Etude des propriétés biochimiques et adhésives des souches de candida spp. isolées de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir

	REPUBLIQUE TUNISIENNE Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université de Carthage Institut Supérieur des Sciences et Technologies de l'Environnement de Borj-Cédria

Projet de Fin d'Etudes

Licence Appliquée en

Physique, chimie de l'environnement

Réalisé à : Laboratoire de Traitement des Eaux Usées Centre de Recherche et Des Technologies des Eaux Bordj-Cédria

Présenté par :

BEN MOULA Mouna & ALI Afef

Thème

Etude des propriétés biochimiques et adhésives des
souches de Candida spp. isolées de la station
de traitement des lixiviats de Djebel Chakir

Soutenu devant le jury composé de :

Mr Taher El Kateb Président (ISSTE-Tunis)

Mr Snoussi Mejdi Encadreur (CERTE, Borj-Cédria)

Mme Noumi Emira Encadreur (ISBM, Monastir)

Année Universitaire: 2011 - 2012 N° d'ordre :

.2050 ä?ã ÇÇãÍ 1003 È.Õ ÉíÑÏÓáÌ ÇÑÈÈ íÌæáæäßÊáÇ ÈØÞáÇ ÉíÑÏÓáÌ ÇÑÈÈ ÉÆíÈáÊ ÇÇíÌæáæäßÊ æ ãæáÚá íáÇÚáÇ ???

Dédicace

A mes parents Abed Razzak Ben Moula et Khadija Salaani.

A mes frères et soeurs Mohamed, Majdi, Maha et Malek.

Vous vous êtes dépensés pour moi sans compter.

En reconnaissance de tous les sacrifices consentis par tous.

Avec toute ma tendresse.

A mes oncles, tantes, cousins et cousines.

Vous avez de près ou de loin contribué à ma formation.

Affectueuse reconnaissance

A tous mes ami(e)s et à leurs familles.

Dédicace

A mes parents Lotfi Ali et Saliha Ali.

A mes frères et soeurs Haithem, Saleh, Rachid et Bouthaina.

Vous vous êtes dépensés pour moi sans compter.

En reconnaissance de tous les sacrifices consentis par tous.

Avec toute ma tendresse.

A mes oncles, tantes, cousins et cousines.

Vous avez de près ou de loin contribué à ma formation.

Affectueuse reconnaissance

A tous mes ami(e)s et à leurs familles.

Merci ...

Remerciements

Ce travail a été effectué grâce à la collaboration du laboratoire

de Traitement des Eaux Usées au Centre de Recherches Et des

Technologies Des Eaux (Technopôle de Bordj-Cédria).

Nous remercions ce partenaire pou l'intérêt qu'il à porté à ce

sujet.

Nous avons l'honneur d'exprimer nos sentiments de gratitude et

nos remerciements les plus chaleureux à toute personne qui nous

a aidés dans l'accomplissement de ce travail et particulièrement à

nos encadreurs Mr. Snoussi Mejdi, Maitre Assistant en

Microbiologie (CERTE) et Mme Noumi Amira, Assistante en

Microbiologie (ISBM, Monastir) qui ont accepté de diriger notre

projet de fin d'études, pour leur important et efficace aide pour

l'élaboration de ce travail.

Que ce travail soit le témoignage de notre vive reconnaissance et

notre profond respect à Mr. Trabelsi Ismail pour l'honneur qu'il

nous a accordé pour travailler pour la première fois sur cette

matrice : les lixiviats et pour ces prestigieux conseils.

De même, nous tenons à exprimer nos sentiments de respect et

nos remerciements les plus profonds A Melle Dehmeni Ameni,

étudiante en Master, Melle Ben Rhomdane Hajer (Technicienne

du laboratoire) qui nous ont soutenus pour accomplir ce rapport.

Nous exprimons aussi nos remerciements aux membres de jurys

pour le grand honneur qu'ils nous ont accordé en acceptant de

juger ce projet de fin d'études.

Sommaire

Introduction 1

Synthèse bibliographique

I. Définition des lixiviats 3

1. Mécanisme de formation des lixiviats 3

2. Composition des lixiviats 4

3. Types de lixiviats 4

II. Généralités sur les Candida . 4

1. Taxinomie et classification 5

2. Morphologie et reproduction . 5

2. 1. Caractéristiques macroscopiques 5

2.2. Caractéristiques microscopiques 5

2.3. Caractéristiques biochimiques . 5

a. Structure cellulaire . 6

b. Structure générale de la paroi . 6

3. Distribution des espèces de Candida........................................ 6

III. Facteurs de pathogénicité des Candida spp 8

1. Variabilité morphologique .. 8

2. Le dimorphisme .. 9

3. Les enzymes 9

4. Adhérence de C. albicans...................................................... 9

IV. différents types de candidoses

10

1. Les candidoses cutanées . 10

2. Les candidoses vaginales 10

3. Les candidoses buccales et digestives 11

V. Résistance aux antifongiques . 11

1. Différent types de résistance 11

VI. Les biofilm fongiques 12

1. Structure d'un biofilm 12

2. Propriétés du biofilm .. 12
3-Développement du biofilm à Candida....................................13

4-Facteurs favorisant le développement d'un biofilm à Candida... 14

Méthodologie & Protocoles

I-Description du site d'étude 15

II-Identification biochimique des espèces de Candida spp. isolées 16

II. 1. Echantillonnage. 16
II.2. Isolement et caractérisation biochimique des espèces de

16

Candida

II.2.1. Isolement des espèces de Candida sur milieu chromogénique 16

II.2.2. Purification des espèces de Candida sur gélose Sabouraud- 17

chloramphénicol .

II.2.3. Observation microscopique 17

II.2.4. Test de floculation 17

II.2.5. Etude des caractères biochimiques sur galeries Api Candida 18

III. Etude phénotypique de la résistance des isolats de Candida 19

spp. aux agents antifongiques ..

III.1. Test de résistance à l'acide borique 19

III.2. Test de résistance à l'amphotéricine B 19

III.2.1. Sur milieu solide . 19

III.2.2.Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice et

20

(CMI) et de la Concentration Minimale Fongicide (CMF)

20

IV. Etude des activités enzymatiques

IV.1. Détermination de l'activité de la phospholipase .. 20

IV.2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée ..... 21

IV.3. Détermination de l'activité de l'estérase . 21

IV.4. Etude de pouvoir hémolytique . 22

IV.5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM .. 22

V. Etude qualitative et quantitative de l'adhésion des souches de

Candida isolées .. 23

V.1. Etude qualitative de l'adhésion 24

V.1.1. Coloration à la safranine . 24

V.1.2. Production de « slime » sur gélose préparée au rouge Congo. 24

V.2. Etude quantitative de l'adhésion 24

V.2.1. Test de hydrophobicité 24

V.2.2. Adhésion des Candida spp. sur les plaques en polystyrène 25

Résultats

I. Caractérisation phénotypique des espèces de Candida spp.

isolées 27

1. Etude morphologique . 27

1.1. Caractéristiques macroscopiques 27

1.2. Caractéristiques microscopiques 28

2. Différentes espèces de Candida spp. Isolées à partir de la station

de traitement des lixiviats de Djebel Chakir 29

3. Test de floculation 30

4. Test de résistance à l'acide borique 31

II. Activité antifongique 31

1. Méthode de diffusion de disque 31

1.

31

Méthode de diffusion de disque

2. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et

de la Concentration Minimale Fongicide (CMF) . 33

III. Etude de la virulence des différentes espèces de Candida spp. 33

isolées .

1. Détermination de l'activité de la phospholipase . 33

2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée 33

3. Détermination de l'activité de l'estérase 34

4. Etude de pouvoir hémolytique 34

5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM 36

IV. Etude qualitative et quantitative de l'adhésion des souches

de Candida spp. Isolées . 37

1. Etude qualitative de la formation de biofilm . 37

1.1. Coloration à la safranine .. 37

1.2. Culture sur milieu au rouge Congo . 37

2. Etude quantitative de la formation de biofilm 38

2.1. Test de hydrophobicité 38

2.2. Sur les plaques en polystyrène . 38

Discussion 45

Conclusions générales 46

Références bibliographiques

Liste des Abréviations

A : Absorbance

AmB : Amphotéricine B

BSA : Sérum Bovine Albumine

C. albicans : Candida albicans

CDR: Candida Drug Resistance

CMI: Concentration minimale inhibitrice

CMF: Concertations minimale fongicide

CVV: Candidose vulvo-vaginale

DCO: Demande Chimique en Oxygène

SDD: Susceptibilité Dose Dépendante

DMSO: Diméthyl Sulfoxyde

DO: Densité Optique

ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Fe²⁺ : Fer

h : heure

MDR: Multi Drug Resistance

min: minute

Mg2 + : Magnesium

MgSO4_:

Mm: Millimolaire

MTT: Bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium

NaCl : Chlorure de soduim

Na2HPO4 : sodium déshydrogénophosphate

nm: Nanomètre

PBS : Phosphate Buffer Saline

PZ: Activité enzymatique

R: Résistante

rpm : rotation par minute

S : Sensible

XTT:2,3-bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5 [(phénylamino) carbonyl]-2H-tétrazoli

YNB: Yeast Nitrogène Base

YNBG : Yeast Nitrogène Base Glycose

YPD: Milieu de culture Yeast extact /peptone /dextrose

Liste des figures

Figure 1. Différentes formes de croissance des Candida 8

Figure 2. Schéma d'un biofilm formé aux surfaces polymérique 13

Figure 3. Photo aérienne du centre d'enfouissement technique de Djebel-Chakir 15

et les bassins de stockage des lixiviats

Figure 4. Unité de traitement des lixiviats de la décharge de Djebel- 16

Chakir

Figure 5. Les principaux morphotypes obtenus sur milieu CHROMagar^TM 27

Candida

Figure 6. Observation microscopique des colonies de Candida sur gélose 27

Sabouraud - chloramphénicol

Figure 7. Observation microscopique des cellules de Candida colorées à la 29

fushine au microscope optique (G×100)

Figure 8. Détermination des diamètres des zones d'inhibition de la croissance des

levures sur milieu Mueller-Hinton-Glucose-Bleu de 31

Figure 9. Aspect de l'activité de la phospholipase sur gélose à base de jaune 33

d'oeuf

Figure 10. Différents exemples de l'activité de la protéase obtenue sur gélose à 34

base de BSA .

Figure 11. Aspect des colonies ayant un pouvoir hémolytique de type â sur gélose 34

à base de sang de mouton .

Figure 12. Formation de biofilm par la méthode de coloration à la safranine 37

1%

Figure 13. Dégradation de la couleur des souches de Candida cultivées sur des 37

boites contenant le rouge Congo

Figure 14. Distribution des valeurs de l'absorbance de XTT (a) à 492 nm et du 41

cristal violet à 595 nm ..

Liste des tableaux

Tableau I. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Candida............ 18

Tableau II. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Zym .. 23

Tableau III. Couleur des isolats obtenus sur milieu CHROMagar^TM Candida en

fonction de l'origine d'isolement . 28
Tableau IV. Différentes espèces de levures isolées à partir de la station de

29

...

traitement des lixiviats de Djebel Chakir

Tableau V. Origine, forme et caractères biochimiques des levures isolées et

testées par les galeries Api Candida............................................................... 30
Tableau VI. Résistance phénotypique des différentes souches test l'amphotéricine

B 32

Tableau VII. Activités enzymatiques (phospholipase, estérase et aspartylprotéase)

et pouvoir hémolytique des différentes souches isolées 35

Tableau VIII. Caractères enzymatiques des différents isolats de levures obtenus

sur la galerie Api Zym 36

Tableau IX. Etude qualitative de la production d'exopolysaccharides par

coloration à la safranine 1% 39



INTRODUCTION

1

Introduction

Les lixiviats représentent des effluents d'eaux fortement polluées issus des centres d'enfouissements contrôlés. De nos jours une préoccupation des autorités concernées par la gestion durable des déchets est accordée.

En Tunisie, les centres d'enfouissements techniques compte 20 décharges contrôlées dont 9 sont en phase d'exploitation. La forte humidité des déchets en Tunisie (moyenne de 65%) produit un volume important des lixiviats qui doivent être traitées avant leurs rejets dans un milieu récepteur. Le stockage des lixiviats produites des centres d'enfouissement a été la solution la plus adoptée comme pour le cas de la décharge contrôlée de Djebel Chakir. La décharge de Djebel Shakir est d'une importance et particularité nationale. En fait, 40% des déchets produits en Tunisie sont enfouis dans cette décharge. Jusqu'au nous jours les lixiviats de cette décharge sont collecté sans traitement dans 13 bassins.

Les souches de Candida isolées des lixiviats qui sont des effluents toxiques issus des centres de stockage des déchets de Djébel Chakir figurent parmi les dix micro-organismes pathogènes les plus fréquemment isolés et sont responsables de 7% de tous les épisodes fébriles d'origines infectieuses. Les levures du genre Candida peuvent être à l'origine de mycoses superficielles ou invasives. Ces dernières sont responsables d'une lourde morbidité et mortalité chez les patients immunodéprimés.

L'accroissement du nombre de sujets atteints de candidose, l'émergence de nouveaux agents pathogènes et la volonté de diminuer cette morbidité sont l'origine du développement de nouvelles technologies appliquées au diagnostique, au suivi de maladies fongiques ainsi qu'au développement de nouvelles molécules antifongiques. En effet, les biofilm fongiques sont des structures très résistantes et complexes. Il a été démontré que l'expression de certaine gènes est induite en fonction de la colonisation des souches de Candida sur les supports, La formation de biofilm ainsi que la communication intercellulaire ce qui induit leur virulence, leur pathogénicité et leur résistance à certains agents antifongiques.

2

Introduction

Notre rapport comporte une première partie bibliographique avec un rappel épidémiologique, et l'étude de caractéristiques biochimiques des souches de Candida spp.

Cette première partie est suivie d'une partie pratique dont les objectifs sont :

1- Identifier biochimiquement les différentes espèces de Candida isolées de la station de traitement des lixiviats (Djébel Chakir).

2- Etudier la virulence des espèces identifiées (activités des enzymes hydrolytiques et hémolytiques) sur milieux solides spécifiques et sur galeries Api Zym.

3- Etudier qualitativement et quantitativement la formation de la biofilm par deux méthodes (XTT et Cristal Violet).

4- Etudier la résistance phénotypique aux antifongiques (méthode de disque et méthode liquide pour la détermination des CMIs et CMFs).



SYNTHÈSE

BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse Bibliographique

I. Définition des lixiviats

Les lixiviats, appelés aussi lessivats, percolât ou « jus de décharge », on désigne« L'eau qui a percolé à travers les déchets en se chargeant bactériologiquement et surtout chimiquement de substances tant minérales qu'organiques. Le lixiviat (ou Percolât) est le liquide résiduel qui provient de la percolation de l'eau à travers un matériau.

Ce terme désigne notamment tous les «jus» issus de décharges, de déchets, de composts, ... etc. Il vient de l'adjectif latin « lixivius », qui signifie: «de lessive, eau qui sert à laver». Dans le cas de déchets, le lixiviat se charge de polluants organiques, minéraux et métalliques, par extraction des composés solubles (lixiviation facilitée par la dégradation biologique des déchets) et risque ainsi de provoquer la pollution de la nappe phréatique. Cette contrainte est particulièrement importante pour la localisation des décharges. C'est en fait le résultat du chemin de l'eau qui s'est infiltré, qui a percolé et ruisselé à travers les déchets jusqu'à ce qu'elle se retrouve au fond de l'alvéole de stockage. Il s'agit en quelque sorte du « jus de poubelle ». L'estimation des taux de génération des lixiviats dans la décharge de Djbel Chakir a été réalisée à partir de plusieurs modèles numériques. Elle se base essentiellement sur les paramètres climatiques lors du calcul des quantités de lixiviats et le modèle du bilan hydrique qui tient compte des principales composantes affectant la génération des lixiviats. Ces composantes font inclure les paramètres climatiques et l'humidité initiale des déchets.

En Tunisie, la quantité de lixiviats stockée à Djbel Chakir est estimée à 100000 m³/an soit 270 m3/j qui sont stockés dans 8 bassins ayant une capacité totale égale à 130000 m³. C'est en grande partie la nature du lixiviat qui détermine la capacité des mâchefers d'incinération d'ordures ménagères. La source principale en eaux d'une décharge vient des précipitations. Il faut toutefois tenir compte de l'humidité des déchets ainsi que du niveau de la nappe phréatique qui peut remonter jusqu'à la base d'une décharge.

1. Mécanisme de formation des lixiviats

La formation des lixiviats est principalement causée par l'infiltration directe de l'eau météoritique dans les déchets qui va se charger en substances polluantes tels que la matière organique soluble résultant de l'activité biologique de la décharge (Leclerc et Bonneau) des constituants inorganiques comme les métaux lourds et des germes qui peuvent être très

dangereux pour la santé et l'environnement.

Synthèse Bibliographique

2. Composition de lixiviat

Les compositions chimiques et biochimiques des lixiviats sont non seulement très diverses mais aussi variables dans le temps et dans l'espace relèvent classiquement quatre types de polluants: (i) la matière organique dissoute ou en suspension, issue de la biomasse, exprimée généralement en DCO (les AGV, les substances humiques et fulviques...); (ii) les micropolluants organiques (hydrocarbures, composés aromatiques...) ; (iii) les composés minéraux majeurs sous forme ionique (Ca²⁺, Mg²⁺, Na+, K⁺ ,NH⁴⁺ ,Fe²⁺) et (iiii) les cations de métaux lourds à l'état de trace.

D'autre part, les lixiviats peuvent aussi contenir certains micro-organismes pathogènes. Plus de 200 familles de composés organiques ont pu être identifiées au cours des nombreuses études menées sur la caractérisation des lixiviats des décharges. La composition globale des lixiviats est le plus fréquemment déterminée grâce à des analyses physico-chimiques. La qualité physico-chimique dépend de nombreux facteurs qui sont cités dans les paragraphes précédents.

3. Type de lixiviat

Suivant le stade d'évolution biologique des déchets, trois types de lixiviats ont été distingués.

· Les lixiviats stabilisés (Age de la décharge > 10 ans)

· Les lixiviats intermédiaires 5 à 10 ans

· Les lixiviats jeunes (Age de la décharge < 5 ans)

Ces lixiviats se caractérisent par une charge organique élevée biodégradable (très chargé par la biomasse bactérienne) par rapport à celle de lixiviat stabilisé.

II. Généralités sur les Candida

1. Taxinomie et classification

Les Candida sont des champignons microscopiques. Ce sont des organismes nucléés eucaryotes appartenant au règne des champignons unicellulaires ou Fungi au phylum des Ascomycètes, au sous-phylum des Saccharomycotina, de la classe des Saccharomycètes, de l'ordre des Saccharomycétales, du groupe des Saccharomycétales mitosporiques et du genre Candida.

Synthèse Bibliographique

Ce sont des organismes hétérotrophes, constituant un groupe autonome dans le monde vivant indépendant des bactéries. Ce genre regroupe plus de 200 espèces dont les plus

rencontrées en pathologie humaine sont C. tropicalis, C. galabrata, C. krusei, C.
guilliermondii, C. parapsilosis, C. kefyr, C. dubliniensis et C. albicans. Cette dernière étant la plus importante et la plus fréquemment étudiée pour sa pathogénicité (Pfaller, 2006).

2. Morphologie et reproduction 2. 1. Caractéristiques macroscopiques

L'examen macroscopique des espèces de Candida cultivées en aérobiose, sur un milieu sélectif dont le pH varie de 2.5 à 7.5 et à une température de 37°C montre qu'il s'agit de colonies ovalaires, crémeuses, non pigmentées et ayant une odeur de levure (Mc Culloudh et al., 1996).

2. 2. Caractéristiques microscopiques

L'aspect microscopique brut de toutes les espèces de Candida est semble. Ce sont des levures non capsulées, à bourgeonnement multilatéral et productrices ou non filaments. Toutes les espèces de Candida ont la forme de blastopores qui peuvent changer de l'aspect ovoïde à allongé et même sphérique (Odds, 1988). Macroscopiquement, C. albicans apparaît une espèce dimorphique caractérisée par la transition de la forme levure (blastopore ovoïdes) à la forme filamenteuse (hyphes parallèles). En ce qui concerne la taille, on remarque bien une variation entre les espèces. En effet, la taille de C. albicans est de 2,9 à 7,2 x 2.9 à 14.4 ìm et C. krusei 2.2 à 5.6 x 4.3 à 15,2 ìm. Les cellules de C. krusei apparaissent allongées et ayant l'aspect de grain de riz. C. kefyr est une autre espèce médicalement importante ayant un aspect microscopique semblable à celui de C. krusei (Samaranayake et Samaranayake, 1994).

2.3. Caractéristiques biochimiques

Le principal caractère biochimique des espèces de candida est la composition de la membrane cellulaire. En effet , la membrane cellulaire est formé de 80 à 90% de carbohydrates qui sont des polymères de glucose (â-glucanes), de N-acétyl-D-glucosamine (chitine) et des polymères de mannose associés d'une façon covalente aux protéine (mannoprotéines), 6 à 25% de protéines et 1 à 7% de lipides (Chaffin et al .,1998).

Synthèse Bibliographique

Le terme d'enveloppe cellulaire de

peut être défini comme étant l'ensemble de la membrane plasmique, l'espace péri plasmatique, la membrane cellulaire et la couche fibreuse associée à la région externe de la membrane. La membrane plasmique forme une barrière perméable entre le cytosol de la cellule et l'environnement extérieur. L'espace péri plasmatique constitue la région entourée par la membrane cellulaire et la membrane plasmique y compris l'espace créé par évagination de la membrane. La membrane cellulaire est essentielle pour la biologie de la biologie de la levure et la présentation de son contenu cellulaire et aussi pour ses interactions avec les cellules humaines hôtes (Cannon et Chaffin, 1999).

a. Structure cellulaire

C. albicans est un eucaryote avec un noyau, une double membrane nucléaire, des chromosomes, des mitochondries et des inclusions lipidiques. IL existe également dans ces cellules des activités enzymatiques de type phosphatase, oxydase et peroxydase .la membrane plasmique est recouverte d'une paroi qui donne à la levure sa forme et sa stabilité mécanique .Elle est aussi une zone de contact entre la cellule et son environnement et sa structure varie selon l'âge et le stade morphologique de la levure (Calderone, 2002). La paroi est l'élément le plus étudié de la cellule.

b. Structure générale de la paroi

La paroi de la levure représente environ 15 à 25 % du poids sec de la cellule. C'est un arrangement ordonné de différents constituants. Certains sont liés par des liaisons covalentes alors que d'autre sont retenus dans la paroi par des liaisons covalentes alors que d'autres sont retenus dans la paroi par des liaisons hydrogènes, des interactions ioniques, ou encore par des interactions hydrophiles ou hydrophobes. Différent constituants comme les polysaccharides, la chitine (N-acétylglucosamine ) et les protéine constituent cette paroi Une structure rigide de polymère complexes de glucose (-1,3 et -1,6 glucanes) et de chitine enveloppe la cellule comme une armure et protège le champignon des stress environnementaux tels que la pression osmotique ( Ruiz-Herrera,2006).

4. Distribution des espèces de Candida

Les espèces de Candida sont des organismes ubiquitaires (Odds, 1988).Ce sont des levures pathogènes naturellement présentes dans la microflores de l'être humain et des animaux, commensales du tractus digestif, de la sphère or pharyngée et de l'appareil vaginal.

Synthèse Bibliographique

Cependant, en présence d'un déséquilibre de la flore microbienne ou d'un affaiblissement du système immunitaire, cette levure peut entrainer des pathologies (candidoses) parfois très sévères. Celles-ci vont de la simple infection superficielle (buccale et vaginale) à la propagation systémique (candidémies) pouvant aller jusqu'à la mort (Shepherd et al., 1985). Les Candida de la flore buccale sont présentes chez 40% de la population humaine (Mac Farlance et Samaranayake, 1989). Candida albicans est l'espèce fongique majoritairement isolée de la cavité orale dont la principale localisation est la face dorsale de la langue, la muqueuse buccale et la surface des dents (Arendorf et walker, 1980; budtz-jorgensen, 2000). Les autres espèces isolées sont C. glabrata, C. tropicalis, C. kefyr, C. krusei et C. guilliermondii (Mac Farlance et Samaranayake, 1989 ; Pfaller, 2006).

4. Epidémiologie

L'épidémiologie des candidoses s'est considérablement modifiée ces dernières décennies avec l'apparition de nouvelles espèces (C. dubliniensis). En effet, le genre Candida représente 83% des levures isolées chez l'homme dont C.albicans constitue l'espèce la plus fréquente (52%) vu qu'elle est saprophyte des muqueuses digestives. Les autres espèces ayant une importance médicale sont C. tropicalis (11%), C. parapsilosis (8%) et C. krusei (5%) (Banerjee et al., 1991; Beck-sague et Jarvis, 1993; klepser et al., 1998). Cependant, de nouvelle données épidémiologique révèlent que l'incidence des infections par des espèces de Candida autres que C.albicans telles que C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis et C. krusei est en voix d'augmentation (Wingard, 1993; Colombo, 2003).

Les dernières données épidémiologique montrent que les Candida spp. occupent la quatrième place des germes isolés des bactériémies et que les candi demies représentent 9% des bactériémies nosocomiales (PFaller, 2001) avec un pourcentage de mortalité allant jusqu'à 40% des cas (Colombo et Guimarães, 2003). Cette augmentation de l'incidence des infections fongiques par les espèces de Candida a souvent été reliée à la déficience du système immunitaire des patients (Horn et al., 1985; Wey et al., 1989; Beck-Sague et Jarvis, 1993). De plus, le taux de colonisation de cette levure au niveau de la cavité orale

augmente avec la sévérité de la maladie et la durée de l'hospitalisation.

(C) pseudohyphes (Odds, 1998).

Synthèse Bibliographique

III. Facteurs de pathogénicité des Candida spp.

La virulence de Candida spp. est due à un ensemble complexe de facteurs. En effet, le genre Candida possède des caractéristiques communes à tous les microorganismes pathogènes tels que la capacité de coloniser et d'envahir l'ensemble des tissus et des organes de l'organisme, la capacité de croitre rapidement à 37°C et la possession d'une paroi cellulaire résistante aux enzymes de dégradation de l'hôte. Cependant, le genre Candida possède des caractéristiques propres comprenant la sécrétion d'adhésive servant à la reconnaissance de l'hôte et à l'attachement aux muqueuses, la production d'enzymes hydrolytiques telles que les phospholipases et les aspartylprotéases et la variation de la morphologie assurée par la transition (dimorphisme) entre la forme levure et la forme mycélienne (Calderone et Fonzi, 2001).

1. Variabilité morphologique

La cellule fongique peut être considérée comme polymorphique, C'est-à-dire qu'elle pourra prendre plusieurs aspects, visibles en microscopie photonique. Les principaux stades morphologiques sont le blastopore, la forme pseudo-mycélienne, le tube germinatif, la forme mycélienne varie et enfin la chlamydospore (Figure 1). Ces différents stades morphologiques peuvent être obtenus pas simple modification des paramètres environnementaux (Odds, 1988).



Figure 1. Différentes formes de croissance des Candida: (A) levure, (B) Hyphes et

Synthèse Bibliographique

2. Le dimorphisme

Le dimorphisme est la capacité du champignon à changer de morphologie selon les conditions environnementales. Cette capacité des souches de Candida à modifier leurs phénotypes en fonction de l'environnement est un facteur de virulence. Deux formes principales peuvent être observées, soit la forme levure ou la forme mycélienne qui a été considérée comme pathogène, celle-ci étant observée dans les tissus infectés évitant ainsi les mécanismes de défense du système immunitaire (Odds, 1988).

3. Les enzymes

L'activité protéolytique de C. albicans lui permet d'utiliser les protéines comme seule source d'azote. Les protéases sont certainement les enzymes de C.albicans les mieux étudiées. Leurs activité protéolytique est due à la famille des gènes SAP qui codent pour des Secreted Aspartic Protéinases (Wi hte et al., 1998). D'autre enzymes sont sécrétées par C.albicans comme les phospholipases ( PL) et les lipases .Le terme phospholipase décrit un groupe d'enzymes qui ont la capacité d' hydrolyser une ou plusieurs liaisons ester des glycéro-phospholipides. Chez C. albicans, les phospholipases extracellulaires sont considérées comme des facteurs de virulence. Différentes sous-classes ont été détectée chez C. albicans: PLA, PLB, PLC et PLD (Hube et al., 1998).

4. Adhérence de C. albicans

L'adhérence à des substrats de l'hôte est essentielle à toute colonisation par un pathogène. La réussite de la colonisation et de l'infection des tissus de l'hôte par les espèces de Candida dépend de leur capacité à adhérer aux muqueuses .Les adhésines de Candida sont des protéines qui se retrouvent à la surface des cellules (Chandra, 2001). Les espèces de Candida sont capables de produire en grandes quantités des exo polysaccharides ou «slime». Ces dernières sont considérés un des facteurs de virulences des isolats de Candida responsable de la dissémination de l'infection chez les organismes hôtes ainsi que leurs persistance et colonisation au niveau des tissus (Ramage et al., 2005). La possibilité de production d'exo-polysaccharides par les souches de Candida spp. peut être testée sur deux milieux différents : soit par leur croissance sur gélose au rouge Congo soit par la méthode de coloration à la

safranine (Davenport et al., 1986).

Synthèse Bibliographique

IV. différents types de candidoses

Les candidoses sont les infections à champignons levuriformes les plus fréquentes et qui se développent en faveur de la chaleur et de l'humidité. Elles se manifestent aux mêmes endroits que les dermatophytoses, mais il existe aussi des formes buccales, génitales et systémiques (Calderone et Fonzi, 2001). Il y a même eu rapport d'endocardites à C. albicans (Maertens et al., 2001; Kaloterakis et al., 2003).

1. Les candidoses cutanées

Les candidoses cutanées sont très répandues chez l'homme (Hay, 1999). Elles sont favorisées par l'humidité et la macération, ce qui explique l'atteinte préférentielle des plis et leur fréquence chez l'obèse. Elles peuvent résulter de l'extension d'une candidose digestive ou génitale où l'on retrouve des facteurs favorisants comme le très jeune âge, le diabète, la prise d'antibiotique et des corticoïdes.

Il existe également une forme rare de candidoses appelée la candidose mucocutanée chronique qui touche les membranes muqueuses, mais qui peut s'étendre à la peau ou aux ongles .Cette forme de candidoses est associée à des problèmes de l'immunité cellulaire (Garber, 2001). Des données récentes tendraient aussi à l'associer avec des déficient sélectives en anticorps (Kalfa et al., 2003). Les groupes à fort risque de développer une candidose systématique opportuniste sont donc composés de patients ayant des atteintes hématologiques malignes ayant reçu la greffe d'un organe solide et sous une médication immunosuppressive, ceux ayant reçu une chimiothérapie immunosuppressive en prévision d'une greffe de moelle et ceux ayant été victimes de brûlures entraînant le perte de la protection fournie par la peau (Garber, 2001).

2. Les candidoses vaginales

La candidose vulvo-vaginale (CVV) est l'une des plus fréquentes infections gynécologique de la femme en période d'activité génitale (Vasquez, 2002). Ces dernières années, les CVV dues à des Candida non albicans tels que C. glabrata, C. tropicalis et C. krusei occupent une importance croissante. Le rôle des facteurs hormonaux dans la survenue des CVV est illustré par plusieurs faits: sa rareté avant la puberté, l'augmentation de sa prévalence à la fin de la deuxième décennie avec un pic persistant les deux décennies suivantes. Après la ménopause, la prévalence de ce type de candidose décroît. Chez l'homme,

les formes génitales sont les balanites et les balano-posthites.

Synthèse Bibliographique

3. Les candidoses buccales et digestives

La candidose orale est une infection opportuniste de la cavité buccale, ayant la plus forte prévalence chez l'humain et causée par la croissance accélérée des champignons unicellulaires du genre Candida (Abu-Elteen et Abu-Elteen, 1998). Plusieurs espèces de Candida sont responsables de cette infection dont C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. pseudotropicalis, C. guillieirimondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis et C. stellatoidea avec une forte fréquence de C. albicans (Odds, 1988). La population est en général porteuse asymptomatique de C. albicans dans une proportion de 20 à 75% (Farah et al ., 2000).

V. Résistance aux antifongiques

L'apparition de souches résistantes à certains composés et la gravité des problèmes de toxicité des antifongiques disponibles commercialement créent une situation préoccupante dans les domaines de la santé publique. On assiste au développement d'un secteur de recherche de plus en plus important et qui semble maintenant s'orienter vers deux approches générales : la recherche de cibles spécifique aux cellules fongique et l'étude des mécanismes immunitaires impliqués lors de ce type d'infection. Ceci pourrait permettre le développement de nouveaux médicaments ayant moins d'effets secondaires

1. Différent types de résistance

La résistance aux antifongiques peut être classée deux catégories: une résistance clinique et une résistance in vitro (expérimentales). La résistance clinique signifie un manque de la réponse clinique vis-à-vis de l'agent antifongique utilisé. Le plus souvent, l'échec du traitement résultant des faibles concentrations de l'agent antifongique dans le sérum et le tissus peut être du à de nombreuses raisons, notamment au choix inadéquat du médicament. De plus, une des raisons significatives de l'échec du traitement est l'état immun déficient avancé du patient, chez qui les fortes doses fongicides de l'agent utilisé sont incapables d'éradiquer la prolifération et la colonisation de l'agent pathogène.

Le deuxième type de résistance aux antifongiques est la résistance in vitro qui peut être divisée en une résistance primaire et une résistance secondaire. (Sanglard et Odds, 2002). La résistance primaire, connue aussi sous le nom de résistance intrinsèque ou innée, est

Synthèse Bibliographique

produite lorsque l'organisme est naturellement résistant à un antifongique donné (exemple C. krusei qui est universellement connue par sa résistance au fluconazole, Wingard et al., 1991).

La résistance secondaire ou acquise est décrite lorsque l'isolat responsable de l'infection devient résistant à l'agent antifongique suite à des mutations et une surexpression de certains gènes (Sanglard et Odds, 2002). Cette forme de résistance qui était rare durant les années précédentes, est devenue de nos jours fréquemment reportée chez les patients infectés par le SIDA et qui souffrent d'une résistance accrue des candidoses oropharyngées et oesophagiques au groupe des azoles (Johnson et al., 1995; Kitchen et al., 1995). Actuellement, les seules résistances connues avec une fréquence non négligeable sont celles concernant la résistance à la 5-fluorocytosines et au fluconazole. C. glabrata qui résistante pour 20% des isolats (Pfaller, 2002; Pfaller, 2006) et C. krusei qui est génétiquement résistante.

VI. Les biofilm fongiques

Les biofilm sont des structures tridimensionnelles de micro-organismes qui se développent sur différents supports. En ce qui concerne les levures du genre Candida, ces micro-organismes peuvent se développer sur les cathéters ou encore sur des prothèses (Donlan, 2001a; Donlan, 2001b; Douglas, 2003). La formation du biofilm par les levures pathogènes du genre Candida a été identifiée comme un problème médical important du fait

que ces structures complexes sont de plus en plus impliquée dans les pathologies
nosocomiales chez des population à risque comme les patients immunodéprimés (Khardori, 1995; Baillaie et Douglas, 1999a; Chandra et al., 2001a).

1. Structure d'un biofilm

L'organisation générale d'un biofilm de Candida est similaire à celle du biofilm bactérien mais le détail dans la composition d'un biofilm de Candida réside au fait que sa structure est fortement dépendante des conditions de formation du biofilm (Costerton, 1999). Cette plasticité de structure suggère que l'architecture du biofilm à Candida formé chez l'homme (hôte) peut aussi varier selon la nature des implants sur lesquels il se développe et

leur localisation (Kumamoto, 2002) laissant envisager des mécanismes de régulation
génétique hautement spécifiques, dépendants de la réponse au contact avec la surface

(Douglas, 2003).

Synthèse Bibliographique

2. Propriétés du biofilm

Les organismes qui croissent au sein d'un biofilm ont des propriétés qui distingues des cellules planctoniques .Ces caractéristiques incluent :

- La protection : lorsque la structure ou le phénotype du biofilm protège les microorganismes des défenses de l'hôte, des agents de traitement, de la dessiccation, des fluides hydrodynamiques et des forces mécaniques.

- Les différences des expressions phénotypiques et des caractéristiques de croissance. - La compétition et les échanges des nutriments : augmentation des concentrations des

nutriments, hétérogénéité microbienne et environnementale pour assurer le flux des

nutriments.

- Communication intercellulaire et inter espèces (Kumamoto, 2002; Chen et al., 2004).

3. Développement du biofilm à Candida

La formation du biofilm candidal répond aux mêmes étapes que celle d'un biofilm bactérien, toutefois lors de la phase de colonisation, une modification morphologique est observée caractérisée par l'apparition de filaments appelés hyphes (Figure 2). La formation de biofilm inclue l'adhésion irréversible des cellules planctonique aux surfaces, la croissance et la sécrétion de polymères extracellulaires (formation de biofilm mature) et enfin le détachement des cellules (Smith et al., 2003).



Figure 2. Schéma d'un biofilm formé aux surfaces polymérique. (A): Cellule
planctonique, (B): Attachement à la surface et formation de membrane cellulaire, (C):
Prolifération cellulaire et production de polymères extracellulaires, (D): maturation du
biofilm, (E): Détachement des cellules.

Synthèse Bibliographique

4. Facteurs favorisant le développement d'un biofilm à Candida

Il est à noter que la nature chimique de la surface influence à la formation du biofilm. En effet, les surfaces comme le latex favorisent cette formation, tandis qu'elle apparaît plus difficile sue des surfaces de polyuréthane ou de silicone (Hawser et Douglas, 1994). L'hydrophobicité de la surface semble positivement corréler avec la formation du biofilm (Li et al., 2003). Aussi, les conditions environnementales comme les turbulence rencontrées dans les cathéters vasculaire ou urétraux favorisent la croissance de la levure au sein d'un biofilm

(Hawser et al., 1998a; Kojic et Darouiche, 2004).



MÉTHODOLOGIE

&

PROTOCOLES

Méthodologie & Protocoles

I-Description du site d'étude

C'est la première et la plus grande décharge contrôlée en Tunisie utilisée pour la récupération des déchets des quatre gouvernorats du grand Tunis (Tunis, Ben Arous, Ariana et Mannouba) qui a été crée en 1993 dans un programme national de gestion des déchets

solides et mise en fonctionnement en 1999. La décharge de Djbel-Chakir est située à 10 Km au Sud Ouest de la ville de Tunis d'une superficie égale à environ 47 ha bâtie sur une surface totale de 124 ha. Elle reçoit 2000 tonnes de déchets/jour dont 68% des déchets organiques. La production des lixiviats est de 270 m³.j^-1. Ces lixiviats sont stockés dans 13 bassins avec une

capacité totale de 300 000 m3

(Figure 3).



Figure 3. Photo aérienne du centre d'enfouissement technique de Djbel- Chakir et l es bassins de stockage des lixiviats.

Après la réception des déchets, les camions poubelles déversent leurs cargaisons dans les alvéoles qui sont l'origine du lixivat jeune. Le traitement des lixiviats (Figure 5) passe par plusieurs étapes. L'échantillonnage a été fait au départ à partir de deux bassins de stockage des lixiviats: lixiviats jeunes (E8), lixiviats âgées (E6). A l'arrivé des l ixiviats brutes (E1) mélangées 2/3 jeunes et 1/3 âgées à la station de traitement collective, elles passent par plusieurs processus d'épuration. D'abord, les lixiviats brutes subissent une filtration à sable qui est dans notre cas non fonctionnelle, ensuite, traitées par l'acide sulfurique à 98% suivi par un filtre à cartouche (E2 ). Puis, les lixiviats passent par un système d'ultrafiltration par osmose inverse de trois étages: 1^er étage (E10), 2^éme étage (E9) et 3^éme étage (E3) qui s'effectue à travers des membranes mi croporeuses retenant les particules dont la taille est comprise entre 0,1 et 0,001 um et qui ne laissent passer que les molécules d'eau. Une fois le traitement

Méthodologie & Protocoles

achevé, on obtient deux phases : le concentrât (E4) qui va entrer de nouveau dans le cycle de traitement, et le perméat épuré (E7) qui est rejeté au niveau de l'embouchure de l'oued El Attar (E5).



Figure 4. Unité de traitement des lixiviats de la décharge de Djebel

-Chakir.

II-Identification biochimique des espèces de Candida

spp. isolées

II. 1. Echantillonnage

Les échantillons analysés dans cette étude ont été prélevés dura nt trois campagnes d'échantillonnage à partir des différentes phases de traitement des lixivi ats de la station de Borj Chakir. La période de c ollecte s'est étendue du mois de Novembr e 2011 au mois de Février 2012, date au cours de laquelle la station est mise hors service. Les échantillons de lixiviats sont prélevés stérilem ent dans des bouteilles en verre (1 L) préa l ablement stérilisées par la chaleur sèche (volume fi nal 1 L) et conservées dans des glacières contenant de la glace. Les échantillons sont analysés d ès le retour au laboratoire puis conservés à

-20°C.

Candida

II.2. Isolement et caractéris ation biochimique des espèces de II.2.1. Isolement des es pèces de Candida sur milieu chromogénique

L'isolement des espèces de Candida à partir des différents prélèvements a été réalisé sur gélose CHROMagar^TM Candida (BioMérieux, France). Cette gélose est un milieu

La floculation des isolats de Candida a été testée en incubant les cellules (DO600nm=1) dans 10 ml de bouillon YPD pendant 24h à 37°C. La lecture visuelle des résultats est réalisée

Méthodologie & Protocoles

chromogénique qui sert pour l'isolement sélectif des levures et l'identification directe des espèces de Candida. L'identification des isolats de C. albicans est caractérisée par une coloration des colonies de cette espèce en vert par l'hydrolyse spécifique d'un substrat chromogène après une incubation de 24 à 48 h à 37°C. L'hydrolyse d'un deuxième substrat permet de différencier les cultures mixtes et d'orienter l'identification vers d'autres espèces à savoir C. tropicalis de couleur «bleu métallique» et C. krusei caractérisée par des colonies roses (Odds et Bernaerts, 1994; Beighton et al., 1995; Pfaller et al., 1996). Ce milieu permet de discriminer entre ces trois espèces et de les isoler même si elles sont en culture mixte et à faible quantité (UFC/ml).

Pour cela, dix millilitres de chaque prélèvement sont enrichis dans 90 ml de bouillon YPD (10g extrait de levure; 10g peptone et 20g glucose) et sont incubés pendant 48h à 37°C (Noumi et al., 2011a). Après incubation, l'isolement sur le milieu chromogénique a été réalisé selon la méthode d'isolement par cadrons.

II.2.2. Purification des espèces de Candida sur gélose Sabouraud-chloramphénicol

La purification des espèces de Candida poussant sur milieu CHROMagar^TM Candida a été réalisée sur des boites de gélose de Sabouraud supplémentée par un antibiotique à large spectre, le chloramphénicol (Bio-rad, France). En effet, la gélose de Sabouraud constitue un milieu sélectif classique pour la culture et l'isolement des levures et des moisissures en particulier les espèces du genre Candida. Pour cela, 45,5 g de la gélose de Sabouraud-chloramphénicol (pH=7) sont chauffés dans un litre d'eau distillée puis autoclavés pendant 15 min à 120°C. Le milieu est coulé dans des boites de Pétri, laissé refroidir puis mises dans l'étuve (37° C) pendant une nuit (Chabasse et al. ,1999). Une fois ensemencées, les boites sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h.

II.2.3. Observation microscopique

Après isolement des souches de Candida sur gélose Sabouraud-chloramphénicol, une colonie bien individualisée a été étalée sur une lame contenant une goutte d'eau physiologique stérile et puis fixée par la flamme du bec Bunsen et colorée à la fuschine 1%. Les observations ont été réalisées par un microscope optique (hund H 500 WETZLAR, Germany) au fort grossissement (Gx100) après ajout d'une goutte d'huile à immersion.

II.2.4. Test de floculation

Méthodologie & Protocoles

après la sortie des tubes de l'étuve d'une à deux heures. Le dépôt des cultures cellulaires au fond des tubes en verre témoigne d'un test positif (Noumi et al., 2012). II.2.5. Etude des caractères biochimiques sur galeries Api Candida

Les caractères biochimiques des différents isolats purifiés sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol sont déterminés en utilisant le système de galerie Api Candida représenté par une galerie constituée de 10 microtubes contenant des substrats déshydratés pour réaliser 12 tests d'identification. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés. Après incubation, la lecture de ces réactions se fait à l'aide du tableau de lecture et l'identification est obtenue à l'aide du catalogue analytique ou d'un logiciel d'identification (Tableau I).

Tableau I. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Candida

Tests Composants actifs

1) GLU D-glucose

2) GAL D-galactose

3) SAC D-saccharose

4) TRE D-tréhalose

5) RAF D-raffinose

6) BMAL 4-nitrophényl-BD-maltopyranose

7) áMAL 2-chloro-4-nitrophényl-áD-maltotrioside

8) BXYL 4-nitrophényl-BD-xylopyranoside

9) BGUR 4-nitrophényl-BD-glucuronide

10) URE Urée

11) BNAG (dans tube n°8) 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-BDglucosminide

12) BGAL (dans tube n°9) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-BD-galactopyranoside

Pour cela, le fond et le couvercle d'une boîte Api sont réunis et de l'eau distillée stérile est ajoutée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide. Ensuite, la galerie est déposée stérilement dans la boîte d'incubation. Une suspension fongique très dense est alors préparée à partir de colonies séparées pures et jeunes sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol dans une ampoule d'NaCl 0,85% Medium qui sera répartie uniquement dans les tubes en évitant de faire des bulles. Les 5 premiers tests et le dernier sont recouverts d'huile de paraffine stérile. Les galeries sont par la suite incubées pendant 24 h à 37°C.

La lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture du guide d'utilisateurs. Les tests sont regroupés en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4) est indiquée pour chacun. A l'intérieur de chaque groupe, les nombres correspondants aux tests positifs sont additionnés. On obtient un nombre de quatre chiffres qui sert de code d'identification. Le

Méthodologie & Protocoles

code est par la suite entré dans la base de données du logiciel Api Web (BioMérieux, France) et l'isolat est ainsi identifié.

III. Etude phénotypique de la résistance des isolats

de Candida spp. aux agents antifongiques

La résistance des différents isolats a été testée vis-à-vis de deux agents antifongiques utilisés dans le traitement des candidoses buccales (Amphotéricine B) et vaginales (Acide borique) selon deux méthodes: sur milieu solide et milieu liquide.

III.1. Test de résistance à l'acide borique

On prépare un milieu de culture de gélose Sabouraud-Chloramphénicol et on lui ajoute 1,8 g d'acide borique/L par filtration en utilisant un filtre seringue de diamètre 0,22 um (IWAKI, Japan). Le milieu est par la suite coulé dans des boites de Pétri, laissé refroidir à température ambiante. Tous les isolats sont repiqués sur ce milieu (technique d'isolement par cdrons) et les boites sont alors incubées de 24 à 48h à 37°C. Si la colonie pousse, elle est donc résistante à l'acide borique sinon la souche est dite sensible à l'acide borique.

III.2. Test de résistance à l'amphotéricine B

III.2.1. Sur milieu solide

La résistance des différents isolats à l'amphotéricine B a été testée selon la méthode CLSI (Wayne, 1997) sur milieu MHGBM (Mueller-Hinton Glucose Bleu de méthylène de composition: MH 38 g, Glucose 2 % et 0,5 ug/ml Bleu de Méthylène). Des disques de papier Wattman stériles de 6 mm de diamètre (Biolife, Milan, Italie) ont été placés sur les tapis de levures (les suspensions ont été ajustées à une _DO520nm=0,4 équivalent à une charge de 10 cellules/ml). L'amphotéricine B est diluée dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) 10% de façon à déposer 100 ug/disque (volume déposé: 10 ul). Les boites sont par la suite incubées à 37°C pendant 24 à 48h. L'apparition d'un halo autour de chaque disque traduit l'inhibition de la croissance des levures. La mesure de cette activité consiste à mesurer le diamètre d'inhibition avec une règle plate (L=20 Cm). Si le diamètre est =9 mm la souche est dite résistante (R), si le diamètre est compris entre 10 et 14 mm la souche est dite Sensible Dose Dépendante (SDD) et si le diamètre et supérieur à 15 mm, la souche est dite sensible à l'amphotéricine B.

Méthodologie & Protocoles

III.2.2.Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice et (CMI) et de la Concentration Minimale Fongicide (CMF)

Les CMIs et CMFs ont été déterminées selon le protocole décrit par Noumi et ses collaborateurs (2009). Des inocula de chaque souche ont été préparés dans l'eau physiologique à partir d'une culture jeune sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol et la densité optique a été ajustée _DO520nm=0,4 équivalente à 10 cellules/ml. Une solution mère d'amphotéricine B de concentration (16ug/ml) a été préparée dans le diméthylsulfoxyde à 10% (DMSO). Des dilutions en cascade sont réalisées dans des tubes à hémolyse stériles de 5 ml contenant le DMSO à 10%. Les plaques ELISA à 96 puits (fond rond) ont été préparées de façon que chaque puits contienne 95 ul de bouillon Sabouraud, 5 ul de la suspension fongique et 100 ul de chaque dilution de l'amphotéricine B. Le puits témoin positif contient 195 ul de bouillon Sabouraud stérile et 5 ul de la suspension fongique. Le volume final dans chaque puits est de 200 ul. Après incubation à 37°C pendant 18 à 24 h, les plaques sont lues à l'oeil nu pour la détermination des CMIs et CMFs.

IV. Etude des activités enzymatiques

La production d'enzymes hydrolytiques telles que les aspartylprotéases, les phospholipases, l'estérase et les hémolysines par les espèces de Candida est un facteur de virulence de cette levure (Ibrahim et al., 1995; Hube, 1998) pour cela, nous nous sommes intéressés à l'étude de ces activités.

IV.1. Détermination de l'activité de la phospholipase

Les souches isolées sont transférées dans les tubes contenant 5 ml du bouillon YPD puis incubées à 37C° pendant 18 h. Après incubation, 1,5 ml de la culture fongique sont transférés dans des tubes eppendorf et centrifugés à 3000 rpm pendant 5 min. Le culot obtenu est lavé deux fois par une solution de PBS stérile (PBS: Na₂HPO₄ 7Mm, NaH₂PO₄ 3Mm et NaCl 130Mm, pH=7,2), puis centrifugé à 3000rpm pendant 5 min. La gélose pour tester l'activité phospholipase est préparée (10 g peptone, 30 g glucose, 57,7 g NaCl, 0,55 CaCl₂ et 20 g d'agar agar dans 1 litre d'eau distillée). Après autoclavage et refroidissement du milieu, 100 ml de jaune d'oeuf sont stérilement récupérés et additionné au milieu préparé. Après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1ul est mis en triplicate à des points équidistants sur des boites des Pétri qui sont par la suite incubées à 37°C pendant 4 jours. La présence de la phospholipase est déterminée par la formation d'une zone opaque autour des

Méthodologie & Protocoles

colonies. L'activité enzymatique (Pz) est mesurée en calculant le rapport entre le diamètre de colonie et le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation. La valeur de PZ est inversement proportionnelle à la nature de l'activité. En effet, si le Pz est égale à 1, la souche est dite phospholipase négative, si Pz est supérieur à (0,63), la souche est dite phospholipase positive et enfin si Pz est inférieur à (0,63), l'activité de phospholipase est très élevée ou fortement positive (Price et al., 1982).

IV.2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée

Les étapes de détermination de l'activité de l'aspartylprotéase sont similaires à celles de la phospholipase, la seule différence réside au fait qu'après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1 ul est mis en triplicate à des point équidistants sur des boites de gélose préalablement préparées (2g de BSA: Sérum Bovine Albumine; 1,45 g sulfate d'ammonium, 20 g glucose, 20 g agar-agar dans 1 litre d'eau distillée). Les boites de Pétri contenant l'inoculum des différentes souches sont incubées à 37 C° pendant 7 jours (Aoki et al., 1990).

La sécrétion de l'aspartylprotéase par les isolats testés est déterminée par la formation d'un halo clair autour des colonies et l'activité enzymatique (Pz) est mesurée de la même façon que celle pour la phospholipase tout en divisant le diamètre de la colonie par le diamètre total (le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation). Nous différencions quatre classes d'activité de cette enzyme: une activité très faible (0,9<Pz<1), une activité faible (0,8<Pz<0,89), une activité élevée (0,7<Pz<0,79) et une activité très élevée (Pz<0,69).

IV.3. Détermination de l'activité de l'estérase

La détermination de cette activité a été réalisée en adoptant la méthode décrite par Ge et al. (2011). Les étapes de détermination de l'activité de l'estérase sont similaires à celles de la phospholipase. Après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1ul est mis en triplicate à des points équidistants sur des boites de gélose d'estérase préalablement préparée (10 g peptone, 5 g NaCl, 0,1 g CaCl2 et 15 g agar-agar dans 1 litre d'eau distillée; pH 6,8). Après autoclavage et refroidissement du milieu, 50 ml de Tween 80 sont stérilement additionnés au milieu préparé. Les boites de Pétri contenant l'inoculum des différents isolats sont incubées à 37°C pendant 10 jours. La présence de l'estérase est déterminée par la formation d'une zone opaque autour des colonies. L'activité enzymatique (PZ) est mesurée en calculant le rapport entre le diamètre de la colonie et le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation (Diamètre total). La valeur de PZ est inversement proportionnelle à la nature

Méthodologie & Protocoles

de l'activité. En effet, si la valeur du PZ est égale à 1, la souche est dite estérase négative, si PZ est supérieur à 0,63, la souche est dite estérase positive, enfin si PZ est inférieur à 0.63, l'activité estérase est très élevée ou fortement positive.

IV.4. Etude de pouvoir hémolytique

La production d'hémolysines par les espèces de Candida isolées des différentes phases de traitement des lixiviats à Borj-Chakir a été évaluée en utilisant la technique décrite par Manns et ses collaborateurs (1994). Les souches purifiée sur gélose sabouraud-chloramphénicol sont récupérées et lavées avec une solution saline stérile (PBS, pH 7,2). Une suspension de 10 cellules /ml a été préparée en ajustant sa densité optique à 0,4 sous une longueur d'onde de 520nm (Samaranayake et Mac Farlane, 1981). Un microlitre de cette suspension est inoculé sur gélose au sang du mouton enrichie par du glucose (3%). La gélose au sang du mouton enrichie par du glucose a été préparée en ajoutant 7 ml de sang frais de mouton à 100 ml de gélose de sabouraud-chloramphénicol supplémentée avec 3% de glucose (m/v). Le pH final du milieu ainsi préparé est de 5,6#177;0,2.

Les boites sont incubées à 37 °C sous atmosphère à 5% de CO₂ pendant 48 h. La présence d'halo translucide autour de l'inoculum témoigne d'une activité hémolytique positive. Le rapport des diamètres de la zone de lyse et celui de la colonie est considéré comme un indice hémolytique pour présenter l'intensité de la production d'hémolysines par les différentes espèces de Candida (Wu et al., 1996). L'analyse est réalisée en triplicate et à deux occasions séparées pour chaque isolat. Trois différents types d'hémolyse peuvent être observés sous la lumière autour de la colonie de Candida (Yigit et Aktas, 2009). Le premier type est caractérisé par un anneau translucide relatif à une bêta hémolyse et le second est un halo verdâtre à noirâtre correspondant à l'alpha hémolyse et le dernier qualifié de gamma hémolyse (pas d'activité). Le calcul de l'indice d'hémolyse a été fait en adoptant la formule proposée par Yigit et Aktas (2009) tout en divisant le diamètre de la colonie par le diamètre total (diamètre de la colonie additionné du diamètre de la zone d'hémolyse). Cet indice donne une idée sur l'intensité de production des hémolysines par les souches de Candida.

IV.5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM

Le système Api ZYM est une micro méthode semi quantitative pour la recherche des activités enzymatiques applicable à des différents types d'échantillons (microorganismes, suspensions cellulaires, tissus, liquides biologiques, etc.). Il permet d'étudier rapidement et simultanément 19 activités enzymatiques à partir de très faibles quantités d'échantillons. La

Méthodologie & Protocoles

galerie Api ZYM contient 20 cupules spécialement adaptées à l'étude des réactions enzymatiques. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, qui réhydrate les substrats. Les réactions produites pendant la période d'incubation (4h) se traduisent par des virages colorés révélés par l'addition des réactifs Zym A et Zym B (Tableau II).

En effet, 100 ìl de la suspension de chaque isolat de levure sont utilisés pour inoculer les différentes cupules des galeries Api Zym. Après 4 h d'incubation à 37°C, les réactifs Zym A et Zym B sont ajoutés dans les différentes cupules et les galeries sont soumises après 5 min de réaction à la lumière blanche pour la révélation des différentes réactions enzymatiques (variation de couleurs). Les couleurs obtenues sont comparées à celles décrites dans le manuel d'utilisation fourni par le fabriquant.

Tableau II. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Zym (BioMérieux).

N°	Enzyme recherchée	Substrats
1	Témoin
2	Phosphatase alcaline	2-naphtol phosphate
3	Estérase (C4)	2-naphtol butyrate
4	Estérase Lipase (C8)	2-naphtol caprylate
5	Lipase (C14)	2-naphtolmyristate
6	Leucine arylamidase	L-leucyl-2-naphtylamide
7	Valine arylamidase	L-valyl-2- naphtylamide
8	Cystine arylamidase	L-cyctil-2- naphtylamide
9	Trypsine	N-benzoyl-DL-arginine-2- naphtylamide
10	á-chymotrypsine	N-glutaryl-fenylalanine-2- naphtylamide
11	Phosphatase acide	2-naphtyl phosphate
12	Naphtol-AS-BI -phosphohydrolase	Naphtol-AS-BI-phosphate
13	á-galactosidase	6-Br-2-naphtyl-áD-galactopyranoside
14	3-galactosidase	2-naphtyl-3D- galactopyranoside
15	3-glucuronidase	Naphtol-AS-BI-3D-glucuronide
16	á-glucosidase	2-naphtyl-áD-glucopyranoside
17	3-glucosidase	6-Br-2-naphtyl-3D-glucosaminide
18	N-acétyl-3-glucosaminidase	1-naphtyl-N-acétyl-3D-glucosaminide
19	á-mannosidase	6-Br-2-naphtyl-áD-monnopyranoside
20	á-fucisidase	2-naphtyl-áL-fucopyranoside

V. Etude qualitative et quantitative de l'adhésion des

souches de Candida isolées

Pour expliquer la persistance des souches de Candida dans les différentes phases de traitement des lixiviats, nous avons testé la capacité de ces levures à s'adhérer et à former un

Méthodologie & Protocoles

biofilm sur une surface inerte qui est le polystyrène ainsi que la production de « slime » ou exopolysaccharides sur milieux liquide et solide.

V.1. Etude qualitative de l'adhésion V.1.1. Coloration à la safranine

La production de « slime » ou exopolysaccharides a été déterminée selon la technique décrite par (Noumi et al., 2011). Brièvement, quelques colonies de Candida cultivées sur gélose Sabouraud dextrose agar ont été inoculées dans les tubes contenant 10 ml de bouillon Sabouraud supplémenté avec du glucose à 8%. Les tubes ont été incubés pendant 24 h à 35°C, puis égouttés et colorés avec 5 ml de safranine 1% pour vérifier la présence ou l'absence d'un culot. La production de slime par chaque isolat est considérée faible (+), moyenne (++), ou forte (+++) selon l'intensité du culot obtenu. Le résultat a été lu par trois observateurs différents.

V.1.2. Production de « slime » sur gélose préparée au rouge Congo

L'aptitude de souche de Candida à produire un biofilm a été évaluée sur milieu rouge Congo en utilisant la technique décrite par Dag et al. (2010). Ce milieu est préparé en ajoutant 0,8 g de rouge Congo (Sigma, France) et 80 g de glucose (Labosi, France) à un 1itre de gélose coeur cervelle (Bio-rad, France). Le milieu a été autoclavé à 115 C° pendant 10 min. Les boites sont incubées pendant 24 h à 37°C en aérobie, suivi d'une nuit à l'obscurité à température ambiante. Les souches productrices de biofilm « slime Producer » apparaissent sous forme de colonies noires, tandis que les souches biofilm négatif sont non pigmentées (blanches, roses avec un point noir au centre).

V.2. Etude quantitative de l'adhésion V.2.1. Test de hydrophobicité

L'hydrophobicité des souches de levures est mesurée selon le protocole décrit par Rosenberg et ses collaborateurs (1983). Le test consiste à mesurer l'adhésion de cette levure au cyclohexane (hydrocarbure) et au xylène .Pour cela, les isolats de levures sont incubés toute une nuit dans 5 ml de bouillon YPD à 28 C°. Les cellules de Candida sont par la suite lavées avec du PBS et leur densité optique (DOi) est ajustée à 1 (DO600 nm =1). Pour le test d'adhésion, 3 ml de la suspension de levure sont mélangés avec 150 ul de cyclohexane ou xylène et dans un tube en verre lavé avec de l'acide sulfurique.

Méthodologie & Protocoles

Le mélange est agité (vortex) durant 1 min puis laissé à température ambiante de 20 min à 1 h. L'absorbance (Af) de la phase aqueuse est mesurée à 600 nm puis comparée avec l'absorbance initiale (A ). Le pourcentage des cellules adhérentes formant une membrane fine à la surface des solvants testés (le cyclohexane et le xylène) est déterminé pour estimer le pourcentage l'hydrophobicité des souches de levure selon l'équation suivante (I).

(I) % d'hydrophobicité= [(DOi-DOf)/DOi] x 100

V.2.2. Adhésion des Candida spp. sur les plaques en polystyrène

Afin de quantifier la formation de biofilm formé par les différentes espèces de Candida isolées, nous avons recours à une première méthode basée sur un dosage spectrophotométrique du Cristal violet 1% dans des plaques ELISA 96 puits à font rond et une deuxième technique colorimétrique basée sur la réduction du 2,3- bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5 [(phénylamino) carbonyl]-2H-tétrazolium (XTT) en un composé coloré hydrosoluble (le formazan) sous l'effet de la déshydrogénase mitochondriale des Candida dans des plaques ELISA de 96 puits à font plat (Hawser, 1998b).

Toutes les espèces de Candida spp. ont été cultivées pendant 18h à 37°C sur milieu Sabouraud- Chloramphénicol. Par la suite, les souches ont été incubées dans un bouillon YNB (Yeast Nitrogen Base; Sigma - Aldrich, St Louis, Mo, India) supplémenté par 100 Mm de glucose (18g/l). Après une nuit de culture, les levures ont été récupérées à la fin de la phase exponentielle de croissance et lavées deux fois avec 5 ml d'une solution saline tamponnée (PBS; pH 7,2). Une suspension de 10 cellules/ ml a été préparée en ajustant la densité optique à 0,4 mesurée à 520 nm.

Les biofilms ont été produits sur des plaques ELISA en polystyrène à 96 puits et à fond plat pour le XTT et à fond rond pour le Cristal violet 1% (Nunc, Roskilde, Danemark) selon le protocole précédemment décrit par Noumi et ses collaborateurs (2010). Cent microlitres de la suspension cellulaire (10 cellules/ml) sont transférés dans les puits de chaque type de plaques à l'aide d'une micropipette. Les plaques sont incubées à 37°C durant 1 h 30 min dans un shaker à 75 rpm pour permettre à la levure d'adhérer aux surfaces des puits (Kuhn al., 2002). Pour chaque plaque, trois puits ne renfermant pas la suspension de Candida sont considérés comme témoin négatif.

Après la phase d'adhésion, les suspensions de cellules ont été aspirées et les plaques ont été lavées deux fois avec 150 ul de PBS stérile pour enlever les cellules non adhérentes. Cent microlitres du bouillon YNB ont été alors transférés dans chaque puits et les plaques ont

Méthodologie & Protocoles

été incubées à 37° C dans un shaker à 75 rpm. Les biofilms ont été développés durant 66 h et la viabilité cellulaire a été mesurée par analyse de la réduction du XTT (cellule viables) et au Crystal violet (cellules fixées). Le milieu a été renouvelé quotidiennement par aspiration du milieu épuisé et addition d'un nouveau milieu chaque jour. Toutes les analyses ont été effectuées en triplicate (Melo et al ., 2006).

L'analyse de la réduction du XTT est réalisée selon la technique décrite par Kuhn et ses collaborateurs (2002). Brièvement, la solution de XTT (1 mg/ml de PBS; Sigma-Aldrich, Inc.Germany) a été préparée et stérilisée par filtration à travers un filtre de 0,22 um de porosité (Millipore, Satorius Minisart CE 0297, Germany) puis stockée à -70°C. La solution de ménadione (0,4 mM dans l'acétone; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo., Switzerland) a été préparée et stérilisée par filtration (filtre 0,22 um juste avant chaque analyse). Avant chaque essai, la solution de XTT et décongelée et mélangée avec la solution de ménadione (5 :1; v/v). Les biofilms ont été lavés cinq fois avec 200 ul de PBS stérile puis nous avons ajouté 200 ul de PBS additionnés par 12 ul de la solution de XTT-ménadione. Les plaques ont été incubées à l'obscurité pendant 2 h à 37 °C.

Pour la méthode au Cristal violet 1%, les biofilms ont été lavés cinq fois avec 200 ul de PBS stérile et colorés avec 200 ul de Cristal violet 1% pendant 15 min. Les plaques sont séchées en position inversée. Les puits sont lavés de nouveau avec du PBS stérile et le Crystal violet a été solubilisé dans 200ul d'une solution éthanol-acétone (80:20 v/v).

Après incubation, 100 ul de la solution ont été transférés dans de nouveaux puits et le changement de couleur de la solution a été mesuré avec un lecteur ELISA (BioRad, France) à 492 nm pour les plaques contenant le XTT et à 595 nm pour le Cristal violet 1%. Les valeurs des absorbances pour les puits témoin ont été alors soustraites des valeurs des puits inoculés par les suspensions pour éliminer les faux résultats dus à l'interférence de fond (Ramage et

al., 2001).



RÉSULTATS

Résultats

I. Caractérisation phénotypique des espèces de

Candida spp. isolées

1. Etude morphologique

1.1. Caractéristiques macroscopiques

Sur milieu chromogénique, plusieurs morphotypes sont décrits pour les échantillons analysés (Tableau III): colonies de couleur bleue, colonie de couleur blanche et colonies de couleur rose ou blanche à centre rose, colonies de couleur mauve et colonies de couleur beige (Figure 5).



Figure 5. Les principaux morphotypes obtenus sur milieu CHROMagar^TM Candida (A): colonies de couleur bleue; (B): colonies de couleur blanche à centre rose; (C): clonies de couleur turquoise.

L'examen macroscopique des espèces de Candida cultivées en aérobiose à 37°C sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol (pH 7,2) montre qu'il s'agit de colonies crémeuses, lisses, rondes et bombées (Figure 6) ayant une odeur de levure. La croissance de Candida sur ce milieu sélectif nous a permis de remarquer que la couleur des colonies est variable selon l'espèce. En effet, sur la gélose Sabouraud-Chloramphénicol, C. albicans est blanchâtre.



Figure 6. Observation microscopique des colonies de Candida sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol. (A): colonies blanches ou crémeuses et lisses; (B): colonies grandes et

sèches.

Résultats

Tableau III. Couleur des isolats obtenue sur milieu CHROMagar^TM Candida en fonction de l'origine d'isolement.

Code	Origine	Milieu	Couleur obtenue
M1	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M2	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M5	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M7	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M8	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M9	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M10	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M11	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie rose
M13	E7	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M14	E7	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M16	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M17	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M18	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M19	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M20	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M21	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M22	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M23	E10	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M24	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M25	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M28	E10	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve claire
M30	E1	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve claire
M31	E1	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche
M32	E4	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M36	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M39	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M40	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M41	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M42	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M43	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M44	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M45	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M46 M47	E5 E5	CHROMagar^TM CandidaCHROMagar^TM Candida	Colonie mauve Colonie bleue
M49	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche à centre
M50	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche à centre
M56	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M57	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue

1.2. Caractéristiques microscopiques

L'aspect microscopique de toutes les espèces de Candida est semblable. L'observation microscopique des cellules de Candida au grossissement (*100) a montré qu'on a 62,16 % de souches de forme ovalaire (Figure 7A) de 2 à 8 um de diamètre. Les autres 37,83% de souches ont une forme allongée ou en forme de grain de riz (Figure 7 B).

Résultats



Figure 7. Observation microscopique des cellules de Candida colorées à la fushine au microscope optique (G*100). (A) : cellules de Candida de forme ovoïde, (B) : cellules de Candida ayant la forme des grains de riz.

2. Différentes espèces de Candida spp. Isolées à partir de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir

L'identification des souches a été réalisée par les galeries Api Candida pour 37 isolats. Par la suite, l'interprétation des résultats a été effectuée par le logiciel Api Web (bioMérieux, France). Deux genres sont identifiés : Candida et Saccharomyces regroupent les espèces suivants isolées C. albicans, C. krusei, C. famata, C. tropicalis, C. guilliermondii et C. lusitaniae et l'espèce Saccharomyces cerevisiae (Tableau IV).

Tableau IV. Différentes espèces de levures isolées à partir de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir en se basant sur les caractères obtenus sur les galeries Api Candida.

Espèces identifiées	Nombre	Codes obtenu sur Api Candida
C. albicans C. krusei	15 14	7512 ; 7712 ; 4512 1000 ; 1010 ; 1020 ; 1030
C. famata	3	2100 ;	3100	; 5100
C. tropicalis	2		7710
C. guilliermondii	1		7320
C. lusitaniae	1		7520
Saccharomyces cerevisiae	1		7300

Nous avons noté au cours de ce travail que les deux espèces isolées est C. albicans (n =15) et C. krusei (n=14) sont majoritairement isolées. Les profils biochimiques des différentes espèces de Candida isolées sont illustrés dans le tableau V ci-dessous.

Résultats

Tableau V. Origine, fo rme et caractères biochimiques des levures isolées et testées par les galeries Api Candida (BioMérieux, France).

Isolats testés Origine	Date de prélèvement	Forme*	Identification biochimique par Api Code Identification (%)
Candida albicans
M2 E5	25/11/2011	Ovale	4512	C. albicans	ND
M5 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M7 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M8 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M16 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M20 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M21 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M24 E2	25/11/2011	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M25 E2	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M36 E2	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M42 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M45 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M47 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M56 E5	06/02/2012	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M57 E5	06/02/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
Candida krusei
M13 E7	25/11/2011	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M22 E5	06/01/2012	Grains de riz	1030	C. krusei	ND
M30 E1	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M31 E1	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M32 E4	06/01/2012	Grains de riz	1010	C. krusei	99,5
M39 E2	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M40 E2	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M41 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M43 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M44 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M49 E5	06/02/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M17 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M18 E5	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M50 E5	06/02/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
Candida famata
M9 E8	25/11/2011	Ovale	5100	C. famata	99,2
M10 E8	25/11/2011	Ovale	2100	C. famata	57,6
M11 E8	25/11/2011	Ovale	3100	C. famata	57,6
C. tropicalis M28 E10	06/01/2012	Ovale	7710	C. tropicalis	95,7
M46 E5	06/01/2012	Ovale	7510	C. tropicalis	99,9
C. lusitaniae M1 E5	25/11/2011	Ovale	7520	C. lusitaniae	99,3
C. guilliermondii M14 E7	25/11/2011	Ovale	7320	C. guilliermondii	96,5
Saccharomyces cerevisiae M23 E10	06/01/2012	Ovale	7300	S. cerevisiae	98,8

ND : Non Déterminé par le logiciel API WEB;

3. Test de floculation

Après incubation de 24 h dans l'étuve 37 ° C, nous avons pu remarquer que toutes les souches testées floculent dans le bouillon Sabouraud-Chloramphénicol avec dépôt des cellules

au fond des tubes (culot blanc).

Résultats

4. Test de résistance à l 'a cide borique

Le but de la réalisation de ce test est de voir le taux de sensibilité ou de résistance des souches de Candida sur un milieu qui contient de l'acide borique (agent antifongique). On a pu remarquer que 22 souches parmi 43 poussent après incubation de 24 h à 37 °C. En effet, ces dernières sont résistantes à l'acide borique. Les autres souches sont alors considérés sensibles.

II. Activité anti fo

ngique

disque

1. Méthode de diffusion de

Sur milieu MHGBM, nous avons montré que toutes les souches testées ne répondent pas de la même façon à l'amphotéricine B (100 ug/disque). En effet, seize souches sont résistantes à l'amphotéricine B puisque les diamètres d'inhibition de la croissance sont inférieurs à 9 ; treize souches sont sensibles à l'amphotéricine B pu i sque les diamètres d'inhibition de la croissance sont compris entre 10 et 14 mm, alors que q uatorze souches ont une susceptibilité dose dépendante avec des diamètres d'inhibition de la cr oissance supérieurs à 15 mm (Figure 8).



Figure 8. Détermination des diamètres des zones d'inhibition de la croissance des levures sur milieu Mueller-Hinton-Glucose-Bleu de Méthylène par l'amphotéricine B (100 ug/disque). (A): Souche résistante; (B): Souche à Sensibilité Dose Dépendante; (C): Souche sensible.

(CMI) et de la

2. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice Concentration Minimale Fongicide (CMF)

La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMIs) et des concentrations minimales fongicides (CMFs) a été faite selon une lecture visuelle. Les valeurs

Résultats

de CMIs sont comprises entre 0,015 et 0,0312 ug/ml alors que les CMFs varient de >0,5 à >16 ug/ml. Tous ces résultats sont résumés dans le tableau VI ci-dessous.

Tableau VI. Résistance phénotypique

l'amphotéricine B (sur milieu MHGBM et sur

vis-à-vis de

milieu liquide) et à l'acide borique.

des différentes souches testées

Souche

	Résistance à l'acide borique (1,8 g/L)	Amph otéricine B
		Sur milieu MHGBM* Milieu liquide (100ug/disque) (ug/ml) ZI#177;DS* Interprétation CMIs CMFs
Candida albicans
C. albicans ATCC 2091	Sensible	6#177;0	R	0.0312	>16
C. albicans ATCC 90028	Sensible	6#177;0	R	0.0312	>16
C. albicans SC5314	Sensible	6#177;0	R	0.015	>4
M2	Résistante	6#177;0	R	0.015	=8
M5	Résistante	17#177;1	S	0.015	>8
M7	Résistante	15#177;1	S	0.015	>8
M 8	Sensible	20#177;0	S	0.015	>16
M16	Résistante	19#177;1	S	0.0312	>4
M20	Résistante	13#177;1	SDD	0.015	>8
M2 1	Sensible	19#177;0	S	0.0312	>0.5
M24	Résistante	14,33#177;0,5	SDD	0.0312	>4
M25	Résistante	13,33#177;1,52	SDD	0.0312	>4
M36	Résistante	14,33#177;3,21	SDD	0.015	>4
M42	Sensible	16,33#177;0,57	S	0.015	>2
M45	Résistante	18#177;1	S	0.0312	>4
M47	Résistante	16,33#177;2,30	S	0.015	>4
M56	Résistante	17#177;1	S	0.015	>4
M57	Résistante	18#177;1,73	S	0.015	>4
Candida krusei
C. krusei ATCC 6258	Résistante	18#177;1	S	0.015	>16
C. krusei 05 (054)	*	*	*	0.015	>8
M1 3	Sensible	13#177;1	SDD	0.0312	>16
M22	Résistante	11,33#177;0,57	SDD	0.0312	>16
M30	Résistante	7,67#177;0,57	R	0.015	>16
M31	Résistante	9,67#177;1,15	SDD	0.015	>16
M32	Sensible	13,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M39	Sensible	14,67#177;1,15	SDD	0.015	>4
M4 0	Sensible	7,33#177;0,57	R	0.0312	>16
M4 1	Sensible	6,67#177;0,57	R	0.015	>16
M43	Sensible	11,67#177;0,57	SDD	0.015	>4
M44	Résistante	12#177;1	SDD	0.0312	>4
M49	Sensible	9#177;1	R	0.015	>4
M1 7	Sensible	9#177;1	R	0.0312	>16
M18	Résistante	12,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M5 0	Sensible	9#177;0	R	0.015	>2
Candida famata
C. famata V 2	Sensible	6#177;0	R	0.015	>1
M9	Résistante	6,33#177;057	R	0.015	>16
M1 0	Sensible	10,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M1 1	Sensible	18,33#177;1,52	S	0.0312	>16
Candida tropicalis
C. tropicalis 06(085 )	*	*	*	0.015	>16
M28	Résistante	15,67#177;0,57	S	0.015	>4
M46	Résistante	6#177;0	R	0.015	>2





Sensible 7,33#177;0,57 R

Sensible 6#177;0 R

Sensible 9,33#177;057 R

14#177;1 S DD

Candida lusitaniae

C. lusitaniae CECT 11458

M1

Candida guilliermondii

M1 4

Saccharomyces cerevisiae

M23 Résistante

0.015 >16

0.015 >1

0.015 >16

0.0312 >4

*MHGBM: gélose Mueller-Hinton Glucose

Bleu de Méthylène; ZI: Diamètre de la zone d'inhibition; DS: Déviation

Standard; R: Résistante; S: Sensible; SDD: Susceptibilité Dose Dépendante; *: Non testé.

de l'aspartylprotéase présente une variation intra et inter-espèces (Figure 1 0).

Résultats

III. Etude de la	virulence des différentes		espèces de
Candida spp. isolées 1. Détermination de l'activité		de la phospholipase

Parmi les 43 souches testées dont celles isolées à partir de la station de traitement des

lixiviats de Borj Chakir, 19

souches ont une activité phospholipase positive (PZ >0,63) révélée par la présence d'un halo opaque autour des colonies sur gélose à base de jaune d'oeuf, 14 souches ont une activité phospholipase négative (PZ = 1) et 10 souches ont une activité fortement positive (PZ<0,63). Les valeurs de PZ qui sont inversement proportionnelles à la nature de l'activité, se sont étendues de 0,48 à 0,63 (Figure 9).

A travers notre étude, nous avons aussi remarqué que la nature de l'activité de cette enzyme varie d'une souche à une autre d'une même espèce. En effet, au sein de l'espèce C. albicans, nous avons décelé deux types d'activité (négative et positive) .(figure9)



Figure 9. Aspect de l'activité de la phospholipase sur gélose à base de jaune d'oeuf. (A):
Souche phospholipase négative; (B): Souche phospholipase positive.

2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée

L'incubation des colonies de levures pendant 8 jours à 37 °C sur la gélose à base de BSA a montré que parmi les 43 souches testées, 32 ont une activité protéase très élevée (PZ < 0,69), deux ont une activité élevée (PZ=0,7), trois isolats ont une activité faible (0,8<PZ<0,89) et 6 présentent une activité très faible ou pas d'activité (PZ =1). Pour l'espèce la plus fréquente, C. albicans , les activités varient de très faible à très élevée alors que toutes les souches de C. krusei possèdent une activité aspartylprotéase secrétée très élevée.

Pendant notre étude, nous

avons remarqué que la distribution des valeurs

de l'activité

Résultats



Figure 10. Différents exemples de l'activité de la protéase obtenue sur gélose à base de BSA.
(A): Absence d'une activité; (B): Activité faible; (C): Activité élevée; (D): Activité très

élevée.

3. Détermination de l'activité de l'estérase

L'incubation des colonies de Candida pendant 10 j à 37°C sur l a gélose de base de Tween 80 à montré que parmi les 43 souches testées, 20 souches ont une activité estérase négative (PZ) = (1), 12 souches ont une activité estérase positive (PZ>0.6 3) et 11 souches ont une activité estérase fortement positive (PZ<0,63).

4. Etude de pouvoir hémolytique

Les résultats ont montré qu'après 48 h d'incubation sur gélose au sang du mouton sous atmosphère à 5% CO2, la plupart des espèces de Candida ont la possibilité de dégrader l'hémoglobine par lyse des érythrocytes. Trois différents types d'hémolyse ont été observés sous la lumière autour de la colonie ensemencée: le premier type est caractérisé par un anneau translucide relatif à une hémolyse de type alpha et le second type est caractérisé par un halo verdâtre à noirâtre correspondant à une béta hémolyse (Figure 11 ). Le dernier type caractérisent les souches non hémolytiques (gamma-hémolytiques). En effet, 19 souches sont â hémolytiques, 17 á hémolytiques et sept souches sont de type gamma.



Figure 11. Aspect des

colonies ayant un pouvoir hémolytique de type â sur gélose à base de sang de mouton.

Résultats

L'ensemble des résultats des activités enzymatique est résumé dans le Tableau VII ci -dessous.

Tableau VII. Activités enzymatiques (phospholipase, estérase et aspartylprotéase) et pouvoir hémolytique des différentes souches isolées.

Les différentes enzymes hydrolytiques testées

Isolats testés

Phospholipase

Estérase Aspartyl

protéase Pouvoir

Pz#177;DS Interprétation Pz#177;DS Interprétation Pz#177; DS Interprétation (IH)* Type

C. albicans

C. albicans ATCC 2091 0,76#177;0,09 Positive

C.albicans ATCC 90028 0,73#177;0,06 Positive

C. albicans SC 5314 0,86#177;0,015 Positive

M2 0,78#177; 0,41 Positive

M5 1#177;0 Négative

M7 1#177;0 Négative

M8 0,75#177;0,09 Positive

M16 1#177;0 négative

M20 0,71#177;0 Positive

M21 1,18#177;0,01 Positive

M24 0,62#177;0,09 Fortement positive

M25 0,58#177;0,065 Fortement positive

M36 0,66#177;0,02 Positive

M42 0,62#177;0,04 Fortement Positive

M45 1#177;0 Négative

M47 1#177;0 Négative

M56 0 ,58#177;0,01 Fortement positive

M57 0,57#177;0,08 Fortement positive

C. krusei

C. krusei ATCC 6258 1#177;0 Négative

C. krusei 05 (054) * *

M13 0,66#177;0,03 Positive

M22 0,83#177;0,12 Positive

M30 1,51#177;0,01 Positive

M31 0,77#177;0,09 Positive

M32 0,85#177;0,01 Positive

M39 1#177;0 négative

M40 0,55#177;0,02 Fortement Positive

M43 0,52#177;0,02 Fortement positive

M44 1,5#177;0 Positive

M49 0,61#177;0,03 Fortement Positive

M41 1#177;0 négative

M17 1,45#177;0,09 Positive

M18 1#177;0 négative

M50 0,61#177;0,03 Fortement Positive

1#177;0 Négative 0,23#177;0 ,02

Très élevée 2,11 â

Très élevée 1,77 â

Très élevée 1 ã

Très élevée 1,93 â

Pas d'activité 1,81 â

Elevée 2,05 â

Elevée 2,36 á

Pas d'activité 2,26 â

Faible 2,84 á

Pas d'activité 2,12 â

Très élevée 1,38 â

Pas d'activité 2 â

Très élevée 1,71 á

Très élevée 2 â

Pas d'activité 1,76 â

Très élevée 1,48 á

Pas d'activité 1 ã

Très élevée 2,1 â

1#177;0 Négative 0,32#177;0,05

1#177;0 Négative 0,41#177;0,08

1#177;0 Négative 0,33#177;0,05

0,71#177;0,1 Positive 1#177;0

0,53#177;0,12 Fortement positive 0,77#177;0,28

1#177;0 Négative 0,72#177;0,04

0,7#177;0,28 Positive 1#177;0

0,51#177;0,01 Fortement positive 0,84#177;0

0,7#177;0,04 Positive 1#177;0

0,43#177;0,31 Fortement positive 0,37#177;0,04

1#177;0 Négative 1#177;0,04

1#177;0 Négative 0,23#177;0,02

0,9#177;0,14 Positive 0,68#177;0,04

0,51#177;0,03 Fortement positive 1#177;0

0,52#177;0,02 Fortement positive 0,59#177;0,06

0,72#177;0,17 Positive 1#177;0

1#177;0,09 Négative 0,6#177;0

Très élevée 1,58 á

* * *

Très élevée 1,44 á

Très élevée 1 ã

Très élevée 1 ã

Très élevée 1 á

Très élevée 1,47 â

Très élevée 1,97 â

Très élevée 1,41 â

Très élevée 1,75 á

Très élevée 1,91 â

Très élevée 1,54 á

Très élevée 1,71 á

Très élevée 1,42 á

Très élevée 1 ã

Très élevée 1,83 á

1#177;0 Négative 0,42#177;0,08

* * *

1#177;0 Négative 0,46#177;0,01

0,51#177;0 Fortement positive 0,69#177;0,08

1#177;0 Négative 0,56#177;0,06

1#177;0 Négative 0,53#177;0,005

1#177;0 Négative 0,53#177;0,04

1#177;0 Négative 0,53#177;0,05

0,58#177;0,08 Fortement positive 0,57#177;0,02

0,65#177;0,06 Positive 0,73#177;0,18

0,71#177;0,01 Positive 0,61#177;0,01

0,55#177;0 ,02 Fortement positive 0,22#177;0,03

0,56#177;0,09 Fortement positive 0,62#177;0,03

0,9#177;0,15 Positive 0,19#177;0,07

0,89#177;0,14 Positive 0,36#177;0,18

0,6#177;0 Positive 0,6#177;0,14

C. famata

1#177;0 Négative 0,25#177;0,02

0,55#177;0 Fortement positive 0,8#177;1,3

1#177;0 Négative 0,56#177;0,06

1#177;0 Négative 0,18#177;0,01

Très élevée 1,78 á

Faible 1 ,69 á

Très élevée 1,54 á

Très élevée 1,51 â

* * *

Très élevée 1 ã

Très élevée 2 â

C. famata V2 0,76#177;0,09 Positive

M9 1#177;0 Négative

M10 1#177;0 négative

M11 1#177;0 négative

C. tropicalis

* * *

C. tropicalis 06(085) * *

0,64#177;0,09 Positive 0,4#177;0,02

0,54#177;0,04 Fortement positive 0,61#177;0,01

M28 1,64#177;0,01 Positive

M46 0,71#177;0,08 Positive



C. lusitaniae

1#177;0 Négative 0,55#177;0,09

1#177;0 Négative 0,68#177;0,33

0 ,66#177;0,05 Positive 0,51#177;0,11

1#177;0 Négative 0,83#177;0,26

Très élevée 1 ã

Très élevée 2 á

Très élevée 1,44 â

faible 2,18 á

C. lusitaniae CECT 11458 1#177;0 Négative

M1 1#177;0 négative



C. guilliermondii

M14 0,6#177;0,4 Fortement Positive



Saccharomyces cerevisiae

M23 0,8#177;0,01 Positive

â : deux zones d'hémolyse ;á : une seule zone d'hémolyse ; ã : pas de zone d'hémolyse

Résultats

5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM

Les produits des différentes souches testés montrent la présence de 19 activités enzymatiques. En effet, toutes les souches produisent: Estérase (C4), Valine arylamidase, Cystine arylamidase et Naphtol-AS-BI -phosphohydrolase. Les résultats sont résumés dans le tableau VIII ci-dessous.

Tableau VIII. Caractères enzymatiques des différents isolats de levures obtenus sur la galerie Api Zym.

Souches

Caractères étudiés sur les galeries API ZYM

5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 4

15 16 17 18 19 20

1 2 3 4

%

- + + + - - 60 - + + + - - 60 + + + + + + 95 + + + + + + 95 + + + + + + 95 - + + + - - 65 + + + + + - 80 + + + + - - 65 + + + + + + 95 - + + + - - 55 - + + + - - 60 + + + + + + 95 + + + + + + 85 + + + + + + 95 + + + + + - 90

60 100 100 100 60 46,6

+ + + + + + 95

- - - - - - 50

- - - - - - 55

+ + + + + + 95 + + + + + - 90 + + + + + + 95 - + - + + + 85 - + + + - - 50

- - - - - - 45

+ + + + + + 95

+ + + + + + 95

- - - - - - 45

+ + + + + + 95

+ + + + + + 95

57,1 71,4 64,2 71,4 64,2 57,1

% des tests positifs 0 86,6 100

100 93,3 100 100 100 66,6 53,3 100 100 60 60

Candida albicans

M2 - + + +

M5 - + + +

M7 - + + +

M8 - + + +

M16 - + + +

M20 - + + +

M21 - + + +

M24 - + + +

M25 - + + +

M36 - - + +

M42 - + + +

M45 - + + +

M47 - - + +

M56 - + + +

M57 - + + +

Candida krusei

M13 - + + +

M22 - + + +

M30 - + + +

M31 - + + +

M32 - + + +

M39 - + + +

M40 - + + +

M43 - - + -

M44 - + + +

M49 - + + +

M41 - + + +

M17 - + + +

M18 - + + +

M50 - + + +

% des tests positifs 0 92,8 100 100

Candida famata

M9 - - + +

M10 - + + +

M11 - + + +

% des tests positifs 0 66,6 100 100

C. tropicalis

+ + + + - - + + - - + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - - + + + + + - + + + + + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + - - + + - + + + + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

100 100 100 100 78,5 71,4 92,8 100 71,4 64,2

- - - - - - 35

- - - - - - 45

+ + + + + + 95

- + + + - - + + - -

+ + + + - - + + - -

+ + + + + + + + + +



33,3 33,3 33,3 33,3 33,3 33,3



66,6 100 100 100 33,3 33,3 100 100 33,3 33,3

M28 - + + + + + + + - - + + - - - + - + - - 55



% total 0 89,1 100 97,2

91,8 97,2 100 100

13-á-galactosidase, 14-â-galactosidase,

-Phosphatase acide, 12-Naphtol-AS-BI phosphohydrolase,

% des tests positifs 0 100 100 100

Candida lusitaniae

M1 - + + + - - + + - - + + - -

% des tests positifs 0 100 100 100

C. guilliermondii

M14 - + + +

+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
64,8	59,4	97,2	100	59,4	56,7	56,7	83,7	81,1	81,1	59,4	48,6

1-Témoin, 2-Phosphatase alcaline, 3-Estérase ( C4),

arylamidase , 9-Trypsine ,10-á-chymotrypsine, 1 1

15-â-glucuronidase, 16-á-glucosidase,17-â-glucosidase,

4-Estérase Lipase (C8), 5-Lipase (C14), 6-Leucine arylamidase,7-Valine arylamidase, 8-Cystine

18-N-acétyl-â-glycosaminidase, 19-á-mannosidase, 20-á-fucosidase.

100 100 100 100 0 50 100 100 0 0

0 100 50 100 50 0

+ + + +

100 100 100 100

% des tests positifs 0 100 100 100

Saccharomyces cerevisiae

M23 - + + +

% des tests positifs 0 100 100 100

- + + - - - 45

0 100 100 0 0 0

+ + + + + + 95

100 100 100 100 100 100

95

0 0 100 100 0 0 100 100 0 0

+ + + + + + + + + +

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

M46 - + + + + + + + - + + + - - - + + + + - 70

Résultats

IV. Etude qualitative et quantitative de des souches de Candida spp. isolées 1. Etude qualitative de l a formation de biofilm 1.1. Coloration à la safranine

l'adhésion

L'étude qualitative de formation de biofilm testée par la méthode de coloration à la safranine 1% a montré que toutes souches de Candida testées sont phénotypiquement formatrices de biofilm à des degrés variables. En effet, 17,77 % de souches sont faiblement formatrices de biofilm (noté ` +') et 57,77% sont moyennement formatrices de biofilm (noté

`++') et 24,44% sont fortement formatrices de biofilm (noté `+++').

Les souches de Candida fortement formatrices de biofilm montrent un dépôt (culot) très dense



au fond du tube en verre après c

oloration à la safranine 1% (Figure12).

(+++)

(++) (+)

Figure 12. Formation de biofilm par la méthode de coloration à la safranine 1%.souche faiblement formatrice de biofilm (+), souche moyennement formatrice de biofi lm (++) et souche fortement formatrice de biofilm (+++).

1.2. Culture sur milieu au rouge

Congo

Tous les isolats sont non producteurs de biofilm (slime négatif) et donnent des colonies de couleur rouge (n=41) et rose (n=4).



Figure 13. Dégradation de la couleur des souches de Candida cultivées sur des boites

contenant le rouge Congo.

Résultats

2. Etude quantitative de la formation de biofilm 2.1. Test de hydrophobicité

Le test de hydrophobicité est basé sur la mesure de l'adhérence des cellules de Candida au cyclohexane (hydrocarbure) à montrer que l'hydrocarbure testé est capable de s'adhérer aux différentes souches de Candida avec différents degrés et ceci est en fonction de l'espèce .En effet, l'adhérence optimale à été observée pour le cyclohexane 85,83% par la souche C. albicans (M47). Aussi, nous avons remarqué que la souche Saccharomyces cerevisiae (M23) a un pourcentage d'hydrophobicité très élevé 84,16%et 47,5% par le cyclohexane et le xylène respectives .Les différentes souches C. albicans ont une adhérence varient entre 10,11% pour la souche C. albicans (M 2) et 85,83% pour la souche C. albicans

(M47). Dans un autre lieu, les pourcentages d'hydrophobicité pour les souches de C.
Tropicalis varient entre 1,81% pour la souche de référence C. Tropicalis 06(085) et fort 79,09% pour la souche M46.

Le pourcentage de souches qui ont une adhérence au cyclohexane supérieur à 50% est 33,33%.

Aussi, la mesure de l'adhérence au xylène a indique que le xylène est capable de s'adhérer comme le cyclohexane aux différentes souches de Candida avec une variation de pourcentage d'adhérence d'une souche à une autre. Le pourcentage le plus élevé à été trouvé chez la C. albicans (M7), (66,66%) et 59,37% pour C. krusei(M30). L'adhérence au xylène pour les souches de C. albicans varient entre 3,26% pour la souche M57 et 66,66% pour la souche (M7). Pour seule souche S. cerevisiae _(M23) a un pourcentage élevé 47,5%.

Le pourcentage des souches qui ont une adhérence au xylène supérieur à 50% est 12,69%.

2.2. Sur les plaques en polystyrène

L'adhésion et la formation de biofilm par les espèces de Candida à la surface des puits des plaques en polystyrène durant 66h ont été déterminées par la réduction colorimétrique du XTT. La formation du biofilm a montré la présence d'une corrélation entre les valeurs des absorbances à 492 nm et l'intensité colorimétrique du XTT. Notre étude a été réalisée sur 43 souches de Candida. Nous avons essayé d'étudier tout d'abord la variation intra-espèce de la réduction du XTT chez C. albicans, C. krusei, C. tropicalis,

Résultats

C. guilliermondii, C. lusitania

e et C. famata. Par la suite, étudié la variation

cette réduction reflétant la capacité

inter-espèce de

de formation du biofilm par cette levure. (Tableau IX).

Tableau IX. Etude qualitative de la production d'exopolysaccharides par coloration à la

safranine 1% et sur gélose au rouge Congo et test d'adhésion aux solvants organiques (xylène

et cyclohexane).

Production de slime

			Hydrophobicité (%)
Souches testées	Coloration à la Safranine 1%	Rouge Congo Morphotype Interprétation
			Xylène Cyclohexane





Candida albicans

C. albicans ATCC 2091

C. albicans ATCC 90028

C. albicans SC 53 14

M2

M5

M7

M8

M1 6
M20

M2 1

M24

M25
M36

M42

M45

M47

M56

M57

Candida krusei

C. krusei ATCC 6258

C. krusei 05 (054)

M1 3

M22
M30

M3 1
M32

M39

M40

M4 1

M43

M44

M49
M1 7
M1 8

M50

Candida famata

C. famata V2

M9 M1 0 M1 1 Candida tropicalis

C. tropicalis 06(085)

M28

M46

Candida lusitaniae

C. lusitaniae CECT 11458

M1

Candida guilliermondii

M1 4

Saccharomyces cerevisiae

M23

++ Rouge Slime négatif

+++ Rose Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rose Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rose Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rose Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

+ Rouge Slime négatif

++ Rouge Slime négatif

+++ Rouge Slime négatif

33,92 33,03

10 19

15,78 10,52

16,85 10,11

17,27 29,09

66,66 57,77

1,66 15,83

56,66 17,5

16,66 52,22

16,49 46,39

17,79 57,62

14 78

46,66 66,66

48,18 82,72

55 80

62,5 85,83

50 76,66

3,26 29,34

3,50 12,28

22,22 1,11

11,81 41,81

3,27 40,98

59,37 70,62

55 56,66

37 27,55

10 34

24,54 61,81

2 48

11 52

16,66 42,5

7,20 54,05

5 4

2 30

32,20 44,91

10,71 25,89

24,60 41,26

0,8 6,62

14,51 16,93

6,36 1,81

24,19 4,83

56,36 79,09

21,66 24,16

11,25 10

21,84 24,36

47,5 84,16

(+) : souche faiblement formatrice de biofilm ; (++) : souche moyennement formatrice de biofilm; (+++) : souch e fortement formatrice de biofilm.

Résultats

La figure 14 (a) montre que les moyennes des valeurs des densités optiques relatives à l'activité de la déshydrogénase mitochondriale différent entre les 43 souches de Candida testées. En effet, les valeurs des densités optiques varient de 0.063 pour la souche C. albicans SC 5314 à 0,375 pour la souche C. albicans (M21). Nous avons pu remarquer que tous les isolats de C. albicans sont plus formateurs de biofilm sur les polystyrènes que les souches de référence SC 5314 (DO=0,063) et C. albicans ATCC 90028 (DO= 0,262). Pour les souches C. krusei, les valeurs des densités optiques varient de 0,19 pour la souche de référence C. krusei 05(054) à 0,33 pour la souche de C. krusei (M43). Nos résultats ont montré que l'espèce albicans est plus formatrice de biofilm sur le polystyrène (DO= 0,375) que l'espèce de C. krusei (DO=0.289). Aussi les espèces C. tropicalis s'avèrent fortement formatrice de biofilm sur ce même matériaux puisque pour la souche de référence C. tropicalis 06(0,85) a une DO=0,306 et pour la souche C. tropicalis _M28 la DO est 0,243, et il en est en même pour la souche C. famata V2 (DO= 0,243).

Pour le Cristal violet 1%, la figure 14 (b) montre que les moyennes des valeurs des densités optiques différentes entre les 43 souches de Candida testées. En effet, les valeurs des densités optiques varient de 0.107 pour la souche C. albicans (M7) à 0,331 pour la souche C. albicans (M57). Pour les souches de C. krusei, les valeurs des densités optiques varient de 0,100 pour la souche de référence C. krusei 05(054) à 0,234 pour la souche de C. krusei (M44).

41

Résultats



(a)

(c)

Figure 14. Distribution des valeurs de l'absorbance de XTT (a) à 492 nm et du cristal violet à 595 nm en fonction des différentes espèces de
Candida isolées de la station de traitement des lixiviats de Djebel-Chakir.



DISCUSSION

42

Discussion

Dans cette étude, 37 souches de levures ont été isolées de la station de traitement des déchets de Djebel Chakir, avec dominance des deux espèces C. albicans (15/37) et C. krusei (14/37).

Six espèces de Candida spp. ont été isolées qui sont C. albicans, C. lusitaniae, C. famata, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. krusei ainsi que la souche Saccharomyces cerevisiae.

L'étude morphologique des Candida spp. a porté sur l'aspect et la forme des colonies sur milieu solide sélectif. L'examen macroscopique des souches cultivées sur ce milieu et à une température de 37°C a montré qu'il s'agit de colonies crémeuses ayant une odeur de levures. La capacité des espèces de Candida à se développer à 37°C est une caractéristique importante à considérer dans l'identification des espèces cliniques sachant que la plupart, des espèces pathogènes se développent aisément à 25°C et à 37°C (McCullough et al., 1996).

L'observation microscopique des cellules de Candida spp. a montré qu'elles sont semblables. Les blastopores peuvent changer de l'aspect ovoïde à allongé et même sphérique (Odds, 1988). Notre étude nous a permis de vérifier que macroscopiquement, C. albicans apparait une espèce caractérisée par la forme de levure (blastopores ovoïdes) et les souches de C. krusei sont de forme allongée ou en grain de riz.

Les activités hydrolytiques incluant la phospholipase, la protéase et l'estérase jouent un rôle important dans la pathogénie des champignons. La sécrétion de ces enzymes à été discutée dans la littérature (da Costa et al., 2009, Noumi et al., 2009). Les enzymes hydraulitiques peuvent entrainer la destruction de la membrane cellulaire et son aussi impliquée dans la pathogénicité des levures de genre Candida.

La sécrétion des phospholipases extracellulaires par les espèces de Candida a été reportée pour la première fois par Costa et ses collaborateurs (1968) suite à la croissance de cette levure sur milieu solide à base de jaune d'oeuf. Nos résultats ont prouvé que 31,11% des souches de Candida ont une activité phospholipase négative et que 44,44% des souches C. albicans sont phospholipase positive, contrairement à l'étude de Farina et ses collaborateurs en 2009 qui ont montré que 99,4% des souches de C. albicans sont productrices de cette enzyme. D'autre étude ont montré que d'autre espèces de Candida telles que les C. tropicalis, C. famata, et C. guilliermondii secrètent aussi de la phospholipase (Noumi et al., 2011).

43

Discussion

En ce qui concerne l'activité protéolique, Naglik et ses collaborateurs (2003) ont prouvé que les Aspartyl protéases sécrétées par les Candida jouent un rôle important dans la virulence de cet organisme. Les rôles attribués à cette enzyme lors de l'infection par C. albicans pourraient aller de la simple absorption des substances nutritives jusqu'à la digestion des immunoglobulines de l'hôte afin de résister au système immunitaire. Nous avons aussi montré que 86,04% des souches de Candida testées sont productrices de la protéase et que cette production est répartie au niveau des six espèces de Candida étudiés (C. albicans, C. lusitaniae, C. famata, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. krusei).

L'étude expérimentale a révélé que 46,51% des isolats de Candida testés ont une activité estérase négative. Les souches de Candida qui ont une activité estérase positive ont un pourcentage de 27,90% parmi elles: C. albicans 33,33% et C. krusei 35,71%. Mudaliar et ses collaborateurs en 2005, la majorité des espèces sont non productrice de l'estérase sur 149 souches de Candida isolées de différents patients malades à montré que 92.3% de C. albicans ne secrète pas l'estérase, C. tropicalis (92.3%), C. parapsilosis (25%), C. dubliniensis (16.6%), C. inconspicua (100 %), et C. lipolytica (100%) non sécrétrices de l'estérase.

Le pouvoir hémolytique des souches de C. albicans à été rapporté pour la première fois par Manns et ses collaborateurs (1994). L'étude de Gang et ses collaborateurs (2001) a démontré qualitativement et quantitativement l'activité hémolytique chez différentes espèces de Candida. Nos résultats ont montré que la majorité des souches testées ont la possibilité de dégrader l'hémoglobine (source de fer par production de deux différents types d'hémolysines responsable de la lyse des érythrocytes). En effet, les souches hémolytiques de Candida ont montré les trois types d'hémolyse. Cependant, l'activité beta hémolytique (hémolyse complète) a été uniquement observée après 48 h d'incubation précédée d'une activité alpha hémolytique (hémolyse incomplète) durant les premières 24 h d'incubation.

L'analyse quantitative des données a montré que l'activité beta hémolytique de C. albicans est plus importante que celle des autres espèces testées. Aussi cette variation a été observée au sein d'une même espèce. En effet, les deux types d'hémolyse (bêta et alpha) ont été observés chez les souches de C. albicans et C. krusei. Ces résultats ont été prouvés en 1999 par Watanabe et ses collaborateurs. Ces observations suggèrent que alpha et beta hémolyse peuvent résulter de deux ou plusieurs différents facteurs hémolytiques produits par

ce type de levures.

44

Discussion

L'adhésion des isolats de Candida à différentes surfaces à été testée qualitativement et quantitativement. La production de Biofilm testée par méthode de coloration à la safranine 1% a montré que toutes les souches de Candida testées sont phénotypiquement formatrices de biofilm avec des degrés variables en fonction de l'intensité du biofilm. En effet, 17,77 % de souches sont faiblement formatrices de biofilm (noté `+') et 57,77% sont moyennement formatrices de biofilm (noté `++') et 24,44 % sont fortement formatrices de biofilm (noté `+++'). Cerickcioglu et ses collaborateurs (2004) suggèrent l'utilisation de cette technique puisqu'elle est simple et efficace pour la détermination des propriétés adhésives de souches de Candida.

La production d'exo-polysaccharides sur milieu au rouge Congo a montré que les souches testées donnent deux morphotypes (rouge et rose) qui sont interprétés comme étant des souches slime négatif. En 2010, Dag et ses collaborateurs ont montré la présence de différents morphotypes : rouge foncé (noté slime positif), rose à centre noir (noté souche faiblement productrice de slime) et rose pale et blanc (noté souche slime négatif). De plus, Gökce et ses collaborateurs (2007) ont étudié la production de biofilm chez 99 souches de C. albicans isolées d'hémoculture en utilisant la méthode en tube et les méthodes spectrophotométriques. Les résultats obtenus montrent une corrélation positive entre les différentes techniques testées.

Il est connu que le rouge Congo interagit avec plusieurs polysaccharides avec une forte affinité pour la chitine et le glucane (Roncero et Duran, 1985). Ceci étant, l'interaction entre ces molécules et le rouge Congo limitent son utilisation pour évaluer qualitativement la formation de biofilm par les souches de Candida. Ainsi et compte tenu de ces remarques, nous ne recommandons pas l'utilisation de ce test (CRA) pour le screening des souches de Candida formatrices de biofilm sur ce milieu. Cette position est aussi prise par Dag en 2010 et Noumi et ses collaborateurs (2011). En effet, ces auteurs ont montré que le test sur rouge Congo a une faible sensibilité avec un pourcentage élevé de faux positifs.

Au cours de notre travail, nous avons étudié l'hydrophobicité des 43 souches de Candida au cyclohexane et au xylène .Nous avons montré que les hydrocarbures testés sont capable de s'adhérer aux différentes souches de Candida avec différentes degrés .Pour le cyclohexane l'adhérence optimale est pour la souche C. albicans _(M47) 85,83% et pour le xylène l'adhérence optimale est pour la souche C. albicans M7 (66,66%) et 59,37% pour C. krusei. En 2010, Raut et ses collaborateurs ont étudié l'hydrophobicité de 50 souches

45

Discussion

cliniques de Candida en corrélation avec la formation de biofilm sur le polystérene .Ils ont trouvé que l'hydrophobicité de la surface des cellules de Candida varie de 2 à 41 %. Ils ont aussi noté qu'il n'y a pas de corrélation entre l'hydrophobicité des cellules de cette levure et leur adhésion au polystyrène.

Les isolats de Candida ont été testés pour leur capacité à former un biofilm à la surface des puits des plaques en polystyrène par mesure de la viabilité cellulaire suite à la réduction du XTT par la déshydrogénase mitochondriale des cellules de Candida métaboliquement actives. Le changement colorimétrique durant la phase de formation de biofilm reflète le nombre des cellules vivantes et peut être quantifié par un lecteur ELISA (Kuhn et al., 2002).

Notre étude nous a permis de remarquer que C. albicans est l'espèce la plus productrice du biofilm suivi par C. krusei. En effet, certaines études ont démontré que le métabolisme du XTT par les cellules adhérentes de Candida peut varier d'une espèce à une autre et que ce métabolisme est plus élevé chez C. albicans que chez les autres espèces vu qu'elle est l'espèce la plus adhérente.

Dans la dernière partie nous avons étudié l'activité antifongique de l'amphotéricine B contre des isolats de Candida. Dans le même domaine, les études de kunkel en 2011 sur 51 souches de C. albicans qui ont été isolées des différents services de l'hôpital à partir des cathéters et des sondes après leur ablation a montré que les cellules de C. albicans sont très résistantes ,cette résistance augmente au cours phases de la formation des biofilms jusqu'à ce qu'elle atteigne son seuil à la phase de maturation (après 48 h) par dosage colorimétrique après coloration au cristal violet.

Il en sort de ce travail que toutes les espèces de Candida isolées des différentes phases de traitement des lixiviats de Djebel-Chakir sont dotées de plusieurs propriétés virulentes: (i) sécrétion de plusieurs enzymes hydrolytiques (phospholipases, estérase, aspartylprotéases), (ii) dégradation des globules rouges, et (iii) formation de biofilm. De telles levures déversées directement dans le milieu récepteur (Oued El Attar) peuvent être une source de danger

potentiel pour l'être humain.



CONCLUSION

GENERALE

Conclusion générale

Les Candida sont des levures ubiquitaires fréquemment isolées de l'environnement (air, fruit, viande, produit laitiers....). Chez l'homme, elles peuvent coloniser de nombreux sites, vivre à l'état commensal à l'intérieur du tube digestif, des voies génito-urinaires, des voies aériennes supérieurs ou au niveau du revêtement cutané. Ce sont des levures opportunistes qui peuvent à la faveur d'une altération des barrières locales, d'un déséquilibre de la flore endogène ou d'un déficit immunitaire, se comporter en pathogènes et envahir un certains nombre de tissus.

Actuellement les données épidémiologiques montrent que les souches de Candida spp. occupent la quatrième place parmi les micro-organismes pathogènes les plus fréquemment isolés. L'épidémiologie des Candida s'est considérablement modifiée ces dernières années avec l'apparition des nouvelles espèces (C. dubliniensis). En effet, le genre Candida représente les champignons les plus isolés chez l'homme, les espèces C. albicans et C. glabrata constituent les espèces les plus fréquentes.

La première partie concerne l'étude de la caractéristique biochimique des espèces de Candida. Ces levures ont une forme ovalaire qui est plus remarquable chez C. albicans. Cette forme est allongée chez des autres espèces comme C. krusei. Aussi, les souches des Candida ne sont pas toutes résistantes à l'acide borique. L'utilisation des galeries Api Candida comme système d'identification des espèces de Candida a montré la présence de sept espèces C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. famata et C. tropicalis et l'identification de deux genres qui sont Candida et Saccharomyces.

La deuxième partie de cette étude a été focalisée sur l'étude des facteurs de virulences ou pathogénicité des Candida spp.

La sécrétion d'enzymes est indispensable à la dégradation des tissus parasités. Les phosolipases favorisant la dissémination de l'infection, étaient déterminées chez la plupart des souches ; la production de ces enzymes est plus importante chez les souches isolées à partir de certains échantillons. Les protéases sont certainement les enzymes des Candida Spp les mieux étudiées. Les résultats obtenus confirment la forte activité protéolytique des souches testées. Les estérases sont des enzymes secrétées par les souches de Candida. La sécrétion de cette enzyme n'est pas observée chez toutes les souches de Candida.

Conclusion générale

L'activité hémolytique est également déterminée chez toutes les souches de Candida. Une activité ß-hémolytique est développée après une lyse totale des érythrocytes du sang du

mouton. Ainsi, il est intéressant de souligner l'importance de l'élément fer dans le
métabolisme des Candida. L'étude des caractères enzymatiques aux galeries Api Zym a permis de détecter 19 enzymes chez les différentes souches de Candida testées. La présence des enzymes varie d'une souche à une autre .Les enzymes les plus détectées sont l'Estérase (C4), la Valine arylamidase, la Cystine arylamidase et le Naphtol-AS-BI phosphohydrolase chez toutes les espèces testées.

La troisième partie concerne l'étude qualitative et quantitative de la formation de

biofilm

L'étude qualitative de la formation de biofilm faite par la coloration à la safranine montre que la majorité des isolats sont moyennement formatrice de biofilm et pour la culture sur milieu au rouge Congo la totalité des souches n'est pas productrice de biofilm.

L'étude quantitative de la formation de biofilm par le test de hydrophobicité indique que le cyclohexane et l'xylène peuvent s'adhérer aux différentes souches de Candida avec des degrés différents. Aussi, concernant l'adhésion et l'implication des isolats de Candida dans la formation de biofilm sur les plaques ELISA, notre étude a bien confirmé que ce facteur

(l'adhésion) est variable selon les espèces.



RÉFÉRENCES

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Résumé

Dans la présente étude, nous nous sommes intéressés à la caractérisation biochimique et à l'étude des propriétés adhésives des souches de Candida spp de la station de traitement des lixiviats de djebel Chakir. La résistance aux agents antifongiques, la production des enzymes et la production de biofilm (qualitativement et quantitativement) de 43 souches de Candida isolées sont étudiées. Les isolats étudiés ont été identifiés sur milieu chromogénique « CHROMagar^TM Candida » et par des galeries Api Candida. Les résultats obtenus ont montré que ces isolats produisent plusieurs enzymes et la majorité des souches est hémolytique. Les souches étudiées sont capables de former un biofilm sur les plaques de polystyrène.

Mots clé : CHROMagar^TM Candida, galeries Api Candida, enzymes, agents antifongiques, biofilm.

Summary

In this work, we study the biochemical and adhesive properties of Candida spp. strains isolated from leachate (Djebel Chakir). The susceptibility to Amphotericin B and boric acid, the production of hydrolytic enzymes and the production of biofilm by the 43 strains of

Candida were tested. All strains were recovered on « CHROMagar^TM Candida » and identified using Api Candida strips. The results obtained showed that the majority of the isolates produced several enzymes and are hemolytic. Most of the studied strains are able to form a biofilm on polystyrene plates.

Keywords: CHROMagar^TM Candida, Api Candida strips, enzymes, biofilm, antifungal agents.

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