5.3. Recueil et conservation des échantillons
Les patients sélectionnés ont été
convoqués et un prélèvement sur le tube EDTA a
été réalisé. D'abord, le sang total a
été déposé sur un papier buvard selon le protocole
ci-après, et puis le reste a été centrifugé pendant
10 minutes à 2500 tours/ minute. Enfin, le plasma recueilli a
été également déposé sur un papier buvard,
selon le protocole ci-après. Il s'agit du papier buvard utilisé
pour le test de Guthrie (Figure 7).
Figure 7. Carte de Guthrie
Sur 5 spots, nous avons déposé 30 ul de sang
total chacun et sur 4 spots 30 ul de plasma chacun. Puis la carte a
été séchée à température ambiante
sous ventilateur.
La conservation a été réalisée
selon deux protocoles : pour chaque patient, une carte comportant 5 spots
de sang total et 4 spots de plasma a été conservée
à une température de - 20° C et une autre comportant 5
spots de sang total et 4 spots de plasma conservée à une
température ambiante.
Ainsi 2 groupes ont été
constitués :
Ø Groupe I : Echantillons constitués de
sang total et de plasma conservés à -20°C avec 2 sous
groupes :
· Sous Groupe Is : Sang total conservé
à -20°C ;
· Sous Groupe Ip : Plasma conservé à
-20°C.
Ø Groupe II : Echantillons constitués de
sang total et de plasma conservés à température ambiante,
avec 2 sous groupes :
· Sous Groupe IIs : Sang total conservé
à température ambiante;
· Sous Groupe IIp : Plasma conservé à
température ambiante.
5.4. Transport
Les cartes conservées à température
ambiante (Groupe II) ont été transportées à
température ambiante dans les enveloppes papiers et les cartes
conservées à - 20° C (Groupes I) ont été
transportées dans des sacs plastiques, contenus dans un pack de camping
contenant la glace pilée. Le transport a duré 8 heures. Les
échantillons conservées à - 20°C sont restés
32 heures hors de leurs conditions initiales.
5.5. Protocoles d'élution et d'extraction
d'ADN
A l'arrivée au laboratoire de Virologie/EA3610 de
Lille, les cartes initialement conservées à - 20°C ont
été remises dans les mêmes conditions, tandis que celles
gardées à température ambiante ont été
gardées comme telle.
Dans le but d'obtenir une méthode d'extraction de l'ADN
total à partir des échantillons séchés sur les
papiers buvards, 2 protocoles ont été réalisés dans
les premières semaines de ce travail. Le premier protocole, utilisant le
kit QIAGEN (QIAGEN S.A, Coutrabeuf, France), décrit par Jardi et al
[37]. Le deuxième protocole a été décrit par
Vauloup-Fellous et al [38]. Il a été utilisé avec
quelques modifications. C'est une méthode dite
« chimique », utilisant le Phenol Chloroforme.
Une première phase expérimentale a
précédé notre étude. Il s'est agi d'une extraction
réalisée sur un sujet, dont le statut VHB n'est pas connu, qui a
été soumis aux mêmes conditions de
prélèvement et de traitement que nos patients, en utilisant les 2
méthodes d'extraction afin de pouvoir les comparer.
Une deuxième phase expérimentale a
consisté à l'extraction des plasmas de deux sujets connus VHB
positif (ADN viral positif) en utilisant les 2 méthodes.
L'extraction de l'ADN de l'ensemble des sujets de
l'étude a été réalisée en utilisant le
protocole décrit par Vauloup-Fellous et al.
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