III- METHODE DE DOSAGE DE L'ACTIVITE DE LA CATALASE
III-1 TEST DE REPRODUCTIBILITE
III-1-1 Méthode (1) adaptée d'après
Tanguy , 1999.
III-1-1-1 Solutions :
KH2PO4 50mM
NaH2PO4 50mM
Tampon de broyage : : KH2PO4 100mM , DTT 1mM, EDTA-Na2 2mM, pH7.4
H2O2 30mM
TRITON X 100 à 1% dans H2Obd
Ethanol 95%.
III-1-1-2 Homogénéisation des tissus pour
dosages
* Peser 20-30mg de tissus (muscle gastrocnémien) * Broyer
dans 1mL de tampon de broyage à 4°C.
* Aliquoter 200 uL d'homogénat pour le dosage des
protéines totales. * Centrifuger 5 min à 5500 rpm , 4°C.
* Prélever et aliquoter le surnageant en fraction de
200uL.
* Congeler les aliquots à - 20°C jusqu'à
utilisation
III-1-1-3 Préparation des surnageants.
*Ajouter 2 uL d'éthanol 95% à 200uL de
surnageant
*Incuber 30 min à 4°C.
*Ajouter 2uL de triton x 100 à 1%
*Incuber 10 min à 4°C
III-1-1-4 Dosage spectrophotométrique de
l'activité de la catalase.
La mesure de l'absorbance est réalisée à 240
nm. Deux blancs sont préparés dans 2 cuves pour faire
l'autozéro du spectrophotomètre. L'échantillon est
mesuré contre le blanc.
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Solution
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Blanc
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Echantillon
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MR (uL)
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900
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600
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Surnageant (uL)
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50
|
50
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H2O2 à 1/200 (uL)
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0
|
300
|
La réaction est déclenchée par l'ajout du
surnageant.
La catalase étant une enzyme à cinétique
non Michaélienne, donc non saturable, l'activité catalase sera
estimée en calculant la constance de vitesse de premier ordre de
disparition de H2O2 (Aebi H, 1982). La constance de vitesse
de disparition de H2O2 (K) est définie telle que :
K= 2,3/?t x log 10 ( DOo/DOt) en
sec-1
Avec :
?t : Durée de la mesure (sec)
DO0 : Densité optique à l'instant
0 DOt : Densité optique à l'instant t
III-1-1-5 Résultats.
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Mesure
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K ( sec -1)
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1
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1,68 x 10
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-3
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3
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1,84 x 10
|
-3
|
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4
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1,85 x 10
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-2
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5
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6,58 x 10
|
-3
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6
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7,44 x 10
|
-3
|
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7
|
1,17 x 10
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-2
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8
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1,20 x 10
|
-2
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9
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4,56 x 10
|
-3
|
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10
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7,96 x 10
|
-3
|
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11
|
1,15 x 10
|
-2
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Le traitement statistique des résultats nous donne une
moyenne de (8,65 #177;2,07) x 10 -3 sec -1 avec un
coefficient de variation de 23.9%.
III -1-1-6 Conclusion :
Le dosage spectrophotométrique de la catalase fonctionne,
mais la variabilité des résultats dans cette séquence de
mesure est importante.
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