3. Extraction des composés phénoliques
Principe
La méthode d'extraction utilisée pour les
composés phénoliques est celle de. L'objectif de l'extraction
est de séparer les substances phénoliques de la poudre solide, le
solvant dissous le principe actif à l'intérieur du solide et
l'entraîner à l'extérieur.
Le choix du méthanol possède l'avantage
d'être facilement éliminé sous vide et il donne en plus un
meilleur rendement d'extraction qui dépasse celui obtenu avec l'eau de 7
fois.Le rendement d'extraction en polyphénols augmente avec le temps de
contact (Djeridane et al, 2006).
Mode opératoire
· 5 g obtenu sont ensuite macérés dans
100ml d'un mélange hydro-alcoolique MeOH (méthanol-eau)
(80/20=v/v) pendant 48 heures à une température ambiante.
· Ce mélange est filtré par papier
whatman.
· Le résidu obtenu est repris pour une
deuxième fois avec un volume de 50 ml du même mélange
hydroalcoolique pendant 24 heures à température ambiante.
· On obtient donc un extrait hydroalcoolique brut.
· On évapore le méthanol par rota vapeur
à 65 °C.
· On obtient un extrait phénolique conservé
à 6°C jusqu'à utilisation.
3.1 Analyses biochimiques
3.1.1 Dosage des polyphénols totaux
Le dosage des polyphénols totaux dans les
extraits des deux échantillons a été effectué par
spectrophotométrie selon la méthode du réactif de Folin -
Cicalteu (Singleton et al, 1999).
Principe
Ce dosage est fondé sur la quantification de la
concentration totale de groupements hydroxyles présents dans l'extrait.
Le réactif de Folin - Cicalteu consiste en une solution jaune acide (Ac)
contenant un complexe polymérique d'ions (hétéro
polyacides). En milieu alcalin, le réactif de Folin - Cicalteu oxyde les
phénols en ions phénolates et réduit partiellement ses
hétéro polyacides d'où la formation d'un complexe bleu
(Daels ,1999).
Mode opératoire
Dans un tube à essai on introduit :
- 0.2 ml d'extrait (préparé dans l'eau
distillée avec les dilutions convenables)
- On ajoute 1 ml du réactif de Folin- Cicalteu
fraîchement préparé (10 fois dilué)
- 0.8 ml de la solution de Na2Co3
à 7.5% (7.5g dans 100 ml)
- L'ensemble est incubé à une température
ambiante pendant deux heures.
- La lecture est effectuée contre un blanc sans extrait
à l'aide d'un spectrophotomètre à 765nm
Expression des résultats
Le taux de polyphénols totaux dans nos extraits a
été calculé à partir d'une courbe
d'étalonnage linéaire (y = ax + b) établie avec des
concentrations précises d'acides gallique Comme standard de
référence, dans les mêmes conditions que
l'échantillon.
3.1.2 Dosage des Flavonoïdes
Principe
La quantification des flavonoïdes a été
effectuée par une méthode adaptée par Zhishen etal,
(1999) avec le trichlorure d'aluminium et la soude. Le trichlorure
d'aluminium forme uncomplexe jaune avec les flavonoïdes et la soude forme
un complexe de couleur rose absorbedans le visible a 510 nm.
Mode opératoire
Ø 500 ul de l'extrait brut de la poudre de la
tomate/pelure.
Ø Mélangés avec 2 ml d'eau
distillée
Ø Suivis de 150 ul de nitrite de sodium (NaNO2)
à 5%.
Ø Après 5 min, 100 ul de trichlorure
d'aluminium (AlCl3) à 10% (m/v) est rajouté au mélange
.Après 6 min d'incubation à la température ambiante
Ø 1 ml de carbonate de sodium
(Na2CO3) à 1 M est additionné.
Immédiatement
Ø Le mélange est complètement
agité afin d'homogénéiser le contenu
Ø L'absorbance de la solution de couleur rosâtre
est déterminée à 510 nm contre un blanc.
Préparation de la courbe
d'étalonnage
Une courbe d'étalonnage est réalisée en
parallèle dans les mêmes conditions opératoires en
utilisant de la catéchine comme contrôle positif.
La teneur en flavonoïdes totaux des extraits de
plante étudiée est exprimée en milligramme (mg)
équivalent de la catéchine par 100 gramme de la matière
végétale sèche (mg EC/100g).
3.1.3 Dosage des Anthocyanes
Le dosage des anthocyanes s'effectue en utilisant deux
propriétés dues à leurs structures :
- La modification de leurs couleurs en fonction du pH.
- La transformation en dérivés incolores sous
l'action de certains réactifs comme
les ions bisulfite.
Principe
La décoloration des anthocyanes par l'acide sulfureux
et les bisulfites alcalins est une réaction qui se fait à pH 3
jusqu'à pH 1. D'autre part la réaction est réversible mais
uniquement dans le cas des anthocyanines. La difficulté de la
réaction en milieu acide s'explique par le passage du bisulfite sous
forme d'acide sulfureux moins dissocié, avec diminution de la
concentration en ions HSO3 (Ribérau, 1968). La
détection des molécules est assurée par des mesures
spectrophotométrique à 520nm.
Mode opératoire
ü dans un tube à essai, on mélange 1 ml
d'extrait avec 1 ml d'ethanol (solution d'éthanol à 95%
acidifiée à 0.1% d'HCl pur) et 20 ml d'HCl à 35%
diluée à 2% dans l'ED.
ü on prépare des cuves pour le
spectrophotomètre comme suit :
- Cuve A : 5 ml du mélange + 2 ml d'ED
- Cuve B : 5 ml du mélange + 2 ml de bisulfute de
sodium
ü Repos 20 mn
ü Lecture par spectrophotomètre à 520
nm.
On peut exprimer approximativement la variation d'absorbance
(DOA -DOB) par :
C (mg/ml) = (DOA -DOB) x 875
Où :
C : Concentration des anthocyanes en
mg/ml.
DOA : Densité optique de la cuve
A
DOB : Densité optique de la cuve
B
875 :Pente de la droite d'étalonnage
obtenu à partir de malvidine-3 glucoside (Ribérau, 1968).
3.1.4 Dosage du Lycopène
Lycopène est un pigment liposoluble, du fait de sa
grande disponibilité, il est beaucoup utilisé comme colorant
(E160d), c'est un tétra terpène de la famille des
carotènes.
Principe
La température de fusion de lycopène est
175°C, puisqu'il est liposoluble alors son extraction se fait soit dans le
cyclohexane (d=0.78), le dichlorométhane (d=1.32), et l'éthanol
(d=0.79). L'identification du lycopène se fait par
spectrophotomètre à 472 nm (Benakmoum et al, 2008).
Mode opératoire
Ø 0.1 g de la poudre dans 10 ml de
(hexane-acétone-éthanol, (50/50/1)
Ø Agiter pendant 10 mn
Ø Centrifuger à 5000 tours par minute pendant 15
mn.
Ø 1 ml de la phase organique est extrait en suite
dilué dans 10 ml d'hexane
Ø Dans une cuve on met un échantillon de la
phase organique
Ø L'absorbance est mesurée à 472 nm
La teneur en lycopène est exprimée selon la
formule suivante :
C(ìg/g) = Abs 472 x Fd x
106 x V / 3450 x 100x P
Où:
Fd : Facteur de dilution
V : Volume du solvant d'extraction
3450 : Coefficient d'extinction de
l'hexane
P : Poids de la prise d'essai
| 
