Memoire Online - Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

Institut National Agronomique Ecole Nationale Supérieure des Industries Unité mixte de recherches (UMR) 206

Paris Grignon (INA P-G) Agricoles et alimentaires (ENSIA) Chimie Biologique INRA / INA P-G

- mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à l'activation allostérique

Site de Grignon : BP 1 - 78850 THIVERVAL-GRIGNON Tél. +33 (0)1 30 81 53 53 - Télécopie +33 (0)1 30 81 53 27

-Mme Catherine LAPIERRE (Professeur en Biochimie à l'INA P-G et directrice de l'UCB 206), pour m'avoir accueilli dans son unité.

-Mr Pierre BRIOZZO pour sa disponibilité au long de la réalisation de ce travail.

- Mrs Ramdane HADDOUCHE, Abdelaziz BENDOU et Ramdane KHATI (Ingénieurs d'état en

A la faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques, Département Biochimie- Microbiologie, Université Mouloud MAMMERI de Tizi-Ouzou (Algérie).

Présentation de la structure d'accueil

Ce stage, effectué dans le cadre du Master 2 Nutrition Santé, s'est déroulé à l'UMR 206

Chimie Biologique (UCB), INRA / INA-PG, Centre de Recherches Versailles-Grignon.

(1)-Étude des lignines naturelles et industrielles, de la structure à la valorisation : dirigée par Pr

(2)-Étude des lipides de réserve végétaux organisés en corps lipidiques, oléosomes et oléosines : dirigée par Dr Thierry CHARDOT.

(3)- Étude des allergènes des céréales : dirigée par Dr Michel LAURIERE (CR, INRA).

(4)- Étude cristallographique des protéines : dirigée par Dr Pierre BRIOZZO.

Mon sujet a été réalisé au sein de l'équipe « cristallographie des protéines », il a porté sur la biologie structurale d'enzymes bactérienne (UMPKeco) et végétale (CKOm). Son but est de déterminer leur structure 3D à résolution atomique afin mieux comprendre leur fonctionnement et envisager par la suite des modifications pour des besoins de santé humaine et agronomiques.

Abréviations

ADN : acide désoxyribonucléique AMP : adénosine monophosphate ATB : antibiotique

NDP : nucléoside diphosphate NMP : nucléoside monophosphate NTP : nucléoside triphosphate

Liste des Encadrés / Figures / Tableaux

Encadrés-----------------------------------------------------------------------------

Encadré 1 : Vérification de la concentration protéique par absorption dans l'UV........................... ²⁹

Encadré 2 : Concentration de la protéine............................................................................ ²⁹

Figures-------------------------------------------------------------------------------

^{Figure 1 : Nombre de structures 3D résolues par
cristallographie, déposées et accessibles dans la PDB...}8

^{Figure 2 : Evolution de la cristallographie des
protéines...........................................................}10

^{Figure 3 : De la protéine à sa structure
3D...........................................................................}11

^{Figure 4 : Les NMPK et la phosphorylation des
NMP.............................................................}13

^{Figure 5: Les trois domaines des
NMPK..................................................................................}15

^{Figure 6 : Régulation de l'activité de
l'UMPKeco...................................................................}16

^{Figure 7 : Repliement global de l'UMPKeco : le
monomère......................................................}18

^{Figure 8 : Repliement global de l'UMPKeco :
l'hexamère fonctionnel..........................................}18

^{Figure 9 : Formules de quelques cytokinines et d'un
inhibiteur ...................................................}20

^{Figure 10 : Dégradation des cytokinines par la
CKOm.............................................................}20

^{Figures 11 a) et b) : Structure 3D et sites de
mutagenèse de la CKOm..........................................}22

^{Figure 12 : La
cristallisation..................................................................................................}24

^{Figure 13 : Mosaïcité d'un
cristal.....................................................................................}24

^{Figure 14 : Diagramme de phase
bidimensionnel...................................................................}25

^{Figure 15 : Technique de la goutte
assise............................................................................}25

^{Figure 16 : Photos du robot de Cristallisation et de la
boite Linbro............................................}30

^{Figure 17 a): Méthode de cristallisation en goutte
suspendue.....................................................}33

^{Figure 17 b) : Montage des cristaux sur des boucles en
nylon....................................................}33

^{Figure 17 c) : Collecte des données de
diffraction..................................................................}33

^{Figure 18 : Suivi de la pureté de l'UMPKeco D159N
D93A par SDS-PAGE.....................................}35

^{Figure 19 : Cristaux de l'UMPKeco D159N
D93A................................................................}36

^{Figure 20 : Cristaux de la
CKOm.....................................................................................}39

^{Tableaux-----------------------------------------------------------------------------}

^{Tableau 1 : Structures 3D résolues par les
différentes techniques analytiques déposées dans la
PDB......}8

^{Tableau 2 : Résumé de la variabilité
des conditions de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A.......}35

^{Tableau 3 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A : Conditions
d'obtention et dimensions.................}35

^{Tableau 4 : Résumé de la variabilité
des conditions de cristallisation de la CKOm...........................}38

^{Tableau 5 : Cristaux de la CKOm : Conditions d'obtention et
dimensions.....................................}38

^{Tableau 6 : Enregistrement des données de
diffraction............................................................}39

^{Tableau 7 : Résultats du traitement des
données....................................................................}40

Sommaire

^{A- Introduction
....................................................................................................}7

^{I)-L'uridine monophosphate kinase d'Escherichia coli
(UMPKeco).................................................}12

^{A- Les
NMPK...........................................................................................................}12

^{1- Définition et Rôles
biologiques..............................................................................}12

^{2-Structures
3D.....................................................................................................}14

^{B-L'UMPKeco
..........................................................................................................}14

^{1-Une NMPK atypique
...........................................................................................}13

^{2-Structures 3D et propriétés
catalytiques.....................................................................}13

^{3-Rôles
............................................................................................................}17

^{4- Contexte et objectifs du
stage.................................................................................}17

^{II)-La Cytokinine oxydase de
maïs........................................................................................}19

^{A-Les
cytokinines.........................................................................................................}19

^{1. Nature chimique
..............................................................................................}19

^{2. Lieu de
synthèse................................................................................................}19

^{3.
Rôles............................................................................................................}19

^{B-La
CKOm...............................................................................................................}21

^{1. Propriétés et Structure
3D...................................................................................}21

^{2. Objectifs du stage
.............................................................................................}21

^{III)-La cristallogénèse des
protéines
.........................................................................................}23

^{A-Aspects
généraux......................................................................................................}23

^{1. Le
cristal............................................................................................................}23

^{2. Principes de la
cristallogenèse.................................................................................}23

^{3. Etapes de la
cristallisation.......................................................................................}25

^{B-Méthodes de
cristallisation..........................................................................................}27

^{B-Matériel et méthodes
..........................................................................................}28

^{1. Clonage, surexpression et
purification..........................................................................}28

^{2.
Cristallisation......................................................................................................}28

^{3. Etapes
ultérieures................................................................................................}31

^{C-Résultats et
discussion.......................................................................................}34

^{A)-Mutant D93A non régulé par le GTP de
l'UMPKeco ..............................................................}34

^{B)-CKOm native et mutant
D169E.......................................................................................}37

^{D-
Projets.........................................................................................................}41

^{Références
bibliographiques................................................................................................}42

^{Annexes........................................................................................................................}44

^{Résumé........................................................................................................................}46

A- Introduction

La génomique décrypte des séquences protéiques en quantité exponentielle (plus de 2 600 000 séquences connues actuellement : ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/, 05 Mai 2006). Mais ces séquences ne renseignent pas plus sur la biologie des systèmes considérés qu'un annuaire téléphonique

de Paris sur l'organisation et les merveilles de cette ville. En effet, les fonctions biologiques des protéines dépendent étroitement de leur structure tridimensionnelle (3D). Celle-ci ne peut être prédite correctement d'après la séquence et doit être résolue expérimentalement, avec trois méthodes possibles : la microscopie électronique, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la cristallographie. La microscopie électronique a une faible résolution : de l'ordre de 20 ? ; la RMN est surtout efficace pour des molécules d'une masse moléculaire (MM) inférieure à 30 kDa. La cristallographie est la seule méthode qui permette la détermination de la structure 3D à résolution atomique : de 1 à 2 ?, et l'étude des macromolécules sans limitation de la MM.

La cristallographie constitue une méthode fondamentale, en biologie structurale, pour l'étude et l'analyse des structures 3D des acides nucléiques et complexes : protéine-acides nucléiques, protéine- protéine et protéine-ligand, dans leur conformation active (Duée et Dideberg, 1997 ; Deleu et al,

1998). Cette technique permet d'obtenir une description 3D détaillée des molécules, et elle apporte des informations concernant les interactions protéine-ligand. Elle réclame un équipement lourd et très onéreux : environ 300 000 € pour le seul ensemble générateur de rayons X / détecteur. Son principal inconvénient est la nécessité d'obtenir des cristaux de la protéine étudiée.

Ses premiers succès datent des années 60 avec la résolution de la structure 3D d'une protéine monomérique (myoglobine, J.C. Kendrew, 1960), d'une protéine oligomérique (hémoglobine, M.F. Perutz, 1962) et d'une enzyme (lysozyme, D.C. Philips, 1965). Les changements fondamentaux intervenus dans les techniques propres à la cristallographie et à la biologie (séquençage des génomes, biologie moléculaire, purification de protéines étiquetées, sources intense de rayons X avec les synchrotrons, détecteurs, informatique...) ont entraîné une véritable explosion de la cristallographie

des protéines. Le nombre de structures résolues ne cesse d'augmenter : 30000 structures protéiques

(soit 86% du total des structures résolues) sont disponibles en mai 2006 dans la Protein Data Bank¹contre 11000 en 2000 (Figure 1 & Tableau 1). Mais ce chiffre ne correspond en fait qu'à 1,3 % des 2 millions de séquences protéiques connues (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/).

Cet aspect quantitatif est doublé d'un aspect qualitatif : des structures des protéines de plus en plus complexes et importantes sont résolues : virus, ribosome 70S bactérien (52 protéines, 3 ARN, au total 2500 kDa)...(Figure 2). Même un nombre non négligeable de protéines membranaires, malgré

Figure 1 : Nombre de structures 3D résolues par cristallographie, déposées et accessibles dans la PDB.

En bleu : le nombre de structures déposées dans l'année, en rose : le nombre total de structure.

Tableau 1 : Structures 3D résolues par les différentes techniques analytiques déposées

Type de Molécule

Protéines

Acides

Nucléiques

(AN)

Complexes

Protéine/AN

Autres

Total

Méthode

Exp.

Rayons X

28835

899

1349

31111

RMN

4568

699

121

5394

Microscopie

Electronique

125

Autres

Total

33564

1611

1501

36710

Etant pluridisciplinaire, la cristallographie est une méthode qui nécessite de bonnes

Cette méthode comporte une étape limitante : la cristallisation, obtention de cristaux stables à partir des macromolécules pures en solution, de taille suffisante (environ 0,1 mm) et qui diffractent suffisamment les rayons X. La connaissance de la physico-chimie des macromolécules n'est pas suffisante pour établir une méthode rationnelle de cristallogenèse, qui reste pour une grande part très empirique. Cette étape délicate et assez longue ne réussit que pour, environ, un quart des cas. La résolution de la structure 3D est longue, elle peut prendre plus d'une année. En revanche, dans les cas faciles et avec les technologies actuelles, les résultats peuvent être obtenus en quelques mois (Figure

Les données déduites de l'étude structurale, par cristallographie, des macromolécules en général et des protéines en particulier ont un fort impact sur l'élaboration des concepts fondamentaux

Elles permettent aussi de comprendre le mécanisme d'action des médicaments [antibiotiques, anti-viraux, anti-cancéreux, antihypertenseurs ...] et des produits phytosanitaires, et d'en concevoir de nouveaux (« drug design »). Dans ce même contexte, les principales caractéristiques des enzymes qui intéressent les industries agro-alimentaires (spécificité et thermosensibilité) sont comprises et on peut ainsi les modifier et/ou les optimiser selon les exigences de l'industrie en question (recherche appliquée).

¹La Protein Data Bank / PDB (Brookhaven, Etats-Unis) : est la banque de données créée en 1977 pour archiver les structures 3D des macromolécules, obtenues par diffraction X ou RMN...

Les premières protéines étudiées par cristallographie étaient classiques : des molécules compactes et globulaires qui cristallisent facilement (lysozymes, A). Par le suite, de nouvelles protéines de plus grande taille et plus délicats à cristalliser (comme celles faisant l'objet de notre stage) voient leur structure 3D résolue : Cytokinine oxydase du maïs, B ; Uridile monophosphate kinase d'E. coli, C. Récemment, les structures de très grosses molécules ont été résolues : sous unité 50 S du ribosome bactérien, D :

Les étapes de détermination de la structure 3D d'une protéine par cristallographie

Taches de diffraction (de Braggs) des rayons X : direction hkl/amplitude et phase

Comprendre : Fonction / Spécificité / Interactions dynamiques entre molécules / Régulation /

Ingénierie des protéines (mutagenèse dirigée, drug design...) / évolution moléculaire (relations

Figure 3 : De la protéine à sa structure 3D. Toute étude structurale des protéines par

cristallographie débute par sa purification, se poursuit par la préparation de cristaux, enregistrement des données de diffraction des rayons X et l'exploitation des clichés pour obtenir la structure 3D. Malgré les progrès considérables réalisés aux différents niveaux de la cristallographie, l'écueil principal reste la cristallogenèse.

I)-L'uridine monophosphate kinase d'Escherichia coli (UMPKeco)

Les nucléotides sont essentiels à tout processus vivant. Les enzymes responsables de leur

synthèse constituent depuis plusieurs années la cible de médicaments antiviraux, antibactériens et antiparasitaires. Parmi ces enzymes figurent les nucléosides monophosphate kinases (NMPK).

1-Définition et Rôles biologiques : Les NMPK sont ubiquitaires, elles représentent une famille de protéines globulaires relativement homologues du point de vue structural et catalytique (Yan & Tsai,

1999). Ces enzymes catalysent la phosphorylation réversible d'un nucléoside monophosphate (NMP)

en un nucléoside diphosphate (NDP) en présence de Mg²⁺, le phosphate transféré provient d'un nucléoside triphosphate (NTP)(Noda, 1973), [réaction ci-dessous]. Le principal donneur de phosphate

est l'ATP, mais ce n'est pas le seul possible : la spécificité des NMPK vis-à-vis des donneurs de

Cette étape métabolique est critique dans la synthèse des NTP. Ces derniers jouent plusieurs

ils sont les précurseurs dans la synthèse des acides nucléiques et des phospholipides ;

ils jouent un rôle dans le cycle : polymérisation / dépolymérisation des microtubules ;

L'échange du phosphate est facilité par les chaînes très conservées d'arginine ; les NMPK suivent une cinétique du type bi-bi aléatoire : ceci implique l'existence de trois formes : libre (sans substrats), semi fermée (avec le NTP ou le NMP) et fermée (avec le NTP et le NMP). Le 1^ersubstrat

Les NMPK sont au nombre de 4 chez les eucaryotes (AMP, GMP, TMP et UMP/CMP kinases) et de 5

chez les procaryotes (AMP, GMP, TMP, UMP et CMP kinases) (Dreusicke et al, 1988 ; Zhou et al,

1998) (Figure 4). Chez les eucaryotes l'UMP/CMP kinase phosphoryle avec la même efficacité l'UMP et la CMP, par contre les chez bactéries se sont deux enzymes distinctes qui assurent cette fonction. Ces CMP et UMP kinases bactériennes ont une spécificité et une structure différentes de celles de leurs homologues eucaryotes. Cela en fait des cibles attractives pour la recherche et la

La production de NTP dans la cellule à partir des NMP passe par deux étapes : (1) phosphorylation

des NMP en NDP par des NMPK spécifiques ; (2) transformation des NDP en NTP par la NDPK non spécifique de chaque base azotée.

2-Structure 3D : Les NMPK partagent la même structure 3D globale comprenant trois domaines : le

domaine CORE, le domaine LID et le domaine NMPbind (Figure 5). Le domaine CORE, rigide et très conservé, comporte un feuillet â à cinq brins parallèles, des hélices á (généralement au nombre de 8 ou

9) et une P-loop. Le domaine LID (flexible) joue le rôle de « couvercle » en venant recouvrir le site donneur de phosphate, permettant l'échange du phosphate ã à l'abri des molécules d'eau. Le domaine flexible NMPbind lie l'accepteur de phosphate. (Yan & Tsai, 1999).

B-L'UMPKeco : modèle intéressant de la régulation enzymatique et cible potentielle de

1-Une NMPK atypique : Avec un point isoélectrique (pI) de 7,24 et une MM de 156 kDa (28,5kDa / sous unité), l'UMPKeco représente environ 0,05 % des protéines totales d'E. coli. Elle est codée par le gène pyrH découvert en 1992, ce gène très conservé est propre aux bactéries est sans homologue chez

les eucaryotes (Serina et al, 1995). L'UMPKeco ne présente aucune similarité significative de séquence ou de repliement avec les autres NMPK. Elle ressemble d'avantage aux aspartokinases (30 % d'identité de séquence), et à un degré moindre (moins de 20% d'identité) à la N-acétyl glutamate kinase (NAGK) et la carbamate kinase (Bucurenci et al, 1996). Elle est présente dans le cytoplasme et près de la membrane bactérienne.

2-Structure 3D et propriétés catalytiques : A la différence des NMPK classiques, généralement monomériques [sauf la TK qui est homodimérique : Haouz et al, 2003], l'UMPKeco est hexamérique

(Serina et al, 1995). La régulation de son activité et assez complexe (Figure 6) : (1) l'UTP est un inhibiteur, cette inhibition est levée par des concentrations élevées de Mg²⁺(2) le GTP agit comme

un activateur allostérique, il se fixe sur un site allostérique distinct du site actif, indépendamment de

Une propriété de l'UMPKeco, qui a empêché pendant plusieurs années la détermination de ses structures cristallographiques, est sa très basse solubilité : < 0,1 mg de protéines/ml (Bucurenci et al,

- Longues : AMPK des bactéries, plantes et mitochondries : grand LID avec insert

Toutes les NMPK ont un repliement de base similaire, organisé en trois domaines. Un domaine

principal et central CORE qui est rigide et qui contient la P-loop. Un domaine LID et un domaine

Figure 6 : L'UMPKeco / impliquée dans la synthèse de novo des nucléotides pyrimidiques

3-Rôles : L'UMPKeco est essentielle à la croissance bactérienne, elle est indispensable à la synthèse

des nucléotides pyrimidiques en catalysant la transformation spécifique de l'UMP en UDP. Les CMP

et UMPK bactériennes n'ont pas d'équivalents chez l'homme, des inhibiteurs pourraient être conçus pour inhiber ces enzymes et bloquer ainsi la croissance bactérienne, sans pour autant entraîner des effets secondaires chez le malade. Cependant, des E. coli sans activité CMPK restent viables (Fricke et

al, 1995). Ceci s'explique par le fait que ces bactéries peuvent produire le CTP à partir de l'UTP grâce

à la CTP synthétase. Au contraire, l'UMPK est essentielle à la croissance bactérienne et constitue de

ce fait une cible privilégiée pour la recherche et la conception (« drug design ») de nouveaux antibiotiques (ATB) (Kholti et al, 1998 ; Fassy et al, 2004).

En plus de son rôle dans la conversion de l'UMP en UDP, l'UMPKeco participe à la régulation

de la transcription et joue très probablement un rôle dans la division des cellules bactériennes (Londais

4-Contexte et objectifs du stage : Avant 2005, il n'existait aucune structure 3D de l'UMPKeco (faible solubilité / cristallogenèse impossible). Après la découverte par A.-M. Gilles et al du mutant ponctuel soluble qui a les mêmes caractéristiques catalytiques que l'enzyme sauvage : mutant D159N.

P. Briozzo et al ont résolu sa structure 3D sous différentes formes : avec l'UTP / inhibiteur, l'UMP / substrat naturel et l'UDP / produit (Figures 7 & 8). Le caractère hexamèrique et le repliement de son monomère distinguent l'UMP kinase d'E. coli des autres NMPK. La structure avec l'UTP montre de

manière surprenante que ce nucléotide se fixe sur le même site accepteur de phosphate que l'UMP et l'UDP (c'est la première fois qu'un NTP est retrouvé sur ce site). Cela suggère fortement que l'UTP

est un inhibiteur compétitif, et pas allostérique comme il a été décrit par les auteurs travaillant sur les NMPK. En conséquence, seule la structure avec GTP permet de visualiser et de décrire le site allostérique. La structure de l'UMPKeco avec le GTP est connue depuis 2005 (article en préparation), mais elle n'explique pas clairement le phénomène d'allostérie. Nos collaborateurs de l'Institut Pasteur

ont constaté que le mutant D93A n'est plus régulé allostériquement par le GTP (D93 est impliqué dans

les interactions de maintien de l'hexamère). Résoudre sa structure 3D pourrait nous permettre de mieux comprendre le phénomène de régulation allostérique.

Figure 7 : Repliement de l'UMP kinase d'E. coli : le monomère avec l'UMP (Briozzo et al, 2005)

Figure 8 : Repliement de l'UMP kinase d'E. coli : l'hexamère fonctionnel avec l'UMP (Briozzo et al, 2005)

II)-La cytokinine oxydase de maïs (CKOm)

Le développement de plantes est régulé par des interactions entre l'environnement et les

facteurs endogènes, particulièrement les hormones. Les phytohormones représentent l'un des éléments essentiels de la régulation de la croissance et du développement des plantes [impliquées à tous les stades depuis la pollinisation jusqu'au contrôle de la floraison, de la fructification et de la sénescence].

Les effets qu'elles provoquent sont souvent pléïotropes et résultent d'interactions complexes qui rendent leur étude difficile. Nous nous intéressons plus particulièrement aux cytokinines qui constituent une des six classes d'hormones végétales (cytokinines + gibbérellines, dormine, éthylène, auxine et brassinostéroïdes).

1-Nature chimique (Figure 9): Environ 200 cytokinines ont été identifiées et isolées (depuis les années 50). Les plus fréquentes sont la trans-zéatine et la N6 -isopentényladénine. Leur formule est à base d'adénine substituée : au lieu du H du groupement amine en position 6 vient se brancher un autre groupement. De plus, beaucoup de cytokinines sont sous forme conjuguée : dans ce cas, il s'agit le plus souvent de glycosideS.

2-Lieu de synthèse : Les cytokinines sont présentes dans presque tous les tissus. Elles sont particulièrement abondantes dans les graines et les fruits. Elles sont, pour l'essentiel, synthétisées sur place, ce qui fait qu'elles se trouvent généralement en quantité suffisante sur leur lieu d'utilisation. Cependant, pour les tissus à prolifération intense, un complément peut être nécessaire. Il semble que

les tissus proches de l'apex racinaire soient impliqués dans la production des ces cytokinines surnuméraires qui vont alors migrer vers les tissus demandeurs via la sève brute.

-stimulent la division cellulaire : effet sur la duplication des chromosomes et sur le recloisonnement cellulaire ;

-peuvent agir sur l'élongation cellulaire (augmentation de la taille des cellules) au niveau des tiges ou des racines ;

-ont en général un effet inhibiteur sur l'élongation longitudinale mais favorisent l'extension radiale.

Par ailleurs, la meilleure connaissance des mécanismes de leur action devrait permettre le développement d'une utilisation raisonnée des régulateurs de croissance à activité agoniste ou

1-Propriétés et Structure 3D : Dans beaucoup de tissus végétaux l'oxydation semble être la voie

principale pour l'inactivation des cytokinines. Le système enzymatique capable de cliver la chaîne N6- latérale des cytokinines a été découvert en 1971 par Paèes et al. Les cytokinines oxydases de maïs (CKOm) oxydent les cytokinines en présence d'oxygène moléculaire [dégradation irréversible : production de l'adénine et d'un aldéhyde] (Figure 10). La CKOm est une flavoenzyme monomérique,

elle fait partie de la famille des oxydoréductases à cofacteur FAD (Flavine Adénine Dinucléotide), ce dernier est lié d'une façon covalente à l'His 87. La MM de la CKOm est de 69 kDa, sa séquence est constituée de 516 aa. L'aminoacétonitrile, HA-8 (un inhibiteur irréversible : molécule suicide) et le cyanure (CN) inhibent son activité alors que les complexes de cuivre-imidazole l'activent (Kopeèny

Le clonage du gène de ckx, fait en 1999, fut une étape cruciale dans l'élucidation du rôle de la CKOm dans le développement des plantes (Galuszka et al, 2001 ; Malito et al, 2004). Des grains de maïs, l'orge et de blé ont été souvent employés pour la purification de la CKO.

Les seules structures de la CKO disponibles sur la PDB sont celles publiées en 2004 par Malito

et al : enzyme seule, complexée avec Isopentényladénine (IP), avec la Trans-zéatine (TZ) et avec la

2-Objectifs du stage : Plusieurs mutant ont étés produits par mutagenèse dirigée (Figure 11 b)). La détermination de la structure 3D de mutant de résidus proches du FAD et de l'enzyme sauvage en

présence d'inhibiteurs va permettre de mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme.

D169 - fixation du substrat Résidu clef dans la catalyse D169E (Asp %o%o%o%o Glu)

Figures 11 a) et b) : Structure 3D et sites de mutagenèse dirigée de la CKOm

III)-La cristallisation des protéines

Pour résoudre par les méthodes biophysiques des structures 3D à résolution atomique il faut utiliser

un rayonnement dont la longueur d'onde est proche de la distance inter-atomique, c'est-à-dire de l'ordre de l'?, donc les rayons X.

Si on voulait résoudre la structure 3D d'une protéine isolée en solution en l'exposant aux rayons

X : les ondes diffusées seraient de faible intensité et l'échantillon se dégraderait sous l'effet du rayonnement X ; sous l'effet du mouvement Brownien la protéine n'aurait ni position, ni orientation définies.

D'où l'intérêt d'obtenir un cristal protéique : manipulable et contenant une quantité énorme de molécules (10¹⁵) ayant la même orientation. Chacune contribue au signal (interférences constructives entre toutes les molécules) et la dégradation due aux rayons X est partagée entre elles.

Le cristal, dont la taille est de quelques dizaines de microns (u ), est un état solide ordonné : les protéines qui le composent sont empilées d'une façon périodique et régulière dans les trois directions

de l'espace. La maille cristalline est répétée par translation à travers tout le cristal (Figure 12). La cohésion entre les molécules protéiques voisines dans le cristal est assurée par des interactions non covalentes : interactions hydrophobes, liaisons hydrogènes, de Van der Waals,... La protéine dans le cristal a la même structure qu'en solution, car étant volumineuses et globulaires, les protéines, ne peuvent pas s'empiler très étroitement. Les espaces ménagés par l'empilement des protéines sont comblés par le solvant (généralement l'eau) qui représente en moyenne 50 % du volume du cristal

[cette caractéristique est à l'origine de la fragilité des cristaux] (Mathews, 1985). Les protéines sont donc dans un état comparable à celui de la solution.

La solubilité d'une protéine est fonction de nombreux paramètres tels que : sa concentration, le pH, la température, la force ionique, l'effet d'additifs....

Lorsque le cristal protéique est obtenu, se pose la question de l'évaluation de sa qualité ; l'aspect visuel peut apporter une première indication mais le véritable test est l'analyse aux rayons X (Mullin, 1993). parmi les défauts rencontrés dans les cristaux protéiques figure la mosaïcité (Figure

13) : structure mosaïque du cristal qui consiste en une juxtaposition de blocs monocristallins

Figure 12 : La cristallisation / Transition de phases (passage d'un état désordonné liquide à un état ordonné solide).

La protéine quitte la solution et passe d'un état soluble à un état de solide ordonné, le cristal. Le motif moléculaire répété par translation le long du réseau cristallin s'appelle maille cristalline. Elle correspond à une molécule protéique ou à une sous unité protéique.

L'arrangement périodique des protéines est à l'origine du phénomène de diffraction observé lorsque le cristal est placé dans

un faisceau de rayons X. La résolution des données et la précision finale de la structure dépendent, directement, de la régularité de l'empilement cristallin (Sauter et Giegé, 2001).

Remplacement des interactions Solvant-Protéines par des interactions Protéines-Protéines

La cristallisation est une transition de phase : la protéine cristallisée passe d'un état de soluté

[protéine soluble] à une phase solide [le cristal]. La cristallisation est le résultat d'un compromis entre les facteurs thermodynamiques (solubilité) et cinétiques (nucléation et croissance cristalline).

Le comportement d'une protéine en fonction des variations de son environnement peut être décrit sous forme d'un diagramme de phases (Figure 14) (Saridakis et al, 1994).

Sur le diagramme est reportée la courbe de solubilité qui définit la limite entre la phase soluble et la phase solide [cristal, précipité microcristallin ou amorphe]. Pour qu'une protéine cristallise, elle doit dépasser cette courbe et entrer dans une zone hors équilibre thermodynamique, elle

se trouve alors dans un état de sursaturation qui lui permet d'initier la cristallisation : la nucléation. Il existe de ce fait une courbe de supersaturation, qui sépare deux zones sursaturées du diagramme : la zone de nucléation où la sursaturation élevée conduit à la nucléation du cristal et la zone métastable où

la sursaturation plus faible est juste suffisante pour que le cristal existant croisse (Sauter et Giegé,

Le passage de la zone insaturée à la zone sursaturée est réalisé en faisant varier un ou plusieurs paramètres physico-chimiques : la concentration protéique et de l'agent cristallisant [sel, polymères, alcool], le pH et plus rarement la température (McPherson, 1982 ; McPherson, 1998).

3.1-La nucléation : La nucléation est le point de départ de la cristallisation, elle correspond à la constitution d'amas moléculaires qui, lorsqu'ils dépassent une taille critique, donnent naissance au cristal.

3.2-La croissance cristalline : La croissance cristalline est le processus physique qui va suivre la nucléation et permettre l'augmentation de la taille des cristaux.

a)-Cinétique : elle dépend directement du degré de sursaturation. Pour les protéines : une couche de protéines s'ajoute toutes les 3 secondes, soit une croissance d'environ 30 ?.s^-1. Le transport des molécules en solution vers le cristal dépend de la diffusion, la convection et de l'agitation de la solution (McPherson et al, 1999). Mais aussi des concentrations de la protéine et de l'agent précipitant,

du pH, de la force ionique, de la température et de la pureté des agents chimiques et de la protéine

Température, pH et Force ionique et nature du tampon Densité, viscosité, pression, temps d'évaporatoire se Vibrations, gravité et mouvements de diffusion, Convection

Solvants organiques : non volatil (méthyl-2,4-pentadiol), volatils (éthanol)

Figure 14 : Diagramme de phase bidimensionnel d'une macromolécule en fonction de sa propre concentration et de celle d'un

agent cristallisant. Lors de la cristallisation, la solubilité de la macromolécule diminue jusqu'à atteindre l'état de supersaturation favorable à l'obtention de cristaux, sans toutefois tomber dans la zone de précipitation.

Au niveau de la courbe de solubilité, le cristal et la solution sont en équilibre thermodynamique. Au-delà de cette courbe, la solution est dite sursaturée. Plus la molécule s'enfonce dans cette zone A---B plus la sursaturation est élevée. En B, il y'a formation d'un noyau stable à partir du quel un cristal va croître. Dans la zone métastable il y'a la croissance cristalline.

La courbe de supersolubilité sépare la zone métastable de la zone de nucléation.

b)-Equilibre et arrêt de la croissance : l'arrêt de la croissance (mûrissement d'Oswald) intervient

lorsque le système atteint le point d'équilibre où la concentration de la molécule est égale à la solubilité : le nombre de molécules qui se détachent du cristal est égal au nombre de molécules qui s'y lient. La présence d'impuretés peut induire l'arrêt irréversible de la croissance cristalline avant d'atteindre le point d'équilibre (Sauter et Giegé, 2001 ; Stelter, 2003).

Plusieurs méthodes sont développées pour cristalliser les protéines. Elles ont toutes pour principe « d'amener les protéines sans les dénaturer en conditions de sursaturation propices à la nucléation, puis à la croissance du cristal». La méthode la plus utilisée est la diffusion de vapeur en goutte suspendue, sa simplicité et son adaptation aux volumes réduits de solutions expliquent sa popularité (McPherson, 1998). Dans une enceinte close, l'équilibre s'établit entre la goutte (contenant

la protéine, le tampon et l'agent cristallisant) et le réservoir (contenant le tampon et l'agent cristallisant à des concentrations plus élevées) par diffusion des espèces volatiles de la goutte (principalement l'eau) jusqu'à ce que la tension de vapeur soit la même dans la goutte et dans le réservoir.

Ce processus d'équilibration concentre l'agent cristallisant et la protéine dans la goutte, ce qui diminue la solubilité de la protéine et si les conditions sont favorables l'amène à cristalliser (Sauter et Giegé, 2001). La cinétique de la diffusion dépend des différences de concentrations dans la goutte et dans le réservoir mais également de la géométrie du système, du volume de la goutte et de sa distance

au réservoir. Dans la Figure 15, est représentée la méthode de la goutte assise utilisée dans les tests au

A-UMPKeco, double mutant D159N D93A [en position 159 : Asp(D) remplacé par Asn (N) / en 93 :

Asp(D) remplacé par Ala(A)] : Le variant UMPK D159N D93A est construit par la méthode de double PCR. La souche transformée est cultivée à 37°C jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 1.5 à 600 nm. Puis la production de protéine est induite par l'ajout de 1 mM d'isopropyl-thiol--D-galactosidase (IPTG) pendant 3 h à 37°C. Les bactéries sont ensuite centrifugées. Le culot bactérien est soit traité immédiatement, soit conservé à -20°C pour une utilisation ultérieure (Serina et al, 1996).

-la première met en jeu une chromatographie d'affinité sur résine de l'acide Ni-Nitrile Triacétique agarose ;

La concentration protéique est évaluée par la méthode de Bradford. L'enzyme purifiée est alors conservée dans du Tris-HCl pH 8,5 50 mM et du NaCl 100 mM à 20°C plusieurs semaines. La pureté du variant UMPKeco D93A est vérifiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (12.5 %)

en présence de SDS (SDS-PAGE). A l'issue de cette étape, l'enzyme doit être très pure, au moins à 97

%, sinon on risque de n'obtenir aucun cristal du fait des impuretés qui pourraient compromettre la cristallisation. Il est aussi nécessaire de disposer de quantités suffisantes de protéines.

B-CKOm sauvage et mutants D169E et D192L : L'amplification est effectuée par la méthode PCR en utilisant un plasmide d'E. coli. Le vecteur contenant le gène d'intérêt : pINA1267,

est ensuite cloné et surexprimé dans la levure Yarrowia lipolitica. La purification de la protéine obtenue (CKOm) est effectuée par deux chromatographies sur colonne échangeuse d'anions. La pureté

Avant de procéder à la cristallisation proprement dite, on a procède à chaque fois à la vérification

de la concentration protéique en mesurant l'absorbance à 280 nm (Encadré 1), la concentration minimale requise pour la cristallogenèse est d'environ 5 mg/ml. Si la concentration protéique est inférieure à cette valeur on procède dès lors à la concentration de la protéine (Encadré 2). Une fois

que la solution protéique est très pure et suffisamment concentrée, on peut passer à la phase de cristallisation qui comprend deux cribles (Figure 16).

Premier crible : tests au robot / essais préliminaires / goutte assise : La recherche des conditions prometteuses de cristallisation s'est effectuée en utilisant les kits Crystal Screen I et II (Annexes 1 &

Encadré 1 : Vérification de la concentration protéique par absorption dans l'UV

La mesure de la concentration protéique s'est effectuée en utilisant un spectrophotomètre UV/VISIBLE (BECKMAN DU 640B).

Un rayon lumineux traverse la solution absorbante contenant 2 u l de la solution protéique et 498 u l du tampon

Tris-HCL pH 8,5 50 mM pour l'UMPK et pH 7,0 100 mM pour la CKOm, après lecture des absorbances à 280

nm et en appliquant la loi de BEER-LAMBERT on détermine la concentration en mg/ml de la protéine.

^{A : absorbance, I : intensité de la
lumière incidente, I}o ^{: intensité de la
lumière transmise, l est l'épaisseur (en cm)}

de la cuve appelé aussi chemin optique, C est la concentration en mg/ml et å : coefficient d'extinction molaire caractéristique de chaque protéine à une longueur d'onde donnée (å est lié à la teneur de la protéine en Trp, Tyr

On a utilisé des centricons 10 à contenance maximale de 2 ml, leur porosité permet à certaines molécules de passer : sels, petites molécules et retient les protéines dont la MM est supérieure à 10 kDa. La solution protéique

est déposée dans la partie supérieure du tube et repose sur la membrane, le tube est alors centrifugé pour forcer le liquide et les petites molécules à traverser cette dernière. Les protéines trop grosses ne peuvent pas passer et

restent dans la partie supérieure, on peut ensuite les récupérer pour mesurer la concentration.

Les kits contiennent 96 conditions différentes : ensemble de précipitants, additifs et

tampons...le plus fréquemment testés avec succès dans la PDB. Quoique empiriques, ces kits permettent d'échantillonner systématiquement un grand nombre de conditions. Le robot de cristallisation permet d'obtenir des cristaux rapidement, en utilisant de faibles quantités de la protéine (0,5 u l par test = économie de protéine par rapport aux essais manuels : 2 u l) ce qui rend possible la réalisation de beaucoup de tests. Dans les tests au robot, on a testé l'UMPK D159N D93A seule (enzyme brute), avec l'UMP (substrat accepteur de phosphate) et avec le GTP (activateur allostérique). Chaque goutte contient 1 u l de solution (0,5 u l de solution protéique -enzyme seule ou avec ligand- et 0,5u l du puit).Au total, 288 essais sont réalisés avec le robot ; la boite est incubée dans

L'observation des résultats se fait à la loupe biloculaire le lendemain, après 3 jours puis chaque semaine. A l'issue de ces essais on détermine et on retient les conditions prometteuses de cristallisation.

Deuxième crible : tests manuels approfondis / méthode de diffusion de vapeur / technique de la

goutte suspendue (Figures 17) : On utilise la technique de la goutte suspendue (hanging drop) sur des boites Linbro. Les essais ont été réalisés de la façon suivante : un volume A de la solution SE

(solution de l'enzyme) [UMPK D159N D93A, ligand GTP et additif ( Glucoside, Glycérol)] est mélangé avec un volume B de solution SR (solution du réservoir) [PEG 6000, le NaCl, l'additif et le tampon], A + B = 4ul. Ce mélange constituant la goutte est déposé sur une lamelle en verre [ronde, 22 mm de diamètre, siliconé avec l'aquasil (Pierce) 2,5 % v/v] placée avec précaution au dessus du puits contenant 1 ml de la SR. L'étanchéité étant indispensable, on graisse préalablement le pourtour du puits avec une graisse à vide à l'aide d'une seringue. Les boîtes ont ensuite été placées dans l'enceinte thermostatée à une température de 20°C. L'observation des résultats se fait se fait comme pour le

Les travaux menés dans l'UMR de Chimie Biologique par Briozzo et al, ont montré que l'UMPKeco cristallise mieux au contact de la graisse, pour chaque paramètre requis on a effectué des essais en présence et en absence de la graisse. Le pH est maintenu constant grâce au tampon Tris-HCl

pH 8,5, 50 mM. 266 essais ont étés effectués manuellement. Au total 554 essais sont effectués avec

(2) les mutants de la CKO cristallisent en général dans les conditions déterminées en 2004 par Briozzo et al (précipitant : PEG 1500 à 30% - condition 43 du Crystal Screen I-, pas de sel, tampon : Tris-HCl pH 7,0 50 mM). Pour les essais manuels approfondis nous avons employé la méthode de

diffusion de vapeur les boites Linbro. Nous avons varié dans le puits la concentration du PEG 1500 et

dans la goutte la concentration protéique. Des tests sont effectués avec la CKOm sauvage brute ( pour

infiltration), avec le mutant D169E-IP et avec le mutant D492L. Au total 96 essais ont étés effectués avec la CKOm : 42 avec la CKOm native, 30 avec le mutant D169E et 6 avec le mutant L492A. Pour

la CKOm, les concentrations de départ étant assez importantes (> à 13 mg/ml), on ne l'a pas concentrée

3.1-Montage des cristaux (Figure : 17 b)) : Les cristaux les plus beaux ont été montés délicatement dans des boucles en nylon de 0,01 mm de diamètre pour l'UMPKeco et 0,1 mm pour la CKOm, et serviront à la diffraction des rayons X. Cette étape est réalisée sous la loupe biloculaire. Avant de monter les cristaux, une solution correspondant à la solution de la goutte ou a été préparée. Cette solution est ensuite déposée sur la goutte, le cristal a été pêché soigneusement. La boucle est ensuite montée sur une tête goniométrique orientable, ce qui permet de centrer et d'orienter correctement le cristal dans le faisceau de rayons X. Avant l'enregistrement des données de diffraction,

les cristaux ont été congelés sous flux d'azote gazeux à 100 K. On augmente ainsi leur durée de vie et

on réduit leur dégradation [modification chimique et formation de radicaux libres] par les rayons X (faisceaux très puissants) pendant l'enregistrement. Comme un cristal contient près de 50 % de solvant, qui est principalement l'eau, la congélation sans cryoprotectant cristalliserait cette eau sous forme de microcristaux qui détériorent le cristal et donnent des anneaux parasites sur les clichés de diffraction. Il est nécessaire de trouver un cryoprotectant adapté qui transforme l'eau en solide amorphe (empêchant la formation de cristaux de glace), sans détériorer le cristal.

On a pêché le cristal avec une boucle de taille adaptée et on l'a transféré dans la solution cryoprotectante (pendant environ 1 min). Dans notre cas, le cryoprotectant utilisé été le glycérol à 20

%. Ces étapes ont lieu au laboratoire d'enzymologie et biochimie structurales de Gif sur Yvette (91).

3.2-Collecte des données de diffraction (Figure 17 c)) : Cette étape consiste à soumettre les cristaux à un faisceau monochromatique de rayons X issu d'un rayonnement synchrotron intense permettant d'enregistrer à haute résolution. On choisit la longueur d'onde appropriée et on fait tourner

le cristal autour d'un axe perpendiculaire au faisceau incident de rayons X (1° dans notre cas). Les intensités diffractées son enregistrées par un détecteur placé lui aussi perpendiculairement au faisceau incident.

3.3-Détermination des paramètres de maille des cristaux : Les données de diffraction sont collectées sur la ligne ID14-1 à l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble) équipée d'un détecteur CCD (charged coupled device). L'enregistrement étant terminé, il est nécessaire de déterminer pour chaque réflexion : son indice hkl, son intensité et l'incertitude sur sa mesure. Le programme DENZO fait l'indexation sur une image puis sur toutes les images ; le programme SCALEPACK de HKL est utilisé pour mettre à l'échelle les intensités de toutes les réflexions dans un

Figure 17 a) : Méthode de cristallisation en goutte suspendue : La méthode de diffusion de vapeur est la

méthode le plus couramment utilisée dans les cristallisations manuelles. Elle est basée sur la saturation atteinte par évaporation des solvants volatils dans une enceinte fermée sans contact entre les solutions liquides. L'équilibre

s'établit progressivement par diffusion de la vapeur d'eau, l'eau passe de la goutte vers le puits et ceci jusqu'à ce qu'on atteigne les conditions de succès (obtention des cristaux) ou les conditions de précipitation / agrégation.

1-Concentration de l'échantillon purifié : Comme le montre la figure 18, la purification

réalisée par les collaborateurs de l'Institut Pasteur est très concluante : le matériel protéique prêt à être utilisé pour la cristallisation est très pur.

Les pertes en protéines lors de la concentration, evaluées par la mesure de l'A280 nm du filtrat, sont négligeables. Le procédé utilisant les centricons 10 est adapté à l'UMPKeco.

---Tests au robot : Les essais de Crystal Screen I & II ont donné les résultats suivants:

? Pour l'enzyme seule (7,41 mg/ml dans la solution départ et de 3,7 mg/ml dans la goutte): de nombreuses aiguilles fines sont apparues dans la condition 1 du Crystal Screen II, en présence de

10 % p/v de PEG 6000 / de NaCl à 2 M et sans tampon (donc le pH dans la goutte était de 8,5 :

? Pour l'enzyme (3,7 mg/ml dans la goutte) avec le GTP (20 mM) : il y a apparition de belles et nombreuses aiguilles dans la même condition (condition 1 du Crystal Screen II).

? Pour l'enzyme (3,7 mg/ml dans la goutte) avec à la fois GTP (20 mM) & UMP (10 mM) : aucune forme cristalline n'est apparue, il y a dans certaines conditions apparition d'agrégats et de précipités.

Les conditions les plus favorables à ce mutant pour cristalliser sont donc : PEG 6000 à 10 % et NaCl 2,0 M, avec GTP à 20 mM, pH 8,5. Par ailleurs, la structure avec GTP est plus intéressante que celle de l'enzyme brute.

---Tests manuels approfondis : Afin d'améliorer les formes cristallines, nous avons fait varier :

-la concentration : du PEG, du NaCl [exercent un effet salting out (recherché pour la cristallisation] et rendent les protéines moins solubles en fixant les molécules d'eau) et du GTP ;

-la concentration et la nature de l'additif (glycérol et le â-octyle-glycoside).

Dans la goutte : nous avons fait varier la concentration protéique et le volume de A & B.

Des aiguilles sont obtenues dans 14 cas correspondants à des conditions différentes (Tableau 3

& Figure 19). Le temps de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A en présence du GTP est à peu près le même que celui de l'UMPKeco D159N D93A seule (environ une semaine).

L'étude cristallographique (par cocristallisation) de complexes enzyme/substrat est aléatoire et présente de grandes difficultés. En effet, il nous est impossible de savoir si le GTP (ligand) est

réellement présent dans le cristal avant la résolution de la structure, qui peut prendre plusieurs mois.

Tableau 3 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A : Conditions d'obtention et dimensions.


PEG 6000 (%)			GTP (mM)			Graisse		NaCl (M)		â-Glucoside (%)		Dimensions (mm)
10			0			Présence		2		0		0,016 x 0,32
7												0,016 x 0,96
12			20									0,016 x 0,8
10			20			Absence						0,016 x 0,72
18			20			Présence						0,016 x 0,32
22			20							0,25		Non Déterminé (ND)
12			20							0		0,016 x 0,32
9,5			20									0,016 x 0,32
10			20									ND
16,5			20									0,016 x 0,32
17			20									0,016 x 0,32
19,5			20									0,016 x 0,32
18,5			20									0,016 x 0,32
19			20									0,016 x 0,32


PEG 6000 (%)		NaCl (M)		GTP (mM)	MPD (%)		ß glucoside (%)		Glycérol (%)		Concentration protéique (mg/ml)
3 à 22		1, 6 à 2, 6		20	5		0,25 à 0,5		0,25		3.7 à 7,4
	Tableau 2 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A

En revanche, le nombre de cristaux obtenus, pour un nombre d'essais comparables, en

présence du GTP est plus important que celui obtenu avec l'enzyme brute (12 cas en présence du GTP

contre 2 avec l'enzyme seule) ; le GTP aurait un effet favorable sur la cristallisation de cette enzyme.

Les meilleurs résultats sont obtenus dans des conditions variables de PEG (entre 7 et 22 %) et

la même concentration du sel (NaCl à 2M), les aiguilles les plus belles sont obtenues au voisinage de

10 % de PEG. La variation de la concentration protéique n'a pas d'effet significatif sur la vitesse et le rendement de la cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A. Sauf pour les concentrations élevées du précipitant (22 % du PEG), l'ajout d'additifs (â-octyl-glucoside à 0,25 %) n'influe pas nettement sur

Le tableau 3 montre que cette enzyme cristallise mieux au contact de la graisse (1 cas de succès sans graisse contre 13 avec graisse), comme pour l'enzyme D159N dont la structure a été publiée.

Les données de diffraction des rayons X ont été enregistrées jusqu'à 3 ? de résolution.120

images sont enregistrées, les taches sont très rares et peu intenses et la mosaïcité est importante : le jeu

Pour la CKOm, nous avons fait varier dans le réservoir la concentration du PEG 1500 et le volume du tampon Tris-HCl pH 7,0. Dans la goutte nous avons fait varier la concentration protéique

et le volume de A & B (Tableau 4). De gros cristaux colorés en jaune (à cause du FAD lié covalemment à l'enzyme par l'His 87) sont obtenues dans 12 cas correspondant à des conditions différentes: 5 cas avec l'enzyme native, 7 cas avec le mutant D169E, aucun cristal n'a été obtenu avec

le mutant D492L (Tableau 5 & Figure 20). Le temps de cristallisation de la CKOm est comparable à celui de l'UMPKeco (environ une semaine). Plusieurs formes cristallines sont obtenues (maclées, rectangulaires...). Comme on pouvait s'y attendre, la CKOm cristallise mieux que l'UMPKeco. Enregistrement et traitement des données de diffraction X : Le Tableau 6 indique quelques

Les données de diffraction de la CKOm sauvage complexée avec un inhibiteur suicide : HA-

8 et du mutant D169E avec le substrat : IP ont été traitées pendant ce stage. Plusieurs paramètres ont

été utilisés pour le suivi et la validation de l'affinement des résultats des diffraction : Rsym (Rsym maximal toléré est 40 % dans la dernière tranche de résolution et 10 % pour l'ensemble des résolutions), complétude (doit être au moins de 80 %)..., les statistiques obtenues à l'issue de plusieurs

Tableau 4 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de la CKOm


CKOm	PEG 1500 (%)	Tampon Tris-HCl pH =7,0	â-octyl-glucoside (%)	Concentration protéique (mg/ml)	VB dans la goutte de 4ul le reste est complété par VA de la SE
Native	16 à 33	+	0,5	7	1,92 à 2,92
Mutant D169 E	28 à 33	+	0,5	8	1,92 à 2,92
Mutant D492L	28 à 33	+	0,5	5	1,92


Enzyme	PEG 1500 (%)	â-Glucoside (%)	Dimensions (mm)
Enzyme Native	16	0,5	0,032 x 0,24
	20		0,048 x 0,24
	22		0,032 x 0,24
	24		0,048 x 0,24
	30		0,032 x 0,24
Mutant D169E	22		0,032 x 0,24
	26		0,13 x 0,24
	28		0,13 x 0,24
	30		0,13 x 0,24
	31		0,13 x 0,24
	32		0,032 x 0,24
	33		0,032 x 0,24


	Nombre de cristaux montés sur des boucles	Nombre de cristaux qui ont diffracté	Conditions retenues	Résolution / Ligne	Glycérol (Cryoprotectant)
UMPKeco D93A avec GTP ?	3	1	-18 % de PEG 6000 -2,0 M NaCl - Protéine à 3,7 mg/ml	3 ? / ID 14-1	20 % pendant 1 min
CKOm, mutant D169E avec IP	3	3	-29 % PEG 1500 -0,5 % â-Glucoside -Protéine à 8 mg/ml -Tris HCl pH 7,0 100 mM	1,9 ? / ID 14-1	20 % pendant 1 min

Jeu de données	CKOm sauvage avec HA-8, Résultats Définitifs	CKOm D169E avec IP, Résultats Préliminaires du traitement en cours
Longueur d'onde des rayons X (?)	0,934	0,934
Nombre d'images enregistrées	200	190
Angle de rotation lors de l'enregistrement (°)	1	1
Distance Cristal -Détecteur (mm)	162,62	177,09
Système cristallin	Système monoclinique	Système monoclinique
Groupe d'espace	C2	C2
Paramètres de maille	a = 254,09 / b = 50,87 / c= 52,26 (?) á = ã = 90,00 / â = 93,19 (°)	a = 251,08 / b =51,27 / c = 51,58 (?) á = ã = 90,00 / â = 93,27 (°)
Résolution retenue pour résoudre la structure 3D (?)	Résolution max 25,00 Résolution min 2,4	Résolution max 25,00 Résolution min 2,00
Nombre de réflexions observées	287781	720276
Nombre de réflexions uniques	22648	43460
Rodandonce	12,7	16,6
Mosaïcité	1,2	2
Complétude %	85,8	96,8
R fact (%) (< 10 %)	12,2	13,2
I/ä (> ou = à 2)	9,94	9,74

Les résultats obtenus pour la CKOm-HA-8 sont moins bons que ceux de la CKOm-D169E-IP.

La structure 3D avec HA-8 ne serait pas assez précise pour permettre de comprendre et d'expliquer clairement le mécanisme d'inhibition. En plus, une structure avec un inhibiteur comparable a été résolue (article en cours de rédaction). Par contre, celle du mutant D169E-IP, vu les résultats préliminaires du traitement des données, va certainement expliquer le rôle de l'Asp 169 dans la catalyse enzymatique. Le tableau 8 résume les résultats de l'étude cristallographique des autres mutants de la CKOm cristallisés et montés par Briozzo et al. La compréhension fine du rôle et du fonctionnement de la CKOm sera améliorée si la structure 3D de ces mutants, dont les cristaux sont

Notre travail nous a permis d'obtenir des cristaux avec le GTP d'un mutant du résidu impliqué dans les interactions de maintien de l'oligomérisation de l'enzyme. La suite du projet consistera d'une part à poursuivre les études cristallographiques d'autres mutants ponctuels non régulés par le GTP et d'autre part à approfondir l'étude des mécanismes de régulation. Cela pourrait avoir des applications dans le domaine de la santé publique.

Le traitement des données étant entrepris, il est nécessaire de résoudre la structure du mutant

D169N avec l'IP et de l'enzyme native avec l'HA-8. Il existe d'autres structures de mutants ponctuels

en cours d'affinement avec des accepteurs d'électrons. Des données ont été enregistrées, le même jour

sur la ligne ID14-1, avec les mutants L492A (deux jeux de données avec des inhibiteurs différents) et E288Q (avec inhibiteur). L'ensemble de ces structures permettra une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement de la CKOm et cela aura éventuellement des applications

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1. 0.02 M Calcium chloride dihydrate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol

2. 0.4 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate

3. 0.4 M Ammonium phosphate monobasic

4. 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 2.0 M Ammonium sulfate

5. 0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol

6. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

7. 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 1.4 M Sodium acetate trihydrate

8. 0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 30% v/v 2-Propanol

9. 0.2 M Ammonium acetate, 0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

10. 0.2 M Ammonium acetate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

11. 0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6, 1.0 M Ammonium phosphate monobasic

12. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 30% v/v 2-Propanol

13. 0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 30% v/v Polyethylene glycol 400

14. 0.2 M Calcium chloride dihydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 28% v/v Polyethylene glycol 400

15. 0.2 M Ammonium sulfate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 30% w/v Polyethylene glycol 8000

16. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 1.5 M Lithium sulfate monohydrate

17. 0.2 M Lithium sulfate monohydrate, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

18. 0.2 M Magnesium acetate tetrahydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 20% w/v Polyethylene glycol 8000

19. 0.2 M Ammonium acetate, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 30% v/v 2-Propanol

20. 0.2 M Ammonium sulfate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 25% w/v Polyethylene glycol 4000

21. 0.2 M Magnesium acetate tetrahydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol

22. 0.2 M Sodium acetate trihydrate, 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

23. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 30% v/v Polyethylene glycol 400

24. 0.2 M Calcium chloride dihydrate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 20% v/v 2-Propanol

25. 0.1 M Imidazole pH 6.5, 1.0 M Sodium acetate trihydrate

26. 0.2 M Ammonium acetate, 0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol

27. 0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 20% v/v 2-Propanol

28. 0.2 M Sodium acetate trihydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 30% w/v Polyethylene glycol 8000

29. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 0.8 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate

30. 0.2 M Ammonium sulfate, 30% w/v Polyethylene glycol 8000

31. 0.2 M Ammonium sulfate, 30% w/v Polyethylene glycol 4000

32. 2.0 M Ammonium sulfate

33. 4.0 M Sodium formate

34. 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 2.0 M Sodium formate

35. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 0.8 M Sodium phosphate monobasic monohydrate, 0.8 M Potassium phosphate

monobasic

36. 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 8% w/v Polyethylene glycol 8000

37. 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 8% w/v Polyethylene glycol 4000

38. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 1.4 M Sodium citrate tribasic dihydrate

39. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 2% v/v Polyethylene glycol 400, 2.0 M Ammonium sulfate

40 0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6, 20% v/v 2-Propanol, 20% w/v Polyethylene glycol 4000

41. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 10% v/v 2-Propanol, 20% w/v Polyethylene glycol 4000

42. 0.05 M Potassium phosphate monobasic, 20% w/v Polyethylene glycol 8000

43. 30% w/v Polyethylene glycol 1500 : Conditions de cristallisation de la CKOm

44. 0.2 M Magnesium formate dihydrate

45. 0.2 M Zinc acetate dihydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5, 18% w/v Polyethylene glycol 8000

46. 0.2 M Calcium acetate hydrate, 0.1 M Sodium cacodylate pH 6.5 , 18% w/v Polyethylene glycol 8000

47. 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 2.0 M Ammonium sulfate

48. 0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5, 2.0 M Ammonium phosphate monobasic

1. 10% PEG 6000, 2.0 M Sodium Chloride : Conditions de cristallisation de l'UMPKeco D93A

2. 0.5 M Sodium Chloride, 0.01 M CTAB, 0.01 M Magnesium Chloride

3. 25% Ethylene Glycol

4. 35% Dioxane

5. 5% iso-Propanol, 2.0 M Ammonium Sulfate

6. 1.0 M Imidazole pH 7.0

7. 10% PEG 1000, 10% PEG 8000

8. 10% Ethanol, 1.5 M Sodium Chloride

9. 2.0 M Sodium Chloride, 0.1 M Na Acetate pH 4.6

10. 30% MPD, 0.1 M Na Acetate pH 4.6, 0.2 M Sodium Chloride

11. 1.0 M 1,6 Hexanediol, 0.1 M Na Acetate pH 4.6, 0.01 M Cobalt Chloride

12. 30% PEG 400, 0.1 M Na Acetate pH 4.6, 0.1 M Cadmium Chloride

13. 30% PEG MME 2000, 0.1 M Na Acetate pH 4.6, 0.2 M Ammonium Sulfate

14. 2.0 M Ammonium Sulfate, 0.1 M Na Citrate pH 5.6, 0.2 M K/Na Tartrate

15. 1.0 M Lithium Sulfate, 0.1 M Na Citrate pH 5.6, 0.5 M Ammonium Sulfate

16. 2% Polyethyleneimine, 0.1 M Na Citrate pH 5.6, 0.5 M Sodium Chloride

17. 35% tert-Butanol, 0.1 M Na Citrate pH 5.6

18. 10% Jeffamine M-600, 0.1 M Na Citrate pH 5.6, 0.01 M Ferric Chloride

19. 2.5 M 1,6 Hexanediol, 0.1 M Na Citrate pH 5.6

20. 1.6 M Magnesium Sulfate, 0.1 M MES pH 6.5

21. 2.0 M Sodium Chloride, 0.1 M MES pH 6.5, 0.2 M Na/K Phosphate

22. 12% PEG 20,000, 0.1 M MES pH 6.5

23. 10% Dioxane, 0.1 M MES pH 6.5, 1.6 M Ammonium Sulfate

24. 30% Jeffamine M-600, 0.1 M MES pH 6.5, 0.05 M Cesium Chloride

25. 1.8 M Ammonium Sulfate, 0.1 M MES pH 6.5, 0.01 M Cobalt Chloride

26. 30% PEG MME 5000, 0.1 M MES pH 6.5, 0.2 M Ammonium Sulfate

27. 25% PEG MME 550, 0.1 M MES pH 6.5, 0.01 M Zinc Sulfate

28. 1.6 M Sodium Citrate pH 6.5

29. 30% MPD, 0.1 M Hepes pH 7.5, 0.5 M Ammonium Sulfate

30. 10% PEG 6000, 0.1 M Hepes pH 7.5, 5% MPD

31. 20% Jeffamine M-600, 0.1 M Hepes pH 7.5

32. 1.6 M Ammonium Sulfate, 0.1 M Hepes pH 7.5, 0.1 M Sodium Chloride

33. 2.0 M Ammonium Formate, 0.1 M Hepes pH 7.5

34. 1.0 M Sodium Acetate, 0.1 M Hepes pH 7.5, 0.05 M Cadmium Sulfate

35. 70% MPD, 0.1 M Hepes pH 7.5

36. 4.3 M Sodium Chloride, 0.1 M Hepes pH 7.5

37. 10% PEG 8000, 0.1 M Hepes pH 7.5, 8% Ethylene Glycol

38. 20% PEG 10,000, 0.1 M Hepes pH 7.5

39. 3.4 M 1,6 Hexanediol, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M Magnesium Chloride

40. 25% tert-Butanol, 0.1 M Tris pH 8.5

41. 1.0 M Lithium Sulfate, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.01 M Nickel (II) Chloride

42. 12% Glycerol, 0.1 M Tris pH 8.5, 1.5 M Ammonium Sulfate

43. 50% MPD, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M Ammonium Phosphate

44. 20% Ethanol, 0.1 M Tris pH 8.5

45. 20% PEG MME 2000, 0.1 M Tris pH 8.5, 0.01 M Nickel (II) Chloride

46. 20% PEG MME 550, 0.1 M Bicine pH 9.0, 0.1 M Sodium Chloride

47. 2.0 M Magnesium Chloride, 0.1 M Bicine pH 9.0

48. 10% PEG 20,000, 0.1 M Bicine pH 9.0, 2% Dioxane

La fonction biologique d'une protéine dépend étroitement de sa structure 3D. La cristallographie est la seule méthode qui permette sa détermination à résolution atomique et sans limitation de la masse moléculaire. Associée à la mutagenèse dirigée, cette technique constitue un outil clé pour la compréhension des mécanismes enzymatiques. Nous l'avons utilisée pour deux enzymes :

Uridine monophosphate kinase d'E. coli : Cette enzyme est certainement essentielle à la croissance bactérienne et n'a pas d'homologue chez l'homme, ce qui en fait une cible potentielle d'antibiotiques. Elle est hexamétrique et régulée par le GTP, un effecteur allostérique. La structure de l'enzyme avec GTP n'explique

pas simplement l'allostérie. Des cristaux du mutant D93A (non régulé par le GTP) ont été obtenus avec du GTP.

Les données de diffraction des rayons X ont été enregistrées à une résolution de 3 ?. Le jeu de données semble très difficile à exploiter.

Cytokinine oxydase du maïs : C'est une flavoenzyme monomérique à cofacteur FAD, elle clive par oxydation les cytokinines (phytohormones intervenant dans la croissance et le développement des plantes) et les rend biologiquement inactives. Plusieurs mutants de résidus proches du FAD avaient été produits par mutagenèse dirigée. Des cristaux de la CKOm sauvage (pour infiltration) et du mutant D169E (avec le substrat,

IP) ont étés obtenus, les données de diffraction ont été enregistrées à 1,8 ?. Le traitement des données du complexe CKOm sauvage-inhibiteur HA-8 (2,4 ?) et du complexe mutant D169E-substrat IP (2,0 ?) a été réalisé. Le phasage sera entrepris prochainement.

Mots clés : Protéine, Cristallographie, Uridine monophosphate kinase d'E. coli, Cytokinine oxydase de maïs, Mutagenèse dirigée.

The biological function of a protein depends on its 3D structure. Crystallography is the only method which allows its determination at atomic resolution and without limitation of the molecular weight. Associated

to site-directed mutagenesis, this technique constitutes a key tool to understand the structural basis of the enzymatic mechanisms. We applied it for two enzymes:

Uridine monophosphate kinase of E. coli: it is hexametric and is regulated by GTP, an allosteric effector. This enzyme is certainly essential to bacterial growth and does not have any counterpart in human. Crystals of mutant D93A (not controlled by the GTP) have been obtained with GTP. X-ray diffraction data have been collected to 3 ? resolution. These data are extremely difficult to process.

Cytokinine oxydase of maize: it is a monomeric flavoenzyme with FAD cofactor; it cleaves by oxidation

the cytokinines (phytohormones involved in plant growth and development) and inactivates them. Several mutants of residues close to FAD have been produced by site-directed mutagenesis. Crystals of wild-type CKOm (for infiltration) and of D169E variant (with the IP substrate) have been obtained, the diffraction data have been recorded to 1,8 ?. Data processing of CKO-HA-8 (2,4 ?) and D169E variant with IP (2,0 ?) have been successful. Phasing should be soon achieved.

Key words: Protein, Crystallography, Uridine monophosphate kinase from E. coli, Cytokinine oxydase