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Caractérisation biochimique et applications potentielles des glucosidases et de la a-galactosidase du suc digestif de la larve de rhynchophorus palmarum (curculionidae)

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par Assoi Yapi Désiré Patrice YAPI
Université ABOBO-ADJAMà Abidjan - Doctorat 2008
  

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Tépu6lique de Cote d'Ivoire
Vnion- Oiscipline-Travail
alinistere de l'cEnseignement Supérieur et
de la ~echerche Scienti#ique

Université d'Abobo-Adjamé

Année Universitaire
2008-2009

MESE

Pour I'obtention du grade de

Docteur

Numéro d'ordre
51

DE

L'UNIVERSITE D'ABOBO-ADJAME
EN SCIENCES ET TE CHNOLOGIE DES ALIMENTS

Option : Biochimie et Technologie des Aliments

Presentee par

YAM Assel T ll Dodd P trice

THEME :

CARACTERISATION !DOMINIQUE ET APPLICATIONS

POTENTIELLES DES CLUCOSIDASES ET DE LA 13-

GMACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE
RRYNCROPROHIS~ 11 111 LCURCULIONIDAEI

Soutenue publiquement
le 29 juillet 2009

Bev n' le Jury :

M. AMANI N'guess n Georges, Prolossour linhforsite dAbobe-Adl me Presiden%

M. AKE Seven, Prolossour Universite Coco* r ggetteur

M. T o DATIE, Prolossour Universite Coco* Ex min tour

M. DIE Kolli M rconi', M itre de conferences linhforsite d'Abobe-Adl me Ex min tour

M. KOUAME Lucien P trice, M itre de conferences linhiersite dAbobe-AM me Directeur de Those

RESUME

La larve de Rhynchophorus palmarum possède dans son tube digestif une variété d'activités osidasiques. Les activités á-glucosidasique, â-glucosidasique et â-galactosidasique sont les plus élevées. Elles sont l'oeuvre de 3 enzymes : une á-glucosidase, une â-glucosidase et une â-galactosidase. Ces biocatalyseurs sont acides, mésophiles et monomériques. Ils sont stables à 37 °C pendant au moins 120 min dans le tampon acétate 100 mM pH 5 ou 5,6. La â-glucosidase a une grande affinité pour le cellobiose et serait aussi impliquée dans la digestion des cellodextrines issues de la dégradation de la cellulose. Elle a une spécificité stricte vis-à-vis du résidu glucosyle et de l'anomerie â. Cette enzyme a une activité transférasique élevée par rapport à celle de la â-galactosidase. En effet, ce biocatalyseur spécifique du résidu galactosyle dégrade les disaccharides et les oligosaccharides provenant de l'hydrolyse des hémicelluloses et possédant des liaisons â(1,3), â(1,4) et â(1,6). Quant à l'á-glucosidase, elle reconnaît seulement le résidu glucosyle et est spécifique de la liaison osidique á(1-2) et á(1-4). C'est pourquoi, elle hydrolyse fortement le saccharose, le maltose et les oligosaccharides. Elle possède une activité transférasique supérieure à celles des sources enzymatiques conventionnelles.

Mots clés : larve, charançon, Rhynchophorus palmarum, á-glucosidase, âglucosidase, â-galactosidase, activité transférasique.

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé en Côte d'Ivoire, à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé, dans le Laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments.

Je tiens à remercier le Professeur Patrice KOUAME, Doyen de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan), Directeur scientifique de ce travail, sans qui ce mémoire n'aurait jamais pu voir le jour. Il m'a fait bénéficier d'un cadre idéal de travail. Malgré ses nombreuses tâches universitaires, il n'a pas hésité à consacrer une partie de son temps à orienter et enrichir ce travail. Je dois dire que j'ai beaucoup appris auprès de lui. Qu'il trouve ici le témoignage de mon profond respect, de ma sincère admiration et de mon fidèle attachement;

Je remercie le Professeur AMANI N'guessan Georges, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour son appui à la recherche. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant de présider ce jury, malgré ses nombreuses occupations administratives et universitaires.

Je suis sensible à l'honneur que me fait le professeur DJE Koffi Marcellin, Président du conseil scientifique de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) en acceptant de faire partie de ce jury et l'assure de mes sincères remerciements. Sa présence dans ce jury montre une fois encore son amour pour le travail bien fait.

Je tiens à remercier le Professeur AKE Sévérin, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche Biosciences de l'Université de Cocody (Abidjan) pour sa contribution à l'amélioration de ce travail. C'est un réel plaisir pour moi de le retrouver comme membre de ce jury.

Je remercie le professeur Yao DATTE, Professeur titulaire à l'Unité de Formation et de Recherche Biosciences de l'Université de Cocody (Abidjan) pour la sollicitude qu'il m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être membre de ce jury.

Je remercie également le Professeur DJE Yao, Maître de conférences à l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Nature et de l'Environnement de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) pour la sollicitude qu'il m'a témoigné. Je suis particulièrement sensible à l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être rapporteur de cette thèse

Au Professeur Alphonse KAMENAN, Doyen honoraire de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé (Abidjan) et Directeur du laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments, je lui exprime toute ma reconnaissance et ma gratitude pour tout ce qu'il a fait pour moi dans le cadre de ma formation universitaire.

Je voudrais remercier sincèrement du fond de mon coeur le Professeur Sébastien NIAMKE pour la sollicitude qu'il m'a témoigné.

Je n'oublie pas tous les enseignants-chercheurs et chercheurs de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences et Technologie des Aliments (UFR-STA) de l'Université d'Abobo-Adjamé à qui je dis merci pour les encouragements et soutiens.

Je voudrais remercier également tous les membres de l'équipe "Biocatalyse" du Laboratoire de Biochimie et Technologie des Aliments de l'Université d'Abobo-Adjamé qui ont participé activement à la réalisation de ce mémoire.

Mes vifs remerciements vont à toutes les personnes dont les compétences scientifiques et techniques m'ont aidé à réaliser ce travail.

DEDICACE

Je dédie ce travail scientifique à :

-mon père,

Je te remercie pour la grande et solide confiance que tu as placée en moi. Aujourd'hui accepte cette thèse comme le couronnement de tous tes sacrifices.

-ma mère,

Je te remercie infiniment pour les sacrifices énormes que tu as bien voulu consentir pour moi. Que le seigneur te garde longtemps en bonne santé sur cette terre. Ce travail n'est qu'un modeste témoignage de ton amour filial et de ma reconnaissance.

-ma fiancée,

Je te dédie ce mémoire pour ton abnégation, ta patience et tes encouragements incessants. Ton soutien indéfectible m'a permis de réaliser ce travail dans les meilleures conditions. Je t'en suis reconnaissant. Je n'ai aucun mot pour traduire la profondeur de mes sentiments à ton égard.

-mon fils,

Que ce travail soit un gage sincère de mon immense amour.

-mes frères et soeurs,

En témoignage de mon profond amour.

-tous mes cousins et cousines,

Ce mémoire est le votre.

-ma grande famile,

Je remercie tout le monde pour les encouragements et conseils.

-tous mes amis,

Je dis Merci pour leur soutien moral et encouragement.

TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS II

DEDICACE III

TABLES DES MATIERES VI

LISTE DES FIGURES ... XII
LISTE DES TABLEAUX XVII

ABREVIATION ET SYMBOLES .. XX

INTRODUCTION ..... 1

Chapitre 1 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 4

I-Généralités sur le charançon 4

1- Systématique du charançon du palmier 4

2- Cycle de vie .. 4

3- Dommages causés . 5

II-Glycosidases . 7

1-Réaction d'hydrolyse 7

1-1-Mécanismes d'action 7

1-1-1-Inversion de configuration anomérique 7

1-1-2-Rétention de configuration anomérique .. 7

1-1-3-Quelques cas particuliers .. 8

1-2-Relation entre les glycosidases de mécanisme d'inversion de configuration anomérique hydrolysant les liaisons alpha et beta 10

1-3-Relation entre des alpha- et beta-glycosidases avec des mécanismes de configuration anomérique opposés . 10

1-4-Classifications des glycosidases 12

1-4-1-Classification traditionnelle 12

1-4-2-Classification structurale 12

1-4-2-1-Principe et classification 12

1-4-2-2-Division des familles des glycosides hydrolases

en sous familles 18

2-Réactions de synthèses 22

3-Propriétés de quelques glycosidases des insectes 24

3-1-Enzymes amylolytiques 24

3-1-1-Amylases 24

3-1-2-Alpha-glucosidases .. 25

3-2-Enzymes cellulolytiques 27

3-2-1-Cellulases 28

3-2-2-beta-Glucosidases 29

3-3-Enzymes hémicellulolytiques 31

3-3-1-Xylanases, laminarinases et lichenases 31

3-3-2-beta-Galactosidases 31

3-3-3-beta-Xylosidases 32

3-4-beta-Fructosidases 32

4-Applications industrielles de quelques glycosidases 32

4-1-beta-Galactosidases 32

4-1-1-Applications médicales .. 32

4-1-2-Applications pharmaceutiques 33

4-1-3-Applications nutritionnelles . 34

4-1-4-Applications en industrie agroalimentaire . 34

4-2-Enzymes amylolytiques 35

4-2-1-Production de sirop de glucose et de fructose 35

4-2-2-Amélioration de la solubilité de l'amidon 35

4-3-Enzymes cellulolytiques et hémicellulolytiques . 36

Chapitre 2 MATERIEL ET METHODES 38

I- Matériel 38

1-Provenance des produits chimiques 38

2- Origine du matériel biologique .. 38

II- Méthodes . 39

1-Préparation des extraits bruts enzymatiques 39

2-Techniques de dosage .. 39

2-1- Dosage de l'activité polysaccharidasique .. 39

2-1-1-Préparation de la solution de DNS 40

2-1-2- Techniques de dosage 40

2-2-Dosage de l'activité olisaccharidasique 40

2-2-1- Préparation du réactif glucose oxydase-péroxydase 40

2-2-2- Technique de dosage 41

2-3- Dosage de l'activité pNP-glycosidasique 41

2-4- Dosage des protéines 42

2-4-1- Méthode de Lowry et al. (1951) 42

2-4-1-1- Réactif utilisés . 42

2-4-1-2- Technique de dosage . 42

2-4-2- Méthode de Bradford (1976) 43

2-4-2-1- Réactif utilisés 43

2-4-2-2- Technique de dosage . 43

2-5- Purification des enzymes . 43

2-5-1- Chromatographie d'échange d'anion sur D.E.A E

Sepharose CL-6B . 44

2-5-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium 44

2-5-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR 44
2-5-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

Phényl-Sepharose CL-4B 45

2-6-Détermination des propriétés moléculaires 45

2-6-1- Détermination des poids moléculaires par gel filtration 45 2-6-2-Détermination des poids moléculaires par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS 46

2-7- Influence du pH sur les activités glycosidasiques . 47

2-7-1- Détermination du pH optimum d'hydrolyse . 47

2-7-2-Détermination de la stabilité au pH . 47

2-7-3-Influence de la force ionique 47

2-8-Influence de la température sur les activités glycosidasiques 47

2-8-1-Détermination de la température optimale

d'hydrolyse, du Q10 et de l'énergie d'activation .. 47

2-8-2-Inactivation thermique . 48

2-8-3-Dénaturation thermique 48

2-9-Détermination de quelques paramètres cinétiques 48

2-10-Actions des agents chimiques sur l'activité hydrolytique 48

2-11-Réactions de transglycosylation 49

2-11-1-Milieu réactionnel 49

2-11-2-Analyse chromatographe des produits de

transglycosylation 49

2-11-3-Calcul du pourcentage de transglycosylation

49

Chapitre 3 RESULTATS ET DISCUSSION . 52

I- RECHERCHE ET DETERMINATION DES CONDITIONS OPTIMALES D'HYDROLYSE DES GLYCOSIDASES DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 52

1-Résultats 52

1-1-Activités glycosidasiques .. 52

1-1-1-Activités exo-glycosidasiques 52

1-1-2-Activités endo-glycosidasiques . 54

1-2-Détermination des températures et pH optima d'hydrolyse 54

1-2-1-Activités á-exo-glycosidasiques 54

1-2-2-Activités â-exo-glycosidasiques 54

1-2-3-Activités endo-glycosidasiques 54

2-Discussion .. 57

Conclusion 59

II-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE L'áGLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 60

1-Résultats 60

1-1- Stratégie de purification . 60

1-1-1- Chromatographie échangeuse d'anion sur gel de

D.E.A.E-Sepharose CL-6B 60

1-1-2- Fractionnement au sulfate d'ammonium 60

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl S-100 HR 61
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

Phényl- Sepharose CL-4B .. 61

1-2-Critère de pureté . 64

1-3-Poids moléculaires de l'á-glucosidase . 64

1-4-Influence du pH sur l'activité de l'á-glucosidase 66

1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 66

1-4-2-Stabilité au pH 66

1-4-3-Influence de la force ionique du tampon . 66

1-5-Influence de la température sur l'á-glucosidase 68

1-5-1- Température optimale d'hydrolyse, énergie

d'activation et Q10 68

1-5-2- Inactivation thermique 68

1-5-3-Dénaturation thermique 68

1-5-4-Conservation au froid 72

1-6-Spécificité de substrat .. 72

1-6-1-Activité sur les p-nitrophényl-D-glycosides . 72

1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et polysaccharides 72

1-7-Paramètres cinétiques .. 75

1-8-Action des agents chimiques 75

1-9-Réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase 78

1-9-1-Influence du pH 78

1-9-2-Influence du temps d'incubation . 78

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur sur l'activité de transglucosylation .. 78
1-9-4-Influence de la concentration du donneur sur l'activité

de transglucosylation .. 78

2- Discussion 82

Conclusion 85

III-PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA â-GLUCOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum 86

1-Résultats 86

1-1-Stratégie de purification 86

1-1-1-Chromatographie échangeuse d'anion sur gel de
DEAE-Sepharose CL 6B 86

1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium 86

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl-100 HR 86
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

Phényl-Sepharose CL-4B 86

1-2-Critère de pureté 89

1

1-3-Poids moléculaires de la â-glucosidase 89

1-4-Influence du pH sur la â-glucosidase .. 91

1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 91

1-4-2-Stabilité au pH .. 91

1-4-3- Influence de la force ionique du tampon 91

1-5- Influence de la température sur la â-glucosidase . 93

1-5-1-Température optimale d'hydrolyse, énergie

d'activation et le Q10 93

1-5-2-Inactivation thermique . 93

1-5-3-Dénaturation thermique 93

1-5-4-Conservation au froid 93

1-6-Spécificité du substrat .. 97

1-6-1-Activité sur les p-nitrophényl-D-glycosides 97

1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et polysaccharides 97

1-7-Paramètres cinétiques .. 99

1-8-Action des agents chimiques 101

1-9-Réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase 103

1-9-1-Influence du pH sur l'activité de transglucosylation 103

1-9-2-Influence du temps d'incubation sur l'activité de transglucosylation 103

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur .. 103

1-9-4-Influence de la concentration du donneur . 103

2-Discussion .. 107

Conclusion 109

IV- PURIFICATION ET CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DE LA â-GALACTOSIDASE DU SUC DIGESTIF DE LA LARVE DE Rhynchophorus palmarum .. 110

1-Résultats 110

1-1-Stratégie de purification 110

1-1-1-Chromatographie échangeuse d'anion sur gel de DEAE-Sepharose CL 6B 110 1-1-2-Fractionnement au sulfate d'ammonium 110

1-1-3-Chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephacryl-100 HR 110
1-1-4-Chromatographie d'interaction hydrophobe sur gel de

Phényl-Sepharose CL-4B 110

1-2-Critère de pureté 113

1-3-Détermination des poids moléculaires de la â-galactosidase 113

1-4-Influence du pH sur la â-galactosidase .. 115

1-4-1-pH optimum d'hydrolyse .. 115

1-4-2-Stabilité au pH .. 115

1-4-3- Influence de la force ionique du tampon 115

1-5- Influence de la température sur la â-galactosidase . 117

1-5-1-Température optimale d'hydrolyse, énergie

d'activation et le Q10 117

1-5-2-Inactivation thermique . 117

1-5-3-Dénaturation thermique 117

1-5-4-Conservation au froid 117

1-6-Spécificité du substrat .. 121

1-6-1-Activité sur les p-nitrophényl-D-glycosides 121

1-6-2-Activité sur les oligosaccharides et polysaccharides 121

1-7-Paramètres cinétiques .. 123

1-8-Action des agents chimiques 125

1-9-Réaction de transglucosylation catalysée par la â-galactosidase 127

1-9-1-Influence du pH sur l'activité de transglucosylation 127

1-9-2-Influence du temps d'incubation sur l'activité de

transglucosylation 127

1-9-3-Influence de la concentration de l'accepteur . 127

1-9-4-Influence de la concentration du donneur . 127

2-Discussion . 131

Conclusion 133

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES 134

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES . 135

XII

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Cycle de vie du charançon Rhynchophorus palmarum 6

Figure 2 : Mécanisme d'inversion de configuration anomérique des glycosidases 9

Figure 3 : Mécanisme de rétention de configuration anomérique des glycosidases 9

Figure 4 : Similarités mécanistiques chez diverses familles de glycosidases . .. 11

Figure 5 : Similarités dans l'orientation des liaisons dans des enzymes de mécanismes opposés 11
Figure 6 : Structure tridimensionnelle de l'endocellulase (famille 5 des glycosidases) de

Thermus caldophilus (A) et de son site actif (B) liant le cellotétraose . 15
Figure 7 : Comparaison entre la structure d'une endoglucanase et celle d'une cellobiohydrolase de la famille GH7 21

Figure 8 : Schémas des réactions catalysées par les glycosidases . 51

Figure 9 : Activités á-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum 53

Figure 10 : Activités â-exo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires, du tube et du suc digestifs de la larve de Rhynchophorus

palmarum

53

Figure 11 : Activités endo-glycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires du tube digestif et du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 55

Figure 12 : Profil chromatographique d'échange d'anion de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B 62

Figure 13 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 62

Figure 14 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B 63

Figure 15 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum. .... 65

Figure 16 : Détermination du pH optimum d'hydrolyse de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 67

Figure 17 : Stabilité au pH de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 67

Figure 18 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de l'a-glucosidase

du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 69

Figure 19 : Inactivation thermique de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum à 37°C et à 45°C 69

Figure 20 : Dénaturation thermique de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 70

Figure 21 : Effet de la congélation sur de l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de 70 Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à pH5,6 .

Figure 22 : Influence du pH sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'aglucosidase du suc digestif de la lave de Rhynchophorus palmarum . 79

Figure 23 : Influence du temps d'incubation sur les réactions de transglucosylation catalysées par l' a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus 79 palmarum

Figure 24 : Influence de la concentration de l'accepteur de glucosyle (2-phényléthanol) sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 80

XIV

Figure 25 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle sur les réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase de suc digestif de la larve de 80
Rhynchophorus palmarum

Figure 26 : Profil chromatographique d'échange d'anion de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL 6B 87

Figure 27 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl-100 HR 87

Figure 28 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B . 88

Figure 29 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de betamercaptoéthanol de la béta-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 90

Figure 30 : Déterminations du pH optimum d'hydrolyse de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 92

Figure 31 : Stabilité au pH de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 92

Figure 32 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de la â-glucosidase

du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 94

Figure 33 : Inactivation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 94

Figure 34 : Dénaturation thermique de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 95

Figure 35 : Effet de la congélation de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à pH5,0 .

95

Figure 36 : Influence du pH sur la réaction de transglucosylation catalysée par la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 104

Figure 37 : Influence du temps d'incubation sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 104

Figure 38 : Influence de la concentration de l'accepteur (2-phényléthanol) sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 105

Figure 39 : Influence de la concentration du donneur de glucosyle (cellobiose) sur la réaction de transglucosylation catalysée par la â-glucosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 105

Figure 40 : Profil chromatographique d'échange d'anion de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de D.E.A.E-Sepharose CL-6B 111

Figure 41 : Profil chromatographique d'exclusion moléculaire de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Sephacryl S-100 HR 111

Figure 42 : Profil chromatographique d'interaction hydrophobe de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur gel de Phényl-Sepharose CL-4B 112

Figure 43 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et de âmercaptoéthanol de â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 114

Figure 44 : Détermination du pH optimum d'hydrolyse de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 116

Figure 45 : Stabilité au pH de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 116

Figure 46 : Détermination de la température optimale d'hydrolyse de la â-galactosidase

du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum .... 118

Figure 47 : Inactivation thermique de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum à 37 °C et à 55 °C . . 118

Figure 48 : Dénaturation thermique de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 119

Figure 49 : Effet de la congélation de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum dans le tampon acétate 100 mM à pH5,0 . 119

Figure 50 : Influence du pH sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-

galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum ... 128

Figure 51 : Influence du temps d'incubation sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 128

Figure 52 : Influence de la concentration de l'accepteur sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . . 129

Figure 53 : Influence de la concentration du donneur de galactosyle (lactose) sur la réaction de transgalactosylation catalysée par la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 129

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases rangées en clans 16

Tableau 2 : Mécanismes réactionnels et acides aminés impliqués dans la catalyse enzymatique des familles des glycosidases non rangées en clans . 17

Tableau 3a : Division de la famille GH13 en sous familles 19

Tableau 3b : Division de la famille GH13 en sous familles 20

Tableau 4 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités a-exoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . .. 55

Tableau 5 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités â-exoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . .. 56

Tableau 6 : Températures et pH optima d'hydrolyse des activités endoglycosidasiques des extraits bruts enzymatiques des glandes salivaires et du suc et tube digestifs de la larve de Rhynchophorus palmarum . 56

Tableau 7 : Bilan global de la purification de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 63

Tableau 8 : Poids moléculaires de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum . 65

Tableau 9 : Quelques propriétés physiques de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 71

Tableau 10 : Activité de l'a-glucosidase sur les p-nitrophényl-glycosides 73

Tableau 11 : Spécificité de substrat de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum sur les oligosaccharides et les polysaccharides ..... 74

Tableau 12 : Quelques paramètres cinétiques de l'a-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 76

Tableau 13 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de l'a-glucosidase du

suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 77

Tableau 14 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation catalysées par l'á-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 81

Tableau 15 : Bilan global de purification de la â-glucosidase du suc digestif de la larve

de Rhynchophorus palmarum 88

Tableau 16 : Poids moléculaires de la â-glucosidase du suc digestif de la larve du Rhynchophorus palmarum . 90

Tableau 17 : Quelques propriétés physiques de la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 96

Tableau 18 : Activité de la â-glucosidase sur les p-nitrophényl-D-glycosides .. 98

Tableau 19 : Spécificité de substrat (oligosaccharides et polysaccharides) de la âglucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 98

Tableau 20 : Quelques paramètres cinétiques de la â-glucosidase du suc digestif de la

larve de Rhynchophorus palmarum . 100

Tableau 21 : Effet de quelques agents chimiques sur la â-glucosidase du suc digestif

de la larve de Rhynchophorus palmarum . . 102

Tableau 22 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transglucosylation catalysées par la â-glucosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 106

Tableau 23 : Bilan global de la purification de la â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 112

Tableau 24 : Poids moléculaires et sous-unité de la â-galactosidase du suc digestif de

la larve de Rhynchophorus palmarum . 114

Tableau 25 : Quelques propriétés physiques de la â-galactosidase du suc digestif de la

larve de Rhynchophorus palmarum . . 120

Tableau 26 : Activité de la â-galactosidase sur les p-nitrophényl-D-glycosides 122

Tableau 27 : Spécificité de substrat (oligosaccharides et polysaccharides) de la â-

galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 122

Tableau 28 : Quelques paramètres cinétiques de â-galactosidase du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 124

Tableau 29 : Effet de quelques agents chimiques sur l'activité de la â-galactosidase du

suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum 126

Tableau 30 : Récapitulatif des paramètres physico-chimiques des réactions de transgalactosylation catalysées par la â-galactosidase purifiée du suc digestif de la larve de Rhynchophorus palmarum . 130

SYMBOLES ET ABREVIATIONS

AMPc : adénosine monophosphate cyclique

ATP : adénosine-5'- triphosphate

CCM : chromatographie sur couche mince

CLHP : chromatographie liquide haute performance

CM : c arboxyméthyle

D.O : Absorbance

Da : dalton

DEAE : diéthylaminoéthyle

DTNB : acide 2,2'-dinitro-5,5'dithio-dibenzoïque

Ea : énergie d'activation

EC : enzyme commission

EDTA : éthylène diamine tétra-acétate

kDa : kilodalton

kJ : kilojoule

KM : constante de Michaelis-Menten

M : molaire

mA : milliampère

nm : nanomètre

p/v : p oids/volume

pCMB : para-chloromercuribenzoate de sodium

pH : potentiel d'hydrogène

pNP : para-nitrophénol

pNPP : para-nitrophényl phosphate

PP : pyrophosphate de sodium

R : constante des gaz parfaits

Rf : référence frontale

RMN : résonance magnétique nucléaire

SAB : sérum albumine bovine

SDS : sodium dodécyle sulfate

PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

SN1 : substitution nucléophile d'ordre 1

SN2 : substitution nucléophile d'ordre 2

Trs : tours

UE : unité enzymatique

UI : unité internationale

Vmax : vitesse maximale

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"Il ne faut pas de tout pour faire un monde. Il faut du bonheur et rien d'autre"   Paul Eluard