Etude de la biodiversité microbienne dans un sol polué par les hydrocarbures

1

ÉíÈÚÔáÇ ÉíØÇÑÞãíÏáÇ ÉíÑÆÇÒÌáÇ ÉíÑæåãÌáÇ

íãáÚáÇ ËÍÈáÇ æ íáÇÚáÇ ãíáÚÊáÇ ÉÑÇÒæ

Département de Biologie

MEMOIRE DE MASTER

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie Filière : Sciences biologiques

Spécialité : Biotechnologie microbienne

Thème

Etude de la biodiversité microbienne dans un sol pollué
par les hydrocarbures.

Présenté par : Soutenu le : /06/2018

Melle BENNABI Amina Melle KHALDI Zineb

Devant le jury composé de :

Président M^r. BOUHADDA Y.

Examinateur1 M^me. DJAADOUNI F.

Examinateur2 M^me. DILMI F.

Encadreur M^r. AIT ABDELSLAM A.

Année Universitaire : 2017/2018

2

Remerciement :

Tout d'abord nous remercions le bon Dieu tout

puissant de la bonne santé, la

Volonté et la patience qu'il nous a donnée tout le

long de la période de nos études.

Nous exprimons nos profondes reconnaissances et

gratitude à toutes les

Personnes qui ont apportés leur aimable

contribution à ce travail par leurs remarques,

Leurs conseils, leurs encouragements et leurs

compétences.

Enfin, un grand merci, à toute personne qui a

contribué de prés

ou de loin à la réalisation de ce travail.

3

Dédicace :

Je dédie ce mémoire :

A mes chers parents, pour tous leurs sacrifices,

leur amour, leur tendresse, leur soutien et leurs

prières tout au long de mes études,

A mes chères soeurs pour leurs encouragements

permanents, et leur soutien moral,

A mes chers frères pour leur appui et leur

encouragement,

A toute ma famille pour leur soutien tout au long

de mon parcours universitaire,

Que ce travail soit l'accomplissement de vos voeux

tant allégués, et le fuit de votre soutien infaillible,

Merci d'être toujours là pour moi.

AMINA.

4

Résumé

La pollution par les hydrocarbures constitue une menace pour les sols algériens vu la longueur du réseau de canalisation servant à transporter le pétrole. Les sols pollués sont peuplés de microorganismes efficaces dans la dégradation biologique du polluant.

Le pétrole représente l'un des polluants récalcitrants qui perturbent la flore autochtone permettant ainsi l'installation de bactéries qui s'adaptent et utilisent cette source de carbone et ou l'un de ces dérivés. Les bactéries « hydrocarbonoclastes» sont des microorganismes qui se nourrissent typiquement d'hydrocarbures.

Dans le but d'isoler des bactéries capables de dégrader les hydrocarbures, nous avons réalisé en février 2018 des prélèvements de sol au niveau de 4 Wilaya.

La mise en culture sur gélose nutritive a permis d'isoler 17 bactéries, dont cinq diffèrent par leurs caractères macroscopiques et microscopiques. Des tests morphologiques et biochimiques ont été utilisés pour la sélection et l'identification de l'ensemble des bactéries cultivables (cinq isolats).

Ces cinq isolats sont testés pour leur capacité à dégrader 1% de pétrole brut sur un milieu minéral de base supplémenté en pétrole comme seule source de carbone et d'énergie.

Les résultats préliminaires obtenus montrent que les bactéries dégradant les hydrocarbures appartiennent à différents groupes de bactéries Gram - et Gram + respectivement à des taux de 75 % et 25 %. Ce sont les bactéries de type bacilles Gram - qui sont prédominantes (83 %).

Enfin le suivi de la cinétique de croissance en présence du pétrole brut et du phénol a montré des courbes de diauxie pour les cinq souches.

Mot clés : hydrocarbonoclaste, bactérie, biodégradation

Abstract

Pollution by hydrocarbons constitues a serious treath on algerian soils because of the transport of oil. Polluted soils are full of microorganisms effective to biologic degradation of the pollutant.

Oil is one of the contrary pollutants that disturb the autochthonous flora thereby enable the installation of bacteria, which adapt themselves and use this source of carbon or one of its derivatives. These hydrocarbonoclastic bacteria are microorganisms that typically feed on hydrocarbons.

In order to isolate bacteria showing ability to degrade hydrocarbons were taken soil samples in FEVRIER 2017 at 4 Wilaya.

The culturing on nutrient agar has allowed us to isolate 17 bacteria, 5 of which differentiate with their macroscopic and microscopic characteristics.

5

These 5 isolates are tested for their capacity to degrade crude petroleum on an enrichment cultures on basal mineral salt medium supplemented with 1% as unique carbon and energy source.

preliminary results showed that the polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria belong to various Gram - and Gram + groups (75% and 25 % respectively). Gram - bacilli were prevalent (83 %).

Finally the monitoring of the kinetic development in presence of crude oil has shown diauxic growth curves for the 5 bacterial strains.

Key words: hydrocarbonoclast, bacteria, biodegradation, hydrocarbonoclastic, hydrocarbon.

ÕÎáã

ÉáãÚÊÓãáÇ ÊÇæäÞáÇ ÉßÈÔ áæØá ÇÑÙä ÉíÑÆÇÒÌáÇ íÖÇÑáÇÇ ÏÏåí ÑØÎ ÊÇäæÈÑßæÑÏíåáÇÈ ËæáÊáÇ ÑÈÊÚí

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4 ìæÊÓã ìáÚ ÉÈÑÊáÇ äã ÊÇäíÚ 2018 ÑíÇÑÈ		í		ÇäÐÎÇ ÊÇäæÈÑßæÑÏíåáÇ áíáÍÊ ìáÚ ÉÑÏÇÞáÇ	ÇíÑíÊßÈáÇ áÒÚ			áÌÇ äã
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ÏíÍæ ÑÏÕãß íÆÇÐÛáÇ ØÓæáÇ ìáÇ ÉÇÖã ãÇÎáÇ áæÑÊÈáÇ äã 1 % áíáÍÊ ìáÚ ÊáÇáÇÓáÇ åÐå ÉÑÏÞ ÑÇÈÊÎÇ ÇäÏÑÇ ìáÚ ÉÑÏÇÞáÇ ÇíÑíÊßÈáÇ äÇ ÉíáæáÇÇ ÌÆÇÊäáÇ ÊÊÈËÇæ ÉÞÇØáÇ æ äæÈÑßáá 25% æ 75%íÊÈÓäÈ íáÇæÊáÇ						.ÉíÆÇíãíßæíÈáÇæ ìáÚ Gram^-
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	ÉáæÒÚãáÇ áÇÐÌáÇÇ		äã ÏÏÚ ÑÈßÇ ÊÇíÕÚáÇ Úæä äã ÇíÑíÊßÈáÇ ÉÚæãÌã			ãÖÊæ
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6

Liste des abréviations

MSM Milieu de Sels Minéraux

HAPs Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

ONPG NaCl

Orthonitrophénylgalactopyranoside Chlorure de sodium

ADH Arginine Dihydrolase

LDC Lysine Décarboxylase

ODC UFC

Citrate de Simmons Unités Formants Colonies

HC Hydrocarbure

BN Bouillon nutritif

DO Densité optique

GN Gélose nutritive

pH Potentiel d'Hydrogène

C Carbone

S Souche

G Gram

P. Pseudomonas

7

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Exemples de durée de demi- vie des HAPs dans le sol. 9

Tableau 2 : Caractéristiques de quatre types de sols étudiés. 35

Tableau 3 : Résultat du potentiel d'hydrogène des sols étudiés. 35

Tableau 4 : Résultat d'analyse d'humidité des sols étudiés. 36

Tableau 5 : Résultat d'analyse de conductivité des sols étudiés. 37

Tableau 6 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 3. 39

Tableau 7 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 4. 39

Tableau 8 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 1. 39

Tableau 9 : Caractères macroscopiques des colonies isolées sur GN. 42

Tableau 10 : Etude microscopique des souches isolées. 42

Tableau 11 : Présence des enzymes respiratoire. 47

Tableau 12 : Résultats des tests biochimiques. 48

8

Liste des figures

Figure 01: Structure chimique des hydrocarbures pétroliers. 3

Figure 02: Représentation schématique d'une pollution pétrolière du sol. 8

Figure 03: Dégradation du pyrène. 17

Figure 04: Dégradation du naphtalène en salicylate par voie intradiol. 18

Figure 05: Site d'échantillonnage de Mascara. 23

Figure 06: Site d'échantillonnage d'Ouargla. 24

Figure 07: Site d'échantillonnage d'Arzew. 24

Figure 08: Site d'échantillonnage de Sfisef. 15

Figure 09: Schéma de l'isolement et de dénombrement des bactéries. 27

Figure 10: Différents échantillons des sols étudiés. 35

37

38

38

Figure 11 : Potentiel d'hydrogène des quatre sols étudies. Figure 12 : Taux d'humidité des quatre sols étudies. Figure 13 : Conductivité électrique des quatre sols étudies.

Figure 14: Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 3. 40

Figure 15: Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 1. 40

Figure 16: Différents aspects des colonies bactériennes obtenus. 44

Figure 17: Différents aspects microscopiques obtenus. 46

Figure 18: Test catalase. 47

Figure 19: Test oxydase. 47

Figure 20: Résultats des tests biochimiques (métabolisme glucidique). 49

Figure 21 : Résultats des tests biochimiques (métabolisme protéique). 50

Figure 22: Résultats des tests biochimiques (King A et B). 50

Figure 23: Zones claires du test de biodégradation. 55

56

57

57

58

58

Figure 24: Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SI) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 25: Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SL) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 26: Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SH) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 27: Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SG) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 28: Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SJ) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

9

Sommaire

Dédicace.

Remerciements.

Résumé. Abstract.

ÕÎáãáÇ

Liste des tableaux.

Liste des figures.

Liste des abréviations.

Introduction. 1
Partie I : Partie bibliographique

I- Les hydrocarbures dans l'environnement. 2

I-1- Définition. 2

I-2- Nature et origine. 2

I-3- Composition et caractéristiques. 2

I-3-1- Les hydrocarbures aliphatiques. 2

I-3-2- Les hydrocarbures cycliques. 3

I-4- Les types de pétroles. 3

I-5- Les hydrocarbures en Algérie. 4

I-5-1- Historique. 4

I-5-2- Problématique liée aux hydrocarbures pétroliers en Algérie. 4

I-6- Mobilité des hydrocarbures dans l'environnement. 6

I-6-1 Evaporation. 6

I-6-2- Solubilisation. 6

I-6-3- Emulsification. 6

I-6-4- Sédimentation. 7

I-6-5- Photo-oxydation 7

I-6-6- Biodégradation. 8

I-6-7- Pénétration dans la chaîne alimentaire. 9

I-7-

9

10

Conséquences de la pollution de l'environnement par les HAPs. I-7-1- Pollution du sol par les HAPs.

I-7-2- Origines de pollution. 10

I-7-3- Types de polluants. 10

I-7-4- Biodétection de la pollution du sol par les hydrocarbures. 10

I-7-4-1- Quatre types de procédés. 11

I-7-5- Biorémediation. 11

11

12

I-7-5-1- Micro-organismes effectuant la bioremédiation. I-7-5-2- Micro-organismes utilisées.

I-7-5-2-1- Bactéries. 12

I-7-5-2-2- Champignons. 12

I-7-5-2-3- Plantes. 13

I-7-6- Traitement des sols pollués par les HAPs. 13

II- Biodégradation des HAPs. 15

II-1- Types de biodégradation. 16

II-1-1- Biodégradation aérobie. 16

10

II-1-2- Biodégradation anaérobie. 18

II-2- Facteur affectant la biodégradation des HAPs. 18

II-3- Biodégradation du pétrole brut. 20

II-4- Biodégradation par type d'hydrocarbure. 20

II-4-1- Biodégradation des hydrocarbures saturés. 20

II-4-1-1- Voies de dégradation des alcanes linéaires. 20

II-5- Biodégradation oxydative des HAPs par les bactéries. 20

II-6- Microbiologie classique.

21

Partie II : Matériels et méthodes

I- Objectif. 23

II- Milieux de culture. 23

III- Matériel biologique. 23

IV- Méthode. 25

IIII-1- Echantillonnage. 25

IIII-2- Analyses physico-chimiques. 25

IIII-2-1- Teneur en eau ou humidité. 25

IIII-2-2- Potentiel d'hydrogène (pH). 25

IIII-2-3- Conductivité électrique (CE). 25

IIII-3- Isolement des microorganismes. 25

IIII-3-1- Enrichissement. 26

IIII-3-1-1- Dilution décimale. 26

IIII-3-1-2- Isolement des bactéries sur milieu solide. 26

IIII-3-2- Dénombrement des bactéries. 26

IIII-3-3- Observation macroscopique. 27

IIII-3-4- Observation microscopique. 28

IIII-3-4-1-Coloration de Gram. 28

IIII-3-4-2-Coloration de spores. 29

IIII-4-Purification des isolats. 29

IIII-5- Conservation des isolats. 29

IIII-6- Identification des microorganismes. 30

IIII-6-1- Recherche des enzymes respiratoires. 30

IIII-6-1-1- Recherche de la catalase. 30

IIII-6-1-2- Recherche de l'oxydase. 30

IIII-6-2-Test ONPG. 30

IIII-6-3- Recherche de Citrate. 31

IIII-6-4- Clark et lubs. 31

IIII-6-5- Hydrolyse a l'amidon. 31

IIII-6-6- Mannitol mobilité. 32

IIII-6-7- Viande-foie. 32

IIII-6-8- Étude du métabolisme protéique. 32

IIII-6-8-1-Recherche des décarboxylases (ODC, LDC, ADH). 32

IIII-6-9- Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture

spécifiques. 32

IIII-6-9-1-Croissance sur milieu King (King A et King B). 32

IIII-6-10- Bouillon nitraté. 33

IIII-7- Isolement de bactéries qui dégradent le pétrole. 33

IIII-8- Détection de l'activité de biodégradation des bactéries. 34

11

Partie III : Résultats et discussions

I- Analyses physico-chimiques. 35

I-1- Caractéristique du sol étudié. 35

I-2- Mesure du potentiel d'hydrogène. 35

I-3- Teneur en eau ou humidité 36

I-4- Conductivité électrique (CE). 37

II- Analyses microbiologiques du sol. 39

II-1- Caractéristiques des isolats purifies. 41

III- Etude des caractères morphologiques. 41

IIII- Recherche des enzymes respiratoires. 47

IV- Tests biochimiques. 48

V- Identification des souches isolées. 51

VI- Test de biodégradation. 54

VII- Détection de l'activité de biodégradation des bactéries. 56

Conclusion. 61

Références bibliographiques. 62

Annexes. 65

Introduction

La pollution par les hydrocarbures constitue une menace très sérieuse pour l'environnement en Algérie. Les pertes et les fuites ainsi que les déversements accidentels font craindre une situation écologique irréversible.

L'Algérie est un pays producteur et exportateur de pétrole. En effet, la production du pétrole brut est en hausse. De nombreux puits ne cessent d'être découverts sur le territoire national par la Sonatrach et/ou par les Associés (Sociétés étrangères d'exploitation et de production), ceci constitue des sources de contamination du sol de plus en plus importante, de l'exploration au transport des hydrocarbures.

Cette pollution nécessite donc l`intervention de différents facteurs pour l`élimination de ce dernier. Parmi ces facteurs, la biodégradation par les microorganismes et en particulier les bactéries est le processus naturel le plus important dans la dépollution de l`environnement. (VANESSA S. CERQUEIRA et al. 2011).

La réussite de La biodégradation des hydrocarbures dans le sol réside non seulement dans le choix de l'agent biologique mais également dans la maitrise des conditions physicochimiques du sol telles que l'humidité, le pH, la disponibilité des nutriments, la concentration des contaminants, qui permettent son développement (KUMAR et GOPAL, 2015).

Les microorganismes jouent un rôle primordiale dans la biodégradation, ils sont très divers dans la nature (YADAV et HASSANIZADEH, 2011). Un certain nombre d'espèces bactériennes sont connues pour la dégradation des hydrocarbures et la plupart d'entre elles sont isolées à partir des sols contaminés. Plusieurs espèces microbiennes sont recensées et qualifiées aptes à dégrader des hydrocarbures (HARITASH et KAUSHIK, 2009).

Le présent travail est réalisé dans le but d'étudier la capacité de dégradation des bactéries du sol contaminé par les hydrocarbures pétroliers présente dans notre échantillon qui se trouve au niveau de champs d'Ouargla, au niveau de la zone industrielle SONATRACH d' Arzew.

La réalisation de ce modeste mémoire est structurée en trois parties : la première partie présente une synthèse bibliographique, la deuxième décrit le matériel et les méthodes utilisés, et une troisième partie consacré aux résultats et discussion qui sera suivi d'une conclusion.

12

Rappel bibliographique

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I. Les hydrocarbures dans l'environnement

I.1. Définition

Les hydrocarbures sont des composés organiques uniquement constitués d'atome de carbone et d'hydrogène (FRENENNEC et al., 1988). Ils possèdent une formule brute de type C n H m, où n et m sont 2 entiers naturels. Ils peuvent être classés en fonction de la forme de leur structure (linéaires, cycliques) et de leur degré de saturation (TARAYRE, 2012).

I.2. Nature et origine

Les hydrocarbures sont considérés comme étant des polluants à la fois organiques et chimiques (KOLLER, 2004) provenant des activités des secteurs énergétique et industriel. Certains composés, les HAP, se forment naturellement par les incendies de forêt (BARRIUSO et al., 1996).

I.3. Composition et caractéristiques

Malgré le fait que les principaux composants présents dans les hydrocarbures soient le carbone et l'hydrogène, une proportion significative d'autres atomes peut être présente. Celle-ci inclue l'oxygène, le soufre et l'azote (MORGAN et WATKINSON, 1994) et des métaux tels que le calcium et le magnésium (CHITOUR, 1983). Les hydrocarbures peuvent être classés en groupes de structures différentes.

I.3.1. Les hydrocarbures aliphatiques

Ce sont des hydrocarbures à chaînes droites saturés ou insaturés. Les hydrocarbures aliphatiques saturés sont des alcanes de formule générale C n H 2n+2, ce sont les plus représentés dans le pétrole et vont du méthane aux chaînes contenant 40 atomes de carbone et plus (CERNIGLIA, 1992).

Les insaturés comportent les alcènes de formule générale C n H 2n. Ces molécules contiennent une double liaison et les alcynes qui ont pour formule C n H 2n-2 et contenant une triple liaison dans leur molécule. Ils sont rares dans les pétroles bruts, plus communs dans les produits de raffinage (CERNIGLIA, 1992).

I.3.2. Les hydrocarbures cycliques

Ils peuvent être saturés : appelés cyclanes qui sont des cycles saturés isomères des alcanes, ou insaturés appelés cyclènes s'ils possèdent une double liaison dans leurs cycles et cyclines s'ils ont une triple liaison. Ils sont dits hétérocycliques si le cycle de leur molécule contient des

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atomes autres que le carbone tels que le soufre, l'azote et l'oxygène. Les hydrocarbures aromatiques sont des composés contenant au moins un noyau benzénique dans leurs molécules. C'est un cycle insaturé à six atomes de carbone. Ils constituent une proportion très importante du pétrole et s'étalent du benzène aux HAP. Ce sont des composés hydrophobes, persistants dans les écosystèmes à cause de leur faible solubilité dans l'eau (Cerniglia, 1992), certains, tels que l'anthracène, sont quasiment insolubles (solubilité de 0.7 mg/l) (SMITH, 1994).

Figure 1 : Structure chimique des hydrocarbures pétroliers (COLOMBANO et al., 2008).

I.4. Les type des pétroles

Le terme de pétrole recouvre un enssemle de produits dont les compositions peuvent être très différentes. La diversité de composition des bruts repose principalement sur leur provenance. En effet , les conditions de formation d'un brut vont influencer l'importance relative de chacune des familles de constituants citées précédemment. Cependant, des bruts issus d'une région donnée peuvent présenter des différences importantes liées aux conditions de formation et d'évolution différentes. Les bruts lourds contiennent des proportions importantes de résines et d'alphaltènes par rapport aux hydrocarbures saturés. Au contraire les bruts légers sont très riches en hydrocarbures saturés et très pauvres en asphaltènes. Cette diversité dans la composition des bruts est un aspect très important dans l'industrie du raffinage (SYAKTI, 2004).

I.5. Les hydrocarbures en Algérie I.5.1. Historique

Les hydrocarbures Algériens ont été nationalises juste après l'indépendance (24 février 1971), ils occupent une place importante par rapport l'économie nationale. L'Algérie dispose de

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potentialités importantes en pétrole et gaz naturel lesquels ne sont pas exploités sous forme de matières premières mais transformés en partie sur place, selon une stratégie et une planification rigoureuses. Le transport, la transformation et la commercialisation des hydrocarbures ont été confiés à la société nationale SONATRACH dont les principaux sièges se trouvent à: Hassi Messaoud, Alger, Arzew et Skikda. Arzew, wilaya d'Oran représente un pôle important de transformation et transport des hydrocarbures. Elle renferme un grand complexe d'industrie pétrochimique en Afrique. Néanmoins, le développement d'une telle industrie s'est fait au détriment de l'environnement de cette belle ville qu'on voit se dégrader d'année en année.

I.5.2. Problématique liée aux hydrocarbures pétroliers en Algérie

Le littoral de l'Ouest d'Algérie recèle un potentiel biologique important, une flore et une faune riches et variés, des sites naturels exceptionnels, un tel littoral devrait faire l'objet d'un soin minutieux. Les hydrocarbures représentent la plus importante source de pollution. Cette pollution résulte de plusieurs activités liées surtout à l'extraction du pétrole, à son transport et en aval à l'utilisation des produits finis dans les raffineries. En effet, de nombreuses études ont permis d'observer l'apparition de problèmes de santé lors de la baignade ou de pratique de sports aquatiques en eau contaminées. Les plus fréquents sont des troubles digestifs et des infections cutanées. Cette pollution à retenue l'attention de l'opinion mondiale et a suscité de nombreuses conventions nationales et internationales. En mai 1974, l'Algérie porta ratification de la convention de Bruxelles, puis, elle adopta le décret n°94-279 du 17 septembre 1994, portant organisation de lutte contre les pollutions marines et institutions de plans d'urgence. Enfin, le 05 février 2002 la loi algérienne n°02-02 relative à la protection et à la valorisation du littoral est promulguée. Théoriquement la législation protège la baie algérienne, cependant la réalité est toute autre. Les textes de la loi restent inappliqués, puisque sur le terrain rien n'est respecté. Les rejets des déchets riches en hydrocarbures émanant des zones industrielles se déversent directement dans la grande bleue et sans parler de ceux émanant des bateaux poubelles et les navires de ballastage qui traversent quotidiennement la côte, comme ce fut le cas en 1989 par le pétrolier `Maas Luis' et en 2003 par le navire italien `Valbruna' (SAKER, 2007). En attendant l'application de ces textes et la concrétisation de ces projets, seule l'état de la faune et la flore pourra témoigner de la triste vérité. En effet, la pollution par les hydrocarbures en Algérie a fait l'objet de plusieurs études, parmi lesquelles on cite les travaux de TALBI (2009) et GHAOUAS en 2005 qui touchent aux techniques physico-chimiques de traitement des effluents de la raffinerie d'Arzew- Oran, ils montrent la composition des produits pétroliers tels que Naphta léger et le Naphta lourd, le kérosène et gasoil. Le gasoil est le produit le plus chargé en alcane (62.36%), ces composés varient entre

16

(C1 à C30), et en aromatique (17.36%) et il regroupe le benzène et des hydrocarbures aromatiques non identifiés. YASSA (2005) cible la pollution atmosphérique, ces travaux traitent la composition en particules organiques de la torche (combustion du pétrole brut) émis par la raffinerie à Hassi-Messaoud et la comparer avec la pollution présente en ville. La composition en particules chimiques atmosphériques en n-alcanes est de 33% pour (C16 et C34) tel Octadecane (0.012 ppm), et de 47% pour les n-alcanoique acides (A10 à A30) tel acide pamitique (0.061 ppm). En HAPs 20% tels Phénanthrène (0.011 ppm) et pyrène (0.003 ppm). LADJI (2010) étudie la composition organique du sable du Sahara pollué par les hydrocarbures des différentes régions d'Algérie, Hassi-Messaoud, Hassi-Bahbah, Laghouat, Tougguort et Ghardaia, la plus grande pollution est détectée en n-alcanes à HassiBahbah avec 66% entre (C16 à C35), le % de chaque n-alcanes est défini dans le sable pollué et pour chaque ville. En HAPs la ville la plus polluée est Laghouat avec 21.8% entre les aromatiques légers tels phénanthrènes, anthracène et les aromatiques lourds tels pyrènes et benzo[a]pyrène, le % de chaque composé aromatique est défini dans le sable pollué et pour chaque ville. BOUTENFNOUCHET en (2005) a permis d'établir une cartographie de la pollution et à évaluer la pollution industrielle par les hydrocarbures totaux au niveau de la plateforme industrielle de Skikda. Cependant, il serait intéressant de connaître l'identité de ces hydrocarbures directement dans l'effluent industriel et même dans le pétrole brut avant et après le traitement en raffinerie, qui est un élément important pour définir le degré du danger qu'ils constituent.

I.6. Mobilité des hydrocarbures dans l'environnement

Une fois déplacé, transformé ou éliminé dans l'environnement, l'hydrocarbure est soumis à différents processus qui vont entraîner des modifications de son aspect général et de ses caractéristiques physico-chimiques. Ces processus sont soumis au contrôle de facteurs physiques, chimiques et biologiques. On citera les facteurs environnementaux qui sont (R.E1, 2004) :

I.6.1. Evaporation

Qui, selon le type de pétrole, peut affecter la quasi totalité ou une partie insignifiante du pétrole déversé. Les fractions de faible poids moléculaires, les plus volatiles des hydrocarbures déversés se perdent dans l'atmosphère à un taux qui est déterminé par le type d'hydrocarbure, la vitesse du vent et la température ambiante. La plupart des pétroles bruts déversés perdent jusqu'à 40% de leur volume dans les première 48 heures alors que les fuels

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moins ils lourds, qui contiennent peu de composés volatils, s'évaporent très peu, même après plusieurs jours (R.E1, 2004).

I.6.2. Solubilisation

Bien que les hydrocarbures soient des composés insolubles dans l'eau, certains d'entre eux peuvent partiellement se dissoudre (hydrocarbures aromatiques et hydrocarbures à faible nombre de carbone) (BERTRAND et MILLE, 1989). Un hydrocarbure est d'autant plus soluble que sa masse moléculaire est faible et que sa polarité est élevée (SOLTANI, 2004). Il est important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour l`environnement, ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés par la faune et la flore (SOLTANI, 2004).

I.6.3.Emulsification

C'est le mélange de deux fractions non miscibles : l'eau et le pétrole. Deux types d'émulsions peuvent se former : Les émulsions directes « huile dans l'eau »: si la surface de l'eau est turbulente ; les hydrocarbures peuvent se fragmenter en gouttelettes qui ensuite restent en suspension dans l'eau. Ces émulsions facilitent l'élimination des hydrocarbures (R.E1, 2004). Et l'eau dans huile appelée « mousse chocolat » Ce type d'émulsion ; que l'on qualifie également d'émulation inverse ; peut se produire en l'espace de quelques heures ; et contient jusqu'à 90% d'eau .Le résultat est une augmentation de la densité et de la viscosité, aussi que des volumes à traiter ou à enlever (R.E1, 2004). Les émulsions eau dans huile sont constituées par des hydrocarbures de haut poids moléculaires (SOLTANI, 2004).

I.6.4. Sédimentation

Elle résulte de l'augmentation de la densité du pétrole par rapport à celle de l'eau de mer. Divers processus interviennent dans l'accroissement de cette densité, à savoir l'évaporation, la dissolution des composés légers, l'oxydation des paraffines, la formation d'agrégats et l'adsorption du pétrole dispersé sur les particules en suspension. Les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques à haut poids moléculaires, sont plus facilement adsorbés par les matières organiques particulaires et colloïdales et donc incorporés plus rapidement dans les sédiments (BERTRAND et MILLE, 1989).

I.6.5. Photo-oxydation

Photo-oxydation est observée au niveau de la surface de l'eau ou l'air (oxygène) et la lumière (radiation solaires) sont présents pour la transformation des hydrocarbures. Etant donné la réduction rapide de la diffusion de la lumière dans les couches épaisses d'hydrocarbures ; la

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photo-oxydation affecte essentiellement les couches minces ou la surfaces des couches épaisses d'hydrocarbures (BERTRAND et MILLE, 1989). La photo-oxydation touche plus particulièrement les composés aromatiques qui sont plus photo-sensibles que les composés aliphatiques elle transforme les hydrocarbures en leurs homologues oxygénés généralement beaucoup plus solubles que les hydrocarbures de départ, mais parfois beaucoup plus toxiques (BERTRAND et MILLE, 1989).

Figure 2 : Représentation schématique du devenir d'une pollution pétrolière à la surface du sol (MORGAN et WATKINSON, 1989).

I.6.6.Biodégradation

La biodégradation des hydrocarbures par les bactéries et les champignons marins contribue de façon significative à la transformation des hydrocarbures en produits oxydés. La vitesse de dégradation dépend de la chaleur, des éléments nutritifs et de la teneur en oxygène dissous ainsi que du type d'hydrocarbure. Les composés les plus légers se dégradent plus vite que ceux qui ont un poids moléculaire élevé (SAUER et al., 1993). L'importance de la biodégradation dans l'élimination du pétrole ; les voies métaboliques d'oxydation des hydrocarbures par les bactéries et les paramètres qui peuvent influencer la biodégradation. (SOLTANI ,2004).

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Tableau 1 : Exemples de durée de demi- vie des HAPs dans le sol (LCPE, 1994)

HAPs Demi-vie

Fluorène 32 à 60 jours

Phénanthrène 2.5 à 210 jours

Anthracène 170 jours à 8 ans

Fluoranthène 268 jours à 377 jours

Pyrène 2010 jours à 5.5 ans

Benzo (a) pyrène 0.3 à 58 ans

I.6.7.Pénétration dans la chaîne alimentaire

Suite à leur exposition à des composés pétroliers variés, plusieurs organismes marins tels que les organismes planctoniques, les invertébrés (bivalves) et les poissons, peuvent accumuler les hydrocarbures sous forme de vésicules intracytoplasmique (BERTRAND et MILLE, 1989). Les organismes planctoniques qui sont solidaires des masses d'eau dans lesquelles ils sont en suspension, sont incapables d'éviter les zones contaminées par des déversements pétroliers et ils incorporent ainsi les hydrocarbures directement dans leurs cellules ce qui constitue une voie de pénétration de ces composés dans la chaîne alimentaire. Par conséquent une altération affectant le plancton se répercute forcement sur les niveaux trophiques les plus élevés de la chaîne alimentaire (LACAZE, 1980).

I.7. Conséquences de la pollution de l'environnement par les hydrocarbures

La notion de la pollution est toute relative .On peut considérer qu'il y a pollution par les hydrocarbures lorsque l'action de ceux-ci peut être considérée comme néfaste aux conditions de vie de l'homme directement, ou indirectement si elle affecte les populations animales et végétales qui lui sont utiles (BRIANT et GATELIER ,1971).

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L'étude de la pollution des hydrocarbures nécessite des dosages très précis:200 ppb d'hydrocarbures dans l'eau sont suffisantes pour altérer son odeur. On constateque10 ans peuvent s'écouler entre un déversement dans le sol et son arrivée dans une nappe aquifère (BRIANT et GATELIER, 1971).

I.7.1. Pollution du sol par les hydrocarbures

L'exploitation des hydrocarbures nécessite et engendre des opération et activités importantes qui perturbent notre environnement provoquant des effets néfastes pour la santé humain. (ARBAOUI et AFFANE, 2005). Les hydrocarbures consistent les éléments essentiels des pétroles; leurs molécules ne contiennent que du carbone et de l'hydrogène, elles se devisent en plusieurs familles chimiques selon leur structure (WAUQUIER, 1994). Toutes ces structures sont basées sur le carbone (WAUQUIER, 1994). Les enchainements moléculaires carbones - carbone peuvent être : soit réunis par une simple liaison -C-C- (suffixe ANE) soit par liaisons multiples : Doubles C=C (suffixe ENE) ou triples C=C (suffixe YNE) (WAUQUIER, 1994).

I.7.2. Origines de pollution

A. Pollutions accidentelles : ou une grande quantité de polluant est déversée en fonction du temps (déversement ou dépôt ponctuel de polluants).

B. Pollutions chroniques : dont les effets cumulés peuvent être plus importants que ceux d'une pollution accidentelle (JEANNOT et LEMIERE ,2001).

I.7.3. Types de polluants

Les groupes de composes pétroliers polluants pour lesquelles la biodépollution est possible sont : A. Les hydrocarbures pétroliers (gasoils, fuel, kérosène, huiles minérales).

B. Les déchets d'exploitation du pétrole (boues et résidus d'huiles goudrons) (BLIEFERT et PERRAVD, 2004).

I.7.4. Biodétection de la pollution du sol par les hydrocarbures

Une méthode plus pratique pour épurer les environnements contaminés par des produits dangereux est la biorémediation ou la dépollution biologique (DAVID ,2005).

Il s'avère que le traitement des terres polluées se fait majoritairement à l'aide de techniques biologiques qui s'appliquent préférentiellement hors site, dans des installations spécialisées recevant des terres de plusieurs origines. Suivent les techniques de biodépollution des sols in situ puis la biodégradation des polluants des terres mises en andain sur le site. Ces techniques

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se basent sur le fait que les micro-organismes qui se développent dans un sol pollué y trouvent des conditions favorables et se nourrissent notamment du polluant présent qui est alors dégradé. En modulant des paramètres comme l'oxygène, l'humidité, la température et les éléments nutritifs, la croissance des micro- organismes dépollueurs peut être optimisée. (DAVID .C ,2005). L'ensemble des procédés d'élimination de polluants, organiques ou minéraux, présents dans les milieux naturels par l'action de microorganismes (DAVID ,2005).

I.7.4.1. Quatre types de procédés

A. Biodégradation: Décomposition d'un substrat organique, par action de microorganismes vivants.

B. Bioréduction: Réduction des composés oxydés (nitrates, oxydes métalliques) par voie biologique.

C. Biolixiviation: Extraction des métaux contenus dans une boue, un sol, un sédiment ou un minerai par solubilisation provoquée par des microorganismes.

D. Biofixation/Biosorption:"Fixation" de polluants, la plupart du temps, métalliques, présents dans un effluent liquide sur des microorganismes.

I.7.5. Biorémediation

La bioremédiation est définie par l'utilisation d'organismes vivants pour détruire les polluants environnementaux. Elle a été appliquée au traitement de contaminations inhabituelles (PERR ,2001) par l'activité des bactéries l'action de leur condition de prolifération (KOLLER, 2004).

I.7.5.1. Micro-organismes effectuant la bioremédiation

L'évolution a permis l'émergence d'une grande variété de micro-organismes présentant des capacités de biodégradation larges et flexibles. Ils peuvent survivre et détruire ou détoxifier des composés chimiques dans une grande variété de niche environnementales (chaleur, froid, PH bas, avec ou sans oxygène, etc.).Les organismes les mieux adaptés pour la bioremédiation sont souvent les espèces indigènes d'un habitat pollué particulier. Les microorganismes indigènes par définition survivre et se multiplie en présence de substances toxiques (PERRY, 2001).

I.7.5.2. Micro-organismes utilisés

La dépollution de sols contaminés par hydrocarbures en utilisant les microorganismes appelés hydrocarbonoclastes a été mise en évidence des 1946 par ZoBell (SOLTANI, 2OO4).

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Les microorganismes impliqués dans cette biodégradation peuvent être : des bactéries, des archées, des algues ou encore des champignons. On dénombre après un siècle d'études 200 genres de ces microorganismes, représentant plus de 500 espèces et souches décrites (TERRAT ,2001)

Depuis cette date le nombre d'espèces bactériennes identifiées possédant cette propriété n'a cessé d'augmentes. En se basant sur la fréquence d'isolement, les genres bactériens prédominants sont Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligénes, Vibro, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Corynebacteria, et Nocardia, Ces organismes dégradant les hydrocarbures sont ubiquistes (SOLTANI ,2004).

I.7.5.2.1. Bactéries

Dans le sol, les bactéries sont les micro-organismes les plus abondants et les plus actifs. En fonction des propriétés physico-chimique du sol ; tous les types physiologiques bactériens sont représentés dans la microflore tellurique : Autotrophes et hétérotrophes, thermophiles et psychrophiles, aérobies, anaérobies facultatifs et anaérobies très répandus, les actinomycètes jouent un rôle important dans la décomposition de la matière organique. Certaines espèces d'actinomycètes du genre Streptomyces produisent la géosmine, un composé volatil qui donne au sol son odeur terreuse caractéristique (BOUSSEBOUA, 2005).

I.7.5.2.2. Champignons

Les champignons semblent plus résistants que les bactéries dans les conditions de très faible humidité et sont relativement plus abondants (SASSON, 1967).

I.7.5.2.3. Plantes

De nombreuses plantes sont capables de fixer dans leurs cellules les métaux lourds, radionucléides, composés organiques polluants et autres produits indésirables; certaines plantes produisent des enzymes qui dégradent ces polluants en des produits moins toxiques ou non-toxiques. Elles peuvent également être accompagnées d'une mycorrhizosphére se chargeant du travail de fixation et / ou de transformation, dont l'étude visant aux applications à l'échelle industrielle est en plein essor. Ces propriétés en ont fait des candidates d'avenir à la dépollution des sols. Les plantes sont aussi sélectionnées selon leur taille et aptitude à faire plonger leurs racines profondément dans le sol, de manière à atteindre les couches polluées profondes (quelques mètres), et selon le type de polluant qu'elles sont capables d'emprisonner ainsi. (COLOMBANO et al ,2010).

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En pratique on peut aussi excaver la terre et l'épandre sur une membrane imperméable sous serre, de manière à isoler la matière polluante et contrôler précisément les paramètres influant sur la croissance des plantes sélectionnées. Cela retire toutefois un des bénéfices majeurs de la phytoremédiation, à savoir son coût d'opération peu élevé (COLOMBANO et al ,2010).

L'un des avantages de la phytoremédiation est la possible revalorisation des polluants recyclables, aussi appelé phytominage. Ainsi, les plantes dites hyperaccumulatrices, qui stockent le polluant dans leurs tiges et leurs feuilles peuvent être récoltées puis incinérées en vue de récupérer les métaux parmi les cendres et les réutiliser en métallurgie (COLOMBANO et al ,2010).

I.7.6. Traitement des sols pollués par les hydrocarbures

Les hydrocarbures en forte concentration dans l'environnement ainsi que leur transfert ont un effet néfaste vis-à-vis la santé de l'homme et les écosystèmes. Le choix d'une méthode de dépollution doit être préalablement étudié à fin d'éviter la diffusion du polluant des sites contaminés. Les différents paramètres étudiés généralement sont :

· Type de polluant

· Nature du sol et son accessibilité ainsi que sa localisation

· Date de la pollution (récente ou ancienne)

· L'étendu de la surface contaminée

· les exigences économiques et administratives

Les opérations de traitements des sols polluées peuvent se faire de plusieurs manières (physico-chimique et biologique). Les procédés physico-chimiques englobent des traitements physiques comme les lavages et l'extraction des polluants, des traitements thermiques par incinération des produits organiques polluants réduits en CO 2 et H 2 O et des traitements chimiques qui ont pour but de détruire les polluants ou les rendre moins toxiques. Les procédés biologiques qui sont plus écologiques sont aussi employés, comme la phytoremédiation qui par certaines plantes permet de transformer les polluants dans les sols par association (racines-microflore). Le « Landfarming » qui repose sur le déversement de terres contaminées sur des surfaces plus ou moins préparées { l'avance. L'ajustement du pH et l'additionnement de l'azote sont réalisés afin de stimuler s'emploie hors site ou sur le site. Une autre technique biologique par aération du sol ou bioventing, repose sur l'injection d'air

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dans le sol pour fournir aux microorganismes l'oxygène nécessaire (la biodégradation) (BOUDERHEM ,2011).

II. Biodégradation des hydrocarbures

La biodégradation des hydrocarbures pose un certain nombre de défis aux micro-organismes. D'une part, le pétrole et ses dérivés se présentent comme des mélanges complexes. D'autre part, les hydrocarbures à faible poids moléculaire montrent une toxicité due à leur effet solvant sur les membranes. Enfin, la majorité des hydrocarbures présente une solubilité limitée dans l'eau (MORGAN et al., 1989).

Les microorganismes doivent donc s'adapter à ces substrats et être capables de les utiliser comme source de carbone. Il est actuellement établi que l'hydrocarbure, pour être assimilé par la cellule, doit subir une transformation. Actuellement, on peut dire que les micro-organismes sont capables de dégrader certains constituants des pétroles, mais que les taux de décomposition dans les écosystèmes naturels sont encore très mal connus. Par ailleurs, la pollution par les hydrocarbures peut souvent être qualifiée de multi-pollution car elle est associée aux métaux lourds, en particulier le vanadium et le nickel naturellement présents dans les pétroles. La concentration du vanadium peut atteindre les 400 à 580 ppm (ENVIRONNEMENT CANADA, 2005).

L'utilisation d'une grande variété d'hydrocarbures par les bactéries a été démontrée. En effet, des souches bactériennes dégradent les paraffines, les cycloparaffines, les HAM et les HAP (MORGAN et WATKINSON, 1989 ; DOELLE, 1979 ;SCHNEIDER et al., 1996 ; SANSEVERINO et al., 1993 ; MALAKUL et al., 1998 ; DEAN et al.,2001 ; GRIFOLLet al., 1992 ; SCRIBAN, 1999 et BOLDRIN et al., 1993). Cette dégradation fait intervenir l'équipement enzymatique des germes caractérisé par une faible spécificité, ou par la synthèse de nouvelles enzymes spécifiques aux polluants présents. Cette voie peut s'opérer jusqu'à un stade avancé qui peut aller jusqu'à la minéralisation complète du substrat (PELMONT, 1993).

Certaines souches transforment les hydrocarbures en la présence obligatoire d'un autre substrat. Le cométabolisme est notamment la voie utilisée par Mycobacterium sp. pour transformer le fluorène en présence de l'extrait de levure et de la peptone (BOLDRIN et al., 1993). Par ailleurs, plusieurs espèces de champignons ont l'aptitude de transformer les hydrocarbures aromatiques polycycliques (BUMPUS, 1988 ; STAPLETON et al., 1998 ; BZALEL et al., 1996 et CERNIGLIA, 1992). Les champignons lignolytiques tels que Phanerochaete chrysosporium dégradent les HAP au moyen des enzymes dégradant la lignine (BUMPUS, 1988). Les champignons non lignolytiques utilisent les monooxygénases du cytochrome P-450. Le plus étudié est Cunninghamella elegans qui transforme les HAP en

produits moins mutagènes, aboutissant ainsi à leurs détoxification (CERNIGLIA, 1992). L'attaque des HAP par les champignons conduit à la détoxification alors que la voie bactérienne conduit à la rupture des cycles avec assimilation du carbone (CERNIGLIA, 1984 ; CERNIGLIA et al., 1992 ; SUTHERLAND, 1992 cité par CERNIGLIA, 1992).

Les algues vertes et les cyanobactéries transforment les HAP sous conditions photoautotrophes. Selenatrum capricornutum dégraderait le Benz[a]pyrène en faisant intervenir une dioxygénase similaire à celle des bactéries (CERNIGLIA, 1992).

Le taux de dégradation des HAP est en général inversement proportionnel au nombre de cycle dans la molécule. La biodégradation de ces composés aussi bien par les procaryotes que par les eucaryotes nécessite la présence d'oxygène pour effectuer la première attaque sur les noyaux (GIBSON et SUBRAMANIAN, 1984 cités par CERNIGLIA, 1992).

Figure 3 : Dégradation du pyrène proposée par LIANG et al. (2006).

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II.2. Types de biodégradation

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II.2.1. Biodégradation aérobie

Selon ZHENPENG et al.,(2002), La biodégradation aérobie d'une substance organique est le degré de modification physique et chimique que subit cette matière organique par les microorganismes. Celle-ci peut être affectée par la modification de l'un des facteurs suivants :

· Vitesse de dégradation des composés organiques.

· Quantité de l'oxygène consommée.

· Produits résultant de la dégradation.

· Activité microbienne.

Figure 4 : Dégradation du naphtalène en salicylate par voie intradiol par des bactéries
aérobies du genre Pseudomonas (VANDECASTEELE, 2005).

II.2.2. Biodégradation anaérobie

La biodégradation anaérobie d'une substance organique est le degré de modification physique et chimique que subit cette matière organique par les microorganismes en conditions d'anaérobiose. La figure 2 illustre les processus de biodégradation que subit la matière organique en condition anaérobie (HONGWIE et al., 2003).

II.3. Facteurs affectant la biodégradation des hydrocarbures dans l'environnement

La biodégradation des hydrocarbures est l'un des premiers mécanismes conduisant à la transformation de ces polluants en produits moins toxiques. Les travaux de recherche sur l'oxydation des hydrocarbures par les microorganismes ont montré que ce processus dépend de la structure chimique des hydrocarbures et des conditions environnementales (COSTES et DRUELLE, 1997). Les facteurs physicochimiques influant sur la vitesse de biodégradation microbienne sont :

A.

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La structure du sol et leur nature (composition structure et surtout diffusion d'oxygène).

B. La composition du polluant selon SOLTANI (2004) (la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les hydrocarbures saturés, viennent en suite les aromatiques légers, les aromatiques à haut poids moléculaire).

C. Température (entre 25°C à 37°C.)

D. Ressources en oxygène ; sous forme d'oxygène pure, air atmosphérique ou le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2)

E. La pression et l'humidité

F. Les nutriments (azote et phosphore en particulier)

G. Le potentiel d'hydrogène (entre 6 et 8)

H. Effet de la salinité

II.4. Biodégradation du pétrole brut

La spécificité des substrats à l'attaque microbienne a été largement étudiée. ATLAS 1981 et LEAHY et COLWELL (1990), ont classé les composés du pétrole en quatre familles. Ces composés différents par leur susceptibilité à l'attaque microbienne. Ainsi la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les saturés, viennent ensuite les aromatiques légers, les aromatiques à haut poids moléculaire, les composés polaires ayant la vitesse de dégradation la plus faible.

Les hydrocarbures saturés incluent les n-alcanes, les alcanes ramifiés et les cycloalcanes. Les alcanes à chaines linéaires sont les plus abondants des hydrocarbures totaux dans le cas du pétrole léger et peuvent atteindre dans certains cas 60%, les plus rapidement dégradable tels les n-alcanes à nombre de carbone supérieur à 44 peuvent être métabolisés par les microorganismes et ceux ayant de 10 à 24 atomes de carbone (C10-4) sont généralement les plus facilement dégradables. Les alcanes ramifiés sont plus récalcitrants à la biodégradation que les n-alcanes et plus le nombre de ramification augmente, moins ces composés sont susceptibles à la biodégradation microbienne. Les hydrocarbures cycliques constituent une fraction importante des hydrocarbures dans la plupart des bruts pétroliers, ils sont difficilement dégradables que les deux séries précédentes à cause de leur toxicité suite à l'interaction avec la membrane cellulaire des microorganismes (SIKKEMA et al., 1995).

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Les expériences montrent de façon équivoque que la biodégradation des cycloalcanes est très limitée (ATLAS 1981). La non accumulation des hydrocarbures cycliques dans l'environnement implique des phénomènes non conventionnels de dégradation telle que l'intervention des phénomènes de Co-oxydation impliquant plusieurs souches microbiennes dont l'équipement enzymatique est complémentaire (BERTRAND et al., 1989, ROTANI et al.,1992).

II.5. Biodégradation par type d'hydrocarbure

En aérobiose, de nombreuses bactéries ont développé des stratégies enzymatiques qui leur permettent d'incorporer un ou deux atomes d'oxygène à la molécule cible. Cette réaction d'oxydation rend l'hydrocarbure plus hydrophile et par conséquent plus facilement dégradable par le métabolisme bactérien. Les réactions impliquées dans ces processus font le plus souvent appel à l'action d'oxygénases (mono- ou dioxygénase). L'acquisition par les organismes des gènes de dégradation des hydrocarbures se fait le plus souvent par transfert horizontal via des plasmides, des transposons (PHALE et al., 2007).

II.5.1. Biodégradation des hydrocarbures saturés II.5.1.1. Voies de dégradation des alcanes linéaires

La dégradation aérobie des alcanes est amorcée par l'introduction d'un atome d'oxygène sur la chaîne aliphatique via l'action d'une monooxygénase pour former un alcool linéaire. Cette réaction peut être réalisée par des cytochromes P450 (SARIASLANI et OMER, 1992), des méthanes monooxygénases et des systèmes d'hydroxylases à fer non hémique appelés « alcane hydroxylase » qui semblent être les plus répandus dans la dégradation des alcanes (VAN BEILEN et al., 2001).

II.6. Biodégradation oxydative des HAPs par les bactéries

Une grande variété de bactéries à Gram-positif et Gram-négatif ont été isolées et caractérisées pour leur capacité à métaboliser les HAPs. Si la dégradation bactérienne des HAPs à faible poids moléculaire tels que le naphtalène, le phénanthrène, ou encore l'anthracène est clairement mise en évidence et présente des similarités importantes (CERNIGLIA, 1992), les mécanismes intervenants dans celle des HAPs à cinq cycles aromatiques ou plus tels que le Benzo Pyrène restent encore à explorer. Les HAPs peuvent être dégradés et minéralisés par un seul organisme ou par cométabolisme. Les bactéries oxydent initialement les HAPs par l'incorporation de deux atomes d'oxygène via l'action d'une dioxygénase entraînant ainsi l'oxydation d'un cycle aromatique. L'étape initiale d'attaque des HAPs peut être réalisée via

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une monooxygénase, une dioxygénase, ou par oxydation du groupement substitué par l'action de monooxygénase (GIBSON et PARALES, 2000 ; KHAN et al., 2001 ; WILLIAMS et SAYERS, 1994). A l'issu de plusieurs réactions biochimiques, l'attaque par une dioxygénase conduit à un cis-dihydrodiol caractéristique de la dégradation bactérienne. Les produits sont par la suite minéralisés ou incorporés en biomasse cellulaire (dépendant du nombre de cycles et de substitutions). La dégradation du naphtalène par clivage intradiol est la mieux connue et constitue la référence pour la dégradation des HAPs. L'étape initiale de la dégradation du naphtalène, catalysée par la naphtalène dioxygénase (NahAc) implique l'incorporation de deux atomes d'oxygène pour former le cis-1,2-naphtalène dihydrodiol. Les étapes enzymatiques suivantes aboutissent à la formation de salicylate et sont spécifiques des composés polyaromatiques (EATON, 1994).

II.7. Microbiologie classique

La microbiologie, selon la technique utilisée, permet de définir les trais morphologiques, physiologiques et/ou métaboliques des microorganismes d'un écosystème donné (HEITKAMP et al., 1988). La majeure partie des connaissances concernant la biodégradation des hydrocarbures dans l'environnement a été acquise à partir d'études basées sur l'isolement de microorganismes hydrocarbonoclastes (WATANBE et HAMAMURA, 2003).

L'isolement présente comme avantage essentiel de pouvoir travailler sur des souches pures et ainsi d'étudier précisément un microorganisme et certaines de ses fonctions. Il est par exemple possible de caractériser in vitro les mécanismes biochimiques et moléculaires impliqués dans la dégradation d'un hydrocarbure. Cependant, les souches hydrocarbonoclastes isolées ne sont pas forcément représentatives des capacités métaboliques de la communauté naturellement présente (THOMPSON et al., 2005).

En effet, seul 1% des bactéries d'une communauté serait cultivable en condition de laboratoire (AMANN et al., 1995), le principal biais de ces techniques étant une sous-estimation importante de la diversité soit une sous-estimation des capacités métaboliques de la communauté étudiée. Aussi, les cinétiques de biodégradation d'un polluant in vitro sont très différentes de celles observées dans l'environnement (WATANBE et BAKER, 2000).

Toutes ces méthodes, à l'exception des comptages directs, sont dépendantes de la culture des microorganismes. Afin de s'affranchir de tels biais, des approches biochimiques et moléculaires ont été développées au cours de ces vingt dernières années. La simple utilisation de techniques de microbiologie classique ne permet pas la caractérisation de communautés complexes. Elles sont aujourd'hui généralement utilisées en complément d'approches moléculaires afin d'apporter des informations complémentaires sur la communauté

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bactérienne étudiée. Au début du XXème siècle, la classification des microorganismes reposait sur des critères morphologiques observés par microscopie ou cultures pures sur boites de Petri. A cette époque, les microbiologistes étaient conscients que ces méthodes étaient restrictives et insuffisantes pour distinguer les espèces les unes des autres (JANSSEN, 2006).

Matériels et méthodes

I. Objectif

Notre travail a pour objectif d'essayer de réhabiliter un sol agricole contaminé par les hydrocarbures pétroliers en utilisant des souches bactériennes.

Ce chapitre a pour but de décrire les différents protocoles et méthodes mis en oeuvre au cours de ce travail. Certains protocoles sont détaillés en annexe.

II. Milieux de culture

Gélose nutritive : GN (la composition voir annexe) : un milieu d'isolement et de purification Gélose au cétrimide (la composition voir annexe) : un milieu sélectif, qui permet l'isolement des Pseudomonas et notamment de P.aeruginosa. Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments par P.aeruginosa.

BN (la composition voir annexe) : un milieu destiné à obtenir une croissance rapide du microorganisme étudié.

MSM (la composition voir annexe) : un milieu des sels minéraux

III. Matériel biologique :

Pour la réalisation de nos expériences, nous avons utilisé des échantillons de sols contaminés par les hydrocarbures prélevés au niveau des champs de Mascara, Ouargla, la raffinerie d'Arzew (Sonatrach, compagnie Algérienne de pétrole). Un autre échantillon est prélevé d'un sol n'ayant pas subit de rejets pétroliers, il s'agit de sfisef. Afin de déterminer la répartition des bactéries telluriques en fonction du degré de pollution du sol par les hydrocarbures.

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Figure 5 : Site d'échantillonnage de Mascara (Google, 2018)

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Figure 6 : Site d'échantillonnage d'Ouargla (Google, 2018)

Figure 7 : Site d'échantillonnage d'Arzew (Google, 2018)

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Figure 8 : Site d'échantillonnage de Sfisef (Google, 2018)

IIII. Méthode

IIII.1.Echantillonnage

L'échantillonnage est effectué au centre de chaque site. Les prélèvements ont été réalisés à l'aide d'une spatule stérile à une profondeur de 20 cm. Pour chaque échantillon, 1Kg de sol prélevé est mis dans des flacons en verre stériles. Les échantillons de sols obtenus sont ensuite tamisés à 5 mm puis à 2 mm pour éliminer les éléments grossiers et les débris organiques. Les échantillons de sols sont conservés au frais (environ 4°C) (CHAUSSOD et al, 1992 ; FARDOUX et al, 2000).

IIII.2. Analyses physico-chimiques IIII.2.1. Teneur en eau ou humidité

Nous avons procédé à la détermination de la teneur pondérale en eau du sol par la méthode gravimétrique selon la norme NF ISO 1146. Elle s'exprime en % c'est-à-dire en gramme d'eau pour 100 g de sol déshydraté à 105°C. Le taux d'humidité s'exprime en % selon la formule suivante : H% = P 1 - P 0 / P 0

P 0 : poids de la prise d'essai du sol (g).

P 1 : poids de la prise d'essai de sol après séchage à 105°C (g).

IIII.2.2. Potentiel d'hydrogène (pH)

Le pH est déterminé selon la norme AFNOR X 31-103 (AFNOR, 1994) par la mesure du pH d'une suspension de sol dans l'eau à 2/5 (rapport masse/volume) après 1 heure d'agitation puis décantation à l'aide d'un pH mètre.

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III.2.3. Conductivité électrique (CE)

La conductivité électrique est mesurée sur l'extrait de sol dilué au 1/5. Elle doit être exprimée en dicisiemens par mètre (ds/m) (BAIZE, 2000). Elle a été déterminée par un conductimètre.

IIII.3.Isolement des microorganismes

Pour la dilution des échantillons, nous avons besoin d'eau physiologique stérile, tubes Stériles, une micropipette et un vortex, une balance.

Pour l'ensemencement et la purification, nous utilisons des boites de Pétri contenant de la Gélose nutritive ordinaire (GN) et de gélose au cétrimide.

IIII.3.1. Enrichissement IIII.3.1.1. Dilution décimale

Afin de dénombrer la microflore bactérienne existant dans l'échantillon, la solution mère du Sol est préparé (10gr de sol dans 90mL de bouillon nutritif) suivie d'une série de dilutions Décimales allant de 10 ^-1 (solution mère) à 10^-6en conditions d'asepsie.

IIII.3.1.2. Isolement des bactéries sur milieu solide

On prélève 0,1 ml de chaque dilution préparée qu'on ensemence par étalement sur les boites De Pétri contenant de la GN et de cétrimide à l'aide d'un râteau. L'incubation des boites se fait à 30°C pendant 24h.

IIII.3.2. Dénombrement des bactéries

Le dénombrement après culture concerne, évidement les cellules viables de l'échantillon Autrement dit, les cellules capables de croitre. Il est basé sur l'aptitude de chaque bactérie, fixée par la solidification du milieu gélosé, à former une colonie visibles à l'oeil nu (AUSTIN, 1988).

Après 24h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide d'un Compteur de colonies en UFC (Unité Formant Colonie).

Le nombre de germes par gramme de sol est déterminé en calculant la moyenne

Arithmétique des résultats obtenus et en tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule (MARCHAL et BOURDON ,1982)

N = n / d. v

35

Où :

N : Nombre des microorganismes en UFC/ ml.

n: Nombre des colonies dénombrées.

v: Volume prélevé (0.1ml).

d: Dilution).

Dénombrement des colonies

Figure 9 : Schéma de l'isolement et de dénombrement des bactéries IIII.3. Observation macroscopique

L'observation macroscopique des colonies permet d'effectuer une première caractérisation (aspect des colonies et de leur revers, la taille et la couleur.

D'après JOFFIN et LEYRAL (2006), les éléments d'identifications macroscopiques sont:

· La forme des colonies : rondes, irrégulières,...etc.

· La taille des colonies par la mesure du diamètre: ponctiformes ou non ponctiformes.

· La chromogénèse: couleur de la colonie.

· L'élévation: convexe, concave, plate.

·

36

L'opacité: opaque, translucide ou transparente.

· La surface: lisse, rugueuse, sèche, dentelée,...etc. IIII.3.4. Observation microscopique

IIII.3.4.1.Coloration de Gram

C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration est réalisé systématiquement sur les différentes colonies purifiés pour préciser le caractère Gram+ ou Gram-. Avec cette coloration double, les bactéries Gram positive apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram négatives sont colorées en rose ou en rouge (DELARRAS, 2008).

La technique est comme suit :

-A partir des boîtes de pétri faire un frottis.

-Déposer une goutte d'eau physiologique sur la lame.

-Frotter la pointe dans la goutte d'eau physiologique. Laisser sécher à l'air.

-Passer 3 fois la lame dans la petite flamme du bec Bunsen pour fixer l'échantillon à la

chaleur.

-Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane (cristal violet) sur le frottis fixé.

-Laisser agir 1 minute. Jeter l'excès de colorant dans un bécher.

-Rincer très brièvement

-Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis.

-Laisser agir 1 minute. Jeter la solution de Lugol dans un bécher et rincer brièvement à l'H2O.

-Déposer quelques gouttes d'alcool sur le frottis et laisser agir 30 secondes.

-Rincer à l'H2O.

-Déposer la solution de fishine pendant 1 minute.

-Rincer à l'H2O.

-Laisser sécher à l'air.

-Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au

grossissement 1000x).

37

IIII.3.4.2.Coloration de spores

La coloration au bleu de méthylène permet l'observation de la morphologie cellulaire et la présence ou l'absence de spore (DELARRAS, 2008).

La technique est comme suivante :

-Réaliser un frottis fixé sur la lame.

-Recouvrir la lame de vert de malachite.

-Chauffer jusqu'à émission de vapeurs sans faire bouillir le colorant ni laisser sécher la

préparation. Le chauffage doit durer 10 min.

-Laisser refroidir et laver à l'eau.

- Recouvrir la lame de fishine durant 1min.

-Laver et sécher

-Observation à l'objectif 100 à immersion.

IIII.4.Purification des isolats

Après 24 h d'incubation, nous passons à l'étape de purification des cultures. Celle-ci

Nous permet d'obtenir des cultures pures à partir des différentes colonies isolées.

La sélection des colonies est basée sur l'aspect macroscopique des colonies à savoir la couleur, la forme, le diamètre, l'opacité. Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite purifié par repiquages successifs et alternés en milieu liquide, puis en milieu solide jusqu'à l'obtention au sein d'une boite de Pétri de colonies identiques par l'aspect et la couleur (Delarras, 2007).

IIII.5. Conservation des isolats

A partir d'une boite de pétri contient des colonies bien purifie, prélever une colonie bien isolé. -ensemencer dans un milieu BN, incuber a 30 °C /24 avec agitation.

-centrifuger a 6000 rpm pendant 10 min dans des tubes Eppendorf (1ml de la suspension bactérienne)

-éliminer le surnageant et garder le culot.

-ajouter 0.8ml BN stérile et 0.2 solution glycérol stérile a l'Eppendorf qui contient le culot. -vortexer et conserver a -20 °C (congélation).

(HOHZOH K, 1982) (JYOTHI K, K SURENDRA BABU 2012)

38

IIII.6. Identification des microorganismes

Elle comporte une série de tests permettant de mettre en évidence le type respiratoire des souches, leur métabolisme énergétique et celle du sulfure d'hydrogène (H2S), la réduction des nitrates. Des activités enzymatiques telles que l'oxydase, la catalase, et les enzymes de transformation des acides aminés (ADH et LDC) ont été également recherchées. Les souches ont été testées aussi pour l'utilisation des citrates, du glucose et de lactose.

IIII.6.1. Recherche des enzymes respiratoires

IIII.6.1.1. Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2 ) Avec dégagement d'oxygène (Marchal et Bourdon, 1982).

Sur une lame et à l'aide d'une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle On ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes = 3%).

La présence d'une catalase est révélée immédiatement par des bulles de gaz qui

Correspondent à l'oxygène dégagé.

IIII.6.1.2. Recherche de l'oxydase

Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase Enzyme entrant dans divers couples d'oxydoréduction (Singleton, 1999).

Pour réaliser ce test, un disque d'oxydase préalablement imbibé d'une goutte d'eau distillée Stérile est déposé sur une lame et mis en contact avec une colonie bactérienne fraîchement cultivée.

L'apparition d'une coloration violette immédiatement indique que le test est positif.

IIII.6.2.Test ONPG

- Faire une suspension dense en eau physiologique de la souche à étudier, puis ajouter un disque ONPG

(MARCHAL et BOURDON, 1982).

IIII.6.3. Recherche de Citrate

(Utilisation du citrate comme seule source de carbone) Pour réaliser ce test :

39

Ensemencer la pente selon une strie longitudinale avec une pipette chargée de suspension (préparée à partir d'une culture sur milieu gélosé, en prenant soin de ne pas racler le milieu pour ne pas apporter d'éléments nutritifs susceptibles de fausser les résultats).

- incuber à 37°C/24, sans trop visser le bouchon

(JOFFIN et LEYRAL, 2006).

IIII.6.4. Clark et Lubs (tests RM et VP)

-Ensemencer un milieu Clark et Lubs avec quelques gouttes de suspension bactérienne.

- Incuber à 37°C pendant 24 à 48 h.

Après vérification de la culture (trouble du milieu) :

Test RM (rouge de méthyle)

-Transférer a l'aide d'une pipette Pasteur environ 0,5 ml de milieu Clark et Lubs dans un tube

à hémolyse.

- Ajouter 1 goutte de rouge de méthyle.

Test VP (Vosges-Proskauer)

- Transférer dans un tube à hémolyse à l'aide d'une pipette Pasteur, environ 0,5 ml de milieu

Clark et Lubs, y ajouter 1 goutte de réactif.

- Attendre 10 min avant de conclure à un résultat négatif

(JOFFIN et LEYRAL, 2006).

IIII.6.4. Hydrolyse a l'amidon

Ensemencer la gélose par une strie ou un spot de 3 à 5 mm de diamètre, à l'aide de l'anse de platine chargée de culture (plusieurs souches possibles sur la même boîte).

Incuber à 30 ou 37°C pendant 1 à 5 jours, en position retournée

(MARCHAL et BOURDON, 1982)

IIII.6.5. Mannitol mobilité

Ensemencer par piqûre centrale à l'aide du fil droit chargé de suspension de la culture à étudier.

Incuber 24 heures à 37°C

(MARCHAL et BOURDON, 1982).

40

IIII.6.6.Viande-foie

-Régénérée la gélose VF par ébullition au bain-marie bouillant pendant environ 30 minutes.

-Ensemencer lorsque le milieu est encore liquide, vers 45°C. L'ensemencement se fait à la pipette Pasteur scellée (ou boutonnée) et chargée. On introduit la pipette Pasteur au fond du tube et on remonte en spirale.

-Ne pas visser le bouchon à fond.

-On place ensuite le tube à l'incubateur (à 37°C) pendant 24 heures (JOFFIN et LEYRAL, 2006).

IIII.6.7. Étude du métabolisme protéique

IIII.6.7.1. Recherche des décarboxylases (ODC, LDC, ADH)

- Ensemencer chaque milieu avec quelques gouttes de suspension de la culture à étudier. - incuber à 37°C/24h

(MARCHAL et BOURDON. ,1982).

IIII.6.I. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques IIII.6.I.1.Croissance sur milieu King (King A et King B)

Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différences espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques (MARCHAL et BOURDON, 1982).

La technique est comme suivante

- A partir d'une culture sur gélose (faire une suspension), ensemencer le milieu en faisant une strie à la surface de la gélose avec l'anse (ou en déposant une goutte de suspension).

- L'incubation est réalisée en aérobiose. IIII.6.J. Bouillon nitraté

Ensemencer un milieu nitraté avec quelques gouttes de suspension bactérienne. Après incubation (culture visible), ajouter:

-Du réactif de Griess (2 gouttes)

-Ou une goutte de réactifs :

o

41

réactif Nitrites 1 (acide sulfanilique),

o réactif Nitrites 2 (á-naphtylamine).

Le réactif de Greiss est un mélange des réactifs nitrites 1 & 2 (MARCHAL et BOURDON, 1982).

IIII.7.isolement de bactéries qui dégradent le pétrole :

-Ensemencer les souches dans un milieu minéral qui contient MSM.

-Lancer une culture des souches isolées dans du bouillon nutritif et incuber pendant 24heures. -Centrifuger la culture à 3000t/min pendant 10 minutes, récupérer le culot et effectuer un lavage avec msm liquide 5 fois.

-Laver l'agar puis préparer MSM solide, le couler dans des boites préalablement numérotées et les laisser solidifier.

-Après solidification de la gélose (verser une grande couche de la gélose), étaler 100 ul de pétrole filtré sur la surface des boites puis laisser sécher devant le bec benzène 3heures de temps.

- A partir des différents culots, prendre avec une ance stérile une goute et déposer sous forme de spots le concentré de culture dans les carreaux appropriés a chaque souche.

-Laisser sécher devant le bec benzène puis incuber a l'abri de la lumière à 30°C pendant 7 à 15jours et la lecture doit se faire quotidiennement

Remarque : l'incubation de certaines souches peut durer jusqu'à 21jours.

-Faire la lecture des boites tous les jours pour voir s'il y apparition de zones claire.

(HOHZOH K, 1982) (JYOTHI K, K SURENDRA BABU 2012) IIII.8.Détection de l'activité de biodégradation des bactéries

La croissance bactérienne a été suivie par mesure de la DO par spectrométrie à une longueur d'onde de 595nm de 0heure jusqu'à 15 jours et a des intervalles réguliers de 2 jours (avec MSM comme Blanc).

(HOHZOH K, 1982) (JYOTHI K, K SURENDRA BABU 2012)

42

Résultats et discussion

I. Analyses physico-chimiques

I.1. Caractéristiques du sol étudié

Tableau 2 : Caractéristiques de quatre types de sols étudiés.

Echantillon			Site de prélèvement			Description
1			Mascara			Couleur marron foncée.
2			Ouargla			Couleur orange, sableux, sèche.
3			Raffinerie d'Arzew			Couleur noir avec des particules marron foncé, forte odeur de polluant
4			Sfisef			Couleur marron.
							E4
		E3 E1 E2
Figure 10 : Différents échantillons des sols étudiés.

I.2. Mesure du potentiel d'hydrogène

Tableau 3 : Potentiel d'hydrogène des quatre sols étudies.

Echantillon	pH
1	6.73
2	6.08
3	6.54
4	6.8

43

Les valeurs de pH obtenues pour les 4 sols étudiés varient entre 6.08 et 6.73. Les échantillons de sol appartenant à E1, E3, E4 sont des sols acidifiés mais présente des valeurs proche de la neutralité alors que E2 est un sol acidifié. On constate aussi une diminution de la valeur de pH pour E2.

Le pH apparait ainsi comme un paramètre qui influence de manière majeure la structure et la diversité des communautés bactériennes dans les sols, et impose directement une contrainte physiologique sur les bactéries du sol. (NICOLAS T., 2013).

L'activité biologique d'un sol varie avec le pH, la diversité, l'abondance et l'activité de la microflore (bactéries) sont en effet influencées par le pH. Chaque espèce possède une plage optimale de pH, par exemple, Un pH de 7 est optimal pour l'activité des bactéries responsables des transformations de la matière organique, et par conséquent il assure un bon déroulement de la biodégradation des hydrocarbures.

I.3. Teneur en eau ou humidité

Tableau 4 : Taux d'humidité des quatre sols étudies.

Echantillon	Humidité
1	4
2	0.95
3	4.3
4	4.4

Les échantillons de sols étudiés sont aussi caractérisés par une humidité relative variant de 0.95 à 4.4%. Les valeurs les plus élevées sont celles de l'échantillon d'E4 (4.4%), de l'échantillon d'E3 (4.3%) et d'E1 (4%), l'échantillon E2 présente la valeur d'humidité la plus faible 0.95%.

Les faibles teneurs en eau des échantillons peuvent d'une part être expliquées par les faibles humidités relatives des sols sahariens (MONOD, 1999), il est à noter qu'un faible taux d'humidité peut avoir un effet négatif sur l'activité microbienne en limitant le contact microorganisme / polluant et en inhibant le processus de dégradation enzymatique (LECOMTE, 1995).

ERIKSON et al. (2001) ont montré l'influence de la structure du sol sur le transport de l'oxygène dans ce dernier. Ces auteurs indiquent que plus un sol est dense, moins les nutriments et l'O 2 sont transportés vers la flore indigène du milieu, responsable de la

biodégradation. De même, NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient la biodégradation. Cependant, dans les zones arides où le sable est la fraction dominante, les micro-organismes et leurs produits de synthèse sont faiblement reliés aux particules du sol (DOMMERGUES ET MANGENOT, 1970).

I.4. Conductivité électrique (CE)

Tableau 5 : Conductivité électrique des quatre sols étudies.

Echantillon	Conductivité
1	2.5
2	14.7
3	3.4
4	3

La valeur de la conductivité électrique de l échantillon E2 est très élevée 14.7 dS/m, les trois autres échantillons présentent des valeurs de conductivité électrique similaires variables de 2.5 à 3 dS/m.

44

Figure 11 : Potentiel d'hydrogène des quatre sols étudies.

Figure 12 : Taux d'humidité des quatre sols étudies.

45

Figure 13 : Conductivité électrique des quatre sols étudies.

II. Analyses microbiologiques du sol

Le résultat du dénombrement sur gélose nutritive obtenus pour les différentes dilutions a permis d'avoir une idée sur la charge bactérienne du site pollué ainsi que de sa diversité. Les valeurs sont rapportées dans les tableaux suivants.

Tableau 6 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 3.

Dilution	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
Dénombrement(boite1)	nappe	nappe	nappe	nappe	118	53
Dénombrement(boite2)	nappe	nappe	nappe	nappe	40	40

Tableau 7 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 4.

Dilution	-1	-2	-3	-4	-5	-6
Dénombrement(boite1)	nappe	nappe	nappe	346	nappe	280
Dénombrement(boite2)	nappe	nappe	nappe	18	nappe	10

Tableau 8 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 1.

Dilution	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6
Dénombrement(boite1)	nappe	nappe	nappe	280	152	270
Dénombrement(boite2)	nappe	nappe	nappe	310	210	80

Figure 14 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 3.

46

47

Figure 15 : Dénombrement sur gélose nutritive pour l'échantillon 1.

Le dénombrement a montré une charge bactérienne aux alentours de 11.4×10⁶ UFC/g de sol pour l'échantillon 3 et de 59.1×10⁶ UFC/g de sol pour l'échantillon 1, cela ne s'explique que par les conditions éco-climatique du site et la présence des polluants.

En tenant compte uniquement des bactéries cultivables, la variété des aspects, par contre n'est pas très élevée, cela nous a permis de sélectionner à partir de 17 isolats 5 seulement qui sont vraiment différentes sur le plan macroscopique.

II.1. Caractéristiques des isolats purifiés

Un sol qui contient des hydrocarbures va modifier l'activité des microorganismes. Ceux-ci doivent donc adapter leur activité enzymatique afin de pouvoir s'y attaquer. Les bactéries vont ensuite subir une période de forte croissance au cours de laquelle ils seront capables d'assimiler les produits de la dégradation des hydrocarbures. Cette biodégradation peut prendre plusieurs mois. Une fois qu'ils ont consommé les composés les plus facilement dégradables, leur nombre diminue jusqu'à atteindre de nouveau la taille d'une population normale. (Ce qui explique l'écart au niveau de nombre des souches isolées entre les deux échantillons). Parfois, seule une partie des polluants est dégradés car les hydrocarbures se lient partiellement à la matière organique du sol et deviennent alors moins accessibles aux microorganismes. Le niveau de dégradation des pétroles (mélange de composés facilement dégradables et de composés récalcitrants) est donc totalement dépendant de la diversité métabolique des bactéries hydrocarbonoclastes présentes dans l`environnement pollué. La diversité des espèces bactériennes est un facteur décisif dans la réponse des communautés bactériennes à ce type de variation environnementale. (SAURET C.,2011).

48

Les colonies sont généralement lisses et ont un diamètre de plus de 1mm, de tous les microorganismes du sol, les bactéries sont les plus nombreuses et les plus petites : la taille de leurs colonies ne dépasse pas en général, 0.5 à 2 mm de diamètre. (ROGET et al,.2001) cité dans (DJAOUD M.,2013).

III. Etude des caractères morphologiques

Les caractères macroscopiques des souches isolées sont regroupés dans le tableau 9. Tableau 9 : Caractères macroscopiques des colonies isolées sur gélose nutritive.

Souche	Taille	Forme	Aspect de surface	Contour	Opacité	Consistance	Couleur
SC	Petite	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Banche
SG	Grande	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Verte
SH	Grande	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Verte
SI	Petite	Allure Demi bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Crémeuse	Banche
SJ	Moyenne	Allure Demi bombé	Lisse	Régulier	Opaque	Grasse	Rouge
SL	Grande		Rigoureuse	Dentelé	Opaque	Sèche	Beige

L'observation macroscopique montre des colonies bien séparées avec des caractères spécifiques qui différencient les souches.

49

Tableau 10 : Etude microscopique des souches isolées.

Critères	Coloration de Gram		Présence de spores
	Gram	Forme des cellules
SC	+	Cocci	Spore -
SG	-	Bacille	Spore -
SH	-	Bacille	Spore -
SI	-	Coccobacille	Spore -
SL	+	Bacille	Spore +
SJ	-	Petit bacille	Spore -

D'après les observations, il ressort que les souches isolées sont de forme et de Gram différents. La souche (SB) est une Cocci à Gram positive. Les souches (SG) et (SH) sont des bacilles à Gram négative, la souche (SI) Coccobacille à Gram négative alors que la souche (SJ) appartient à des petits bacilles à Gram négative, tandis que la souche (SL) est bacille à Gram positive.

La coloration de spore a révélé la présence de spore uniquement chez les bacilles, les coques et les colibacilles en sont dépourvus.

Selon PELMONT, (1995), Les caractéristiques des bactéries aptes à biodégrader les hydrocarbures sont les suivantes :

· La majorité des souches bâtonnées Gram négatives

· 32% des bactéries motiles ou mobiles

· 20% des bactéries à Gram positives, filamenteux.

Les figures en dessous illustrent les différents aspects macroscopiques et quelques aspects microscopiques.

50

51

Souche C

Souche J

Souche L

52

Figure 16 : Différents aspects des colonies bactériennes obtenus.

Souche H

Souche

Souche G

Figure 17 : Différents aspects microscopiques obtenus.

53

IIII. Recherche des enzymes respiratoires

Le dégagement des bulles de gaz par les souches (SG), (SI), (SJ), et (SL) révèle la présence de l'enzyme catalase sauf pour les souches (SC), et (SH) qui ne possède pas d'enzyme.

54

Pour le test de l'oxydase toutes les souches ont un résultat négatif à part les deux souches (SG), et (SH).

Tableau 11 : Présence des enzymes respiratoire.

Souche	Oxydase	Catalase
SC	-	-
SG	+	+
SH	+	-
SI	-	+
SJ	-	+
SL	-	+

Figure 19 : Test oxydase.

Figure 18 : Test catalase.

IV. Tests biochimiques

Le tableau 12 regroupe les résultats des tests que nous avons effectués sur chacune des souches isolées.

55

Tableau 12 : Résultats des tests biochimiques.

Souches /tests		SC	SG	SH	si	SJ	SL
Enzymes Respiratoires	Catalase	-	+	+	+	+	+
	Oxydase	_	+	+	_	-	-
	Viande foie	Ana Fac	AS	AS	AAF	Ana Fac	AAF
	Nitrate	+	+	_	+	+	+
Métabolismes glucidique	Glucose	-	+	-	-	+	+
	Diholoside	-	-	-	+	-	-
	Gaz	+	-	-	+	+	+
	H2s	-	-	-	+	-	-
	ONPG	+	+	-	-	+	-
	RM	+	+	+	+	-	-
	VP-		-	-	-	-	-
	Mannitol	+	+	+	+	+	+
	Citrate perméase	-	+	+	-	+	+
Métabolisme protéique	ADH	_	+	+	_	_	_
	LDC	+	+	+	+	+	_
	ODC	_	+	+	_	+	_
King A		/	_	_	/	/	/
King B		/	+	+	/	/	/

56

Mannitol

TSI

Citrate

Clark et Lubs

ONPG

VF

Figure 20 : Résultats des tests biochimiques obtenus (métabolisme glucidique).

57

ADH

LDC

ODC

Figure 21 : Résultats des tests biochimiques obtenus (métabolisme protéique).

King A

King B

Figure 22 : Résultats des tests biochimiques obtenus (King A et B).

V. Identification des souches isolées

L'identification a pu être réalisée à l'échelle du genre ou de la famille. En effet, parmi les cinq bactéries isolées, nous avons pu affilier les souches comme appartenant aux familles suivantes (BERGEY, 1984 ) :

58

Pseudomonaceae

D'après sa morphologie macroscopique, les souche SG et SH ont été affiliées au genre Pseudomonas en raison de la morphologie de ses petites colonies circulaires, lisses et brillantes. Ces souches ont une forme bacillaire, isolées ou en amas avec les caractéristiques suivantes : Gram négatif, oxydase positive, catalase positive, non sporulées. Ceci nous a orientés vers la culture de ces souches sur milieux King A et King B spécifiques des Pseudomonas.

La révélation d'une couleur bleu verte sur King A et un jaune verdâtre fluorescent sur King B confirme l'appartenance au genre Pseudomonas (Figure 22). Ces bactéries ont un caractère aérobie strict, ADH et citrate positif (BERGEY, 1984 ;LARPENT, 1992 ; PREVOT, 1961 et SINGLETON, 1999). Une identification biochimique (tableau 12) a permis de différencier ces souches bactériennes et de les identifier au tant que : Pseudomonas putida (SH) et Pseudomonas fluorescens (SG).

L'incapacité de la souche SH à dégrader le mannitol avec ONPG positive (tableau 12) nous permet de supposer qu'il s'agit de Pseudomonas putida. (LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Les colonies de la souche SG sont incolores dans le milieu King A et elles sont de couleur jaune dans le milieu King B. A coté de ce paramètre, les caractères biochimiques permettent de déduire que cette souche correspondrait à P.fleoresens. (LEYRAL et JOFFIN,1998).

Moraxellaceae

Ce sont de petits Coccobacille G- de 0,9 um sur 1,36 um, immobiles. La souche (SI) répond positivement au catalase et de nitrate réductase, ainsi que l'ONPG. Elle n'utilise pas le glucose. Elle produit l'H2S, et peut utiliser les nitrates. Elle est LDC positive mais ADH et ODC négative. D'après les résultats des tests biochimiques (tableau 12) et par comparaison avec ceux établis par BERGEY (1984), il est probable que la souche (SD) correspondrait à l'espèce Acinetobacter sp.

Bacillaceae

En raison de la morphologie de leurs cellules en forme de bacilles (figure 6), Gram positif, sporulés (tableau 10) catalase positive, oxydase négative et un citrate perméase positif (tableau 12). La souche (SL) a été affiliée au genre Bacillus.

La souche (SL) a un ONPG, ADH, LDC et ODC négatives, elle oxyde le glucose et le saccharose, ne produit pas H 2 S (tableau 12). D'après ces caractéristiques, cette souche pourrait être Bacillus sp. (BERGEY, 1984 ; LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Enterococcaceae

59

La souche (SC) est apparentée au genre Enterococcus en raison de sa forme de chaînettes. Les colonies blanches, régulières et lisses (figure 22). Cette souche n'oxyde pas le glucose, à mobilité, oxydase négative et résistante (NACL= 6).

D'après les résultats des tests biochimiques et par comparaison avec ceux établis par BERGEY (1984), il est probable que la souche SC correspondrait à l'espèce Entérococcus sp.

Enterobacteriaceae

La souches (SJ) a été rattachée à la famille des Enterobacteriaceae et présente les caractéristiques suivantes : une forme bacillaire (figure 22), à Gram négatif, catalase positive et oxydase négative. L'étude des caractères biochimiques, nous a permis de rattacher la souche (SJ) au genre Serratia.

La souche bactérienne (SJ) est mobile, capable d'utiliser le citrate de sodium comme unique source de carbone, elle est ONPG positive, LDC, ADH, ODC, indole et VP négatives (tableau12). Compte tenu de ces résultats, l'espèce serait probablement Serratia marcescens (BERGEY, 1984, LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La synthèse des résultats obtenus et leur comparaison à ceux de nombreux auteurs (BERGEY, 1974 ; MARCHAL, 1987 ; LARPENT et al., 1990 et LARPENT et al., 1998) nous conduisent aux conclusions suivantes :

SG :

Famille : Pseudomonadaceae Genre : Pseudomonas

Espèce : Pseudomonas fluorescens

SH :

Famille : Pseudomonadaceae Genre : Pseudomanas

Espèce : Pseudomanas putida

60

SI :

Famille : Moraxellaceae Genre : Acinetobacter Espèce : Acinetobacter sp

SL :

Famille : Bacillaceae Genre : Bacillus Espèce : Bacillus sp

SJ :

Famille : Enterobacteriaceae Genre : Serratia

Espèce : Serratia marcescens VI. Test de biodégradation

Après une incubation de 5 jours à l'obscurité, les colonies qui montrent une dégradation sont entourées de zones claires sur la surface opaque de la gélose. Cette technique s'appelle: (OIL SPREADING THECHNIQUE) (HOHZOH K et al., 1982).

Après l'incubation des boites, la lecture se fait quotidiennement pour voire s'il y a eu apparition de zones clair.

La biodégradation des hydrocarbures se manifeste par l'apparition de zones claires sur le milieu de culture. Cette méthode s'avère, simple et pratique pour l'isolement des bactéries qui ont le potentiel de dégrader les hydrocarbures.

Ces bactéries isolées sont capables de digérer le pétrole et cette méthode peut être applicable pour la détection de souches qui dégradent d'autres hydrocarbures non volatiles.

Cette méthode peut être utilisée aussi pour l'étude de la dégradation du naphtalène, phénanthrène, et l'anthracène en plus de la détection des bactéries mutantes, auxotrophes

61

d'après HOHZOH K et al., 1982.

Dans quelques cas, il y a eu des colonies qui ont montré une dégradation du pétrole vaporisé sur la gélose, et qui ont donné des zones beaucoup plus importantes que celles observées dans le travail de ce dernier. Le diamètre des zones varie de 2 mm à 10 mm, et cela est important comme résultat par rapport aux résultats cités dans la littérature. (HOHZOH K et al., 1982).

La souche C (avec un diamètre de 10 mm) La souche G (avec un diamètre de 2mm)

La souche H (avec un diamètre de 4mm) La souche I (avec un diamètre de 2mm)

La souche J (avec un diamètre de 4mm) La souche L (avec un diamètre de 2mm)

Figure 23 : Les zones claires du test de biodégradation.

62

VII. Détection de l'activité de biodégradation des bactéries

La variation de biomasse au cours de temps (jour) des quatre souches testé au cours de croissance dans le milieu de sels minéraux (MSM) additionné de 1% de pétrole brute comme seul source de carbone et de phénol a été suivi en mesurant la concentration microbienne en fonction du temps ce qui nous a permis de tracer les courbes représentées par les figure (24,

25, 26, 27 et 28). Les valeurs de Log UFC/ml en fonction du temps sont données dans les tableaux (voir annexe).

63

Figure 24 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SI) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

64

Figure 25 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SL) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 26 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SH) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

65

Figure 27 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SG) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 28 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SJ) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Cinétique de croissance des souches bactériennes testées (dégradation du pétrole)

D'après les figures (24, 25, 26, 27 et 28) on observe une similarité de trajet de croissance pour les cinq souches testés toutes presque présentent le même troc .La croissance pour les cinq

66

souches commence par un DO= 5, puis on observe une augmentation de la croissance de T0 jusqu'à 30 minutes puis une augmentation exprimée par un phase de croissance exponentielle courte .Cette augmentation ralentie correspond a la phase stationnaire pas fixée dans même valeur mais presque stable, observée a partir d'une heure a 24 heures pour les 5 souches et après la 5 éme heure il ya une recroissance de biomasse des souches jusqu`à un valeur maximale (DO SI =6.456) (DO SL =6,453) (DO SH =6,369) (DO SG =6,447) (DO SJ =6,429). Cette DO atteint son maximum à la fin de l`incubation.

Les variations des densités optiques (DO) constatées dans les milieux de culture des différentes souches bactériennes étudiées (SI, SL, SH, SG, SJ) peuvent être dues à la distribution différente de ces bactéries entre les deux phases de notre culture, ou par leur vitesse d`adaptation au substrat utilisé (AKMOUCI, 2009).

L`absence de phase latence démontre une adaptation plus rapide des souches étudiées à la source de carbone utilisée (hydrocarbure pétrole), ils ont dégradé les fractions soluble des hydrocarbures pétrolières.

Par ailleurs, l`augmentation de la biomasse microbienne correspondrait à la phase exponentielle, phase durant laquelle la dissolution du substrat «hydrocarbure pétrole» suffit aux besoins métaboliques des souches. Ainsi, La stabilisation de la concentration microbienne au-delà d'une heure montre que le niveau des exigences nutritionnelles surpassent la vitesse de dissolution du substrat, la biodisponibilité deviendra alors limitant (ROCHA et al. 2007), la diminution explique peut être par la migration de la cellule vers le nutriment par augmentation de hydrophobicité pour facilité l`accession de hydrocarbure. Puis on observe encore une 2 éme phase exponentielle s'explique par la richesse du milieu par des composés facile à dégrader qui s'exprime aussi par un indicateur biologique de croissance élevé.

Cinétique de croissance des souches bactériennes testées (dégradation du phénol)

On observant l'évolution de la croissance pendant 24 heures dans des courbes des (24, 25, 26, 27 et 28). Au temps initial de la croissance, la concentration microbienne diminue pour les souches (SI, SH, SG, SJ) durant le premier temps (30 minutes) au même temps il y a une augmentation notable de croissance de souche SL. Pour 1 heure on remarque une perturbation des valeurs de la concentration microbienne pour toutes les souches et après 3

67

heures il ya une recroissance de biomasse des souches jusqu`à une valeur maximale (DO SI =5,481) (DO SL =5,610) (DO SH =5,574) (DO SG =5,279) (DO SJ =5,279).

Ce résultat peut être expliqué par l'adaptation des cellules au phénol comme seule source de carbone, la cinétique de biodégradation est plus rapide, et le phénomène de biodégradation se déclenche immédiatement après la mise en culture des cellules adaptées (SL), contrairement aux cellules non adaptées (SI, SH, SG, SJ).

L'amélioration de la capacité des microorganismes adaptés au phénol à le biodégrader se manifeste par l'amélioration de la cinétique de croissance des cellules bactériennes, ainsi que l'augmentation du taux de croissance des bactéries libres Les cellules non adaptés prennent plus de temps à croître et à consommer (biodégrader) le phénol. Ces résultats sont conformes avec les travaux de SHIMP et al .,(1987)

68

Conclusion

Le pétrole se présente comme un mélange complexe d'hydrocarbures. Sa dégradation implique une microflore diversifiée du fait de la spécificité des fonctions déprédatives. Il est caractérisé par l'hydrophobicité de ses molécules, ce qui réduit leur biodisponibilité.

L'objectif principal de cette étude était d'étudier la biodiversité microbienne dans un sol pollué par les hydrocarbures et d'isoler des bactéries aptes à dégrader des hydrocarbures.

Afin de mener à bien nos travaux, nous avons réalisé une étude préliminaire concernant, d`une part, la sélection des meilleures bactéries (cinq souches sont testées dans notre étude) qui se cultivent en présence de pétrole brut comme seule source de carbone, pour une bonne compréhension des conditions optimales du processus de biodégradation des hydrocarbures dans le milieu terrestre.

Les résultats d'isolement bactériens de sol contaminés, nous ont permis d'isoler six souches bactériennes. En se basant sur leurs caractères microscopiques (deux souches à Gram+ et quatre souches à Gram-), macroscopique et biochimique.

Les sols contaminés par le pétrole brut permettent aux différents microorganismes de dégrader les hydrocarbures de vivre.

L'évolution de cinétique au cours du temps révèle que les bactéries : SI, SL, SH, SG, SJ en mesurant la concentration microbienne en fonction du temps ce qui nous a permis de tracer les courbes représentées la croissance élevés.

On peut donc conclure que les différents constituants de pétrole sont intrinsèquement biodégradables, mais à des degrés variables et appropriés aux différentes espèces des bactéries hydrocarbonoclastes utilisées.

69

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72

Annexes Annexe 1:

Matériels utilisés

Ø Equipements 1- Etuve.

1- Spectrophotomètre UV.

2- Autoclave.

3- pH mètre.

4- Agitateur -plaque chauffante.

5- Vortex.

6- Centrifugeuse.

7- Incubateur- agitateur.

8- Microscope photonique.

9- Loupe.

10- Balance.

11- Bec Bunsen.

12- Réfrigérateur.

Ø Verreries et matériels en plastiques

1- Erlenmeyer de 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.

2- Becher de 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.

3- Boite de Pétri en plastique.

4- Pipettes Pasteur.

5- Anse de platine.

6- Tubes à essai.

7- Lames et lamelles.

8- Seringues.

9-

73

Parafilm.

10- Micropipettes.

11- Pinces (a bois et métallique).

12- Cuvettes de spectrophotomètre.

13- Sacs en plastique.

Annexe 2:

Milieu de dénombrement et de conservation Bouillon nutritif : la composition chimique en g /L d eau distillée

Peptone	5
Extrait de viande	1
Extrait de levures	2
Chlorure de sodium	5

PH final 7.4 + /- 0 ,2 a 25 C

Stérilisation a l autoclave a 121 +/- pendants 15 minutes Gélose nutritive : composition chimique en g /L d eau distillée

Peptone	5
Extrait de viande	1
Extrait de levures	2
Chlorure de sodium	5
Agar	15

PH 7, 4 +/- 0,2 a 25 C

Stérilisation à l autoclave à 121 C pendant 15 minutes

Gélose cétrimide : la composition chimique en g /L d eau distillée

Peptone de gélatine bovin ou porcin	.20
Chlorure de magnésium	1 ,4
Sulfate de potassium	.. ......10
Cétrimide	0 ,3
Glycérol	10 ml

74

Agar .13 ,6

PH 7 ,2

La gélose viande foie : la composition chimique en g /L d'eau distillée

Base de viande de foie 30

Glucose 2

Agar .6

PH final 7,6 +/- 0 ,2 a 25 ?C

Stérilisation a l autoclave : 20 min a 121 +/- 1 C

La gélose au nitrate conventionnelle : la composition chimique en g /L d eau distillée

Extrait de viande . . 3

Peptone .5

KNO3 1

Agar 12

PH final 7,2 +/- 0,2

Stérilisation à l autoclave à 121 C pendant 15 minutes

Citrate de simmons : la composition chimique en g /L d'eau distillée

Sulfate de magnésium . 0.2g/l

Phosphate mono-ammoniaque 1g/l

Phosphate bipotassique .2g/l

Chlorure de sodium 5g/l

Bleu de bromothymol 0.08g/l

Agar 15g/l

Milieu Clark et Lubs : la composition chimique en g /L d'eau distillée

Peptone trypsique ou polypeptone . 7g

Glucose 5g

K2HPO4 . 5g

pH= 7 ,5

La composition du milieu Mannitol : la composition chimique en g /L d'eau distillée

75

Peptone trypsique de viande 20g/l

Agar .4g/l

Mannitol 2g/l

K NO3 1g/l

Rouge de phénol 4ml

Gélose king A : la formule théorique de la gélose king A en en g /L d'eau distillée

Peptone bactériologique A		20
Agar purifié		.12
Glycérol		10
K2SO4		10
MgCL2		1,4
PH 7,2 +/- 0 ,2 a25 C Gélose king B : formule théorique de la gélose king B en en g /L d'eau distillée Peptone bactériologique B 20
Agar purifié		12
Glycérol		10 ml
K2HPO4		1 ,5
MgSO4 7H2O		1 ,5
PH 7,2 +/- 0 ,2 a25 C Milieu MSM minéral Salt medium : la composition chimique en g /L d'eau distillée
K2HPO4	1.8
NH4Cl	4
MgSO4.7H2O	..0.2
NaCl	0.1
Na2SO4.7H2O	0.01

Agar 2 0

Source de carbone . 1%

Eau physiologique

Chlorure de sodium ...9g

76

Eau distillée . 1000ml

Réactifs et additifs Alcool

Disque d'oxydases Eau distillée

Eau oxygénée

Fuchine

Huile de vaseline Huile à immersion Poudre de Zinc Réactifs de Kovacs Solution de lugol Violet de gentiane

Annexe 3:

Mise en oeuvre pratique

Coloration de Gram :

· Selon la norme (NF EN ISO 7218, octobre 2007)

· Préparer un frottis d'un produit pathologique ou d'une culture bactérienne pure

· Recouvrir le frottis de violet de cristal oxalaté laisser agir 1 min rincer a l eau distillée

· Verser de lugol et le laisser agir pendant une minute 1 minute rincer a l eau distillée

· Décolorer à alcool à 95 entre 15 et 30 secondes rincer à l eau distillée

· Recolorer avec le safranine pendant 10 à 30 secondes rincer a l eau distillée

· Sécher au dessus de la flamme d u bec Bunsen

· Observer au microscope a l objectif 100 immersion

Avec cette coloration double les bactéries Gram + apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram - sont colorées en rose ou en rouge

Coloration des spores bactérienne :

· réaliser un frottis en routine puis :

· le recouvrir d une solution aqueuse vert de vert malachite 0,5 % chauffer pendant quelques minutes sur une platine chauffante jusqu' a émission de vapeurs Rajouter du colorant pendant le chauffage si nécessaire sans jamais laisser évaporer complètement le colorant

· laver a l eau distillée

· colorer avec de la safranine pendants 30 secondes

Les cellules végétatives apparaissent colorée en rouge les spores en vert dans leur sporange rouges et les spores libres colorées en vert

Annexe 4:

Contrôle de qualité du milieu

Gélose king B :

Souches bactériennes Couleur des colonies après 24 h a 48 h d

incubation a 36 °C

Pseudomonas aeruginosa ATTC 10145 Jaune vert fluorescente

équivalente a NCTC 10332

Pseudomonas fluorescens CIP 69.13 Jaune vert faible

équivalente a ATCC 13525

Gélose king A :

Souches bactériennes Couleur des colonies après 24 h a 48 h d

incubation a 30 °C

Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853 Bleu vert

Pseudomonas aeruginosa ATTC 9027 Pseudomonas aeruginosa ATTC 17934

77

78

Pseudomonas fluorescens CIP 69.13 T Incolore

DELARRAS C., 2014. Pratique en microbiologie de laboratoire recherche de bactéries et de levures moisissures, Paris : Edition Céline Poiteaux 570, 586, 115, 66, 88, 71, 66 p Hohzoh Kiyohara, 1982) (Jyothi K, K Surendra Babu 2012)

Annexe 5 :

Suivi de la cinétique de la croissance microbienne

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SI) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	T0	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9
T	5,0028	5,3654	5,3741	5,3808	5,4502	5,5087	5,4308	5,5481	5,6095	6,1610
	8569	8798	3709	1401	4911	541	2727	8461	9441	6839
P	5,00	5,7634	5,8750	5,8864	5,8976	5,9084	5,9777	6,0293	6,2041	6,4563
	63025	2799	6126	9073	2709	8502	2361	8378	1998	6603
P	4,9867	4,5910	4,8450	5,0128	5,1522	4,9344	5,2552	5,2695	5,2810	5,4814
h	7173	6461	9804	3722	8834	9845	7251	1294	3337	4263

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne de la souche (L) cultivée sur le milieu bouillon nutritif, MSM additionné de 1% de pétrole brut et ou phénol

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	4,8994	5,1977	5,3610	5,5428	5,5906	5,5498	5,5407	5,7047	5,7072	6,2776
	557	9754	9797	2543	9326	2037	4646	2233	8623	0921
P	5,0211	5,4969	5,6053	5,9822	6,0644	6,0648	6,1875	6,1461	6,1271	6,4533
	893	2965	0505	7123	5799	3222	2072	2804	048	1834
P	5,0128	5,1583	5,2013	5,4771	5,0086	5,2922	5,2944	5,2966	5,2988	5,6106
h	3722	6249	9712	2125	0017	5607	6623	6519	5308	6016

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SH) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	5,0969	5,1603	5,3371	5,3046	5,5365	5,5567	5,5518	5,6901	5,7140	6,3279
	1001	6847	2634	3412	5844	0444	5645	9608	502	7162
P	5,2227	5,6998	5,7024	5,7067	5,8750	6,0170	5,9684	6,1105	6,1034	6,3692
	1647	3773	3054	1778	6126	3334	8295	8971	6162	1586
P	5,0718	5,0492	5,1613	5,1522	5,0827	5,0569	5,0791	5,2041	5,2787	5,5740
h	8201	1802	68	8834	8537	0485	8125	1998	536	3127

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SG) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9

79

T	5,0517	4,9956	5,1388	5,1751	5,4199	5,5215	5,5369	5,6092	5,6975	6,2697
	9545	3519	288	2509	5575	739	7907	3858	1994	4637
P	5,3222	5,7923	6	6,0413	6,0969	6,1351	6,1322	6,2240	6,1875	6,4471
	1929	9169		9269	1001	3265	5969	1481	2072	5803
P	4,9590	4,6989	4,8450	4,8061	4,6627	4,6776	4,6901	4,7781	4,9542	5,2798
h	4139	7	9804	7997	5783	0695	9608	5125	4251	9498

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SJ) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	5,3528	5,4345	5,4497	5,4292	5,5087	5,4205	5,5158	5,6842	5,7631	6,2451
	2544	689	3545	1379	541	0584	7384	4675	7833	0121
P	5,6020	5,9837	6,2139	5,7853	6,0632	5,8426	5,8893	5,9890	6,1683	6,4297
	5999	7659	6024	2984	0822	0924	017	0462	0101	5228
p	5,2329	4,3010	4,8450	4,8061	4,6020	4,6776	4,6901	4,7781	4,9542	5,2798
h	9611	3	9804	7997	5999	0695	9608	5125	4251	9498

80

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol