III. Détermination de la composition chimique des
huiles essentielles
L'analyse de la composition des huiles essentielles a
été effectuée par la technique de la chromatographie en
phase gazeuse (CPG) et par chromatographie en phase gazeuse couplée
à une spectrophotométrie de masse (SM).
Les huiles essentielles sont analysées par
chromatographie en phase gazeuse du type `SHIMADZU Séries GC-2014 system
(figure 13) équipé d'un injecteur diviseur (220°C) et d'un
détecteur à ionisation de flamme (280°C). La colonne
capillaire en silice fondue est à phase stationnaire apolaire .Elle est
de type DB5 (30 m x 0,25 mm).
La température du four est programmé de 50
jusqu'à 220°C à raison de 5°C/min. Le débit du
gaz vecteur (l'azote) est de 1ml/min. Avant l'analyse, les huiles essentielles
sont diluées 20 fois dans l'hexane. L'identification des
différents composés a été réalisée
sur la base des indices de rétention linéaires.
Figure 13: chromatographe en phase gazeuse
avec détection par ionisation de flamme
(GC-FID)
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Le couplage CG / SM a permis également l'identification
des huiles essentielles. Le principe repose sur la fragmentation des
composés suite à leur bombardement par un flux d'électrons
et leur exposition à des champs électriques. Les ions
libérés seront classés selon leur rapport masse/charge. Le
chromatographe utilisé est de type Agilent 19091S-433(figure14). La
phase stationnaire est formée de 5% phényl méthyl siloxane
et 95% diméthylpolysiloxane. Le gaz vecteur est l'hélium, avec
une pression de 7,63 psi en tête de la colonne et un débit
constant de 1 ml par minute dans la colonne. L'injection de l'extrait se fait
en mode split (100 :1). 2ul de l'extrait sont injectés. La
température du four au moment de l'injection est constante (50°C)
puis elle suit un gradient linéaire jusqu'à 300°C à
raison de 2°C par minute pendant 15 minutes.
Figure 14: Couplage chromatographe en phase
gazeuse/ Spectrométrie de masse (CG / SM)
IV. Dosage des composés phénoliques 1. Dosage
des polyphénols totaux
? Principe
Selon Dewanto et al. (2002), Le dosage des
polyphénols totaux se fait par la méthode colorimétrique
de Folin- Ciocalteu qui est basé sur le principe de
l'oxydoréduction. Le réactif de Folin-Ciocalteu (RFC), un acide
de couleur jaune, présente des polyhétérocycles acides
contenant du molybdène et tungstène. En milieu alcalin, il est
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réduit en présence de polyphénols, en oxyde
de tungstène et de molybdène en donnant une couleur bleue.
? Mode opératoire
Une prise de 125ul de l'extrait aqueux / 500 ul huile essentielle
dilué est mélangée avec 500ul d'eau distillée et
125ul de réactif de Folin-Ciocalteu. Après une agitation
vigoureuse du mélange suivie d'un repos de 3 minutes, une prise de
1250ul de Carbonate de sodium Na2CO3 à 7% est additionnée. Enfin
le mélange obtenu est ajusté par 3ml d'eau distillée.
Après un repos de 90 minutes à l'obscurité.
La lecture de l'absorbance est effectuée à une longueur d'onde de
760 nm par rapport à un blanc dont l'extrait est remplacé par le
solvant d'extraction (figure15).
Une gamme étalon d'acide gallique est
préparée dans les mêmes conditions que les
échantillons, pour des concentrations variables de 0 à 100
mg.l-1.Les teneurs des extraits en polyphénols totaux sont
exprimés en mg d'équivalent acide gallique par gramme de
matière sèche (mg EAG.g-1MS).
Figure 15: Spectrophotomètre
2. Dosage des flavonoïdes
? Principe
Selon Dewanto et al. (2002), le dosage des
flavonoïdes se fait par la méthode colorimétrique qui est
basée sur la formation d'un complexe jaune entre les flavonoïdes et
le chlorure d'aluminium.
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? Mode opératoire
Une prise de 125ul de l'extrait aqueux convenablement
dilué est mélangée avec 35,5ul de NaNO2 (5 %).
Après un repos de 6 minutes, 75ul de AlCl36H2O (10 %) fraîchement
préparée est ajouté au mélange et 5 minutes plus
tard, 250ul de NaOH (1M) sont additionnés. Finalement, le mélange
est ajusté à 1250ul avec de l'eau distillée. La lecture de
l'absorbance se fait à 510 nm contre un blanc dans lequel l'extrait est
remplacé par le solvant d'extraction.
Une gamme étalon de catéchine est
préparée dans le méthanol, dans les mêmes conditions
que les échantillons, pour des concentrations allant de 0 à 100
mg.l-1. Les teneurs des extraits en flavonoïdes sont
exprimées en mg d'équivalent catéchine par gramme de
matière sèche (mgEC.g-1MS).
3. Dosage des tanins condensés
? Principe
Selon Price et al. (1978) le dosage des tanins
condensés se fait par la méthode colorimétrique
basée sur la dépolymérisation des tanins condensés
en présence d'acide sulfurique. Sous l'effet de la vanilline, ces tanins
se transforment en anthocyanidols de couleur rouge spécifique. (Sun et
al., 1998).
? Mode opératoire
Un aliquote de 0.05 ml de l'extrait aqueux est additionné
à 3 ml de vanilline (4 %) et 1,5 ml de HCl concentré.
Après 15 min d'incubation à une température ambiante,
l'absorbance est mesurée à 500 nm.
Une gamme étalon de catéchine est
préparée, dans les mêmes conditions que les
échantillons, pour des concentrations allant de 0 à 100
mg.l-1. Les teneurs des extraits en tanins condensés sont
exprimées en mg d'équivalent catéchine par gramme de
matière sèche (mgEC.g-1MS).
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