Memoire Online - Optimisation de la technique d'échantillonnage "headspace" dans le cadre de l'analyse des huiles essentielles

Optimisation de la technique d'échantillonnage « Headspace» dans le cadre de l'analyse des huiles essentielles

Je tiens à remercier les personnes qui m'ont apporté leur aide pour la réalisation de ce mémoire ainsi que ceux qui m'ont fait partager leur expérience et leur réflexion au fil de mon travail. Je pense aussi à ceux qui m'ont apporté leur énergie, leurs encouragements, en m'accordant un peu ou beaucoup de leur temps pour me permettre de mener à bien ce travail.

- Au professeur Duez, promoteur de ce mémoire, pour son accueil chaleureux au sein

du laboratoire de Pharmacognosie et pour sa patiente, sa pédagogie ainsi que pour

Résumé

La technique d'échantillonnage « Headspace » est utilisée depuis une cinquantaine d'années déjà dans divers domaines relatifs à l'analyse de composés volatils en association avec la chromatographie gazeuse. Elle présente l'avantage de pouvoir introduire l'échantillon directement sous forme gazeuse dans l'injecteur du système chromatographique. Ainsi, elle se prête bien à l'étude d'analytes facilement volatilisable présents dans des matrices non chromatographiables comme par exemple l'analyse d'huiles essentielles présentes dans certaines plantes.

Ce mémoire porte sur cette dernière application. Les plantes employées dans cette présentation appartiennent au genre Ocimum L. et sont analysées à l'aide d'un appareillage « Headspace » statique. Etant donné les difficultés rencontrées lors de travaux antérieurs sur des échantillons de ce type, cette étude tente d'identifier et de résoudre les problèmes analytiques en question. Deux aspects distincts sont abordés :

- D'une part, l'influence des différentes méthodes de préparation de l'échantillon sur les analyses en « Headspace ».

- Et d'autre part, l'importance et l'effet des différents paramètres du système « Headspace ».

La technique est donc étudiée de façon globale mais tout en se limitant au cadre d'une analyse sur matière végétale.

La validation d'un tel procédé analytique serait très avantageuse car il est peu coûteux, rapide et permet de s'affranchir des effets de matrice.

Il est cependant apparu que cette méthode analytique, relativement simple en théorie, présente une multitude de paramètres expérimentaux à prendre en considération et s'avère donc relativement complexe à mettre en pratique. Ce travail permet déjà d'apporter certaines informations quant au comportement de l'appareillage « Headspace » vis-à-vis de l'analyse de plantes aromatiques mais une série d'essais supplémentaires s'impose afin de pouvoir valider le processus.

1.	Introduction :		1
	1.1	Applications :	2
	1.2	Principe général :	3
	1.3	Avantages et désavantages :	4
	1.4	Les différents types de « Headspace » :	5
	1.4.1	La « Static Headspace Extraction » (SHE):	5
	1.4.2	La «Dynamic Headspace Extraction» («Purge and Trap»):	6
	1.4.3	La « Solid Phase Microextraction » (SPME) :	7
	1.5	Théorie et application de la « Static Headspace Extraction » (SHE) :	8
	1.5.1	Les différents types d'échantillonnage en SHE :	8
	1.5.2	Le coefficient K :	11
	1.5.3	Le coefficient Beta :	12
	1.5.4	La dérivation :	13
	1.5.5	Préparation de l'échantillon :	14
	1.5.6	Les différents paramètres :	15
	1.5.7	La « Multiple Headspace Extraction » (MHE) :	18
	1.6	Le genre Ocimum :	18
2.	But du Travail :		20
3.	Matériels et méthodes :		21
	3.1	L'échantillon :	21
	3.1.1	Matière végétale :	21
	3.1.2	Préparation de l'échantillon :	21
	3.2	Le système « Headspace » :	22
	3.2.1	Type d'appareillage :	22
	3.2.2	Protocole :	24
	3.3	La Chromatographie Gazeuse :	25
	3.3.1	L'injecteur :	26
	3.3.2	Colonne et phase stationnaire :	26
	3.3.3	Détecteur :	26
	3.3.4	Programme de Température :	27
4.	Résultats et discussion :		27

4.2.3 Variation du temps de remplissage de la boucle (« Loop Fill Time ») : 43

1. Introduction

La découverte du concept chromatographique est généralement attribuée à un botaniste russe du nom de Mikhaïl Tswett (Rouessac and Rouessac 2004). Vers 1900, lors de ses travaux de biochimie végétale, il décide de mettre au point une technique de séparation mettant en oeuvre une colonne remplie de carbonate de calcium et un éluant constitué d'un mélange éther de pétrole - éthanol afin de séparer la chlorophylle et, les caroténoïdes. Il s'agit là du premier modèle de chromatographie (Wilkinson 2003).

Vers 1941, Martin et Synge apportent certains éléments qui vont en quelque sorte révolutionner le domaine de l'analyse chromatographique et cela, aussi bien au niveau de la chromatographie liquide que phase gazeuse ou planaire. Ils reçoivent le prix Nobel en 1952 (Wilkinson 2003).

Mais ce n'est vraiment qu'en 1952 que les premiers travaux sur la chromatographie gazeuse apparaissent avec James et Martin à la suite desquels cette méthode connait un réel essor. En effet, les colonnes capillaires ainsi que des détecteurs à ionisation de flamme, à ionisation à l'argon et à capture d'électrons vont alors faire leur apparition. Par après de nombreuses recherches ont suivi afin de mettre au point de nouvelles colonnes, de nouveaux injecteurs, etc....

Suite à cela, diverses techniques couplées à la chromatographie gazeuse, comme la technique « Headspace », vont faire leur apparition. Sa première utilisation remonte à 1958 ; par après la méthode va se diversifier et différentes versions vont être mises au point. Cette méthode, qui est apparentée à une extraction en phase gazeuse, est couplée à la chromatographie gazeuse

pour l'analyse de composés volatils présents dans des matrices complexes. Elle est
largement répandue dans différents domaines tels que l'agro-alimentaire, la parfumerie, le milieu pharmaceutique, la justice criminelle, l'environnement (Snow and Slack 2002). Un des pionniers de cette technique, Roman Kaiser, un chimiste suisse, a longtemps cherché à mettre au point une méthode d'analyse permettant de travailler sur des senteurs afin de

1.1 Applications

L'analyse de composés volatiles dans les médicaments représente une des applications les plus communes de la méthode d'extraction « Headspace » en industrie (Sitaramaraju, van Hul et al. 2008).

Cette méthode a également trouvé son application dans le domaine de l'analyse biologique, par exemple pour l'analyse de produits de réactions métabolique ou encore pour l'analyse de diverses toxines (Snow and Slack 2002).

Dans le milieu médico-légal, elle est notamment utilisée pour l'analyse de l'alcool dans le sang mais également pour toute une série d'autres composés de faibles poids moléculaires présents dans ce dernier (Dills, Kent et al. 1991). Etant donné sa bonne reproductibilité, sa sensibilité et sa stabilité, cette technique d'extraction s'avère une méthode de choix pour les analyses médico-légales (Snow and Slack 2002).

Pour certaines analyses cliniques elle s'avère également intéressante, par exemple pour l'évaluation de la stabilité de l'éther dans le corps dans le cadre d'une étude portant sur les suicides. Certains chercheurs ont également étudié la variation des composés volatils responsables des odeurs corporelles en fonction de l'âge (Snow and Slack 2002).

Elle est aussi utilisée pour analyser divers arômes naturels et odeurs en parfumerie mais aussi dans le domaine de l'alimentation. Des travaux ont par exemple été menés pour analyser la composition en acétaldéhyde de la bière (Tian 2010) ou des substances aromatiques dans le cognac (Snow and Slack 2002).

Certains ont même étudié la variation des substances volatiles présentes dans le fromage blanc en fonction du type de champignons utilisés pour sa production.

La technique « Headspace » est également largement appliquée dans le domaine environnemental notamment pour l'analyse de polluants. C'est le cas du toluène, un solvant fréquemment utilisé dans l'industrie pétrochimique, pharmaceutique et textile ; la teneur en toluène présente dans les urines d'un groupe de travailleurs a ainsi pu être déterminée (Heidari, Shahtaheri et al. 2008).

En parfumerie, elle est également très utilisée car elle permet de capturer l'odeur d'une plante sans devoir la détruire ni même la cueillir car il suffit de placer une cloche en verre autour de la fleur pour emprisonner directement l'espace de tête au dessus de la fleur (ce qui est un avantage non négligeable pour les plantes protégées ou chères)(Anonyme). Elle permet aussi de capturer et d'étudier des odeurs plus proches, selon les parfumeurs, de l'odeur réellement dégagée par la plante contrairement aux odeurs obtenues par hydrodistillation ou via l'extraction par un solvant organique (Linskens and Jackson 2010). Mises à part les odeurs dégagées par certaines plantes, la technique peut aussi servir pour l'étude d'autres senteurs d'intérêt en parfumerie comme celles présentes sur certains lieux (ex : salon de thé).

Ce type de méthode d'extraction peut donc s'avérer fort intéressant pour l'analyse de composés volatils présents dans des matrices complexes (par exemple un parfum présent dans un savon) et cela sans perte excessive de temps et d'argent et avec une certaine facilité d'utilisation (Restek 2000).

1.2 Principe général

La méthode d'extraction « Headspace » est relativement simple et regroupe en fait une famille de techniques basées sur un principe commun, l'établissement d'un équilibre entre une phase solide ou liquide une phase gazeuse (Zhu and Chai 2005). Dans toutes ces techniques, l'échantillon, solide ou liquide, est introduit dans un flacon en verre qui est ensuite scellé. Ensuite les analytes volatils sont libérés de la matrice complexe pour les faire passer en phase gazeuse (c'est cette phase que l'on appelle « Headspace » ou « Espace de

tête). Ensuite un aliquote de la phase gazeuse est prélevé et introduit dans le chromatographe gazeux où il est analysé (Grob and Barry 2004).

La taille du flacon doit donc être suffisante pour permettre à la phase gazeuse de prendre place. L'échantillon peut être analysé tel quel ou être additionné d'un solvant de dilution ou d'un agent pouvant modifier la matrice (Restek 2000).

L'étape cruciale se situe au niveau de l'équilibre qui s'établit avec la phase gazeuse ; lors du prélèvement de l'échantillon il faut être certain que l'équilibre soit atteint (Grob and Barry 2004).

Deux grands types de « Headspace » ont été développés. D'une part la méthode statique où, une fois l'équilibre atteint, un aliquote de la phase gazeuse est prélevé et transféré à la GC. D'autre part la méthode dynamique (aussi appelée « Purge and Trap ») où l'équilibre n'est jamais atteint étant donné que la phase gazeuse « Headspace » est continuellement renouvelée pour être piégée sur une matière adsorbante (Grob and Barry 2004).

1.3 Avantages et désavantages

La chromatographie gazeuse couplée au « Headspace » (HSGC) permet de travailler sans utiliser de solvant organique ce qui n'est généralement pas le cas en GC classique. Ici le liquide d'extraction est remplacé par un gaz qui est en fait le solvant idéal pour les composés fortement volatils (Kolb and Ettre 2006).

Elle permet donc d'analyser directement un échantillon sous forme solide ou liquide tout en évitant l'effet de matrice, ce qui est avantageux pour la plupart des substrats biologiques ou environnementaux qui sont relativement complexes (Rouseff, Cadwallader et al. 2001). D'autre part, ce procédé permet un réel gain de temps au niveau de la préparation des échantillons, une étape relativement chronophage (Sitaramaraju, van Hul et al. 2008). En effet, dans la plupart des laboratoires, cette étape représente en fait les 2/3 du temps dépensé pour une analyse (la plupart des échantillons nécessitant un traitement préalable adapté à la technique analytique). L'HS-GC permet également de diminuer les erreurs qui peuvent apparaître lors de cette étape de préparation. Ces erreurs peuvent être causées par des impuretés, des pertes d'échantillon,...

Sa facilité d'utilisation et son automatisation sont également deux points positifs (le premier modèle automatisé est apparu en 1967) (Restek 2000).

Toutefois, pour que ce type d'extraction soit utilisable, il faut que la substance recherchée soit fortement volatile. Il faut aussi pouvoir garantir l'établissement de l'équilibre entre la phase gazeuse et l'échantillon (aussi appelé « phase condensée ») (Grob and Barry 2004). Le risque

de perte de gaz lors du transfert de l'échantillon vers la chromatographie gazeuse est aussi problématique pour certains types de « Headspace » (Poole 2009).

1.4 Les différents types de « Headspace »

Il s'agit du type de « Headspace » le plus ancien et le plus classique ; sa première utilisation remonte à 1958. Dans la littérature, le terme général « Headspace » est d'ailleurs souvent utilisé pour désigner la SHE (Hübschmann 2009). C'est la version la plus facilement automatisée et validée de toutes les différentes « Headspace » (Snow and Slack 2002). Elle est utilisée pour les analyses de gammes de concentration plus élevée que les autres versions reprises ci-dessous ; elle est donc moins sensible.

Dans ce système, l'échantillon solide ou liquide, accompagné ou non d'un agent modifiant la matrice, est placé dans un flacon de 10 ou 20 mL qui est ensuite fermé hermétiquement. Le tout est chauffé pendant un temps donné pour atteindre l'équilibre entre la phase gazeuse (« Headspace) et l'échantillon ; la quantité de chaque composé volatil se trouvant dans le « Headspace » est alors proportionnelle à celle contenue dans l'échantillon (Papet, Brunet et al. 2010). Au cours de cette étape, les composés volatils sont donc extraits de la matrice complexe non volatile. Un aliquote de la phase gazeuse est alors prélevé, soit via une seringue (mode manuel), soit via un système de prélèvement automatisé, et est transféré à la GC pour l'analyse (Grob and Barry 2004). Dans les installations modernes, la seringue est remplacée par une boucle de transfert thermostatisée et pressurisée, ce qui permet un transfert plus inerte et plus « propre » vers la GC (Snow and Slack 2002).

La version « statique » ou « d'équilibre » est relativement facile d'utilisation et ne nécessite généralement aucune préparation supplémentaire au niveau de l'échantillon pour ce qui est des analyses qualitatives. En ce qui concerne l'aspect quantitatif, il peut être intéressant de prendre en compte et de minimiser l'effet de matrice pour augmenter la linéarité et la précision. Pour ce type d'analyses on s'orientera donc préférentiellement vers la version « Dynamique » (cf. ci-dessous) qui s'avère être nettement plus fiable (Paris 2002-2003). La SHE étant la technique utilisée pour les diverses analyses reprises pour ce mémoire, elle sera expliquée plus en détails par après.

Cette technique a fait son apparition vers 1970 après la commercialisation du Tenax® un polymère adsorbant fréquemment utilisé (Snow and Slack 2002). Le mode dynamique s'avère être préférable pour l'analyse de traces ou lorsque l'on recherche une extraction plus approfondie des analytes. Elle est donc plus sensible que la version statique car, ici, la quasi-totalité de l'analyte est transférée à la GC contrairement au mode statique où seulement une certaine quantité est prélevée.

Comme pour la version « statique », l'extraction à partir de la matrice est fortement liée à la volatilité de l'analyte. Pour principale différence, la version dynamique ne laisse pas l'équilibre s'établir entre l'échantillon et la phase gazeuse. En effet, un flux continu de gaz vecteur (par exemple, l'héliumn, le « Purge Gas ») permet de balayer en permanence soit la phase gazeuse « Headspace » soit directement l'échantillon empêchant ainsi l'établissement de l'équilibre. Cette étape de « Purge » est réalisée pendant une durée bien déterminée. L'extraction de l'analyte est ainsi facilitée grâce à la formation d'un gradient de concentration ; les analytes sont entraînés par le gaz porteur pour être piégés et concentrés juste avant l'analyse, d'où le nom « Purge And trap »(Grob and Barry 2004). Le système piégeant l'analyte doit remplir certains critères, notamment le fait de retenir essentiellement l'analyte d'intérêt, de permettre une injection rapide au niveau de la colonne et de ne pas introduire d'impuretés dans le système.

Ensuite une désorption thermique au niveau du piège permet à l'analyte de passer dans le GC.

Le couplage « Headspace - SPME », apparu en 1993, a été developpé par la société « Supelco ». Il s'agit d'une nouvelle alternative de « Headspace » qui peut être également couplée à la HPLC. Cette technique a fait l'objet de nombreuses recherches durant les dernières décennies. Elle peut être utilisée pour une large gamme d'applications pour lesquelles elle a été validée (Papet, Brunet et al. 2010). Au début de son utilisation, les scientifiques ont rencontré divers problèmes technique pour ce qui est de sa reproductibilité, de son automatisation et de son chauffage mais, aujourd'hui, de nombreuses solutions ont été apportées et elle est maintenant utilisée pour mener des analyses complexes et ce, dans des gammes de concentrations relativement faibles. (Snow and Slack 2002)

La technique consiste à introduire dans l'espace de tête de l'échantillon une seringue rétractable remplie d'une fibre en silice fondue imprégnée d'une phase stationnaire polymérique (par exemple du polyacrylate ou du divinyl benzène). Celle-ci va piéger et concentrer les analytes se trouvant dans cette phase confinée. La seringue est ensuite introduite dans l'injecteur où il y a désorption thermique, ce qui permet à l'analyte d'être libéré dans le GC. Une même fibre peut être réutilisée jusqu'à cinquante fois. La SPME peut être couplée à un mode statique ou dynamique de « Headspace », leur association permettant d'augmenter la sensibilité et de diminuer les limites de détection et de quantification. (Papet, Brunet et al. 2010)

1.5 Théorie et application de la « Static Headspace Extraction » (SHE)

La totalité des analyses reprises dans ce mémoire ayant été menées sur SHE, la théorie et l'application de celle-ci seront vues plus en détails.

1.5.1 Les différents types d'échantillonnage en SHE

En SHE divers types d'instrumentation, automatisés ou non, permettent d'extraire les composés d'intérêts. Parmi ceux-ci on rencontre 3 grandes classes d'appareillage :

- « Système à équilibre de pression » - « Système avec boucle - pression »

Dans ce genre de configuration, une seringue étanche permet de transférer l'échantillon de l'espace de tête à la GC. Il existe des systèmes à seringues manuels ou automatisés.

D'une part, ceux-ci ne sont pas thermostatisés ; il y a donc un risque de recondensation dans la seringue lors du transfert de l'aliquote. Il est d'ailleurs conseillé de préchauffer la seringue dans un four à 90°C avant d'effectuer le transfert, ce qui semble peu pratique.

D'autre part, lors du transfert à la GC, la pression au sein de la seringue n'est pas contrôlée et peut donc varier. Pour pallier ce problème, des valves ont été développées, permettant de bloquer le système pour empêcher les fuites (cf. Valves Luer-Lock) (Kolb and Ettre 2006).

Actuellement, les systèmes automatisés sont nettement plus répandus. L'échantillon est tout d'abord thermostatisé à une certaine température et pendant un certain temps. Une fois l'équilibre atteint, le prélèvement est effectué via la seringue et injecté dans la GC. Le point positif est qu'ici la seringue est thermostatisée (Kolb and Ettre 2006).

Figure 5 : Système « Injection par seringue étanche aux gaz » ( Restek (2000)

Comme pour les autres techniques, l'échantillon est thermostatisé à une certaine température pendant un temps donné. Une fois l'équilibre atteint, l'échantillon est pressurisé à une pression supérieure à celle de la colonne par apport de gaz vecteur via une aiguille introduite dans le récipient. Après ces deux étapes d'équilibrage et de pressurisation, la valve est fermée et l'afflux de gaz vecteur interrompu. L'échantillon est alors connecté à la GC via une ligne de transfert chauffée qui reste ouverte durant un certain laps de temps. Grâce à la différence de pression qui a été établie, l'échantillon est transféré à la GC (Kolb and Ettre 2006). Différents paramètres peuvent être contrôlés comme par exemple la pression établie dans le vial ou encore le temps de transfert.

Ce genre d'appareillage permet en principe d'obtenir des résultats présentant une bonne reproductibilité. Cela est dû notamment au fait que le nombre de pièces utilisées pour le transfert est relativement réduit ce qui évite en grande partie les éventuelles pertes par

Ce type d'échantillonnage ne permet cependant pas de connaître avec exactitude le volume prélevé ; le temps d'ouverture de la boucle ne définit en effet le volume prélevé qui dépend aussi de tous les autres paramètres (pression, temps de pressurisation, température,...) (Restek 2000).

Une des premières versions automatisées de ce type d'instrument est apparue en 1967 (Kolb and Ettre 2006).

Figure 6 : Système à équilibre de pression (Grob, R. L. and E. F. Barry (2004)

Une fois l'équilibre atteint, l'échantillon est pressurisé grâce au gaz vecteur, de manière similaire à la configuration précédente. Comme principale différence, l'injection ne se fait pas directement dans la colonne. En effet, comme son nom l'indique, cette technique fait intervenir une boucle (« Loop ») qui sert d'intermédiaire entre le vial du « Headspace » et la GC (Pawliszyn 2002).

Tout d'abord, l'aliquote du « Headspace » va remplir la boucle grâce à la différence de pression précédemment établie. Ensuite le contenu de la boucle sera lui-même introduit dans la GC de manière habituelle. Tout cela grâce à une valve à 6 entrées (Kolb and Ettre 2006). Cette version présente certains avantages et désavantages. Sur le plan positif, le fait de pouvoir thermostatiser la boucle permet de réduire les pertes des composés de hauts poids moléculaires par adsorption,... De plus avec ce système, le volume de la boucle est connu et fixe (contrairement au système précédent), ce qui permet d'augmenter la reproductibilité (Restek 2000).

Comme principal inconvénient, une analyse précédente peut contaminer la boucle du système (« Carryover »), pour provoquer l'apparition de pics parasites (« Ghost Peaks »). Ce dernier modèle est celui utilisé pour les diverses analyses reprises dans ce mémoire.

1.5.2 Le coefficient K

La préparation de l'échantillon doit être effectuée de telle sorte que la concentration de l'analyte au niveau de l'espace de tête soit maximale et que les contaminations provenant de la matrice soient minimales (Restek 2000). Ceci est basé sur le coefficient de partage K qui définit la distribution de l'analyte entre la phase condensée de l'échantillon et la phase gazeuse. Les composés ayant un faible coefficient auront plus facilement tendance à passer dans la phase gazeuse ; ces composés seront plus facilement détectables (par exemple l'hexane dans l'eau). Et inversement, pour les composés ayant un coefficient élevé, ceux-ci présenteront une limite de détection élevée et conduiront à l'obtention d'un signal faible (par exemple l'éthanol dans l'eau) (Flanagan, Taylor et al. 2007).

Plusieurs paramètres permettent de diminuer la valeur du coefficient K : ? La température du flacon

Pour l'éthanol par exemple, le fait de passer de 40°C à 80°C au niveau du vial permet de diminuer d'environ 4 fois le coefficient de partage (Restek 2000).

Le coefficient peut être réduit par l'ajout d'un sel inorganique. Ceci est valable pour un échantillon de type aqueux et pour faciliter le passage des substances organiques polaires. L'ajout de sel permet alors de diminuer leur solubilité et d'augmenter leur concentration au niveau du « Headspace ». Cet effet n'est quasiment pas visible sur les composés ayant un coefficient moyennement élevé (Restek 2000).

Il faut aussi travailler avec des concentrations en sel relativement élevées pour pouvoir réellement augmenter la sensibilité.

Certains problèmes peuvent survenir suite à l'ajout de sel comme l'augmentation de la viscosité des échantillons aqueux, augmentant ainsi le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre. Certains sels contiennent aussi des impuretés pouvant contaminer l'analyse. Il a été suggéré que cette amélioration de la sensibilité due au « salting out » dans le cadre de l'HS-GC ne serait pas exclusivement due à l'ajout du sel ; le fait d'ajouter une certaine quantité de sel permettrait également d'augmenter le volume de l'échantillon et, de ce fait, d'augmenter la sensibilité (par diminution du coefficient voir 1.5.3) (Kolb and Ettre 2006).

1.5.3 Le coefficient Beta

Le coefficient f3 est défini comme le volume occupé par le phase gazeuse « Headspace » par rapport à celui de la phase condensée de l'échantillon. Une valeur faible de f3 permet généralement une réponse plus élevée mais cette relation ne se vérifie pas toujours. Il convient tout d'abord d'optimiser l'échantillon pour diminuer la valeur du coefficient K avant même de penser à modifier le coefficient f3 (par exemple en augmentant la taille de l'échantillon) (Kolb and Ettre 2006).

1.5.4 La dérivation

La dérivation est une autre technique permettant d'augmenter la sensibilité et les performances de l'analyse « Headspace ». Il s'agit d'une « réaction chimique quantitative entre un réactif et une molécule peu ou non volatile pour augmenter sa volatilité, par diminution des tensions internes (liaisons inter- et intramoléculaires) comme, par exemple, l'estérification des fonctions carboxyliques » (Sternberg 2003 - 2004).

Elle concerne principalement les alcools, les acides et les amines qui sont des composés pouvant présenter certaines difficultés lors des analyses de par la présence de liens hydrogènes. Ces espèces peuvent se condenser ou s'adsorber au niveau de l'orifice lors de l'injection ou au niveau de la colonne, ce qui provoque une diminution de la réponse de l'appareil. Elles présentent également une grande solubilité au sein des échantillons aqueux, ce qui provoque une diminution du signal (Restek 2000).

La dérivation peut permettre de diminuer les effets d'adsorption lors de l'injection dans le GC et également d'augmenter la volatilité de l'analyte. Pour ce faire, toute une série de réactions sont possibles comme l'estérification, l'acétylation, la silylation ou l'alkylation. Ces réactions se déroulent souvent à hautes températures au sein même du vial et peuvent créer une pression supplémentaire à celle tolérée par le septum et le récipient ; il existe donc des septums spéciaux pouvant tolérer un certain excès de pression. Il faut toutefois être attentif au fait que ces réactions de dérivation peuvent dans certains cas faire apparaître des produits de réactions volatils et perturbent l'analyse du « Headspace » (surtout dans le cas où leur temps de rétention est proche de celui de l'analyte) (Restek 2000).

1.5.5 Préparation de l'échantillon

La préparation de l'échantillon doit se faire de telle sorte que la concentration de l'analyte dans la phase gazeuse soit maximale tout en minimisant les contaminations pouvant provenir de la matrice. Par exemple l'eau peut poser problème en se recondensant dans la ligne de transfert.

Les échantillons fortement concentrés peuvent également être responsables de « carry over¹ » ; c'est pourquoi on conseille de procéder par ordre croissant de concentration lors d'une analyse. Dans le cas où on est certain que l'échantillon précédent a contaminé la colonne, celle-ci peut être chauffée à sa température maximale pour en quelque sorte la « décrasser ».

De même, le fait de travailler avec des températures plus élevées au niveau de la ligne de transfert permet de diminuer le phénomène de « carry over » (Restek 2000).

Les échantillons solides fréquemment analysés en « Headspace » sont les médicaments, les matériaux pour emballages imprimés (films plastiques, aluminium,...), les sols et les polymères (Kolb and Ettre 2006).

Il s'avère parfois difficile pour ce type d'échantillons d'atteindre l'équilibre (étape indispensable pour les analyses quantitatives). En effet, les substances volatiles à analyser peuvent parfois être emprisonnées dans l'échantillon ce qui nécessite un temps considérable pour atteindre l'équilibre. Il faut donc pouvoir garantir l'établissement de celui-ci et ce, dans un laps de temps raisonnable. Dans un tel cas, il est alors nécessaire de modifier l'état physique de l'échantillon.

- soit l'analyse du solide tel quel (méthode valable pour les solides permettant d'atteindre l'équilibre facilement)

- Soit l'ajout d'un solvant (dans le cas où le solide ne permet pas d'atteindre l'équilibre) - Soit le broyage du solide (dans le cas où le solide ne permet pas d'atteindre l'équilibre)

L'ajout d'un solvant permet de transférer l'échantillon dans le liquide, ce qui est intéressant car le travail sur matière liquide s'avère être nettement plus simple, l'équilibre étant en

¹ Il s'agit d'une contamination provenant d'une analyse précédente et qui provoque l'apparition d'un pic parasite sur le chromatogramme.

principe atteint nettement plus rapidement. Cependant, cette approche provoque bien souvent une diminution du signal en comparaison avec l'analyse sur poudre sèche (à cause de la viscosité du solvant,...). Il y a donc une certaine perte de sensibilité. Cette méthode présente un second inconvénient ; en effet, le solvant organique utilisé entraîne bien souvent une solubilisation de l'analyte. Ce phénomène va donc provoquer une augmentation du coefficient de partage (généralement faible dans les échantillons solides) diminuant ainsi la concentration d'analyte en phase gazeuse (Grob and Barry 2004).

Le broyage, quant à lui, permet d'augmenter la surface disponible pour le passage dans le « Headspace ». Pour moudre le solide sans générer de chaleur excessive, on utilise en général la technique du cryobroyage qui consiste à broyer l'échantillon en présence de dioxyde de carbone ou d'azote liquide. Cette technique permet de réduire nettement la taille de l'échantillon tout en évitant les pertes et dégradations pouvant provenir d'une augmentation de température (Kolb and Ettre 2006).

Cette diminution de taille permet de réduire nettement le temps de diffusion et d'atteindre plus facilement l'équilibre. Il faut noter que les échantillons préparés par ce procédé doivent être mélangés avant d'être analysés s'ils ont été stockés un certain temps car un gradient de concentration a pu s'établir durant le stockage (Grob and Barry 2004).

La préparation des échantillons liquides en SHE se fait habituellement de manière assez simple. En général, l'échantillon est tout simplement introduit dans le vial qui est ensuite rapidement scellé pour limiter les pertes (Grob and Barry 2004).

1.5.6 Les différents paramètres

Le choix des divers paramètres doit se faire de manière judicieuse. En effet, il faut pouvoir maximiser le signal et la sensibilité tout en minimisant le temps et le matériel utilisé.

La température à laquelle le vial sera chauffé va permettre d'influencer la pression de vapeur de l'analyte. Cette pression de vapeur est une variable très importante pour cette technique analytique car elle joue sur le passage de l'analyte en phase gazeuse. La pression varie de manière exponentielle, dès lors,une faible différence de température peut avoir une très forte influence sur la réponse obtenue. Le fait d'augmenter la température permet de diminuer le coefficient K (cf. section 1.5.2) et donc d'augmenter la pression de vapeur. Ce phénomène est

surtout visible pour les composés avec une valeur élevée du coefficient K (une molécule polaire dans une matrice aqueuse par exemple) (Muffet 2011). Une augmentation de température permet donc d'accroître le flux d'évaporation et de diminuer le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre, ce qui va également influencer la concentration à saturation (Papet, Brunet et al. 2010).

Ce paramètre a donc une influence directe sur la sensibilité et sur le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre. La température influence aussi la solubilité dans le milieu à analyser (Kolb and Ettre 2006).

Toutefois cette règle n'est pas universelle. En effet, certains composés peuvent être décomposés par la chaleur ou peuvent être impliqués dans des phénomènes d'oxydation (Kolb and Ettre 2006). Certains composés parasites présents dans la matrice peuvent aussi voir leur volatilité augmenter (Hübschmann 2009).

Il faut aussi se méfier de l'augmentation de pression dans l'espace de tête pouvant provenir du solvant présent dans le vial. Cette augmentation peut être responsable de divers problème analytiques notamment d'un déséquilibre de pression lors du prélèvement d'un aliquote¹. Cette réalité concerne surtout les solvants à basse température d'ébullition, ce qui pousse l'analyste à préférer des solvants présentant des hauts points d'ébullition. On conseille en général de ne pas travailler à une température supérieure à 10°C au dessus de la température d'ébullition d'un solvant (Anonyme 2000) .

Le temps durant lequel l'échantillon est chauffé joue aussi un rôle important pour le transfert de l'analyte dans l'espace de tête. Ce paramètre est déterminé en fonction de la quantité d'échantillon, du type d'échantillon, du coefficient de partage de l'analyte,... Il existe pour chaque analyte un temps d'équilibration optimal. En effet il ne faut pas que celui-ci (i) soit inférieur au temps nécessaire pour atteindre l'équilibre (ce qui entrainerait des problèmes de reproductibilité) ; et (ii) soit supérieur au temps optimal car, même sans modification du signal, il s'agit là d'une perte de temps inutile. Pour déterminer le temps de chauffe idéal, il est habituellement conseillé de procéder par balayage en faisant varier la température pour évaluer l'évolution de l'aire du pic d'intérêt en fonction du temps de chauffe (Anonyme 2000).

Le type de vial choisi doit correspondre à la taille de l'échantillon. A ce niveau-ci, de nombreuses contaminations peuvent apparaître suite à un nettoyage incomplet ou encore via l'adsorption de contaminant.

¹ La plupart des systèmes de prélèvement étant basés sur une différence de pression.

Le type de septum doit aussi permettre d'éviter d'éventuelles contaminations. Le Teflon® permet en général de minimiser les risques (Restek 2000).

Le fait de mélanger l'échantillon lors du chauffage permet de faciliter le passage à l'état d'équilibre (Restek 2000). Pour certaines analyses, le temps d'équilibration a pu être réduit de 45 à 10 min grâce à cette étape de mélange (Hübschmann 2009).

Après l'étape de pressurisation, une partie du « Headspace » est transférée dans la boucle grâce à la différence de pression préétablie. Il est possible de régler le temps de remplissage de la boucle (le temps durant lequel le mélange gazeux « Headspace - Gaz de pressurisation » traverse la boucle) ainsi que le temps d'équilibration de la boucle (le temps nécessaire pour permettre au mélange gazeux d'atteindre la température de la boucle et permettre de stabiliser la pression) (Anonyme 2000).

Pour cette étape, il est possible de définir non seulement la pression établie dans le flacon mais aussi le temps durant lequel le tout est pressurisé.

Pour la majorité des échantillons liquides, la pression développée dans le milieu est suffisante pour permettre le passage dans la boucle. En revanche pour les matières solides cela peut poser problème. Il est alors nécessaire de pressuriser et d'ajouter une pression supplémentaire. Les valeurs usuelles de pressions dans le flacon sont de l'ordre de 1.5 à 2 Atm. Pour pouvoir définir la pression optimale pour une analyse donnée il est conseillé ici également de procéder par balayage (pour des mêmes valeurs de temps et de température) en portant sur graphique l'aire du pic en fonction de la pression.

Pour le temps de pressurisation, les valeurs habituelles vont de 10 à 30 secondes (Anonyme 2000).

Il s'agit du temps nécessaire pour transférer la totalité du contenu de la boucle vers la GC. Ce temps doit être suffisant pour que la totalité de l'aliquote puisse passer. En cas de temps trop court, une partie de la quantité prélevée serait perdue, ce qui impliquerait une perte de sensibilité. Il est dès lors vivement conseillé de fixer cette valeur à un niveau suffisamment

élevé afin de garantir la totalité du transfert. Il faut aussi noter qu'un temps excessif ne représente pas un problème en soi (Anonyme 2000).

Le fait d'augmenter la quantité d'échantillon permet en général d'obtenir une meilleure sensibilité. Dans le cas où la sensibilité n'est pas primordiale, cette approche s'avère cependant être peu intéressante car le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre se trouve alors augmenté.

1.5.7 La « Multiple Headspace Extraction » (MHE)

La MHE est une méthode quantitative qui consiste à prélever successivement plusieurs aliquotes d'un même échantillon. L'aire du pic obtenu va alors diminuer proportionnellement avec le nombre de prélèvements. Une fois l'analyse terminée (c'est-à-dire lorsque l'aire du pic vaut zéro), la somme des aires des pics obtenus est calculée, ce qui fournit la quantité totale d'analyte présent dans l'échantillon (Kolb and Ettre 2006). De nos jours, les prélèvements ne se font plus jusqu'à l'obtention d'une aire de pic nulle vu la perte de temps trop importante qui en découlerait. Après un nombre limité de prélèvements (2 à 4) la quantité totale du composé est alors déterminée au moyen d'une analyse par régression linéaire (Grob and Barry 2004).

Lors de cette analyse, la valeur du coefficient K ne varie pas, ce qui ne change donc pas l'affinité de l'analyte pour le milieu. Cette technique présente l'avantage de s'affranchir des effets de matrice et s'avère utile également lorsque l'utilisation de standard est compromise (Jordi 2004).

1.6 Le genre Ocimum

Le genre Ocimum appartient à la famille des Lamiaceae et à la sous-famille des Nepetoidae. Les plantes appartenant à ce genre sont utilisée depuis plus de 3000 ans pour un usage médicinal et alimentaire (Johnson and Franz 2002). Au niveau taxonomique, la place du genre n'est pas très claire, en effet, à cause de nombreux phénomènes d'hybridation et de polyploïdie, la classification en est devenue plus complexe (Bhowon, Jhaumeer-Laulloo et al. 2012). Il comprend au total pas moins de 65 espèces (Paton, Harley et al. 1999) dont le représentant le plus connu est le basilic (Ocimum basilicum L.) Celui-ci est originaire d'Inde et peut être utilisé comme condiment frais ou séché (Klimánková, Holadová et al. 2008). Mis

à part l'assaisonnement de divers plats, il est également utilisé en médecine traditionnelle pour traiter les maux de tête, la diarrhée, les troubles rénaux,...(Grayer, Vieira et al. 2004). Le type de basilic cultivé mais aussi les conditions environnementales ont une influence sur les teneurs des différents composés responsables de l'arôme développé (Jirovetz, Buschbauer et al. 2003). Ces composés sont, notamment, l'estragole, le linalool, le 1,8 cinéole et le méthyl eugénol (Lee, Umano et al. 2005). Pour pouvoir étudier la composition de l'huile essentielle de ces plantes il faut au préalable les extraire. Pour ce faire, il existe diverses méthodes comme la distillation à la vapeur d'eau, l'extraction par un solvant ou encore l'extraction en espace de tête. Il faut noter que les monoterpènes présents peuvent être facilement perdus ou encore altérés lors de l'extraction. Avec l'hydrodistillation par exemple, les monoterpènes peuvent subir des modifications chimiques lors du chauffage en présence d'eau. Avec l'extraction par un solvant, des pertes peuvent aussi apparaître lors de l'élimination de ce dernier. Le choix d'une méthode d'extraction douce et adéquate s'avère donc nécessaire (Klimánková, Holadová et al. 2008).

2. But du Travail

Le couplage HS-GC parait, en théorie, la solution idéale pour l'analyse de composés volatils présents dans une matrice non chromatographiable et donc pour l'analyse des huiles essentielles dans des plantes médicinales. Cependant le nombre de paramètres à optimiser est conséquent (aussi bien pour la préparation de l'échantillon (afin d'optimiser l'extraction « Headspace ») que pour les différents paramètres de l'appareillage en lui-même). Il faut donc pouvoir s'assurer de travailler avec les meilleures conditions pour un type d'analyse donné. Cette optimisation des paramètres permet de garantir l'établissement de l'équilibre (indispensable pour la reproductibilité d'une analyse à l'autre) ainsi qu'une extraction et un transfert efficaces des composés volatils.

Des résultats précédents ont montré cependant que la technique présentait quelques disparités au cours des analyses d'Ocimum. En effet, lors de travaux effectués sur échantillons solides (fragments de plantes ou poudre végétale), une certaine discrimination entre les différents composés présents dans l'échantillon est apparue. Quelques composés présentant les temps de rétention les plus faibles évoluent de manière proportionnelle et plus ou moins linéaire avec la quantité de plante introduite dans le vial alors que les composés plus fortement retenus, eux, ne suivent pas du tout cette évolution (Michel 2012).

Etant donné que l'analyse sur échantillon solide s'avère être nettement plus complexe (en comparaison avec les matières liquides), il va falloir aussi bien s'axer sur la préparation de l'échantillon que sur l'appareillage « Headspace » en lui-même. L'objectif est donc de diminuer les effets de matrices (libération des composés volatils, adsorption éventuelle,...), de permettre un passage homogène des composés en phase gazeuse (ce passage étant défini par le « chemin » parcouru par l'analyte pour gagner la phase gazeuse) et, bien sûr, de définir les valeurs optimales pour les paramètres de l'extraction en espace de tête (température, temps d'équilibration,...).

Le but étant aussi de pouvoir observer et comprendre l'impact qu'a chacun des différents facteurs sur l'analyse des huiles essentielles en espace de tête.

3. Matériels et méthodes 3.1 L'échantillon

3.1.1 Matière végétale

Une première partie des analyses a été effectuée sur des feuilles d'Ocimum centraliafricanum R.E. Fries (Paton, Harley et al. 1999) provenant de République Démocratique du Congo et plus précisément des mines de Kasonta et Luiswishi. Il s'agit d'une plante herbacée vivace que l'on trouve essentiellement en Afrique du Sud et qui supporte des sols exceptionnellement riches en cuivre. Elle mesure entre 15 et 75 cm de hauteur, les feuilles sont opposées, ascendantes et sessiles. Cet échantillon a été prélevé et séché à l'air libre puis introduit dans un sachet hermétiquement fermé en présence de silicagel (afin de garantir l'absence d'eau) (Michel 2012).

Cependant, vu la faible rémanence de composés volatils dans ces échantillons de 2011, il a été décidé d'opter pour Ocimum basilicum L. que nous avons acheté en grande surface. Il s'agit du basilic de la marque « Carrefour® : Selection » (lot : L2282BA, 15 g) et de la marque « Ducros®» (12 g).

3.1.2 Préparation de l'échantillon

La quantité de feuilles nécessaire est prélevée puis coupée à l'aide de ciseaux. Le tout est introduit dans un récipient en INOX® pour procéder à un cryobroyage ; de l'azote liquide est versé sur la matière végétale qui est alors congelée et devient cassante, le tout est alors broyé

à l'aide d'un pilon ce qui donne une poudre relativement fine et homogène (voir figure 12). Celle-ci est finalement introduite dans un récipient hermétiquement fermé de 20 mL. Cette technique permet d'obtenir une poudre de fine granulométrie exempte de solvant et cela sans altérer la matière végétale. En effet, les température atteintes lors du broyage restent très faibles, ce qui permet de ne pas altérer les composés fragiles et instables (Mathieu and Fonteneau 2008).

3.2 Le système « Headspace »

Le modèle de « Headspace » utilisé dans cette étude est de type statique équipé d'un système de prélèvement « Boucle - Pression » (voir point 1.5.1). Il s'agit du modèle « Agilent® 7694 E Headspace Sampler » et plus précisément de la version « G1883 ». Cet appareil analytique est muni d'un plateau tournant dans lequel peuvent être introduits jusqu'à 12 vials (de 10 ou 20 mL).

Ce modèle dispose de trois zones chauffées distinctes qui sont le four pour le vial, la boucle et la ligne de transfert. Au niveau du vial, le système de chauffe est constitué d'un bloc métallique fonctionnant au moyen d'une résistance. La ligne de transfert, composée de nickel, sert de jonction entre le « Headspace » et le GC.

Les pressions de la voie pour le gaz porteur du GC et la voie servant à la pressurisation du vial peuvent être réglées manuellement au niveau du « Headspace ».

Cet instrument est également muni d'un bras robotisé permettant de surélever le vial à analyser et ensuite de percer le septum du récipient pour le prélèvement.

Avant de procéder aux diverses analyses, une série d'étalons externes a été sélectionnée et analysée selon (Masada 1976). La liste de ces différents standards est reprise ci-dessous :

Les étalons ont été prélevés au moyen de capillaires en verre et une quantité de 5 uL a été introduite dans chaque vial.

Entre chaque série d'analyses, un essai à blanc a été effectué afin de détecter d'éventuelles contaminations (« Carry-Over »).

Pour chaque analyse, une certaine quantité d'échantillon est introduite dans un vial de type « Agilent® Technologies, Flat Bottom Headspace Vials » de 10 mL (n° lot : 914-09-12/001) qui est scellé par un septum « 20mm Tan PTFE/White Silicone Septa (Agilent® Technologies) (n° lot : 122393-1-1) grâce au cerclage en aluminium « Agilent 20 mm, Crimp Cap Headspace, Safety Release».

Le vial est alors introduit dans le carrousel, agité pendant une minute puis chauffé à 90°C pendant 35 minutes. Il est ensuite surélevé et percé par une aiguille afin de prélever un aliquote de l'espace de tête. La suite se déroule comme expliqué au paragraphe « 1.5.1 » section « Système Boucle - Pression ». L'ensemble des paramètres du « Headspace » est repris dans le tableau ci-dessous.

	Temps (min)
Equilibrage du vial	34,00
Pressurisation	1,00
Remplissage de la boucle	0,20
Equilibration de la boucle	0,05
Injection	1,00
Cycle GC	33,75
Mélange	1,00
	Température (°C)
Vial	100
Boucle	110
Ligne de transfert	120
	Pression (PSI)¹
Vial	22.04
Gaz porteur	21,30

3.3 La Chromatographie Gazeuse

Le système GC appartient à la marque « Hewlett Packard® », il s'agit du modèle « 6890 Series GC System ».

3.3.1 L'injecteur

Il s'agit d'un injecteur de type « EPC - Split - Splitless- Inlet ». Dans la configuration « Split », le gaz vecteur se mélange à l'échantillon gazeux et seule une faible quantité est injectée dans la colonne (la majorité restante étant éliminée). Ce type d'injecteur permet d'éviter la saturation des sites de rétention des colonnes à faible capacité (Kauffmann and Van

Le gaz vecteur est l'hélium, à un flux de 2,0 mL / min. Le rapport de division (« split ratio ») est réglé à 1,0 (on travaille donc en mode « Splitless ») et la température de l'injecteur est de

3.3.2 Colonne et phase stationnaire

Il s'agit d'une colonne capillaire du type Agilent 19091L-333 HP, 50+50% Phenyl Methyl Siloxane, 30,0 m x 250 um (i.d), épaisseur de film 0,10 um. Elle résiste à une température maximale de 310°C. La phase stationnaire appartient à la famille des polysiloxanes sur lesquels sont greffées des chaînes alkyles (méthyl et phényl). Ce type de colonne permet de travailler sur des gammes de température relativement larges (Rouessac and Rouessac 2004).

3.3.3 Détecteur

Il s'agit d'un détecteur à ionisation de flamme (« FID ») qui se prête relativement bien à l'analyse des substances organiques volatiles. Les analytes sont entraînés dans la flamme alimentée par de l'hydrogène et de l'air, ce qui le décompose en ions qui créent un courant supérieur à celui mesuré en présence du gaz vecteur.

Les détecteurs FID sont universels et présentent une bonne sensibilité ainsi qu'un large champ de linéarité. Cependant ils impliquent inévitablement la destruction de l'échantillon et ils sont non spécifiques (Vaubourdolle 2007).

La température du détecteur est de 250°C et les débits d'air et d'hydrogène sont, respectivement, de : 400 et 30 mL/min.

Le four commence par chauffer la colonne à 60°C pendant 1 minute. Ensuite il augmente de 4°C/min jusqu'à 125°C. Puis à raison de 10°C/min jusque 230°C. Et enfin il redescend à 40°C, température maintenue pendant 6 minutes (période de rééquilibrage) La durée totale d'un cycle est de 33,75 minutes. Il est important d'établir un léger décalage entre le « Headspace » (34,00 min) et le GC (33,75 min) pour permettre l'enchaînement des analyses.

3.3.5 Analyse Statistique :

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du programme informatique « MODDE 9.1 ». Ce dernier a permis d'établir le plan factoriel et d'évaluer les effets de chaque paramètre représenté.

4. Résultats et discussion

- La première partie porte essentiellement sur la préparation de l'échantillon. Elle aborde certains points, notamment l'influence du type de broyage, de l'ajout d'un solvant ou de l'effet « Salting-out ».

- La seconde partie s'axe essentiellement sur l'optimisation des paramètres de l'appareillage «Headspace ». Dans cette partie, les différents paramètres du « Headspace » sont étudiés à l'aide d'un plan factoriel afin de voir l'impact qu'a chacun d'eux sur les analyses. Les valeurs optimales sont également déterminées pour les paramètres influençant les résultats chromatographiques.

Pour l'entièreté des tests, le programme du GC est resté le même comme décrit dans la section « Matériel et méthodes » ; c'est pourquoi seuls les paramètres du « Headspace » seront précisés pour chacune des analyses.

Les valeurs initiales des paramètres du « Headspace » sont reprises ci-dessous (voir tableau 3).

	Temps (min)
Equilibrage du vial	34
Pressurisation	1
Remplissage de la boucle	0,1
Equilibration de la boucle	0,05
Injection	1
Cycle GC	33,75
Mélange	1
	Température (°C)
Vial	90
Boucle	100
Ligne de transfert	110
	Pression (PSI)
Vial	15,50
Gaz porteur	21,3

4.1.1 Comparaison des méthodes de broyage

L'échantillon a été broyé avant chaque analyse afin d'obtenir une libération optimale des composés volatils à partir de la poudre, rendue homogène. Dans cette section, deux méthodes de broyages sont comparées ; le broyage à l'aide d'un pilon et le cryobroyage. Une seule des

Pour rappel, le cryobroyage permet d'obtenir une poudre d'une fine granulométrie et d'une homogénéité satisfaisante tout en préservant les composés instables et fragiles présents dans la matière végétale (Anonyme 2012).

Afin d'évaluer l'éventuelle amélioration que cette technique peut apporter à une analyse, une étude de linéarité a été réalisée avec, d'une part, la méthode de « cryobroyage » et, d'autre part, la méthode classique avec broyage par pilon en verre. Pour chacune d'elles, une série de 9 essais a été réalisée avec trois groupes de masses différentes (3 essais par masse) à savoir : 100, 200 et 300 mg. Les graphiques de l'aire de pics (en pA.s) en fonction de la masse ont ensuite été tracés.

Sur ces graphiques, il apparaît clairement que l'aire des pics évolue de manière nettement plus uniforme avec la méthode du « cryobroyage » (figure 16 et 17).

Figure 16 : Linéarité de 4 pics différents en fonction de la masse d'un échantillon d'Ocimum centraliafricanum, broyage à l'aide d'une baguette en verre. Températures « Headspace » : 90°C (vial) / 100 °C (boucle) / 110°C (ligne de transfert), 3 essais par masse. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Figure 17 : Linéarité de 4 pics différents en fonction de la masse d'un échantillon d'Ocimum centraliafricanum à l'aide du cryobroyage. T° « Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert), 3 essais par masse. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Les aires augmentent de manière nettement plus linéaire, ce qui se traduit par des valeurs de « R² » plus satisfaisantes (figure 18).

Figure 18 : Valeurs des « R² » obtenues pour chacune des deux méthodes de broyage et pour les 4 composés différents (3masses analysées en triplicate).

Le fait d'obtenir une poudre plus fine et plus homogène permet donc une diffusion plus facile et moins aléatoire dans l'espace de tête. Toutefois, il semble que l'aire du pic le plus retenu (avec le T.R le plus élevé soit : 4,263 min) présente une valeur du « R² » encore faible soit : 0,6467.

Selon (Kolb and Ettre 2006), les composés présentant un faible coefficient de partage ( qui implique une faible affinité pour l'échantillon), sont les composés pour lesquels l'augmentation du volume de l'échantillon aura un effet significatif au niveau de l'aire du pic. A l'opposé des composés caractérisés par une valeur élevée du coefficient ne sont, eux, que peu ou pas influencé par la quantité d'échantillon. Ceci confirme nos observations ; les composés les plus volatils (avec les temps de rétention les plus faibles) varient fortement avec le volume de l'échantillon à l'opposé des composés présentant une faible volatilité.

Les prélèvements d'O. centraliafricanum ayant été effectués il y a plusieurs mois, il est fort probable que la teneur en composés volatils aie nettement diminué au fil du temps. Les conditions de conservation n'étant pas optimales, ceci explique peut-être la faible fréquence des pics obtenus sur les chromatogrammes ainsi que leur faible intensité. La solution serait peut-être de congeler les plantes directement après leur prélèvement et de les conserver ainsi jusqu'à l'étape de cryobroyage.

L'échantillon a donc été abandonné et changé pour un basilic (O. basilicum) de la marque Carrefour® qui a été séché et conservé dans des conditions standardisées. Sur les chromatogrammes obtenus (figure 19), l'intensité et le nombre de pics sont nettement plus appréciables avec ce nouvel échantillon.

Figure 19 : Comparaison des chromatogrammes de l'analyse d'Ocimum centraliafricanum et Ocimum basilicum (Carrefour®). T° « Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert). Masse : 100 mg, Cryobroyage. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

4.1.3 Ajout d'un solvant

Par la suite, l'étude s'est portée sur l'effet provoqué par l'ajout d'un solvant sur la poudre sèche d'échantillon. Comme expliqué plus haut à la section « 1.5.5 Préparation de l'échantillon », l'ajout d'un liquide peut permettre d'atteindre l'équilibre nettement plus rapidement.

Cependant, cet ajout peut parfois engendrer une perte de signal provenant de la solubilisation de certains composés, un ralentissement du passage à l'équilibre de par la viscosité du solvant ou encore l'apparition d'un pic parasite sur le chromatogramme.

Dès lors, un solvant adéquat pour les analyses en espace de tête doit présenter une grande stabilité ainsi qu'un point d'ébullition élevé.

Le premier solvant testé est le mygliol 812® qui est une huile neutre relativement stable par rapport aux phénomènes d'oxydations et qui présente un point d'ébullition relativement élevé : entre 240 et 270°C. La poudre de chaque vial a été additionnée de 500 uL d'huile neutre et le tout a été scellé hermétiquement. Les droites de régressions ont été étudiées de la

Sur le graphique de linéarité (figure 20) on peut voir que celle-ci n'est pas améliorée par l'ajout de liquide.

Quant aux chromatogrammes, deux phénomènes apparaissent : d'une part, le signal obtenu est fortement diminué par rapport à l'analyse sur poudre sèche (comme expliqué précédemment) et, d'autre part, le solvant interfère au niveau de l'analyse. En effet, un pic important provenant du passage en phase gazeuse du solvant apparaît sur les chromatogrammes (figure 21).

Figure 20 : Linéarité obtenue avec Ocimum basilicum en présence de 500 uL de mygliol 812 ® pour les 4 composés différents. T° « Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert), Cryobroyage, 3 essais par masse. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Figure 21 : Chromatogramme obtenu par l'analyse de 200 mg d'Ocimum basilicum (Carrefour®) en présence de 500 uL de mygliol 812®. T° « Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert), cryobroyage. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Figure 22 : Chromatogramme obtenu avec 500 uL de mygliol 812®. T° « Headspace » : 90°C (vial) /100°C (boucle) / 110°C (ligne de transfert). Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Contrairement à ce qui avait été prévu, une partie des composés présents dans l'huile a pu passer dans l'espace de tête après le chauffage de 33,75 minutes à 90°C dans le « Headspace » (il s'agit sans doute d'acides gras à chaîne courte provenant de la dégradation

Il faut également rappeler que la linéarité n'a pas été réellement améliorée.

En conclusion, le mygliol 812® ne présente pas de résultats satisfaisants et n'apporte pas de réelle amélioration pour l'analyse.

Le second solvant testé est l'eau MilliQ ®, qui présente l'avantage de diminuer l'affinité des composés organiques volatils vis-à-vis de la poudre de l'échantillon. Etant caractérisée par une faible pression de vapeur, le risque qu'elle interfère au niveau de la détection des substances organiques volatiles est donc assez faible (Quiroga, Dong et al. 2009). Cependant, elle risque d'atteindre le détecteur FID et de provoquer, si la quantité est importante, une extinction de la flamme.

Pour travailler en présence d'eau, il est conseillé de porter les températures de la boucle et de la ligne de transfert à des valeurs supérieures à la température d'ébullition de l'eau (au-delà de 100°C) afin d'éviter les phénomènes de recondensation (Anonyme 2000).

Les températures du vial, de la boucle et de la ligne de transfert ont donc été fixées à 100, 110 et 120°C respectivement. La quantité d'eau introduite dans les vials est de 500 uL. Sur les chromatogrammes, le signal paraît légèrement augmenté en présence d'eau (en comparaison avec la poudre sèche), ceci est surtout remarquable pour le thymol (voir figure 23).

Figure 23 : Comparaison des chromatogrammes obtenus avec Ocimum basilicum en présence et en absence d'eau MilliQ®. T° « Headspace » : 100°C (vial) /110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert), cryobroyage. Masse : 100 mg. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Par la suite, la répétabilité des analyses en présence d'eau a été étudiée. Comme celle-ci présente un point d'ébullition relativement bas (en comparaison avec le mygliol 812® par exemple), elle peut être responsable d'un apport de pression supplémentaire au niveau de l'espace de tête ce qui peut se traduire par des modifications importantes sur le plan expérimental (Kolb and Ettre 2006).

Pour ce faire, deux séries d'échantillon ont été préparées : l'une avec la poudre sèche et l'autre avec la poudre additionnée de 500 uL d'eau MilliQ®. Chaque série étant constituée de 9 essais avec, pour chacune, une masse de poudre de 100 mg d'O. basilicum (Carrefour®). Tous les essais ont été préparés et analysés le même jour.

Sur les graphiques (figure 24 et 25), l'ajout d'eau se traduit très clairement par une diminution de la répétabilité.

Figures 24 et 25 : Répétabilité des analyses obtenue par l'analyse d'Ocimum basilicum en absence et en présence d'eau pour l'aire du pic de P-Cymène (T.R : 5,288 min). T°

« Headspace » : 100°C (vial) /110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert), cryobroyage, n = 9 essais. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

En effet, avec la poudre seule, les dispersions autour de la moyenne sont nettement moins larges qu'en présence d'eau (voir tableau 4).

Tableau 4 : Comparaison des coefficients de variation du P-Cymène pour les des deux séries d'essais (n=9).

En conclusion, l'ajout de ce solvant à l'échantillon introduit donc une variabilité accrue. Celle-ci peut, comme expliqué précédemment, provenir d'une augmentation de pression au sein du vial qui induit des pertes lors du transfert.

4.1.4 L'effet « Salting-out »

Lorsque l'on se trouve en milieu aqueux et en présence de composés organiques relativement polaires, l'ajout d'électrolyte peut s'avérer fort intéressant pour diminuer le coefficient de partage et ainsi augmenter la concentration de ces composés dans l'espace de tête (Zuba, Parczewski et al. 2001). Pour avoir un effet significatif en analyse « Headspace », il est conseillé de travailler avec des concentrations en sel de l'ordre de 20 % car, en-dessous, les modifications apportées sont minimes, voire inexistantes.

Par contre, le sel ajouté à l'échantillon peut parfois contenir certaines impuretés qui vont parasiter le chromatogramme final. Il peut aussi entraîner une augmentation de la viscosité de l'eau et modifier la pression de vapeur entraînant ainsi une augmentation du temps de chauffe nécessaire pour atteindre l'équilibre (Kott 2010).

Afin d'observer l'impact qu'a l'ajout de chlorure de sodium sur l'échantillon, 100 mg d'O. basilicum (Carrefour®) ont été additionnés, d'une part, de 500 uL de solution NaCl à 20 % et, d'autre part, de 500 uL de solution saturée en NaCl¹. Chaque vial est ensuite analysé. Les températures du vial, de la boucle et de la ligne de transfert sont conservées à 100, 110 et 120°C afin d'éviter une éventuelle condensation lors du transfert.

Il apparaît alors, sur les chromatogrammes obtenus (figure 26), que l'ajout de sel n'augmente nullement la volatilité des analytes ; en présence de solution saturée en NaCl une diminution de celle-ci est même observée.

Figure 26 : Comparaison des chromatogrammes obtenus par l'analyse d'Ocimum basilicum avec la poudre sèche, la solution NaCl à 20 % et la solution saturée en NaCl. T°

« Headspace » : 100°C (vial) /110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert), cryobroyage, Résultat d'une expérience. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min

Ce phénomène est peut-être causé par l'augmentation de la viscosité de l'eau qui réduit sans doute le passage des composés en phase gazeuse.

Dès lors, l'effet « Salting-out » n'apporte pas d'amélioration significative en termes de sensibilité pour l'analyse de la plante ; comme expliqué par (Kolb and Ettre 2006), l'ajout de sel est empirique en analyse « Headspace », il est difficile de prévoir l'effet produit pour un type d'analyse donné.

N'ayant obtenu aucun résultat satisfaisant avec l'ajout d'un solvant, seul la poudre sèche sera analysée pour la suite des expériences.

4.2.1 Plan factoriel

Etant donné le nombre important de paramètres, une analyse en plan factoriel a été sélectionnée. Elle permet de prendre en compte plusieurs paramètres tout en effectuant un nombre réduit d'essais (Groupy 2006).

Un plan d'expérience linéaire constitué de 5 facteurs et 2 niveaux a été choisi. Les valeurs des niveaux -1 et+1 (minimum et maximum) ont été fixées pour chacun des paramètres comme indiqué sur la figure 27. Parmi ces facteurs, la masse a été choisie car son impact positif sur l'aire du pic est certain. Elle sert en quelque sorte à « valider » le plan factoriel. Les 4 autres facteurs testés sont la température du vial, la pressurisation du vial, le temps de remplissage de la boucle et le temps de pressurisation du vial. Le plan factoriel se compose donc d'une série de 8 essais à effectuer selon un ordre aléatoire. La réponse choisie est l'aire du pic de P-Cymène en pA.s.

L'entièreté des essais a été réalisée le même jour. Ensuite les données ont été représentées sur un graphique (figure 27) où sont repris les différents paramètres ainsi que leurs effets sur l'évolution de l'aire du pic. Pour qu'un effet ne soit pas négligeable, son intervalle de confiance ne doit pas recouvrir zéro. Il apparaît que la masse a une forte influence sur l'augmentation de l'aire (comme attendu) ; la température du vial et le temps de remplissage de la boucle (« Loop Fill time ») jouent également un rôle significatif. En revanche, la pressurisation du vial et le temps de pressurisation du vial n'ont qu'un effet limité, voire inexistant dans la gamme considérée.

Le plan factoriel permet d'avoir rapidement une idée de l'importance qui caractérise l'effet de chaque paramètre significatif.

Paramètre :	Niveau -1 :		Niveau +1 :
Température Vial / Boucle/ Ligne de transfert	90	/ 100 / 110 °C	100	/ 110 /120 °C
Pressurisation du vial		22,00 PSI		29,00 PSI
Temps de remplissage de la boucle		0,10 Min		0,20 Min
Temps de pressurisation du vial		0,20 Min		0,50 Min

Figure 27 : Plan factoriel à 5 facteurs et deux niveaux de type linéaire obtenu via le logiciel MODDE 9.1® avec Ocimum basilicum (Carrefour®). Tableau avec les différents niveaux et graphique des effets en « Plots ».

4.2.2 Variation de température

Sur base du plan factoriel, la valeur optimale pour la température de chauffe du vial a été définie. Pour ce faire, un balayage entre 90 et 140°C a été effectué. Les températures de la boucle et de la ligne de transfert ont été fixées à des valeurs supérieures à celle du four du vial afin d'éviter une éventuelle condensation soit, respectivement, 150 et 160°C. Généralement, il est conseillé de garder la température de la boucle et de la ligne de transfert à, respectivement, 15 et 25°C au-dessus de celle du vial. Et en présence de solvant, il est vivement conseillé de ne pas dépasser 10°C au dessus de la température d'ébullition car cela pourrait engendrer une altération du septum et des fuites de gaz (Anonyme 2000).

Lorsque la température de chauffe du vial est augmentée, le passage vers l'espace de tête est facilité et la concentration de l'analyte en phase gazeuse est accrue. En effet, chaque composé présent dans la plante est caractérisé par son propre coefficient de partage ; lorsque l'on

augmente la température, la grande majorité de ceux-ci voit son coefficient diminué et son transfert vers l'espace de tête augmenté (Hinshaw 2012).

Une augmentation de température permet également de diminuer le temps d'équilibe (Muffet 2011).

Il faut également noter que la température est intimement liée à la pression de vapeur des composés et qu'elle suit une évolution exponentielle en fonction de la température. Ceci implique qu'une faible variation de température engendre une importante variation de pression de vapeur et donc une modification non-négligeable du passage de l'analyte vers la phase gazeuse (voir figure 28).

Figure 28 : Evolution de la pression de vapeur de l'eau en fonction de la température (Kolb and Ettre 2006).

En analysant le graphique de l'aire du pic de P-Cymène en fonction de la température de chauffe du vial (figure 29), il semble que, jusqu'à 100°C, l'aire évolue de manière croissante. C'est-à-dire que, jusqu'à ce point, la quantité d'analyte passant dans l'espace de tête est

Figure 29 : Evolution de l'aire du pic de P-Cymène en fonction de la température du Vial. Echantillon : O. basilicum (Carrefour®). T° boucle : 150 °C / T° ligne de transfert : 160°C, cryobroyage, n = 1, masse : 100 mg. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de remplissage de la boucle : 0,10 min, temps de pressurisation : 1,0 min.

Toutefois, une fois passé ce point, l'aire diminue fortement sans doute à cause d'une dégradation du composé. Cela montre bien qu'il y a un juste milieu entre, d'une part, l'amélioration du transfert vers l'espace de tête et, d'autre part, la dégradation des composés instables.

Cependant, la structure du P-cymène indique qu'il s'agit d'un composé relativement stable ; l'hypothèse selon laquelle il serait dégradé aux températures élevées paraît, dès lors, peu probable. Il faut également noter que ce phénomène se produit pour les autres pics, le problème semble donc provenir de l'appareillage et non de l'échantillon.

Pour la suite des analyses, la température de chauffe du vial sera donc fixée à 100°C.

4.2.3 Variation du temps de remplissage de la boucle (« Loop Fill Time »)

Toujours sur base du plan factoriel, un balayage du temps de remplissage de la boucle a été effectué. Pour rappel, ce temps correspond à la période durant laquelle la boucle reste ouverte afin que l'aliquote de l'espace de tête lui soit transféré. Pour le type de système concerné ici, le temps conseillé est de 10 secondes (soit 0,16 minutes). Si ce temps de remplissage est trop long, il y a un risque de retour du gaz vers l'espace de tête du vial. Si ce temps est court, la

pression facilite le passage au niveau de la boucle et la quantité d'analyte qui passera vers la GC sera plus importante (Anonyme 2000).

Le balayage s'étend de 0,10 min à 0,30 min avec des espacements de 0,05 min pour chaque essai et avec des masses de 100 mg (voir figure 30) .

Figure 30 : Balayage du temps de remplissage de la boucle avec O. basilicum (Carrefour®). T°vial : 100°C / T° Boucle : 110 °C / T° ligne de transfert : 120°C ; cryobroyage, résultat d'une expérience, masse : 100 mg. Pressurisation du vial : 15,5 PSI, temps de pressurisation : 1,0 min.

La valeur offrant la meilleure sensibilité est 0,20 min ce qui correspond à un temps de 12 secondes, valeur proche de celle conseillée à la base (qui est de 10 secondes). Cette valeur sera conservée pour la suite des analyses.

4.2.4 Optimisation de la pression du vial

La pression établie dans le vial doit normalement se situer aux alentours de 1,5 à 2 Atm pour ce type d'appareillage (Anonyme 2000). Or, la valeur fixée initialement pour les analyses est 15,5 PSI ce qui correspond à seulement 1,02 Atm. Il se peut donc que la pression établie au sein du vial soit trop faible que pour permettre un transfert efficace par différence de pression vers la boucle d'échantillonnage.

L'objectif de cette expérience est de voir si une éventuelle augmentation de la sensibilité serait obtenue en faisant varier la pression entre 18 et 28 PSI. Les autres paramètres du « Headspace » restent fixes.

La pressurisation du vial est d'autant plus importante pour les échantillons sous forme solide car, contrairement aux formes liquides, la pression développée est bien souvent insuffisante pour permettre un transfert efficace vers le chromatographe gazeux.

En observant le graphique de l'aire du pic de P-Cymène en fonction de la pression dans le vial (figure 31) et l'évolution du pic de P-Cymène (figure 32), il semble qu'il y ait une augmentation de la sensibilité pour une pression de 22 PSI (ce qui équivaut à 1,497 Atm) mais cela devrait être vérifié par une série d'essais supplémentaire.

Figure 31 : Evolution de l'aire du pic de P-Cymène en fonction de la pressurisation du vial. Echantillon : Ocimum basilicum (Carrefour®). T° « Headspace » : 100°C (vial) / 110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert). Masse : 100 mg, cryobroyage, résultat d'une expérience. Temps de remplissage de la boucle : 0,20 min, Temps de pressurisation : 1,0 min.

Figure 32 : Evolution du pic de P-Cymène en fonction de la pression dans le vial.

Echantillon : O. basilicum (Carrefour®). T° « Headspace » : 100°C (vial) / 110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert) ; Cryobroyage, masse : 100 mg, n = 1. Temps de remplissage de la boucle : 0,20 min, Temps de pressurisation : 1,0 min.

Ceci confirme bien l'hypothèse selon laquelle la pression établie initialement était trop insuffisante que pour permettre une extraction efficace. Cette valeur est donc conservée pour le système « Headspace ».

4.2.5 Ajouts dosés

Cette méthode a permis d'étudier l'influence réelle qu'exerce notre poudre sur les différents composés volatils présents dans l'échantillon. Deux séries de 5 essais ont été établies : d'une part, une série avec 100 mg de poudre sèche et, d'autre part, une série avec une matrice constituée de 500 uL d'eau MilliQ. Dans chaque série, des quantités croissantes de standard de 1,8 cinéole (Sigma Aldrich®) ont été ajoutées (de 1 à 5 uL) (voir tableau 5).

Le but de cette expérience est de pouvoir observer les interactions présentes au sein de la poudre. En effet, si les composés ne sont que peu ou pas retenus dans l'échantillon les deux droites obtenues devraient augmenter parallèlement. Toutefois, si les composés sont sujets à d'importantes interactions avec la poudre, certaines disparités entre les deux droites pourraient être rencontrées (Feinberg 2001).

Les deux droites de régression obtenues (figure 33) présentent, toute deux, un R² acceptable mais, cependant, l'évolution des deux séries ne se fait pas de la même manière.

Figure 33 : Droite de régression du cinéole obtenue par la méthode des ajouts dosés avec, d'une part, la poudre (m = 100 mg) telle quelle (O. basilicum Carrefour ®) et, d'autre part, de l'eau MilliQ® (V = 500 uL). T° « Headspace » : 100°C (vial) / 110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert), cryobroyage. Temps de remplissage de la boucle : 0,20 min, Temps de pressurisation : 1,0 min, pressurisation du vial : 22,00 PSI.

Un test d'égalité des pentes de Student a été réalisé afin de confirmer de manière statistique cette différence. Ce test compare la valeur « t » obtenue selon l'équation ci-dessous à celle de la valeur t (0.05; N1+N2 - 4) trouvée dans les tables pour un seuil de 0,05 et un degré de liberté de n1+n2-4.

Si la valeur du t calculé est inférieure à celle des tables, l'hypothèse d'égalité des pentes des droites est alors acceptée.

*Poudre et eau*
b1	5668,4
Somme des carrés des écarts sur X	10
Somme des carrés des écarts sur Y	323960742
Somme des carrés des écarts (résidus)	2276543,4
Variance des résidus	1138271,7
*Poudre sèche*
b2	2886,5
Somme des carrés des écarts sur X	10
Somme des carrés des écarts sur Y	88206461,1
Somme des carrés des écarts (résidus)	3139427,43
Variance des résidus	1569713,71

- La variance résiduelle commune vaut alors : S²C = 451330,903 - La valeur t calculée vaut : ttest = 9,25931761

Il existe donc des interactions entre le matériel végétal et les composés volatils. Il se peut que la poudre exerce des effets d'adsorption vis-à-vis des analytes ; phénomène facilité par la grande porosité de l'échantillon. Ceci influence directement le passage des composés dans l'espace de tête étant donné que le coefficient de partition est lié aux phénomènes d'adsorption également (Kolb and Ettre 2006). Les systèmes avec adsorption présentent de nombreuses difficultés pour les analyses quantitatives.

4.2.6 Changement d'échantillon

Pour la suite des analyses, un nouvel échantillon a été choisi : il s'agit d'O. basilicum de la marque Ducros®. Les chromatogrammes pour chacune des deux marques (Carrefour® et Ducros®) ont été comparés et certaines variations sont apparues. Notamment pour le méthyl eugénol et l'estragole (figure 34 et 35) qui présentent de grosses différences.

Figure 34 et 35 : Comparaison des pics de méthyleugénole et d'estragole pour les deux marques d'O. basilicum (Carrefour® et Ducros®). T° « Headspace » : 100°C (vial) / 110°C (boucle) / 120°C (ligne de transfert), cryobroyage, n = 1, masse : 100 mg.

En effet, les teneurs pour le basilic de la marque Ducros® sont nettement plus élevées. Ce qui prouve bien qu'en fonction de la variété ou de la qualité, des conditions de culture et du séchage, les composés volatils peuvent varier et donc modifier sensiblement l'arôme de la plante.

4.3 Evaluation de l'apport des optimisations à la qualité des analyses

4.3.1 Modèle linéaire et quadratique

Suite à toutes ces analyses, il a été décidé d'analyser 3 groupes de masses différentes (100, 200 et 300 mg) en triplicate, tout en fixant l'entièreté des paramètres du « Headspace » aux valeurs optimales (voir tableau 7). Ceci permet la comparaison aux données de départ du (voir tableau 3).

	Paramètres du "Headspace"	Valeurs
Température (°C)	Vial	100
	Vial	100
	Boucle	110
	Ligne de transfert	120
Temps (min)	Remplissage de la boucle	0,20
	Remplissage de la boucle	0,20
	Equilibration	34,00
	Pressurisation	1,00
	Equilibration de la boucle	0,05
	Injection	1
	GC Cycle	33,75
Pression (PSI)	Vial	22,04
	Vial	22,04
	Gaz vecteur	21,30

Tableau 7 : Valeurs optimisées des différents paramètres du « Headspace ». Les valeurs en rouge ont été modifiées par rapport au tableau 3.

Les droites de régression ont été tracées sur le graphique pour montrer l'évolution de l'aire des pics (en pA.s) en fonction de la masse (figure 38). L'évolution suit plus ou moins le modèle linéaire mais il apparaît, avec les valeurs des R², que la linéarité diminue proportionnellement avec le temps de rétention (comme lors des premiers tests effectués, figure 16 et 17).

Figure 38 : Droites de régression obtenues par l'analyse d'O. basilicum (Ducros®) pour 3 composés différents. Paramètres « Headspace » fixés aux valeurs optimales en fonction des analyses précédentes, voir ci-dessous « tableau 4 », n = 3 pour chaque masse.

Une série supplémentaire de 3 essais a été analysée pour une masse de 200 mg afin de voir si les valeurs aberrantes obtenues pour cette masse se répétaient.

Ensuite une analyse statistique a été menée pour voir si ces données suggérent une évolution différente du modèle linéaire. Pour ce faire, le graphique des résidus a été tracé ; lorsque l'on se trouve dans un modèle linéaire, les résidus doivent se disposer de manière sphérique. Ce qui n'est clairement pas le cas ici (voir figure 39).

Figure 39 : Graphique des résidus pour le P-Cymène obtenu par l'analyse de linéarité.

En effet, les résidus sont disposés de part et d'autre de l'axe de façon régulière ce qui tend à réfuter l'hypothèse selon laquelle les données suivraient le modèle linéaire.

D'autres modèles ont donc été testés afin de voir lequel correspond au mieux aux résultats. En se basant sur l'évolution des résidus qui ne sont pas répartis de manière aléatoire, le modèle quadratique a été testé. Avec ce modèle, un recouvrement des données plus satisfaisant qu'avec le modèle linéaire a été obtenu (voir figure 40).

Figure 40 : Comparaison du modèle linéaire et quadratique pour le P-Cymène

Ceci s'explique en partie par le fait qu'une majorité des paramètres du « Headspace » varie selon ce modèle quadratique (comme la température,...). Ce modèle tend vers une asymptote, aux valeurs de masses importantes, ce qui s'explique sans doute par la saturation de l'espace de tête lorsque la quantité de poudre à analyser devient trop grande.

L'hypothèse de départ selon laquelle l'aire des pics varierait de manière linéaire avec l'augmentation de masse d'échantillon est en fait peu probable.

5. Conclusion

La méthode d'échantillonnage « Headspace » paraît simple en théorie mais s'avère nettement plus complexe à mettre en pratique. Le fait de pouvoir injecter directement l'échantillon sous forme gazeuse dans le GC est assez avantageux par rapport à l'injection classique mais le nombre conséquent de paramètres du « Headspace » ainsi que le mode de préparation de l'échantillon sont deux aspects à prendre en compte et qui ne sont pas toujours simples à définir en pratique. C'est pourquoi nous avons réfléchi à une approche de validation. En réalité, il existe peu de littérature traitant des analyses en « Headspace » statique et encore moins dans le cadre de plantes contenant des huiles essentielles. De plus, aucun protocole de validation n'a été décrit pour ce type d'analyses.

La version statique paraît, dès lors, plus adaptée à l'analyse d'échantillons liquides (où l'équilibre s'établit plus rapidement et uniformément qu'avec un échantillon solide) et ce, pour des analyses plutôt qualitatives que quantitatives. L'application de cette technique est fortement limitée pour les composés sous forme de traces et pour ceux présentant des tensions de vapeur très faibles (Dijkstra, Massart et al. 1978).

Pour effectuer des analyses quantitatives, la version SPME serait peut-être plus appropriée car décrite comme présentant une meilleure sensibilité ainsi qu'une meilleure reproductibilité ; faire appel à des techniques comme la « Multiple Headspace Extraction » (MITE) ou la méthode des standards internes (qui n'ont pas été abordées ici par manque de temps) avec lesquelles il serait possible d'obtenir des résultats plus satisfaisants serait une seconde option (Moldoveanu and David 2002). Ainsi, l'une de ces deux méthodes paraît être nécessaire voir même indispensable pour pouvoir présenter une étude basée sur des données quantitatives provenant d'une analyse en « Headspace » statique.

Il reste, toutefois, un certain nombre de paramètres qui n'ont pas pu être évalués et qui jouent un rôle difficile à évaluer dans ce type d'analyse comme, par exemple, le temps écoulé entre la fermeture du vial et l'analyse de l'échantillon, l'étanchéité du septum au cours d'une analyse, le nettoyage des vials, la taille du vial employé, les phénomènes d'adsorption entre l'échantillon et la paroi du vial,...

Pour conclure, l'hypothèse de départ selon laquelle l'évolution des aires de pics en fonction de l'augmentation de la masse se faisait de manière linéaire ne semble pas vraiment se vérifier dans la pratique. Les données tendent plutôt à indiquer une évolution selon le modèle quadratique. Pour confirmer ce modèle, il faudrait procéder à une série d'analyses supplémentaires et il serait aussi intéressant d'établir un nouveau plan factoriel basé sur le

modèle quadratique (et non sur le modèle linéaire) afin d'estimer l'importance de chaque paramètre. Cependant, ce type d'analyse nécessiterait un nombre d'essais conséquent (au-delà de la quarantaine pour le plan factoriel).

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