Memoire Online - Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

Pour résoudre par les méthodes biophysiques des structures 3D à résolution atomique il faut utiliser

un rayonnement dont la longueur d'onde est proche de la distance inter-atomique, c'est-à-dire de l'ordre de l'?, donc les rayons X.

Si on voulait résoudre la structure 3D d'une protéine isolée en solution en l'exposant aux rayons

X : les ondes diffusées seraient de faible intensité et l'échantillon se dégraderait sous l'effet du rayonnement X ; sous l'effet du mouvement Brownien la protéine n'aurait ni position, ni orientation définies.

D'où l'intérêt d'obtenir un cristal protéique : manipulable et contenant une quantité énorme de molécules (10¹⁵) ayant la même orientation. Chacune contribue au signal (interférences constructives entre toutes les molécules) et la dégradation due aux rayons X est partagée entre elles.

Le cristal, dont la taille est de quelques dizaines de microns (u ), est un état solide ordonné : les protéines qui le composent sont empilées d'une façon périodique et régulière dans les trois directions

de l'espace. La maille cristalline est répétée par translation à travers tout le cristal (Figure 12). La cohésion entre les molécules protéiques voisines dans le cristal est assurée par des interactions non covalentes : interactions hydrophobes, liaisons hydrogènes, de Van der Waals,... La protéine dans le cristal a la même structure qu'en solution, car étant volumineuses et globulaires, les protéines, ne peuvent pas s'empiler très étroitement. Les espaces ménagés par l'empilement des protéines sont comblés par le solvant (généralement l'eau) qui représente en moyenne 50 % du volume du cristal

[cette caractéristique est à l'origine de la fragilité des cristaux] (Mathews, 1985). Les protéines sont donc dans un état comparable à celui de la solution.

La solubilité d'une protéine est fonction de nombreux paramètres tels que : sa concentration, le pH, la température, la force ionique, l'effet d'additifs....

Lorsque le cristal protéique est obtenu, se pose la question de l'évaluation de sa qualité ; l'aspect visuel peut apporter une première indication mais le véritable test est l'analyse aux rayons X (Mullin, 1993). parmi les défauts rencontrés dans les cristaux protéiques figure la mosaïcité (Figure

13) : structure mosaïque du cristal qui consiste en une juxtaposition de blocs monocristallins

Figure 12 : La cristallisation / Transition de phases (passage d'un état désordonné liquide à un état ordonné solide).

La protéine quitte la solution et passe d'un état soluble à un état de solide ordonné, le cristal. Le motif moléculaire répété par translation le long du réseau cristallin s'appelle maille cristalline. Elle correspond à une molécule protéique ou à une sous unité protéique.

L'arrangement périodique des protéines est à l'origine du phénomène de diffraction observé lorsque le cristal est placé dans

un faisceau de rayons X. La résolution des données et la précision finale de la structure dépendent, directement, de la régularité de l'empilement cristallin (Sauter et Giegé, 2001).

Remplacement des interactions Solvant-Protéines par des interactions Protéines-Protéines

La cristallisation est une transition de phase : la protéine cristallisée passe d'un état de soluté

[protéine soluble] à une phase solide [le cristal]. La cristallisation est le résultat d'un compromis entre les facteurs thermodynamiques (solubilité) et cinétiques (nucléation et croissance cristalline).

Le comportement d'une protéine en fonction des variations de son environnement peut être décrit sous forme d'un diagramme de phases (Figure 14) (Saridakis et al, 1994).

Sur le diagramme est reportée la courbe de solubilité qui définit la limite entre la phase soluble et la phase solide [cristal, précipité microcristallin ou amorphe]. Pour qu'une protéine cristallise, elle doit dépasser cette courbe et entrer dans une zone hors équilibre thermodynamique, elle

se trouve alors dans un état de sursaturation qui lui permet d'initier la cristallisation : la nucléation. Il existe de ce fait une courbe de supersaturation, qui sépare deux zones sursaturées du diagramme : la zone de nucléation où la sursaturation élevée conduit à la nucléation du cristal et la zone métastable où

la sursaturation plus faible est juste suffisante pour que le cristal existant croisse (Sauter et Giegé,

Le passage de la zone insaturée à la zone sursaturée est réalisé en faisant varier un ou plusieurs paramètres physico-chimiques : la concentration protéique et de l'agent cristallisant [sel, polymères, alcool], le pH et plus rarement la température (McPherson, 1982 ; McPherson, 1998).

3.1-La nucléation : La nucléation est le point de départ de la cristallisation, elle correspond à la constitution d'amas moléculaires qui, lorsqu'ils dépassent une taille critique, donnent naissance au cristal.

3.2-La croissance cristalline : La croissance cristalline est le processus physique qui va suivre la nucléation et permettre l'augmentation de la taille des cristaux.

a)-Cinétique : elle dépend directement du degré de sursaturation. Pour les protéines : une couche de protéines s'ajoute toutes les 3 secondes, soit une croissance d'environ 30 ?.s^-1. Le transport des molécules en solution vers le cristal dépend de la diffusion, la convection et de l'agitation de la solution (McPherson et al, 1999). Mais aussi des concentrations de la protéine et de l'agent précipitant,

du pH, de la force ionique, de la température et de la pureté des agents chimiques et de la protéine

Température, pH et Force ionique et nature du tampon Densité, viscosité, pression, temps d'évaporatoire se Vibrations, gravité et mouvements de diffusion, Convection

Solvants organiques : non volatil (méthyl-2,4-pentadiol), volatils (éthanol)

Figure 14 : Diagramme de phase bidimensionnel d'une macromolécule en fonction de sa propre concentration et de celle d'un

agent cristallisant. Lors de la cristallisation, la solubilité de la macromolécule diminue jusqu'à atteindre l'état de supersaturation favorable à l'obtention de cristaux, sans toutefois tomber dans la zone de précipitation.

Au niveau de la courbe de solubilité, le cristal et la solution sont en équilibre thermodynamique. Au-delà de cette courbe, la solution est dite sursaturée. Plus la molécule s'enfonce dans cette zone A---B plus la sursaturation est élevée. En B, il y'a formation d'un noyau stable à partir du quel un cristal va croître. Dans la zone métastable il y'a la croissance cristalline.

La courbe de supersolubilité sépare la zone métastable de la zone de nucléation.

b)-Equilibre et arrêt de la croissance : l'arrêt de la croissance (mûrissement d'Oswald) intervient

lorsque le système atteint le point d'équilibre où la concentration de la molécule est égale à la solubilité : le nombre de molécules qui se détachent du cristal est égal au nombre de molécules qui s'y lient. La présence d'impuretés peut induire l'arrêt irréversible de la croissance cristalline avant d'atteindre le point d'équilibre (Sauter et Giegé, 2001 ; Stelter, 2003).

Plusieurs méthodes sont développées pour cristalliser les protéines. Elles ont toutes pour principe « d'amener les protéines sans les dénaturer en conditions de sursaturation propices à la nucléation, puis à la croissance du cristal». La méthode la plus utilisée est la diffusion de vapeur en goutte suspendue, sa simplicité et son adaptation aux volumes réduits de solutions expliquent sa popularité (McPherson, 1998). Dans une enceinte close, l'équilibre s'établit entre la goutte (contenant

la protéine, le tampon et l'agent cristallisant) et le réservoir (contenant le tampon et l'agent cristallisant à des concentrations plus élevées) par diffusion des espèces volatiles de la goutte (principalement l'eau) jusqu'à ce que la tension de vapeur soit la même dans la goutte et dans le réservoir.

Ce processus d'équilibration concentre l'agent cristallisant et la protéine dans la goutte, ce qui diminue la solubilité de la protéine et si les conditions sont favorables l'amène à cristalliser (Sauter et Giegé, 2001). La cinétique de la diffusion dépend des différences de concentrations dans la goutte et dans le réservoir mais également de la géométrie du système, du volume de la goutte et de sa distance

au réservoir. Dans la Figure 15, est représentée la méthode de la goutte assise utilisée dans les tests au

A-UMPKeco, double mutant D159N D93A [en position 159 : Asp(D) remplacé par Asn (N) / en 93 :

Asp(D) remplacé par Ala(A)] : Le variant UMPK D159N D93A est construit par la méthode de double PCR. La souche transformée est cultivée à 37°C jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 1.5 à 600 nm. Puis la production de protéine est induite par l'ajout de 1 mM d'isopropyl-thiol--D-galactosidase (IPTG) pendant 3 h à 37°C. Les bactéries sont ensuite centrifugées. Le culot bactérien est soit traité immédiatement, soit conservé à -20°C pour une utilisation ultérieure (Serina et al, 1996).

-la première met en jeu une chromatographie d'affinité sur résine de l'acide Ni-Nitrile Triacétique agarose ;

La concentration protéique est évaluée par la méthode de Bradford. L'enzyme purifiée est alors conservée dans du Tris-HCl pH 8,5 50 mM et du NaCl 100 mM à 20°C plusieurs semaines. La pureté du variant UMPKeco D93A est vérifiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (12.5 %)

en présence de SDS (SDS-PAGE). A l'issue de cette étape, l'enzyme doit être très pure, au moins à 97

%, sinon on risque de n'obtenir aucun cristal du fait des impuretés qui pourraient compromettre la cristallisation. Il est aussi nécessaire de disposer de quantités suffisantes de protéines.

B-CKOm sauvage et mutants D169E et D192L : L'amplification est effectuée par la méthode PCR en utilisant un plasmide d'E. coli. Le vecteur contenant le gène d'intérêt : pINA1267,

est ensuite cloné et surexprimé dans la levure Yarrowia lipolitica. La purification de la protéine obtenue (CKOm) est effectuée par deux chromatographies sur colonne échangeuse d'anions. La pureté

Avant de procéder à la cristallisation proprement dite, on a procède à chaque fois à la vérification

de la concentration protéique en mesurant l'absorbance à 280 nm (Encadré 1), la concentration minimale requise pour la cristallogenèse est d'environ 5 mg/ml. Si la concentration protéique est inférieure à cette valeur on procède dès lors à la concentration de la protéine (Encadré 2). Une fois

que la solution protéique est très pure et suffisamment concentrée, on peut passer à la phase de cristallisation qui comprend deux cribles (Figure 16).

Premier crible : tests au robot / essais préliminaires / goutte assise : La recherche des conditions prometteuses de cristallisation s'est effectuée en utilisant les kits Crystal Screen I et II (Annexes 1 &

Encadré 1 : Vérification de la concentration protéique par absorption dans l'UV

La mesure de la concentration protéique s'est effectuée en utilisant un spectrophotomètre UV/VISIBLE (BECKMAN DU 640B).

Un rayon lumineux traverse la solution absorbante contenant 2 u l de la solution protéique et 498 u l du tampon

Tris-HCL pH 8,5 50 mM pour l'UMPK et pH 7,0 100 mM pour la CKOm, après lecture des absorbances à 280

nm et en appliquant la loi de BEER-LAMBERT on détermine la concentration en mg/ml de la protéine.

^{A : absorbance, I : intensité de la
lumière incidente, I}o ^{: intensité de la
lumière transmise, l est l'épaisseur (en cm)}

de la cuve appelé aussi chemin optique, C est la concentration en mg/ml et å : coefficient d'extinction molaire caractéristique de chaque protéine à une longueur d'onde donnée (å est lié à la teneur de la protéine en Trp, Tyr

On a utilisé des centricons 10 à contenance maximale de 2 ml, leur porosité permet à certaines molécules de passer : sels, petites molécules et retient les protéines dont la MM est supérieure à 10 kDa. La solution protéique

est déposée dans la partie supérieure du tube et repose sur la membrane, le tube est alors centrifugé pour forcer le liquide et les petites molécules à traverser cette dernière. Les protéines trop grosses ne peuvent pas passer et

restent dans la partie supérieure, on peut ensuite les récupérer pour mesurer la concentration.

Les kits contiennent 96 conditions différentes : ensemble de précipitants, additifs et

tampons...le plus fréquemment testés avec succès dans la PDB. Quoique empiriques, ces kits permettent d'échantillonner systématiquement un grand nombre de conditions. Le robot de cristallisation permet d'obtenir des cristaux rapidement, en utilisant de faibles quantités de la protéine (0,5 u l par test = économie de protéine par rapport aux essais manuels : 2 u l) ce qui rend possible la réalisation de beaucoup de tests. Dans les tests au robot, on a testé l'UMPK D159N D93A seule (enzyme brute), avec l'UMP (substrat accepteur de phosphate) et avec le GTP (activateur allostérique). Chaque goutte contient 1 u l de solution (0,5 u l de solution protéique -enzyme seule ou avec ligand- et 0,5u l du puit).Au total, 288 essais sont réalisés avec le robot ; la boite est incubée dans

L'observation des résultats se fait à la loupe biloculaire le lendemain, après 3 jours puis chaque semaine. A l'issue de ces essais on détermine et on retient les conditions prometteuses de cristallisation.

Deuxième crible : tests manuels approfondis / méthode de diffusion de vapeur / technique de la

goutte suspendue (Figures 17) : On utilise la technique de la goutte suspendue (hanging drop) sur des boites Linbro. Les essais ont été réalisés de la façon suivante : un volume A de la solution SE

(solution de l'enzyme) [UMPK D159N D93A, ligand GTP et additif ( Glucoside, Glycérol)] est mélangé avec un volume B de solution SR (solution du réservoir) [PEG 6000, le NaCl, l'additif et le tampon], A + B = 4ul. Ce mélange constituant la goutte est déposé sur une lamelle en verre [ronde, 22 mm de diamètre, siliconé avec l'aquasil (Pierce) 2,5 % v/v] placée avec précaution au dessus du puits contenant 1 ml de la SR. L'étanchéité étant indispensable, on graisse préalablement le pourtour du puits avec une graisse à vide à l'aide d'une seringue. Les boîtes ont ensuite été placées dans l'enceinte thermostatée à une température de 20°C. L'observation des résultats se fait se fait comme pour le

Les travaux menés dans l'UMR de Chimie Biologique par Briozzo et al, ont montré que l'UMPKeco cristallise mieux au contact de la graisse, pour chaque paramètre requis on a effectué des essais en présence et en absence de la graisse. Le pH est maintenu constant grâce au tampon Tris-HCl

pH 8,5, 50 mM. 266 essais ont étés effectués manuellement. Au total 554 essais sont effectués avec

(2) les mutants de la CKO cristallisent en général dans les conditions déterminées en 2004 par Briozzo et al (précipitant : PEG 1500 à 30% - condition 43 du Crystal Screen I-, pas de sel, tampon : Tris-HCl pH 7,0 50 mM). Pour les essais manuels approfondis nous avons employé la méthode de

diffusion de vapeur les boites Linbro. Nous avons varié dans le puits la concentration du PEG 1500 et

dans la goutte la concentration protéique. Des tests sont effectués avec la CKOm sauvage brute ( pour

infiltration), avec le mutant D169E-IP et avec le mutant D492L. Au total 96 essais ont étés effectués avec la CKOm : 42 avec la CKOm native, 30 avec le mutant D169E et 6 avec le mutant L492A. Pour

la CKOm, les concentrations de départ étant assez importantes (> à 13 mg/ml), on ne l'a pas concentrée

3.1-Montage des cristaux (Figure : 17 b)) : Les cristaux les plus beaux ont été montés délicatement dans des boucles en nylon de 0,01 mm de diamètre pour l'UMPKeco et 0,1 mm pour la CKOm, et serviront à la diffraction des rayons X. Cette étape est réalisée sous la loupe biloculaire. Avant de monter les cristaux, une solution correspondant à la solution de la goutte ou a été préparée. Cette solution est ensuite déposée sur la goutte, le cristal a été pêché soigneusement. La boucle est ensuite montée sur une tête goniométrique orientable, ce qui permet de centrer et d'orienter correctement le cristal dans le faisceau de rayons X. Avant l'enregistrement des données de diffraction,

les cristaux ont été congelés sous flux d'azote gazeux à 100 K. On augmente ainsi leur durée de vie et

on réduit leur dégradation [modification chimique et formation de radicaux libres] par les rayons X (faisceaux très puissants) pendant l'enregistrement. Comme un cristal contient près de 50 % de solvant, qui est principalement l'eau, la congélation sans cryoprotectant cristalliserait cette eau sous forme de microcristaux qui détériorent le cristal et donnent des anneaux parasites sur les clichés de diffraction. Il est nécessaire de trouver un cryoprotectant adapté qui transforme l'eau en solide amorphe (empêchant la formation de cristaux de glace), sans détériorer le cristal.

On a pêché le cristal avec une boucle de taille adaptée et on l'a transféré dans la solution cryoprotectante (pendant environ 1 min). Dans notre cas, le cryoprotectant utilisé été le glycérol à 20

%. Ces étapes ont lieu au laboratoire d'enzymologie et biochimie structurales de Gif sur Yvette (91).

3.2-Collecte des données de diffraction (Figure 17 c)) : Cette étape consiste à soumettre les cristaux à un faisceau monochromatique de rayons X issu d'un rayonnement synchrotron intense permettant d'enregistrer à haute résolution. On choisit la longueur d'onde appropriée et on fait tourner

le cristal autour d'un axe perpendiculaire au faisceau incident de rayons X (1° dans notre cas). Les intensités diffractées son enregistrées par un détecteur placé lui aussi perpendiculairement au faisceau incident.

3.3-Détermination des paramètres de maille des cristaux : Les données de diffraction sont collectées sur la ligne ID14-1 à l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble) équipée d'un détecteur CCD (charged coupled device). L'enregistrement étant terminé, il est nécessaire de déterminer pour chaque réflexion : son indice hkl, son intensité et l'incertitude sur sa mesure. Le programme DENZO fait l'indexation sur une image puis sur toutes les images ; le programme SCALEPACK de HKL est utilisé pour mettre à l'échelle les intensités de toutes les réflexions dans un

Figure 17 a) : Méthode de cristallisation en goutte suspendue : La méthode de diffusion de vapeur est la

méthode le plus couramment utilisée dans les cristallisations manuelles. Elle est basée sur la saturation atteinte par évaporation des solvants volatils dans une enceinte fermée sans contact entre les solutions liquides. L'équilibre

s'établit progressivement par diffusion de la vapeur d'eau, l'eau passe de la goutte vers le puits et ceci jusqu'à ce qu'on atteigne les conditions de succès (obtention des cristaux) ou les conditions de précipitation / agrégation.

1-Concentration de l'échantillon purifié : Comme le montre la figure 18, la purification

réalisée par les collaborateurs de l'Institut Pasteur est très concluante : le matériel protéique prêt à être utilisé pour la cristallisation est très pur.

Les pertes en protéines lors de la concentration, evaluées par la mesure de l'A280 nm du filtrat, sont négligeables. Le procédé utilisant les centricons 10 est adapté à l'UMPKeco.

---Tests au robot : Les essais de Crystal Screen I & II ont donné les résultats suivants:

? Pour l'enzyme seule (7,41 mg/ml dans la solution départ et de 3,7 mg/ml dans la goutte): de nombreuses aiguilles fines sont apparues dans la condition 1 du Crystal Screen II, en présence de

10 % p/v de PEG 6000 / de NaCl à 2 M et sans tampon (donc le pH dans la goutte était de 8,5 :

? Pour l'enzyme (3,7 mg/ml dans la goutte) avec le GTP (20 mM) : il y a apparition de belles et nombreuses aiguilles dans la même condition (condition 1 du Crystal Screen II).

? Pour l'enzyme (3,7 mg/ml dans la goutte) avec à la fois GTP (20 mM) & UMP (10 mM) : aucune forme cristalline n'est apparue, il y a dans certaines conditions apparition d'agrégats et de précipités.

Les conditions les plus favorables à ce mutant pour cristalliser sont donc : PEG 6000 à 10 % et NaCl 2,0 M, avec GTP à 20 mM, pH 8,5. Par ailleurs, la structure avec GTP est plus intéressante que celle de l'enzyme brute.

---Tests manuels approfondis : Afin d'améliorer les formes cristallines, nous avons fait varier :

-la concentration : du PEG, du NaCl [exercent un effet salting out (recherché pour la cristallisation] et rendent les protéines moins solubles en fixant les molécules d'eau) et du GTP ;

-la concentration et la nature de l'additif (glycérol et le â-octyle-glycoside).

Dans la goutte : nous avons fait varier la concentration protéique et le volume de A & B.

Des aiguilles sont obtenues dans 14 cas correspondants à des conditions différentes (Tableau 3

& Figure 19). Le temps de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A en présence du GTP est à peu près le même que celui de l'UMPKeco D159N D93A seule (environ une semaine).

L'étude cristallographique (par cocristallisation) de complexes enzyme/substrat est aléatoire et présente de grandes difficultés. En effet, il nous est impossible de savoir si le GTP (ligand) est

réellement présent dans le cristal avant la résolution de la structure, qui peut prendre plusieurs mois.

Tableau 3 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A : Conditions d'obtention et dimensions.


PEG 6000 (%)			GTP (mM)			Graisse		NaCl (M)		â-Glucoside (%)		Dimensions (mm)
10			0			Présence		2		0		0,016 x 0,32
7												0,016 x 0,96
12			20									0,016 x 0,8
10			20			Absence						0,016 x 0,72
18			20			Présence						0,016 x 0,32
22			20							0,25		Non Déterminé (ND)
12			20							0		0,016 x 0,32
9,5			20									0,016 x 0,32
10			20									ND
16,5			20									0,016 x 0,32
17			20									0,016 x 0,32
19,5			20									0,016 x 0,32
18,5			20									0,016 x 0,32
19			20									0,016 x 0,32


PEG 6000 (%)		NaCl (M)		GTP (mM)	MPD (%)		ß glucoside (%)		Glycérol (%)		Concentration protéique (mg/ml)
3 à 22		1, 6 à 2, 6		20	5		0,25 à 0,5		0,25		3.7 à 7,4
	Tableau 2 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A

En revanche, le nombre de cristaux obtenus, pour un nombre d'essais comparables, en

présence du GTP est plus important que celui obtenu avec l'enzyme brute (12 cas en présence du GTP

contre 2 avec l'enzyme seule) ; le GTP aurait un effet favorable sur la cristallisation de cette enzyme.

Les meilleurs résultats sont obtenus dans des conditions variables de PEG (entre 7 et 22 %) et

la même concentration du sel (NaCl à 2M), les aiguilles les plus belles sont obtenues au voisinage de

10 % de PEG. La variation de la concentration protéique n'a pas d'effet significatif sur la vitesse et le rendement de la cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A. Sauf pour les concentrations élevées du précipitant (22 % du PEG), l'ajout d'additifs (â-octyl-glucoside à 0,25 %) n'influe pas nettement sur

Le tableau 3 montre que cette enzyme cristallise mieux au contact de la graisse (1 cas de succès sans graisse contre 13 avec graisse), comme pour l'enzyme D159N dont la structure a été publiée.

Les données de diffraction des rayons X ont été enregistrées jusqu'à 3 ? de résolution.120

images sont enregistrées, les taches sont très rares et peu intenses et la mosaïcité est importante : le jeu

Pour la CKOm, nous avons fait varier dans le réservoir la concentration du PEG 1500 et le volume du tampon Tris-HCl pH 7,0. Dans la goutte nous avons fait varier la concentration protéique

et le volume de A & B (Tableau 4). De gros cristaux colorés en jaune (à cause du FAD lié covalemment à l'enzyme par l'His 87) sont obtenues dans 12 cas correspondant à des conditions différentes: 5 cas avec l'enzyme native, 7 cas avec le mutant D169E, aucun cristal n'a été obtenu avec

le mutant D492L (Tableau 5 & Figure 20). Le temps de cristallisation de la CKOm est comparable à celui de l'UMPKeco (environ une semaine). Plusieurs formes cristallines sont obtenues (maclées, rectangulaires...). Comme on pouvait s'y attendre, la CKOm cristallise mieux que l'UMPKeco. Enregistrement et traitement des données de diffraction X : Le Tableau 6 indique quelques

Les données de diffraction de la CKOm sauvage complexée avec un inhibiteur suicide : HA-

8 et du mutant D169E avec le substrat : IP ont été traitées pendant ce stage. Plusieurs paramètres ont

été utilisés pour le suivi et la validation de l'affinement des résultats des diffraction : Rsym (Rsym maximal toléré est 40 % dans la dernière tranche de résolution et 10 % pour l'ensemble des résolutions), complétude (doit être au moins de 80 %)..., les statistiques obtenues à l'issue de plusieurs

Tableau 4 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de la CKOm


CKOm	PEG 1500 (%)	Tampon Tris-HCl pH =7,0	â-octyl-glucoside (%)	Concentration protéique (mg/ml)	VB dans la goutte de 4ul le reste est complété par VA de la SE
Native	16 à 33	+	0,5	7	1,92 à 2,92
Mutant D169 E	28 à 33	+	0,5	8	1,92 à 2,92
Mutant D492L	28 à 33	+	0,5	5	1,92


Enzyme	PEG 1500 (%)	â-Glucoside (%)	Dimensions (mm)
Enzyme Native	16	0,5	0,032 x 0,24
	20		0,048 x 0,24
	22		0,032 x 0,24
	24		0,048 x 0,24
	30		0,032 x 0,24
Mutant D169E	22		0,032 x 0,24
	26		0,13 x 0,24
	28		0,13 x 0,24
	30		0,13 x 0,24
	31		0,13 x 0,24
	32		0,032 x 0,24
	33		0,032 x 0,24


	Nombre de cristaux montés sur des boucles	Nombre de cristaux qui ont diffracté	Conditions retenues	Résolution / Ligne	Glycérol (Cryoprotectant)
UMPKeco D93A avec GTP ?	3	1	-18 % de PEG 6000 -2,0 M NaCl - Protéine à 3,7 mg/ml	3 ? / ID 14-1	20 % pendant 1 min
CKOm, mutant D169E avec IP	3	3	-29 % PEG 1500 -0,5 % â-Glucoside -Protéine à 8 mg/ml -Tris HCl pH 7,0 100 mM	1,9 ? / ID 14-1	20 % pendant 1 min

Jeu de données	CKOm sauvage avec HA-8, Résultats Définitifs	CKOm D169E avec IP, Résultats Préliminaires du traitement en cours
Longueur d'onde des rayons X (?)	0,934	0,934
Nombre d'images enregistrées	200	190
Angle de rotation lors de l'enregistrement (°)	1	1
Distance Cristal -Détecteur (mm)	162,62	177,09
Système cristallin	Système monoclinique	Système monoclinique
Groupe d'espace	C2	C2
Paramètres de maille	a = 254,09 / b = 50,87 / c= 52,26 (?) á = ã = 90,00 / â = 93,19 (°)	a = 251,08 / b =51,27 / c = 51,58 (?) á = ã = 90,00 / â = 93,27 (°)
Résolution retenue pour résoudre la structure 3D (?)	Résolution max 25,00 Résolution min 2,4	Résolution max 25,00 Résolution min 2,00
Nombre de réflexions observées	287781	720276
Nombre de réflexions uniques	22648	43460
Rodandonce	12,7	16,6
Mosaïcité	1,2	2
Complétude %	85,8	96,8
R fact (%) (< 10 %)	12,2	13,2
I/ä (> ou = à 2)	9,94	9,74

Les résultats obtenus pour la CKOm-HA-8 sont moins bons que ceux de la CKOm-D169E-IP.

La structure 3D avec HA-8 ne serait pas assez précise pour permettre de comprendre et d'expliquer clairement le mécanisme d'inhibition. En plus, une structure avec un inhibiteur comparable a été résolue (article en cours de rédaction). Par contre, celle du mutant D169E-IP, vu les résultats préliminaires du traitement des données, va certainement expliquer le rôle de l'Asp 169 dans la catalyse enzymatique. Le tableau 8 résume les résultats de l'étude cristallographique des autres mutants de la CKOm cristallisés et montés par Briozzo et al. La compréhension fine du rôle et du fonctionnement de la CKOm sera améliorée si la structure 3D de ces mutants, dont les cristaux sont

Notre travail nous a permis d'obtenir des cristaux avec le GTP d'un mutant du résidu impliqué dans les interactions de maintien de l'oligomérisation de l'enzyme. La suite du projet consistera d'une part à poursuivre les études cristallographiques d'autres mutants ponctuels non régulés par le GTP et d'autre part à approfondir l'étude des mécanismes de régulation. Cela pourrait avoir des applications dans le domaine de la santé publique.

Le traitement des données étant entrepris, il est nécessaire de résoudre la structure du mutant

D169N avec l'IP et de l'enzyme native avec l'HA-8. Il existe d'autres structures de mutants ponctuels

en cours d'affinement avec des accepteurs d'électrons. Des données ont été enregistrées, le même jour

sur la ligne ID14-1, avec les mutants L492A (deux jeux de données avec des inhibiteurs différents) et E288Q (avec inhibiteur). L'ensemble de ces structures permettra une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement de la CKOm et cela aura éventuellement des applications

Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

III)-La cristallisation des protéines