Memoire Online - Influence du sédiment sur les flux énergétiques et le métabolisme oxydatif chez l'huà®tre creuse Crassostrea Gigas

Après son introduction dans les années 70 sur le littoral français, l'huître creuse a toujours été touchée par une mortalité plus ou moins importante selon les années. Cependant, on assiste ces dernières années à une augmentation de l'intensité de ce phénomène avec par exemple une mortalité touchant les juvéniles pour l'année 2008 exceptionnellement élevée par rapport aux suivis des mortalités effectués depuis une vingtaine d'année. Entre 2000 et 2005, le défi Morest (Mortalité estivale des huîtres), un projet réunissant une quinzaine de laboratoires, a permis d'identifier le caractère multifactoriel des mortalités estivales avec d'une part des caractéristiques intrinsèques de l'animal (gamétogénèse, croissance, système antioxydant) mais aussi son interaction avec l'environnement (pluviométrie, température, nature du sédiment, pesticides) ainsi que des agents pathogènes (vibrio).

Le risque de mortalité lié à la proximité du sédiment a été identifié dans ce cadre: les huîtres cultivées à 15 cm du sol présentent des mortalités nettement plus élevées que celles cultivées à 70 cm du sol (Figure 1).

Figure 1 : Mortalités comparées entre les élevages à 0-15cm (plat) et 50-70cm du sol (table) sur le site atelier de Perquis dans le sud du bassin de Marennes Oléron. Huîtres 2 ans.[1, 2]

De plus, les huîtres transférées au cours du printemps à proximité du sédiment (0-15cm) montrent des mortalités corrélées au temps de résidence près du sédiment ce qui suggère l'existence d'un stress chronique lié au sédiment provoquant un affaiblissement progressif des individus. L'épisode de mortalité en juin est alors plus important pour les huîtres qui ont séjourné plus longtemps à proximité du sédiment que par des huîtres situées à 70 cm du sédiment (Figure 2).

Figure 2 : Mortalités corrélées à leur temps de séjour à proximité du sédiment, en pointillé : lot témoin situé à 70cm du sédiment sur table [3].

La mesure du taux d'oxygène dans les sédiments montre une montée du niveau anoxique à la fin du printemps et en été. Cette évolution du taux d'oxygène dissout est expliquée par la sédimentation de matière organique provenant principalement de la production primaire et de l'activité nutritive des huîtres ainsi que des apports du continent. La chaîne microbienne présente à la surface et dans le sédiment recycle ce substrat en consommant de l'oxygène [4]. Lors d'un bloom printanier très productif, ce processus peut même provoquer l'anoxie totale au niveau du benthos [5].

De plus, ces baisses saisonnières du taux d'oxygène dans les sédiments correspondent avec l'apparition de composés réduits tel que l'ammoniac et les sulfures (Figure 3). Le caractère saisonnier de l'apparition de ces composés représenterait donc une source de stress potentiel dans les zones ostréicoles. Par exemple en France, les crises anoxiques survenant en été dans l'étang de Thau (Hérault) sont à l'origine de production de sulfures à des taux très élevés. Plusieurs travaux ont montré qu'un déficit en oxygène dissout chez Crassostrea gigas peut provoquer une dépression métabolique qui sensibiliserait les huîtres pendant l'épisode de mortalité estivale [6]. La réduction de l'activité de nutrition et de la respiration sont des réponses fréquemment observées à l'hypoxie et aux sulfures chez les invertébrés comme l'a montré Le Moullac et al. chez l'huître creuse [6]. De plus, les sulfures sont directement toxiques pour les organismes vivants car ils sont des inhibiteurs de la cytochrome c oxydase, l'enzyme terminale de la chaîne de transport d'électrons [6].

Figure 3: Variation de la teneur en ammonium et en sulfures dans les sédiments de PERQUIS pendant l'été 2006[3]

D'autres facteurs peuvent également expliquer cet effet sédiment sur les mortalités. Les apports terrigènes sont sources de pesticides, HAP, PCB, métaux lourds sous forme particulaire et d'autres polluants qui, par leur nature hydrophobe, se retrouvent piégés dans les sédiments.

L'augmentation des phénomènes de mortalités de ces dernières années pourrait aussi être corrélée à l'envasement progressif des sites de conchyliculture. Par exemple, dans le parc conchylicole de Grandcamp Maisy (baie des Veys - Normandie), le taux de pélite (vases fines) est de 8% maximum en 1992, 21% maximum en 1998 et de 64% maximum en 2003 [3].

La création dans le projet Morest de deux souches d'huîtres « R » et « S », souches dites Résistantes ou Sensibles aux mortalités estivales a permis de décrire des différences au niveau du métabolisme et de l'expression des gènes dans ces deux souches '[7]. Parmi les gènes différentiellement exprimés, on retrouve la catalase et la superoxide dismutase, des enzymes du métabolisme oxydatif. L'hypoxie, les composés réduits, les métaux lourds ou les pesticides sont connus pour pouvoir créer un stress oxydant. On observe au niveau des cellules du système immunitaire de Crassostrea gigas que la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) est plus importante pour les huîtres de la souche « S » [8]. La régulation du stress oxydatif aurait potentiellement un rôle dans les mortalités estivales.

La méthode d'élevage en baie de Quiberon est traditionnellement l'élevage des huîtres « à plat », c'est-à-dire directement sur le sédiment et en eau profonde où les huîtres ne découvrent jamais. La baie de Quiberon est le premier site de conchyliculture de Bretagne avec 60% du potentiel de production breton. Depuis 2003, on assiste à des mortalités passant de l'ordre de 35-40% à près de 75% (Enquête SRC Bretagne Sud). Des essais de cultures sur table en eau profonde pour l'année 2007 ont aussi clairement montré l'impact de la proximité du sédiment dans ce cas (Figure 4). La mortalité est plus importante pour les huîtres élevées au sol que les huîtres surélevées sur tables. La question de la qualité du sédiment est donc particulièrement importante et le projet Riscosol a été créé pour répondre à cette problématique.

Figure 4 : en pointillé - huître élevées au sol, traits continus - huîtres élevées sur table (bleu clair - station QB02, bleu foncé - station QB03, rouge - station QB04, orange - station QB 05, vert - station QB06) Rapport interne Ifremer Fleury et al. - 2008

Financée pour la période 2008-2010, cette étude a pour objectif de mieux cerner l'effet du sédiment sur les mortalités des huîtres à travers une étude équivalente à celle développée dans MOREST (Ecophysiologie et physiologie, Analyse physicochimique et microbiologique, écologie).

L'objectif majeur du projet est donc de caractériser le sédiment, d'étudier les échanges et flux de matière organique avec le sédiment, leur intégration par la flore microbienne et d'étudier comment cela peut influencer la physiologie de l'huître.

L'objectif de cette étude est de documenter la partie physiologie pour le projet Riscosol. Comment la physiologie des huîtres est-elle affectée par ces variations de qualité du sédiment ? Peut-on identifier des stress chroniques et aigus ?

Pour répondre à ces questions, un certain nombre de paramètres caractéristiques du métabolisme énergétique et oxydatif de l'huître creuse ont été étudiés.

Le matériel biologique utilisé proviendra d'une part d'une comparaison d'huîtres élevées sur différents types de sédiment dans la baie de Quiberon en eau profonde (projet Riscosol) et d'une expérimentation en milieu contrôlé au cours de laquelle des huîtres ont été soumises à un milieu hypoxique [6] et pour lesquelles des mesures écophysiologiques et biochimiques sont déjà disponibles. La plupart des méthodes font appel à des cinétiques enzymatiques et à des dosages colorimétriques qui sont réalisés en microplaque sur un lecteur Biotek. Ces techniques seront validées chez l'huître par la recherche des conditions optimales d'extraction et de dosage.

Les analyses biochimiques ont pour but d'évaluer l'état de santé général de l'huître en appréciant la gestion de l'énergie et la régulation du métabolisme oxydatif des animaux :

L'état des réserves énergétiques est évalué par la mesure des glucides totaux (glycogène principalement) ainsi que les lipides totaux. L'utilisation de cette énergie sera appréciée par des mesures d'activités enzymatiques au carrefour Phosphoénolpyruvate (PEP). A partir du PEP, la voie de la PEPCK permet la synthèse de précurseurs du métabolisme anaérobie tandis que la voie de la Pyruvate Kinase est considérée comme la voie donnant les précurseurs du métabolisme aérobie (Figure 5).

Figure 5 : Exemple de métabolisme général aérobie et anaérobie (chez la douve du foie), en flèche rouge : métabolisme aérobie, en flèche bleue : métabolisme anaérobie, pointillées : transport d'électrons, en encadrés : produits finaux, en vert : enzymes dosés dans le cadre du stage. Abréviations : AcCoA, acetyl-CoA; ASCT, acetate:succinate CoA-transferase; C, cytochrome c, C I, complex I; C III, complex III; CIV, complex IV; CITR, citrate; FRD, fumarate reductase; FUM, fumarate; MAL, malate; ME, malic enzyme; OXAC, oxaloacetate; PDH, pyruvate dehydrogenase; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate; RQ, rhodoquinone; SDH, succinate dehydrogenase; SUCC, succinate; Succ-CoA, succinyl-CoA; UQ, ubiquinone. Modifié d'après Tielens [9]

Le niveau de l'activité métabolique, que l'on peut associer aux besoins en ATP de la cellule, sera apprécié par les mesures d'activité enzymatique du cycle de Krebs (CS : Citrate Synthase) et de la phosphorylation oxydative (CCO : Cytochrome C Oxydase). Le couple PK/PEPCK permettra éventuellement d'observer un glissement vers un métabolisme anaérobie.

Le métabolisme cellulaire est obligatoirement associé à la production de ROS, des composés radicalaires ou non issus de l'oxygène et fortement réactifs vis-à-vis des macromolécules de la cellule. On considère que cette production de ROS provient à 80% de la chaîne respiratoire dans la mitochondrie, le reste étant principalement dû au fonctionnement d'une enzyme transmembranaire, la NADPH oxydase.

Le long de la chaine respiratoire, une proportion significative de l'oxygène (2 % à 6 %) échappe à la réduction complète en H₂O et subit une réduction mono-électronique au niveau des complexes I et III (cf CI et CIII Figure 5), pour donner naissance à l'ion superoxyde (O^-.₂) : cette production est absolument indissociable du processus respiratoire [10].

Figure 6 : Schéma des réponses antioxydantes de la cellule face aux ROS : GRd - Glutation Réductase, GPx - Glutathion Peroxydase, CAT - Catalase, SOD - Superoxide Dismutase, en vert - Réaction de Fenton, GSSG - Glutathion oxydé, GSH - Glutathion réduit

L'anion superoxide initial est pris en charge par une cascade de réactions d'oxydoréductions ou enzymatiques pour donner des dérivés oxygénés activés ou inertes. La Superoxide Dismutase (SOD) est dosée dans le cadre de ce stage. C'est la première étape de ce système antioxydant. Les activités Catalase et Glutathion Peroxydase (GPx) permettent l'élimination de l'eau oxygénée. Cette étape doit être la plus efficace possible car H₂O₂ produit, par la réaction de Fenton, le radical hydroxyle (OHÿ) qui est, de tous les ROS, l'espèce la plus réactive et la plus dommageable pour la cellule.

De plus, les défenses antioxydantes sont liés par le système des glutathions à la phase II de détoxication de molécules exogènes comme les hydrocarbures type HAP ou encore les herbicides par exemple. Le glutathion réduit (GSH), en plus de sa capacité antioxydante, est une molécule-clé dans la signalisation et l'élimination de composés biotransformés. Le glutathion réduit est également connu pour ses capacités de chélation et d'élimination des métaux lourds. La mesure de l'activité GR (glutathion réductase) permettra d'évaluer les besoins de la cellule en glutathion réduit.

Le stress oxydant résulte d'un excès de la production de ROS par les systèmes pro-oxydant par rapport à la prise en charge de ces ROS par les systèmes antioxydants. Les conséquences de ce stress oxydant sont des dommages non spécifiques et irréversibles de molécules comme l'ADN, les lipides ou des protéines. Si des macromolécules endommagées par les ROS sont activées en radicaux libres, des réactions en chaîne peuvent apparaitre. La cellule a mis en place des défenses antiradicalaires, principalement des vitamines, pour se protéger de ce type de réaction. La mesure de l'activité antiradicalaire est réalisée avec le dosage DPPH.

La deuxième source de ROS dans la cellule est issue du fonctionnement de la NADPH oxydase dans des cellules spécialisées de l'immunité. En cas d'attaques de pathogènes, ces cellules produisent massivement des anions superoxydes dans les phagosomes avec la NADPH oxydase afin de lyser les agents infectieux. Cette activité ne sera pas étudiée dans le cadre de ce stage.

Matériel et Méthodes

Les huîtres sélectionnées pour le projet Riscosol proviennent de captage naturel d'Arcachon. Les juvéniles de 18 mois ont été répartis sur 6 stations dans la baie de Quiberon. Trois sites seulement ont été retenus pour les analyses biochimiques (Stations QB02, QB04 et QB05 - Figure 7). La présence d'un gradient d'envasement a justifié ce choix, la station 5 étant la plus envasée, la station 2 la moins envasée, la station 4 étant intermédiaire (Annexe 3). Les stations 2 et 5 sont à une profondeur moyenne de 7-8 mètres tandis que la station 4 est à environ 13 mètres de profondeur. Les eaux du fond pour cette dernière station sont plus froides, plus turbides et sont davantage soumises aux phénomènes de stratification pendant l'été.

Figure 7 : Carte de situation des sites retenus dans la baie de Quiberon pour le projet Riscosol

Un prélèvement de 30 huîtres pour les mesures physiologiques est réalisé à date fixée. Pendant la durée du stage les prélèvements de juillet 2008, septembre 2008 et mars 2009 ont été analysés. Des mesures biométriques sont effectuées le jour du prélèvement (poids total, poids de chair, poids de coquille). Sur les 30 huîtres, 3 pools de 5 huîtres sont réalisés sur l'animal entier et 3 autres pools de 5 huîtres sont constitués par tissus (glande digestive, les branchies et le muscle). Les pools d'animaux entiers et des tissus sont congelés dans l'azote liquide aussitôt après dissection jusqu'à l'analyse.

Le matériel biologique et le protocole de la manipulation en milieu contrôlé hypoxie - normoxie est décrit par Gilles Le Moullac [6]. Nous avons retenu les échantillons d'huîtres issues de la manipulation de juin 2005 (ce qui correspond à une température de 20°C) et pour les huîtres de la souche R seulement. La souche R est une souche d'huître sélectionnée en une génération pour ses qualités de résistance face aux mortalités estivales.

Après une phase d'acclimatation d'une semaine en milieu contrôlé, un lot est placé en condition hypoxique (2.0mg O₂/L d'eau de mer) et un deuxième lot témoin est gardé en normoxie (environ 8.5mg O₂/L d'eau de mer). Des prélèvements sont effectués à T0, T2, T10 et T20 jours pour les mesures biochimiques.

Les échantillons d'huîtres congelés sont broyés au Dangoumeau. La poudre fine obtenue est ensuite aliquotée par 100 ou 200mg dans des tubes eppendorfs. Les aliquots sont extraits dans un tampon dont la composition spécifique dépend des conditions du dosage :

Dosages GR-CS-CAT-SOD : Tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) + 0.1% Triton X-100 + 1mM EDTA

Dosages PK-PEPCK : Tampon Imidazole-HCl 0.2M pH7.2 + NaF 100mM + EDTA 5mM + EGTA 5mM + 2-âmercaptoéthanol 15mM + Antiprotéases

L'homogénéisation est réalisée à l'aide d'un broyeur mécanique (polytron). Pendant toute la durée de l'homogénéisation, les échantillons sont maintenus dans un bain de glace. Seule exception, pour le dosage DPPH, l'homogénéisation est uniquement réalisée par ultrasons. Les broyats sont ensuite centrifugés :

Dosage CCO : Extraction de mitochondries : première centrifugation à 1400g pendant 5mn à 4°C. Le surnageant est isolé puis centrifugé une deuxième fois à 9000g pendant 9mn à 4°C. Le culot est ensuite redissout dans un tampon phosphate 50mM pH 7.8 pour les analyses.

Les dosages sont réalisés en microplaques de 96 puits et les cinétiques sont lues avec un lecteur spectrophotométrique Biotek UV/visible. Les résultats sont exprimés par rapport à des mg de protéines solubles, dosage réalisé par la méthode de LOWRY (kit BioRad).

Le poids sec moyen de l'huître ainsi que le taux de matière organique moyen par huître est obtenu après séchage d'un aliquot de poudre à 80°C et 450°C.

La PK est une enzyme de la glycolyse. La réaction qu'elle catalyse est irréversible, ce qui est très surprenant au vu du nom de l'enzyme qui décrit la réaction inverse. Elle est régulée au niveau allostérique (phosphorylation) ainsi que par l'alanine qui est le principal inhibiteur de cette enzyme.

La décroissance du NADH est suivie à 340nm et permet de suivre la cinétique de la première réaction.

La PEPCK est la première enzyme de la néoglucogénèse. Elle catalyse également la réaction inverse contrairement à la PK. Cette étape permet de dériver la glycolyse vers d'autres voies du métabolisme anaérobie au lieu d'aboutir au cycle de Krebs par la voie classique (via la PK). La PEPCK est régulée au niveau transcriptionnel.

Le principe du dosage est similaire à celui de la PK. On mesure la production d'oxaloacétate avec le suivi de l'absorbance du NADH à 340nm.

La condensation de l'acétyl-CoA et de l'oxaloacétate pour former le citrate est catalysée par cette enzyme. C'est une enzyme mitochondriale, la première enzyme du cycle de Krebs. Chez l'huître creuse, sa régulation est basée sur le fait que son produit, le citrate, l'inhibe à forte concentration [11]. La disponibilité en oxaloacétate serait également un facteur limitant selon Fields [11].

La réaction est suivie en dosant les résidus thiols avec le DNTB (dinitrothiobenzoate) dont le produit de la réaction (NTB) absorbe à 412nm.

La cytochrome c oxydase (CCO) catalyse l'étape finale de transfert d'électrons vers l'oxygène moléculaire au cours de la phosphorylation oxydative (Figure 5). C'est un gros complexe transmembranaire mitochondrial organisé en dimère. Chaque monomère comporte 13 sous-unités codées à la fois par le génome mitochondrial et le génome nucléaire. La stabilité du complexe est donc très sensible et une extraction de mitochondrie est nécessaire pour avoir des conditions optimales de dosage.

Le principe du dosage consiste simplement à ajouter à l'extrait le donneur d'électron normal de l'enzyme : le cytochrome c réduit dont le pic d'absorbance se situe à 550nm. On suit l'oxydation du cytochrome C à 550nm.

Les lipides totaux sont dosés selon la méthode de Bligh et Dyer dont le principe consiste à réaliser plusieurs extractions au mélange éthanol/dichlorométhane. Les glucides totaux sont dosés selon la méthode de Dubois. Les glucides se combinent avec le phénol et donnent une coloration rose-saumon absorbant à 490 nm.

Bien que ne réagissant pas directement avec une espèce réactive de l'oxygène, on considère que cette enzyme fait quand même parti du métabolisme oxydatif car elle recycle le glutathion réduit (GSH). En effet, le GSH sert à la fois de co-substrat pour la glutahion peroxydase mais sert aussi à détoxifier la cellule de xénobiotiques qui sont potentiellement une source de production de ROS.

Comme pour le dosage de la Citrate Synthase, la deuxième réaction fait intervenir un indicateur coloré (le nitrothiobenzoate) qui permet de suivre la cinétique de la réaction initiale à 412nm.

La superoxyde dismutase est une métalloprotéine qui catalyse la dismutation de l'anion superoxyde en oxygène et en peroxyde d'hydrogène. Il existe plusieurs formes de SOD utilisant différents noyaux métalliques. On retrouve la Cu/Zn-SOD dans le cytosol et de la Mn-SOD dans les mitochondries principalement. Seule l'activité SOD cytosolique est mesurée dans le protocole utilisé ici.

Des anions superoxydes sont générés par la réaction entre l'hypoxanthine et la xanthine oxydase. Ces anions réduisent le cytochrome C. La SOD présente dans l'échantillon dismute les anions superoxydes et ceux-ci sont en quantité moindre pour réduire le cytochrome C. L'analyse est donc basée sur la « compétition » entre la SOD et le cytochrome C pour les anions superoxydes. On dose la production de cytochrome C réduit à 550nm en présence ou en absence d'échantillon.

La catalase permet de catalyser la dismutation de l'eau oxygénée (peroxyde d'hydrogène) en eau et en dioxygène. C'est une des enzymes les plus performantes connues (sa vitesse est seulement limitée par la diffusion du substrat).

Le dosage est réalisé avec un kit Invitrogen. L' H₂O₂ non dégradé par la catalase réagit avec l'Amplex Red, un composé qui réagit en présence de peroxydase pour produire un composé fluorescent : la résorufine qui absorbe à 560 nm.

La méthode est basée sur la dégradation du radical DPPH (diphenyl-1-picrylhydrazyl) solubilisé dans un mélange Méthanol/eau à 80%. Un antioxydant aura la capacité de donner un électron singulet au radical synthétique DPPH de coloration violette pour le stabiliser en DPPH non radicalaire de coloration jaune-verte. La mesure de la décroissance de coloration violette au bout de 30 minutes d'incubation permet de déterminer le pourcentage d'inhibition par rapport au blanc dont l'absorbance ne varie pas.

Une Anova à deux facteurs a été réalisée pour toutes les analyses de Riscosol (facteur temps + facteur station, méthode LSD à 95% de confiance). Si le découplage du facteur temps est possible, une analyse de variance sur un seul point temporel a pu être réalisée pour mettre en évidence des différences entre stations. Un test T est réalisé pour différencier sur le plan statistique les données d'hypoxie et de normoxie (alpha=5%).

Résultats

Les résultats des données biométriques obtenues en baie de Quiberon permettent d'évaluer la croissance et la mortalité des huîtres pour les différentes stations (Figure 8).

Figure 8 : suivi des mortalités et de la croissance sur les sites de la baie de Quiberon, S : huîtres sur le sédiment, P : huîtres en poche surélevées - Résultats préliminaires Riscosol, Mazurié et al. 2009

La croissance a principalement lieu entre février et juin. Il n'y a pas de différences notables de croissance entre les trois stations (2, 4 et 5). Les stations 2 et 5 sont caractérisées par des mortalités peu élevées contrairement à la station 4 où la totalité des huîtres est morte en octobre 2008. Pour cette dernière station, des huîtres du même lot mais élevées sur l'estran depuis février 2008 ont été resemées en février 2009 afin de continuer le suivi. On note que le gain de poids des huîtres élevées sur l'estran est presque trois fois plus faible que celles élevées dans la baie en eau profonde. En mars 2009, les huîtres de la station 2 ont un poids sec moyen de 1.41g tandis que les huîtres du même âge issues de l'estran font 0.53g de poids sec en moyenne (tableau annexe 2).

Figure 9 : Taux de lipides totaux et de glucides totaux en %/poids sec, Moyenne +/- Ecart-type, n=3

Les taux de lipides des huîtres des trois sites étudiés sont plus élevés en juillet qu'aux autres dates (Anova à deux facteurs, P<0.05). Aucune différence significative entre stations n'est observée. Toutes les valeurs de glucides totaux sont équivalentes sur le plan statistique exceptée celle de la station 04 en mars (Anova à un facteur pour le mois de mars, P<0.05).

Les résultats sont exprimés en Unité enzymatique par mg de poids de chair fraiche ou par mg de protéines solubles.

Figure 10 : Activité Pyruvate kinase et Phosphoénolpyruvate Carboxykinase sur les échantillons Riscosol d'huîtres entières, Moyenne +/- Ecart-type, n=3

Les variations de l'activité PK sont statistiquement différentes dans le temps (Anova à deux facteurs P<0.01). Aucun effet station n'est observé. Il n'y a pas de différences statistiques entre les différents points pour l'activité PEPCK (Anova à 2 facteurs, P<0.05) hormis le point de mars pour la station 04 (Anova 1 facteur en mars, P<0.05).

Figure 11 : Activité Citrate Synthèse et Cytochrome C oxydase sur les échantillons Riscosol d'huîtres entières, Moyenne +/- Ecart-type, n=3

Comme la PK, les variations de l'activité Citrate Synthase sont essentiellement expliquées par les variations saisonnières (Anova à deux facteurs, P<0.01), aucun effet station n'est observé. Concernant la CCO, les variations de l'activité sont uniquement expliquées par le temps et aucun effet station n'est observé par l'analyse statistique. L'activité CCO de la station 4 en septembre est différente des autres stations à ce temps mais avec un intervalle de confiance plus faible (92% - méthode LSD).

Figure 12 : Activité Pyruvate Kinase et Phosphoénolpyruvate Carboxykinase en conditions contrôlées de normoxie et d'hypoxie (~25% de la saturation en O₂), Moyenne +/- Ecart-type,* différence significative entre Normoxie et Hypoxie

La mise en conditions hypoxiques des huîtres provoque une baisse de l'activité de la PK et PEPCK. Cependant la différence n'est statistiquement significative que pour le temps T2 jours pour la PK et T10 jours pour la PEPCK.

Figure 13 : Activité Citrate Synthèse et Cytochrome C oxydase en conditions contrôlées de normoxie et d'hypoxie, Moyenne +/- Ecart-type,* différence significative

On observe une activité Citrate Synthase plus importante en condition hypoxique particulièrement pour le temps T10jours (P<0.05). Aucune différence significative n'a été mise en évidence concernant l'activité CCO entre condition d'hypoxie et de normoxie.

Figure 14 : Activité Superoxide Dismutase et Catalase sur les échantillons Riscosol d'huîtres entières, Moyenne +/- Ecart-type, n=3

Pour l'activité Superoxide Dismutase, l'analyse de variance ne révèle aucune différence statistique quelque soit le facteur. Cependant, pour le mois de mars, une ANOVA à un facteur permet de différencier les activités SOD entre la station 4 et les stations 2 et 5(P<0.05). L'activité Catalase est caractérisée par un effet station significatif (P<0.001), ainsi qu'un effet du à la saison (P<0.05) ; (ANOVA à deux facteurs).

Figure 15 : Activité Glutathion Réductase et dosage DPPH sur les échantillons Riscosol d'huîtres entières Moyenne +/- Ecart-type, n=3

Les variations de l'activité GR sont statistiquement différentes au cours du temps (Anova à deux facteurs P<0.001). Pour cette enzyme, l'activité GR de la station 5 semble plus haute que celle de la station 2, en particulier lors du mois de septembre, mais cette différence n'est pas significative au seuil de 5% (P=0.067). Les variations de l'activité DPPH sont fortement expliquées par l'effet temps (P<0.001) mais aucune différence statistique ne permet de déceler des variations entre stations.

Figure 16 : Activité Superoxide Dismutase et Catalase en condition contrôlée d'hypoxie, Moyenne +/- Ecart-type,* différence significative entre Normoxie et Hypoxie

En condition d'hypoxie l'activité SOD est plus faible par rapport à la normoxie de façon significative à T10 jours(P<0.05) et presque significative à T20 jours (P=0.051). Tout comme comme les activitées PK et PEPCK, on observe une augmentation de l'activité SOD au cours de l'expérience pour les individus témoin (normoxie). L'activité Catalase ne varie pas avec les conditions hypoxiques.

Figure 17 : Activité Glutathion Réductase en condition contrôlée d'hypoxie, Moyenne +/- Ecart-type,* différence significative entre Normoxie et Hypoxie

L'activité Glutathion Réductase est significativement réduite en condition d'hypoxie, la différence est significative pour le point T20 jours (P<0.05) et confirme donc la tendance observée aux temps précédents.

Figure 18 : Corrélation linéaire entre les données de CS et CCO (par réplicats biologiques) et corrélation linéaire entre les activités PK et GR (par point de mesure).

Une corrélation est observée entre les activités de CS et de CCO ainsi qu'entre les activités de PK et de GR. Les coefficients de corrélation R² sont supérieurs à 0.5.

Discussion

La croissance observée en baie de Quiberon en eau profonde est très importante. Pour comparaison, le taux de croissance printanier des huîtres de Marennes-Oléron est 0.18g poids sec/mois (données « Morest » Soletchnik et al. [3]) tandis qu'il atteint 0.38g poids sec/mois en baie de Quiberon pour la station QB05. Les mortalités sont faibles pour les stations 2 et 5 et sont relativement régulières (environ 20% sur une année), tandis que la station 4 a subi une forte mortalité pendant cette première année d'élevage au sol (Figure 8). La présence sur ce site de nombreux bigorneaux perceurs pourrait être une des explications à ce taux de mortalité. La perte de poids de l'ensemble des animaux pendant l'été correspond principalement à l'émission de gamètes. Par ailleurs, on observe des différences au niveau physiologique des huîtres stockées sur l'estran qui ont subi l'exondation et qui ont été resemées en mars. La taille moyenne et le poids sec moyen de ces huîtres sont beaucoup plus faibles (annexe 2). Les réserves énergétiques sont plus faibles, le niveau de métabolisme énergétique est également plus faible tandis que le métabolisme oxydatif est davantage activé par rapport aux huîtres cultivées en pleine eau. Tous ces éléments attestent du fait que les huîtres resemées ont été ou sont, dans ces nouvelles conditions environnementales, stressées et ne sont pas comparables aux huîtres des autres stations.

Les réserves d'énergie chez l'huître creuse sont principalement constituées de glycogène et de lipides. Le taux de lipides suit essentiellement la gamétogénèse, les gonades ayant le plus fort taux de lipides dans l'organisme. La baisse du taux de lipides entre juillet et septembre 2008 (Figure 9) concomitante à la perte de poids sec peut correspondre à la ponte. Le taux de lipides est en accord avec les données bibliographiques [12]. Concernant les glucides totaux, les taux sont classiques pour cette espèce qui est connue pour stocker beaucoup de glucides par rapport à d'autres huîtres comme l'huître plate par exemple [12, 13]. Les huîtres n'ont pas encore commencé à stocker des sucres en mars. On note également un taux de sucres plus faible pour les nouveaux individus de la station 04 arrivés en mars.

L'activité PK pendant juillet et septembre est assez faible (100-150mU/g poids frais) comparée aux taux mesurés en condition contrôlé normoxie-hypoxie qui sont plutôt de l'ordre de 500-700mU/g poids frais. L'activité PK plus élevée en mars atteste que la glycolyse fonctionne bien à cette période et pourrait correspondre à la présence de ressources nutritives dans l'environnement.

Les données de CS sur Crassostrea gigas dans la littérature montrent des activités comparables aux nôtres (Activité CS de 1.5mU/mg ph soit environ 50mU/mg prot. pour Fields et al. [11], activités de 0.8mU/mg ph soit environ 30mU/mg prot. pour Dunphy et al. [13]). Les valeurs de CS estivales paraissent tout de même plus élevées pour les échantillons Riscosol (~60mU/mg prot.) que les échantillons témoins de la manipulation hypoxie (~20mU/mg prot.) ce qui peut s'expliquer par le stress environnemental naturel (marées, sédiment,...) subi par les huîtres par rapport à des conditions en milieu contrôlé en laboratoire.

L'absence de hausse de la CS en mars peut signifier que les produits de la glycolyse ne sont pas essentiellement utilisés pour les dépenses energétiques de l'animal. Ils peuvent être orientés vers des voies de stockages (synthèse lipidique par exemple) ou pour la gamétogénèse. Des niveaux faibles d'activité Citrate Synthase peuvent également être le signe d'une contamination aux métaux lourds [14]. Hormis une contamination de ce type, la CS (et le métabolisme plus généralement) serait régulé par la température essentiellement [14]. Pour la PK, outre la température, plusieurs autres facteurs peuvent participer à sa régulation. Le Moullac indique que l'activité PK chez Crassostrea gigas peut être lié au processus reproductif [6]. Les facteurs comme l'alimentation et le type de métabolisme (aérobie/anaérobie) seraient également liés aux variations saisonnières de l'activité PK [15].

Des conditions limitantes d'oxygène pendant l'été 2008 pourraient provoquer la baisse de l'activité PK aux niveaux mesurés. La baisse de l'activité PK a été plusieurs fois confirmée en condition hypoxique [6, 16]. L'influence de l'hypoxie sur l'activité Citrate Synthase est contradictoire selon les auteurs dans la littérature. Certains montrent la baisse de l'activité en condition hypoxique chez E. Coli [17] ou chez le rat [18], tandis que d'autres études montrent l'inverse chez les bivalves marins [19]. Nos résultats pour l'expérimentation hypoxie tendent à confirmer la hausse de l'activité CS en condition d'hypoxie chez l'huître creuse.

La réponse de ces deux enzymes à l'hypoxie est donc totalement différente. Cela contribue à expliquer le découplage observé entre les données de PK et CS.

Il n'y a pas de variations saisonnières de l'activité PEPCK. L'activité PEPCK est connue pour ses faibles variations d'activité, sa régulation étant surtout allostérique. L'activité est principalement régulée par les variations de pH observées en condition d'hypoxie ou d'émersion qui influe sur le sens de la réaction. On note toutefois une activité plus basse pour les huîtres issues de l'estran de la station QB04 en mars.

Concernant l'activité CCO, la variabilité des taux entre les différents réplicats biologiques est très élevée. Elle correspond à une grande hétérogénéité au sein de la population. Cela est particulièrement mis en évidence pour la station 04 en septembre 2008. A cette date, la station 04 est touchée par de fortes mortalités. La probabilité d'échantillonner des huîtres moribondes ou en état de stress est donc non négligeable et pourrait correspondre à cette forte différence entre individus. Une hausse de l'activité CCO pourrait être liée à un stress environnemental. En effet, certains résultats de « Morest » en conditions contrôlées (hypoxie) montraient une augmentation de l'activité ETS (mesure du transport d'électron de la chaîne respiratoire) en été et en automne alors que la consommation d'oxygène des huîtres en hypoxie a baissé de 70% [6]. Ce résultat peut être expliqué par un processus de compensation de l'huître qui essaye de maintenir le plus possible un métabolisme aérobie. L'hypothèse d'une régulation au niveau du gène est alors envisageable puisqu'une sur-régulation de la sous-unité III de la cytochrome c oxydase a été montrée dans la glande digestive d'huîtres soumises à l'hypoxie [20]. Cependant, les résultats de nos mesures de l'activité CCO sur les huîtres soumises à l'hypoxie ne montrent pas de réponse de l'activité de la CCO spécifiquement au manque d'oxygène. Cette différence entre l'expression de gène et l'activité enzymatique pour la CCO en condition d'hypoxie a déjà été discutée par Ripamonti et al. Il s'étonnait de voir l'expression du gène augmenter alors que l'activité baissait pour cette enzyme lors de ses essais sur le rat [18]. De nombreuses étapes régulatrices entre l'expression au niveau d'un gène et l'activité d'une protéine existent et peuvent expliquer ce résultat. L'activité CCO peut également être induite par une contamination au cadmium [21]. L'activité CCO plus haute en été serait davantage due à des facteurs comme la température, l'hypoxie ou les métaux lourds qu'aux sulfures, ceux-ci provoquant une baisse de l'activité CCO [22].

La corrélation entre les activités CS et CCO est représentative du lien entre production du pouvoir réducteur par le cycle de Krebs et le fonctionnement de la chaîne respiratoire. Marie et al. [23] ont déjà montré ce type de corrélation chez le ver hydrothermal Paralvinella g.. La CS et la CCO peuvent être utilisées comme des indices du niveau de métabolisme. La CS est même parfois considérée comme un indice de la croissance de l'individu (chez l'huître creuse [13, 24].

La mesure de l'activité GPx a mis en évidence des taux très faibles. Les activités étant à la limite du seuil de détection, les données ne sont pas interprétables. La faible activité GPx chez Crassostrea gigas est tout de même un résultat important. Il confirme les résultats de Valavanidis et al. [25] qui indique que l'activité GPX est de deux ou trois ordres de grandeur plus faible chez les invertébrés que chez les vertébrés.

Pour les échantillons Riscosol, aucune différence d'activité de SOD n'est visible, aussi bien entre les différentes stations qu'entre les différents points temporels. On note toujours une activité différente pour le lot d'huître provenant de l'estran (station QB04 en mars) ainsi qu'une plus grande variabilité concernant les huîtres de la station 02 en table (hors-sol). Pourtant la SOD répond assez bien à l'hypoxie, comme le confirme nos analyses ainsi que les travaux de Monari et al. chez la petite praire [26] ou Pannuzio et al. chez la littorine [27]. Nos données confirment le schéma de réponse de l'activité SOD en condition hypoxique décrit par Chen et al. chez le pétoncle [28] : dans un premier temps, la SOD est activée par l'hypoxie puis l'activité décroit rapidement à partir de 7 jours d'hypoxie. Les faibles valeurs observées pour la SOD en Baie de Quiberon ne plaident pas forcement en faveur d'un sédiment peu anoxique tout au long de l'année car l'activité SOD varie également avec la contamination par les pathogènes et la pollution (chez la moule [29]). Box et al. [30] soulignent que la rapidité d'adaptation de cette activité enzymatique à des changements environnementaux en fait un bon biomarqueur de la qualité de l'environnement.

L'évolution de l'activité catalase au cours de l'année ne suit pas la tendance générale des autres activités enzymatiques qui semblent indiquer que le métabolisme de l'huître est plus actif en juin qu'en septembre. En effet, le taux de catalase est globalement plus élevé en septembre qu'en juillet. A cette date, les taux de catalase de l'ordre de 150-200U/mg prot. semblent assez élevés par rapport aux taux mesurés en conditions contrôlées de la manipulation hypoxie qui sont de 80-100U/mg prot. La bibliographie donne aussi des activités catalase généralement plus faibles : 20-60U/mg prot. dans la glande digestive de la palourde [31], 80-100U/mg prot. chez la moule bleue [32].

La catalase est connue pour répondre assez bien aux polluants [33, 34] mais très peu à l'hypoxie [35] ce que confirme nos essais en conditions d'hypoxie. La variation observée dans le milieu est peut-être due à un incident qui a remis de la vase en suspension (grande marée, tempête, dragage,...) et qui a provoqué ce pic en septembre. Cependant, les fluctuations saisonnières de l'activité catalase peuvent également varier en ce sens : on observe un pic de l'activité catalase chez Mytilus galloprovencialis en novembre alors que l'activité est minimale en mai (mesures sur les branchies, [36]). C'est pour cette activité enzymatique que l'on dénote la plus grande différence entre les différentes stations de la baie de Quiberon à chaque date. Comme pour la GR, on pourrait associer ces différences au gradient d'envasement des stations. Ici, la station 02 (la moins envasée) a le taux le plus faible de catalase tandis que la station 05 présente le taux le plus fort.

Les activités de GR des huîtres de la baie de Quiberon, en juillet et en septembre sont relativement basses (environ 3-4 mU/mg prot.) si on les compare aux taux de GR des huîtres témoins pour l'expérimentation hypoxie qui atteignent 10mU/mg prot. Nos essais montrent une baisse de cette activité en hypoxie conformément aux travaux de Pannuzio et al. qui ont également relevé une baisse de la GR chez la littorine en condition d'hypoxie : le taux d'activité GR passe de 13.8#177;1.5 mU/mg prot. en normoxie à 8.3#177;0.8 mU/mg prot. après 6 jours d'hypoxie [27].

La GR suit essentiellement le rythme de l'activité métabolique de l'individu en temps normal, c'est-à-dire une activité corrélée essentiellement à la température ou à l'activité d'assimilation nutritive. Manduzio et al. ont observé des fluctuations saisonnières de GR chez la moule bleue avec un pic d'activité en juin alors qu'elle est minimale pendant l'hiver [29]. Dans notre cas, l'activité GR est moins importante en septembre et juillet qu'en mars. Cela peut être expliqué par une reprise de l'activité d'assimilation nutritive dès mars ou bien par la forte répression de cette activité pendant l'été. La modification de l'activité GR avec des conditions hypoxiques en été n'est donc pas à exclure.

On peut noter également que pour cette activité enzymatique, on retrouve une légère différence entre stations (non significative sur le plan statistique) qui est corrélée avec le taux d'envasement de la station. Cela est peut être lié avec le rôle de la GR dans la détoxication des xénobiotiques et des métaux lourds qui sont surtout présents dans les sédiments.

La corrélation observée entre l'activité PK et l'activité GR est surprenante car elle lie le métabolisme oxydatif et la glycolyse et non la chaîne respiratoire. Le rôle de la GR dans la production du glutathion réduit pourrait expliquer ce lien. L'activité de filtration apporte à la fois des nutriments et des matières en suspensions non nutritives. Ces dernières peuvent être des métaux lourds ou des xénobiotiques. La détoxication de ces composés faisant intervenir le glutathion, on peut coupler ces activités de détoxications avec l'assimilation de glucose qui dépend également du rythme de filtration.

Concernant le DPPH, on remarque que l'organisme mobilise ses capacités antiradicalaires surtout en été ce qui est en accord les travaux de Seguineau et al. chez Crassostrea gigas qui montrent une baisse hivernale du taux de vitamines [37]. Le système antioxydant non enzymatique, est principalement représenté par des vitamines, mais certains acides aminés (cystéine méthionine) ou le glutathion réduit (GSH) ont également un rôle de défense contre les radicaux libres. En mars, le taux très faible d'antioxydants peut être interprété par le fait que l'animal n'a pas besoin à ce moment de l'année de mobiliser des défenses antioxydantes. On peut considérer que des conditions eutrophes du milieu devraient permettre une réaction rapide des organismes en cas de stress. Toutefois certains antioxydants comme l'acide ascorbique et le tocophérol n'interviennent pas dans le dosage DPPH [38]. Le protocole utilisé ciblerait donc une partie des défenses antiradicalaires qui n'est pas activée pendant le printemps.

Concernant les activités enzymatiques mesurées, aucune différence significative n'est observée entre les huîtres de la station 2 à plat sur le sédiment (QB02) ou en surélevé sur table (QB-T) pour le prélèvement du mois de mars. Cependant, la croissance des huîtres sur le sédiment est meilleure : 1.43g de poids frais contre 1.09g pour les huîtres surélevées en mars 2009 (table annexe 2). On observe aussi une mortalité légèrement supérieure pour les huîtres sur le sédiment (Figure 9). Cette mortalité différentielle n'est peut être pas due à un stress physiologique mais à facteur externe comme la prédation par exemple. Il est probable que des différences entre les huîtres surélevées et les huîtres au contact du sédiment devront apparaître davantage au moment de l'épisode de mortalité vers juin.

Conclusion

La majorité des mesures effectuées mettent en évidence le cycle saisonnier des huîtres sans pour autant pouvoir discriminer les différentes stations dans la baie. L'absence d'effet station pour la plupart de mesures effectuées indique que les huîtres sont dans des conditions environnementales très proches. En baie de Quiberon, l'année 2008 a été caractérisée par des mortalités relativement faibles chez les huîtres adultes. La faible amplitude de cet évènement peut expliquer l'absence de différences entre les différentes stations de la baie.

Les résultats préliminaires des biogéochimistes semblent converger vers le fait que les sédiments des différentes stations présentent de faibles taux d'ammoniac, de l'ordre de 60uM à 2cm en dessous de la surface et pas de traces de sulfures et que les flux sont faibles traduisant une faible activité biologique du sédiment.

Les résultats sont confirmés par les analyses microbiologiques qui révèlent une faible concentration des bactéries totales et cultivables aussi bien dans les sédiments que dans l'hémolymphe des huîtres. Cependant les stations 5 et 4 présentent respectivement le plus faible et le plus fort pourcentage en vibrios, bactéries le plus souvent impliquées dans la mortalité des huîtres.

Toutefois, l'activité catalase est à surveiller car elle serait un bon marqueur du taux d'envasement de la station. De même, l'activité Cytochrome C oxydase pourrait être corrélée à un état de stress physiologique prémortem. Les analyses réalisées sur les huîtres placées en condition d'hypoxie ont permis de mieux comprendre les réponses des différents systèmes enzymatiques au manque d'oxygène. En effet, en milieu naturel, une multitude de facteurs (température, salinité, oxygène dissout, photopériode, prédation,...) peuvent influer la physiologie de l'animal et il est toujours très difficile de découpler les divers facteurs causant un stress.

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Annexes

code	nom	Latitude	Longitude	sédiment
2P	Men-er-Roué - poche	47°32'340	3°05'464
2S	Men-er-Roué - sol	47°32'341	3°05'465	Sablo-vaseux avec maërl
3S	Beaumer sud -sol	47°32'857	3°02'600	Vase molle
4S	Angle sud - sol	47°31'228	3°04'549	Vase molle
5S	St-Pierre-Qb -sol	47°31'012	3°06'772	Vase dure
6S	Karrek-Bernard - sol	47°33'010	3°05'312	Sable vaseux

Annexe 2 : Table poids sec moyen par huître, poids sec initial en février 2008 : 0.11g, QB04 en mars 2009 correspond à un semis de la même population restée sur estran en 2008/2009, QB-T en mars 2009 correspond à des huîtres de station QB02 surélevées en table.

Temps	Station	Poids sec moyen
Juillet 08	QB02	1,560
	QB04	1,564
	QB05	1,641
Septembre 08	QB02	1,409
	QB04	1,311
	QB05	1,361
Mars 09	QB02	1,432
	QB04	0,531
	QB05	1,510
	QB-T	1,092

Annexe 3 : Etude préliminaire Riscosol, vases fines/argiles et sables de la baie de Quiberon, données non publiées, Fleury et al. 2007.

Dans le contexte des mortalités estivales de l'huître creuse sur le littoral français, le projet « Riscosol » a été initié pour comprendre les échanges de matière et d'énergie au niveau du sédiment dans la baie de Quiberon. En effet, une hypothèse majeure pour expliquer la mortalité des huîtres est que la proximité et la qualité du sédiment provoquerait une dépression métabolique des individus pendant la phase de croissance printanière. Une sensibilisation plus ou moins forte selon la qualité du sédiment provoquerait des mortalités. L'objectif de ces travaux est de documenter comment la physiologie de l'huître est affectée par des variations de la qualité du sédiment. Les huîtres proviennent de trois stations situées en baie de Quiberon ainsi que d'une expérimentation en condition contrôlée d'hypoxie. La mesure de paramètres du métabolisme énergétique (PK : Pyruvate Kinase, PEPCK : Phosphoénolpyruvate Carboxiykinase, CS : Citrate Synthase et CCO : Cytochrome c oxydase) et du métabolisme oxydatif (GR : Glutathion Réductase, GPx : Glutathion Peroxydase, CAT : Catalase, SOD : Superoxide Dismutase et DPPH : activité antiradicalaire) permet d'évaluer les conditions physiologiques des huîtres. Les résultats mettent en évidence de faibles différences au niveau physiologique pour les huîtres des différentes stations de la baie de Quiberon. Les variations d'activité observées sont principalement expliquées par des fluctuations saisonnières. Toutefois, l'activité catalase semblerait être un bon marqueur du taux d'envasement et l'activité Cytochrome C oxydase pourrait être corrélée à un état de stress physiologique. La poursuite du suivi en 2009 pourra confirmer ces hypothèses. Cette étude a permis également de documenter certaines variations d'activités enzymatiques en réponse à l'hypoxie chez Crassostrea gigas.

The program named «Riscosol», aiming to study the exchange of energy and matter on the sediment interface in the Quiberon bay, was initiated to understand the role of sediment quality in the summer mortality phenomenon of the Pacific oyster on the French coast. The major hypothesis to explain the mortality of oysters is that the low quality and the proximity of the sediment could affect the metabolism of the organisms during the spring growth. Therefore, this sensitivity could cause abnormal mortality in the early summer. The purpose of this study is to examine how the physiology of oysters is affected by the variations of the quality of the sediment. Oysters were sampled from three sites in the Quiberon bay and from a controlled experiment inducing hypoxia. The measurement of several energetic metabolism parameters (PK : Pyruvate Kinase, PEPCK : Phosphoénolpyruvate Carboxykinase, CS : Citrate Synthase and CCO : Cytochrome c oxidase) and the oxidative metabolism (GR : Glutathion Réductase, GPx : Glutathion Peroxydase, CAT : Catalase, SOD : Superoxide Dismutase and DPPH (total antioxydant capacity) was performed to determine oyster condition. The results show small differences of physiological state between the three studied sites in the Quiberon bay. The fluctuations of activity are mostly related to seasonal variations. However, the catalase activity appeared to be a good marker of the silting of the sampled sites and the Cytochrome C oxidase activity could be a good marker of physiological stress. The continuation of the monitoring in 2009 will allow to test these hypotheses. Our study also provides novel information about the response of Pacific oyster under hypoxia condition.

Influence du sédiment sur les flux énergétiques et le métabolisme oxydatif chez l'huà®tre creuse Crassostrea Gigas

Abréviations