d'eau distillée. Mélanger l'hémoglobine avec quelques millilitres d'eau distillée jusqu'à l'obtention d'une pâte lisse. Tout en mélangeant, ajouter progressivement l'eau distillée restante jusqu'à la formation d'une solution homogène.

-Autoclaver les flacons à 121°C pendant 45 minutes puis les ramenés à 50°C.

-Ajouter aseptiquement 200mL de la solution d'hémoglobine, 4mL de polyvitex (soit 1mL de polyvitex pour 100mL de milieu) à 200mL de la solution de base TSA.

-Mélanger délicatement, mais soigneusement pour éviter la formation de bulles d'air dans la gélose (Faire de lent mouvement de 8 sur la paillasse).

-Couler la gélose dans des boites de Pétri avec une épaisseur de 4mm. -Laisser solidifier à la température ambiante.

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-Emballer les boites coulées dans un papier aluminium et conserver à 4°C pour une utilisation ultérieure.

II-1-2- A partir de la gélose trypcase-soja et du sang de mouton défibriné

-Mettre en suspension 16g de la gélose TSA dans 400mL d'eau distillée et bien homogénéiser.

-Chauffer à l'aide de la flamme du bec bunsen jusqu'à dissolution complète en agitant fréquemment avec une baguette.

-Laisser bouillir 1 à 2 minutes.

-Le répartir dans un flacon stérile.

-Autoclaver à 121°C pendant 45 minutes puis laisser refroidir à 50°C. -Ajouter 20mL du sang de mouton défibriné.

-Placer le mélange au bain-marie à 80°C pendant 15 minutes tout en homogénéisant de temps en temps.

-Ramener à 50°C et ajouter 4mL de polyvitex.

-Mélanger les ingrédients en évitant la formation de bulles d'air.

-Couler la gélose dans des boîtes de Pétri avec une épaisseur de 4 mm. -Laisser solidifier à la température ambiante.

-Emballer dans un papier aluminium et conserver à 4°C pour une utilisation ultérieure.

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II-2-CONTROLE DE STERILITE

Après la préparation des milieux, nous avons incubé une de chacune des boîtes coulées à l'étuve pendant 24 heures.

La présence de souillure entraîne le rejet de la gélose.

II-3- REPIQUAGE DES SOUCHES

A partir des souches précédemment retenues, sept boites de gélose chocolat du laboratoire ont été ensemencées. L'inoculum utilisé a été ensemencé de telle sorte que le tiers de chaque plaque de gélose ait été ensemencé en stries serrées puis le reste en stries de manière à obtenir des colonies isolées. Les plaques de gélose ont été placées en anaérobiose et incubées à 35°C pendant 24 heures.

II-4- CONTROLE DES SOUCHES

Un contrôle a été réalisé sur les colonies qui se sont développées sur la gélose chocolat. Pour ce faire des frottis ont été réalisés puis colorés au Gram.

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II-5- REALISATION DES SUSPENSIONS ET CULTURES

II-5-1- Réalisation des suspensions

Pour chacune des espèces, nous avons réalisé une suspension en prenant une colonie qui a été émulsionnée dans 10mL d'eau physiologique stérile. A partir de cette suspension deux dilutions dont l'une à 10-1 et l'autre à 10-2 ont été réalisées (Figure 3 page 25).

10mL d'eau

9mL d'eau

1mL 1mL

9mL d'eau

Physiologique physiologique physiologique

stérile stérile stérile

Suspension Suspension Suspension

initiale au 1/10ème au 1/100ème

Figure 1 : Réalisation de suspension et des dilutions 10-1 et 10-2

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II-5-2- Culture

A partir de chacune des suspensions et des dilutions, nous avons ensemencé des plaques de gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et de gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Technique

-Disposer les plaques de gélose à ensemencer sur la paillasse.

-Diviser les plaques de gélose par le dos de la boite de Petri en trois bandes parallèles au moyen d'un marqueur.

-Numéroter les bandes : 1, 2 et 3.

-Ensemencer la suspension initiale sur la bande 1, la dilution 10-1 sur la

bande 2.et la dilution 10-2 sur la bande 3.

-Incuber à 35°C en anaérobiose pendant 24 heures.

Après incubation, la densité des colonies sur les plaques de gélose a été évaluée à l'aide d'une carte modèle d'identification de la densité des colonies pour la numération des bactéries (Voir annexe1).

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I- RESULTATS

Figure 2: Culture obtenue avec Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Figure 3: Culture obtenue avec Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées.

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Tableau IV : Densités des colonies de Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses Gélose chocolat à Gélose chocolat à

base de l'hémoglobine base du sang de

Suspensions en granulées mouton défibriné

Initiale 106 106

1 /10 105 105

1/100 103 103

Après 24 heures de culture, Neisseria meningitidis W135 "première souche" a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau V : Densités des colonies de Neisseria meningitidis W135 "deuxième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses
Suspensions

Gélose chocolat à
base de l'hémoglobine
en granulées

Gélose chocolat à
base du sang de
mouton défibriné

Initiale

106

106

1 /10

105

105

1/100

103

103

 

Après 24 heures de culture, Neisseria meningitidis W135 "deuxième souche" a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau VI : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "première souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses Gélose chocolat à Gélose chocolat à

base de l'hémoglobine base du sang de

Suspensions en granulées mouton défibriné

Initiale 105 105

1 /10 104 104

1/100 102 102

Après 24 heures de culture, Neisseria meningitidis Y "première souche" a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau VII : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "deuxième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine et sur la gélose chocolat à base de sang défibriné de mouton.

Géloses Gélose chocolat à Gélose chocolat à

base de l'hémoglobine base du sang de

Suspensions en granulées mouton défibriné

Initiale 105 105

1 /10 105 105

1/100 103 103

Après 24 heures de culture, Neisseria meningitidis Y "deuxième souche" a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau VIII : Densités des colonies de Neisseria meningitidis Y "troisième souche" sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses Gélose chocolat à Gélose chocolat à

base de l'hémoglobine base du sang de

Suspensions en granulées mouton défibriné

Initiale 106 106

1 /10 105 105

1/100 103 103

Après 24 heures de culture, Neisseria meningitidis Y "troisième souche" a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau IX : Densités des colonies de Streptococcus pneumoniae sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses
Suspensions

Gélose chocolat à
base de l'hémoglobine
en granulées

Gélose chocolat à
base du sang de
mouton défibriné

Initiale

102

102

1 /10

0

0

1/100

0

0

 

Après 24 heures de culture, Streptococcus pneumoniae a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Tableau X : Densités des colonies d'Haemophilus influenzae b sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

Géloses
Suspensions

Gélose chocolat à
base de l'hémoglobine
en granulées

Gélose chocolat à
base du sang de
mouton défibriné

Initiale

103

103

1 /10

102

102

1/100

01

01

 

Après 24 heures de culture, Haemophilus influenzae b a montré les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux différents types de géloses chocolat.

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Utilisation comparée de la gélose chocolat à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la culture de trois espèces bactériennes méningées

II- COMMENTAIRE

L'objectif général du présent travail était de substituer la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées "commercialisée" à la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné "maison" pour la culture des bactéries méningées.

La densité des colonies de trois espèces bactériennes à savoir : Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae en culture sur les deux différents types de gélose chocolat a été recherchée.

Par rapport à la préparation d'un volume égal des deux différents types de gélose chocolat, il est nécessaire d'utiliser les mêmes quantités de la gélose trypcase soja. Le sang défibriné provenant des moutons peut être obtenu par le biais des vétérinaires à des coûts très bas, l'hémoglobine en granulées est commercialisée. Ce qui rend coûteux la gélose chocolat à base de l'hémoglobine et ne profite pas au laboratoire. Notons aussi des risques de formation des grumeaux au moment de la dissolution de l'hémoglobine.

Les résultats obtenus ont montré une bonne concordance en ce qui concerne la densité des colonies pour la culture de ces trois espèces méningées sur les deux types de gélose chocolat.

De tout ce qui précède nous pouvons bel et bien substituer la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées "gélose chocolat commercialisée" à la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné "gélose chocolat maison".

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Au terme de cette étude, la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées "commercialisée" et la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné ont donnée les mêmes résultats pour la culture des bactéries exigeantes.

Il est alors possibles de substituer la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en granulées à la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné.

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Nous ne pouvons terminer ce travail sans formuler les suggestions ci-après :

· . A l'endroit des autorités du Ministère de la Santé et des partenaires au développement sanitaire (OMS, UNICEF, PNUD) :

v' Favoriser la vulgarisation de ces résultats afin d'en permettre une utilisation réelle et correcte par les techniciens de laboratoire.

v' Sensibiliser les techniciens de laboratoire sur l'importance que révèle l'utilisation de la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné stérile.

v' Mettre à la disposition du personnel les matériels et réactifs adéquats pour le bon fonctionnement des services de laboratoire

· . A l'endroit des techniciens de laboratoire

v' L'utilisation de la gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné pour le diagnostic des principales espèces méningées.

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1. Anonyme

DIAGNOSTIC Pasteur

Milieux et Réactifs de Laboratoire Pasteur Microbiologie Immunologie.1987

2. Anonyme

MSP

Formation recyclage des TB pour le diagnostic des maladies à haut risque épidémique : choléra, méningite, fièvre jaune.1993

3. LOKO F.

Support de cours de Biochimie clinique 2006. P181. EPAC-UAC

4. Internet

X. Nassif

Les bactéries des infections bactériennes du système nerveux central

In BACTERIOLOGIE SYSTEMATIQUE de Faculté de Médecine Necker-Enfants malades. 2002-2003 P.71-74

Http://www.google.com, 2008

5. Laboratoire Central du Ministère de la Santé (République du Bénin)

Rapport d'activité 2007. P18

6. MARCHAL N., BOURDON J. L. et RICHARD C. L.

Généralités sur les Milieux et techniques réservés à l'étude de certains germes bactériens. In : Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimiques des bactéries. DOIN EDITEURS Paris 1987. PP. 3-21 et 165-440

7. OMS

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Technique de Laboratoire pour le Diagnostic des Méningites à Neisseria meningitidis, à Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae. 2000. P 71

8. BOUREE P

Liquide céphalo-rachidien in Examen de laboratoire en Médecine Tropicale. Edition Masson Paris 1987. PP 99-100.

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ANNEXE 2

BOUILLON TRYPCASE SOJA Formule en g/l d'eau distillée

-Hydrolysant trypsique-caséine : 17,00 - Peptone papanique de soja : 3,00 -Chlorure de sodium : 5,00

-Phosphate dipotassique : 2,50

-Glucose : 2,50

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TABLE DES MATIERES

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES

DEDICACES i

I- MATERIEL 19

REMERCIEMENTS v

I-1- MATERIEL BIOLOGIQUE 19

SUMMARY vi

I-2- AUTRE MATERIEL 19

LISTE DES ABREVIATIONS vii

II- METHODES 22

LISTE DES TABLEAUX viii

II-1- TECHNIQUES DE PREPARATION DE LA GELOSE

LISTE DES FIGURES ix

22

CHOCOLAT

INTRODUCTION 01

II-1-1-A partir de la trypcase-soja et de l'hémoglobine en granulées.. 22 PREMIERE PARTIE : GENERALITES

II-1-2- A partir de la trypcase-soja et du sang de mouton défibriné 23

I- PRESENTATION DU LABORATOIRE CENTRAL 03

II-2- CONTROLE DE STERILITE 24

II- RAPPELS PHYSIOPATHOLOGIQUES SUR LE LCR 04

II-3- REPIQUAGE DES SOUCHES 24

II-1- DEFINITION DU LCR. 04

II-4- CONTROLE DES SOUCHES 24

II-2- EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LCR 04

II-5- REALISATION DES SUSPENSIONS ET CULTURE 25

II-2-1- Observation lors du prélèvement 04

II-5-1- Réalisation des suspensions 25

II-2-2- Aspect du liquide céphalo-rachidien 04

II-5-2- Culture 26

II-3- EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DE LCR. 05

TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET COMMENTAIRE

II-3-1- Examen cytologique 05

I- RESULTATS 27

II-3-2- Examen bactériologique 07

II- COMMENTAIRE 35

III- IDENTIFICATION DES PRINCIPAUX GERMES DE LA 12 CONCLUSION 36
MENINGITE BACTERIENNE

SUGGESTIONS 37

III-1- IDENTIFICATION DE Neisseria meningitidis 12

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 38

III-2- IDENTIFICATION DE Streptococcus pneumoniae 14

ANNEXES

III-3- IDENTIFICATION DE Haemophilus influenzae 15

IV- LES MILIEUX DE CULTURE 16

IV-1- DEFINITION 16

IV-2- MODE GENERAL DE PREPARATION 16

IV3- QALITE DU MILIEU DE CULTURE 17

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