Memoire Online - Evaluation de l'activité antidermatophytique des extraits au méthanol et fractions d'acalyphamanniana (euphorbiacées) et tristemma hirtum (mélastomatacées)

Je soussigné MOMO DONGMO Rosine Clémence atteste que la présente thèse intitulée : Evaluation de l'activité antidermatophytique des extraits au méthanol et fractions d'Acalypha manniana (Euphorbiacée) et de Tristemma hirtum (Melastomatacée), est le fruit de mes propres travaux de recherche effectués au Laboratoire de Microbiologie et des Substances Antimicrobiennes (LAMSA) du Département de Biochimie de l'Université de Dschang, sous la direction du Pr KUIATE Jules-Roger.

Cette thèse est authentique et n'a pas été antérieurement présentée pour l'acquisition de quelque grade universitaire que ce soit.

FICHE DE CERTIFICATION DES CORRECTIONS APRES SOUTENANCE

La présente thèse a été revue et corrigée conformément aux observations du jury.

DEDICACES

ü Mes frères et soeurs MOMO Christian Didier, TCHOUMPMI Nathalie, KOUAHOU Carine, ATEMKENG Alex, MOMO Hermann Patrick, MOMO Anicet,

ü Mes neveux et nièces TCHOUMPMI McLarry, YOMBE Bill Cindy, YANDJA Allison, Amira Jen CALEB, Aksa Latifah CALEB, Jonathan MOMO, Hannah MOMO.

Je vous suis infiniment reconnaissante pour tout votre soutien et tout l'amour que vous me porté. Grâce à vous j'ai pu me surpasser et donner le meilleur de moi. Que ce travail puisse être pour vous un réel motif de fierté.

REMERCIEMENTS

J'adresse mes sincères remerciements à toutes les personnes qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail :

ü Pr KUIATE Jules-Roger, qui a non seulement mis son matériel à ma disposition, mais m'a encadré tout au long de ce travail. Vos remarques, critiques et suggestions m'ont permi de mieux comprendre mon travail et de m'améliorer

ü Mr TAMOKOU Jean de Dieu, ses conseils, sa disponibilité et ses instructions rigoureuses ont contribué à l'amélioration de ce travail.

ü Mr MOUOKEU Raymond Simplice, qui a consacré beaucoup d'efforts à la réalisation de ce travail. Dieu seul saura vraiment vous remercier.

ü Mr NJATENG Guy Sedar Singhor, pour sa disponibilité, ses remarques et ses conseils.

ü Mr NGO TEKE Gerald, ses instructions rigoureuses et ses critiques ont contribuées à l'amélioration de ce travail.

ü Mes aînés de laboratoire : LUNGA Paul, NDEUTOU Armelle, MEFFO Carole, TIFUH Roger pour leurs encouragements.

ü Mes camarades de promotion : AWOUNTSA S. Rodrigue, DJAFOUA Yves Marcel, FOGUE Pythagore, FOUAPON M. Héroïne, NOUMEDEM K. Jaures, MAGNIFOUET N. Hugette, LIENOU L. Landry, KAMTCHUENG M. Odette, NGOUFACK K. Martine, METANGOUE Hermione, MOKALE K. A. Laurel, TODJOU Valéry, TANING Clovis, TSOFACK Serge P., FONGANG D. Hervet, MAFOKOUE Nina, CHOUATCHO N. Eric, pour leur franche collaboration.

ü Mes amis du Département de Chimie : HOUDJEU P. Christian, SEUYEP Denis, TSEUMEGNE Joseph pour leurs encouragements.

ü Mes amis PANGI Princely, LONTSI Raoul, MOUSSA Mohamadou, JIEKAK N. S. Aurélien et TCHAHA Merlin pour tout leur soutien moral

ü Tous les enseignants du Département de Biochimie de l'Université de Dschang pour leurs conseils et leurs enseignements.

ü Le laboratoire de Botanique appliquée de la Faculté des Sciences et le laboratoire des Sols de la FASA pour leur franche collaboration

ü A tous ceux dont les noms ne figurent pas ici et qui ont contribué d'une manière ou d'une autre à la réalisation de ce travail.

LISTE DES PHOTOGRAPHIES

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES ABREVIATIONS

RESUME

Les dermatophytes sont des champignons capables de digérer la kératine et de causer des dermatophytoses qui affectent 20 à 40% de la population mondiale, principalement les enfants. Acalypha manniana (Euphorbiacée) et Tristemma hirtum (Mélastomatacée) sont des plantes médicinales Camerounaises, utilisées dans le traitement des maladies de la peau. Dans l'optique de trouver des extraits de plantes à activité antidermatophytique, les feuilles d'A. manniana, les feuilles et tiges de T. hirtum, ont été macérées dans du méthanol. Les extraits méthanoliques obtenus ont été fractionnés successivement à l'hexane et à l'acétate d'éthyle. Les extraits et fractions des deux plantes ont été soumis au criblage phytochimique par des méthodes standards, puis testés in vitro sur quatre dermatophytes (Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton terrestre, Trichophyton equinum et Microsporum gypseum) par les méthodes d'incorporation en milieu solide et de dilution en milieu liquide. L'évaluation in vivo de l'efficacité d'une pommade à base de la fraction résiduelle de T. hirtum a été réalisée sur des cochons d'Inde mâles infectés par inoculation dermique d'une suspension de spores de T. mentagrophytes.

La caractérisation chimique des extraits et fractions a révélé la présence des saponines, des flavonoïdes, des triterpènes, des anthraquinones et des tannins, avec des différences de composition entre extraits et fractions. In vitro, l'activité antidermatophytique des extraits et fractions des deux plantes a été dose-dépendante. L'extrait brut et la fraction résiduelle de T. hirtum ont présenté des activités comparables (P > 0,05) et significativement plus importantes sur tous les dermatophytes avec des CMI comprises entre 128 et 512 ug/ml, traduisant le fait que le fractionnement n'améliore pas l'activité antidermatophytique de cet extrait. L'extrait brut d'A. manniana a montré une activité plus importante que ses fractions sur T. mentagrophytes avec une CMI de 256 ug/ml.. Toutes les fractions hexanique et à l'acétate d'éthyle ont montré des CMI comprises entre 256 et 1024 ug/ml. Excepté l'extrait au méthanol d'A. manniana qui a eu une action fongicide sur T. equinum avec une CMF de 1024 ug/ml ,tous les autres extraits ont eu une action fongistatique (CMF > 4096 ug/ml). In vivo, la pommade à 2,5% de la fraction résiduelle de T. hirtum a induit une diminution du diamètre des lésions de 60% et un taux de guérison de 50% des animaux après 25 jours de traitement. Les résultats justifient en partie l'usage d'A. manniana et T. hirtum en médecine traditionnelle contre les maladies de la peau et montrent que la fraction résiduelle de T. hirtum, sous réserve d'études toxicologique, pharmacocinétique et pharmacodynamique, pourrait constituer une substance antidermatophytique potentielle.

ABSTRACT

Dermatophytes are fungi that infect keratinized tissues of the body, producing dermatophytosis. These skin diseases affect 20 to 40% of the world population and are very frequent in developing countries. Acalypha manniana (Euphorbiaceae) and Tristemma hirtum (Melastomataceae) are Cameroonian medicinal plants used in the treatment of skin diseases. In order to find new substances with antidermatophytic properties, in vitro and in vivo antidermatophytic activities of methanolic extracts and fractions of these two plants were investigated. Leaves of A. manniana, stems and leaves of T. hirtum powdered, were macerated in methanol. The methanolic extracts of both plants were then fractionated successively with hexane and ethyl acetate. Phytochemical tests were done using standard methods. The extracts and fractions were tested in vitro on four species of dermatophytes (Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton terrestre and Microsporum gypseum) by using agar and broth dilution methods. In vivo activity of a cream, based on the T. hirtum residual fraction was carried out on male guinea pigs previously infected with a spore suspension of T. mentagrophytes.

Phytochemical screening of the extracts and fractions revealed the presence of saponins, flavonoids, triterpenoids, anthraquinones and tannins, with differences between the crude extracts and fractions, and within fractions. None of the extracts and fractions contained coumarins. The in-vitro study showed that all the extracts and fractions exerted a dose-dependent antidermatophytic activity. T. hirtum crude extract and its residual fraction were most active (P > 0,05) on all the strains with MIC values ranging from 128 to 512 ug/ml, showing that the fractionation does not improve the antidermatophytic activity of the extract. The crude extract of A. manniana was more active than its fractions on T. mentagrophytes with MIC value of 256 ug/ml and exhibited fungicidal activity against T. equinum with MFC value of 1024 ug/ml. Hexane and ethyl acetate fractions of both plant were less active and presented MIC values ranging from 256 to1024 ug/ml. Except the A. manniana crude extract, T. hirtum extract and fractions of both plants exerted a fungistatic activity. The in-vivo efficiency test of a 2.5% T. hirtum-based cream displayed a 60% reduction of diameters of lesions and a recovering of 50% guinea pigs after twenty five days of treatment. These results partially justify the traditional use of A. manniana and T. hirtum to cure skin diseases, and provide promising baseline information for the potential use of these plants in the treatment of dermatophytosis. The T. hirtum residual fraction, after further toxicological, pharmacokinetic and pharmacodynamic studies, could be useful as an antidermatophytic substance.

INTRODUCTION

Dans le domaine de la dermatologie, les dermatoses généralement rencontrées sont causées par les dermatophytes (Samuel et al., 2000). Les dermatophytes sont des champignons capables de digérer la kératine et de causer les dermatophytoses chez l'Homme et les animaux (Kuiate et al., 2006). L'incidence des dermatophytoses a augmenté durant ces dernières années, surtout chez les patients immunodéprimés (Santos et Hamdan, 2005). Elles affectent environ 20 à 40% de la population mondiale, principalement les enfants en âge scolaire (Sepahvand et al., 2009). Dans certaines régions du Cameroun, la prévalence des dermatophytoses chez les enfants est d'environ 31% (Maslin et al., 2005). Elles ne sont certes pas mortelles, mais constituent un problème de santé publique en raison des difficultés rencontrées pour la guérison de certains cas, la récidivité, et le nombre limité d'antifongiques efficaces (Samuel et al., 2000). Ces antifongiques sont par ailleurs coûteux, donc pas facilement accessibles par les populations pauvres (Bennet et al., 2000). A ces limites, s'ajoutent l'émergence de la résistance de certaines souches aux médicaments disponibles qui présentent quelques fois une toxicité assez élevée (Granier, 2003). Tous ces facteurs rendent nécessaire la recherche de nouveaux médicaments antifongiques efficaces, de faible coût et de faible toxicité.

Les recherches ethnobotaniques et ethnopharmacologiques reçoivent depuis des années une attention particulière, avec un intérêt croissant pour les plantes médicinales et leurs extraits comme source potentielle de médicaments antimicrobiens (Cowan, 1999). Les plantes constituent en effet un bon réservoir d'agents chimiothérapeutiques à potentiel curatif considérable (Zhang et Björn, 2009). La recherche des substances antimicrobiennes constituent le principal axe de recherche du Laboratoire de Microbiologie et de Substances Antimicrobiennes de l'Université de Dschang (LAMSA), où les travaux présentés dans cette thèse ont été menés. L'objectif de ce travail a consisté à l'étude des propriétés antidermatophytiques des extraits et fractions d'Acalypha manniana et Tristemma hirtum, deux plantes de la flore Camerounaise utilisées en médecine traditionnelle dans le traitement des maladies de la peau . Pour y parvenir, nous avons procédé à :

· L'évaluation de l'activité antidermatophytique in vitro des extraits et fractions

· L'évaluation de l'efficacité antidermatophytique d'une pommade à base de la fraction résiduelle de T. hirtum sur un modèle animal.

CHAPITRE 1 : REVUE DE LA LITTERATURE

I Généralités sur les champignons

I.1 Les champignons

I.1.1 Définition

Les champignons sont des êtres eucaryotes, hétérotrophes, unicellulaires ou filamenteux, sans organisation tissulaire et qui peuvent se reproduire soit sexuellement soit de façon asexuée (Murray et al .,2008).

I.1.2 Caractéristiques structurales

Les champignons sont caractérisés par une paroi cellulaire qui contient, des glucanes (â-1,3-glucane), des mannanes et la chitine. La membrane cellulaire des champignons est constituée de stérols (l'ergostérol principalement), et un cytoplasme dépourvu de chlorophylle. La plupart des champignons possèdent un mycélium, constitué de tubes appelés hyphes. Chez les champignons supérieurs, les hyphes sont cloisonnés ou septés, tandis que chez les champignons inférieurs ou primitifs, les cloisons intercellulaires sont rares (Stevens et al., 2006).

Les champignons les plus simples sont les levures (unicellulaires), et peuvent être regroupées selon leur mode de reproduction en levures vraies (issues d'une reproduction sexuée) et levures imparfaites (issues d'une reproduction asexuée). Les autres champignons, pluricellulaires, sont pour la plupart filamenteux (Alexopoulos et al.,1996).

I.1.3 Reproduction

La reproduction des champignons est complexe, reflétant ainsi l'hétérogénéité de leur mode de vie. Elle peut être sexuée ou asexuée, bien que certains champignons alternent entre les deux types de reproduction (Nester et al., 1998).

La reproduction asexuée se fait sans fusion de gamètes. C'est un mode de reproduction commun à presque tous les champignons. La reproduction asexuée chez les champignons peut se faire par bourgeonnement, fission binaire, fragmentation, ou par formation de spores (Alexopoulos et al.,1996).

Le bourgeonnement et la fission binaire sont les formes de reproduction asexuée les plus simples. Le bourgeonnement est une division inégale du cytoplasme, résultant en une cellule parent et une cellule fille, celle-ci étant plus petite que la cellule parent. La fission binaire par contre aboutit à deux cellules identiques. Ces deux formes de reproduction suivent la mitose.

Illustration de la fission binaire et du bourgeonnement chez les levures (Abedon, 1997)

La fragmentation est une forme de reproduction asexuée où un nouvel organisme se développe à partir d'un fragment parent. La sporulation est la plus importante forme de reproduction asexuée chez les champignons. Elle se fait à travers les spores asexuées, formées au cours de la phase asexuée du cycle de vie des champignons (phase anamorphe). Suite à une mitose, ces spores se transforment en cellules reproductives appelées mitospores qui, après dispersion, se développent en de nouveaux organismes.

Après fragmentation du protoplasme en plusieurs parties (a, b), il se forme des parois autour des prospores (c) puis la maturation s'arrête et les parois disparaissent. Le protoplasme devient moins dense(d) et les prospores fusionnent (e) pour donner une nouvelle cellule végétative (f) puis le bourgeonnement commence (g). Illustration des différentes étapes de la sporulation chez Saccharomyces paradoxus (Solomon, 2007)

Pour qu'une reproduction sexuée se réalise, il est nécessaire d'avoir deux noyaux haploïdes capables de s'accoupler, ou un seul noyau diploïde. Les deux noyaux haploïdes doivent d'abord fusionner pour donner un noyau diploïde qui subit par la suite une méiose. Cette méiose est à l'origine de la variation au sein de la progéniture fongique. Ces évènements sont suivis par la formation de spores (les ascospores, les basidiospores, zygospores), dont le processus varie en fonction des différentes classes de champignons (Deacon, 2005).

1 germination des spores ; 2 libération des conidies ; 3 germination de la conidie ; 4 mycélium du champignon ; 5 rapprochement de deux filaments provenant de spores différentes ; 6 fusion des deux cellules à deux noyaux à n chromosomes ; 7 filament ascogène à 2 noyaux à n chromosomes ; 8 fusion des deux noyaux (2n) ; 9 deux noyaux à n obtenus après la première division de la méiose ; 10 4 noyaux à n (deuxième division de la méiose) ; 11 mitose ; 12 asque contenant 8 ascospores à n chromosomes chacune.

Illustration de la reproduction sexuée chez les ascomycètes (Florimont, 2009)

Plusieurs champignons alternent entre la reproduction sexuée et asexuée, dépendant des conditions. A titre indicatif, la moisissure du genre Dictyostelium effectue une fission binaire lorsque les conditions sont favorables. Mais lorsque celles-ci deviennent défavorables (dessiccation, rayons UV, augmentation ou baisse de la température), le champignon procède à une reproduction sexuée qui aboutit à la formation de spores. Certains champignons échangent également leur matériel génétique par des processus parasexués. La fréquence et l'importance relative de ce mode de reproduction ne sont pas bien claires et peuvent être inférieures comparées à celles de la reproduction sexuée. Mais, ce mode de reproduction est nécessaire dans l'hybridation qui est associée à l'évolution des espèces fongiques (Bruns, 2006).

I.1.4 Classification

La classification des champignons est généralement basée sur les caractéristiques de leurs structures de reproduction qui permettent de distinguer quatre classes de champignons :

Les champignons de ce groupe ont la particularité de croître rapidement. Ils possèdent des cellules non mobiles et des hyphes non septés. Les zygomycètes peuvent se reproduire sexuellement et asexuellement. La reproduction sexuée aboutit à la production de zygospores spores immobiles à parois épaisses. La reproduction asexuée aboutit quant à elle à des spores (chlamydoconidies, sporangiospores) contenues dans un sporange issu de sporangiophores simples ou branchés. Le Rhizoporus stolonifer est une espèce courante qui appartient à ce groupe (Alexopoulos et al.,1996).

Tous les champignons connus de ce groupe se reproduisent de façon asexuée par des conidies (Redecker et Raab, 2006). Les hyphes sont septés et présentent des pores simples. Cette classe contient la majorité des champignons d'importance médicale tels que les dermatophytes.

Les ascomycètes possèdent des hyphes septés présentant de simples pores qui permettent une migration cytoplasmique et nucléaire. La reproduction sexuée aboutit à la formation d'ascospores endogènes dans un ascus, contrairement à la reproduction asexuée qui aboutit à des conidies. On retrouve dans ce groupe des champignons tels que Pneumocystis jirovecii (Alexopoulos et al.,1996).

Les basidiomycètes possèdent des hyphes septés à pores complexes appelés dolipores, permettant une migration cytoplasmique. Ils produisent sexuellement des spores exogènes appelées basidiospores. On retrouve dans ce groupe des champignons tels que Ustilago maydis, les espèces commensales de l'Homme du genre Malassezia et le pathogène opportuniste de l'Homme Cryptococcus neoformans (Alexopoulos et al., 1996).

I.1.5 Importance des champignons

Les champignons sont d'un grand intérêt pour l'homme dans plusieurs domaines d'activité :

En industrie agroalimentaire, certains champignons, à l'instar de la levure Saccharomyces cereviceae, sont utilisés en fromagerie et en pâtisserie, mais également dans la production de boissons alcooliques par fermentation (Piskur et al., 2006).

En écologie, les champignons saprophytes participent au maintient de l'équilibre écologique en libérant dans l'environnement, à partir de la matière qu'ils décomposent, du carbone et des sels minéraux (Joffin, 2005).

En biotechnologie, les champignons tels que Ashbya gossypii, sont exploités dans la production de vitamines A, B ou D (Santos et al.,2005).

En pharmacie, plusieurs espèces de champignons sont utilisées pour la synthèse de médicaments. Le polysaccharide K, produit chimique dérivé de Trametes versicolor, est utilisé comme adjuvant dans le traitement du cancer (Fisher et Yang, 2002).

En agriculture, les champignons à l'instar de Beauveria bassiana sont utilisés dans la lutte biologique. Ce champignon permet de lutter contre le doryphore dans la culture des pommes de terre ou contre une chenille responsable de la pyrale du maïs (Becker, 1998).

Bien que les champignons soient exploités dans tous ces domaines, plusieurs sont des parasites des plantes, des animaux et de l'homme.

Les champignons envahissent occasionnellement l'air que nous respirons par l'intermédiaire de leurs spores disséminés par le vent. Ces spores sont responsables de certaines allergies et maladies graves. L'aspergillose pulmonaire par exemple, est une maladie de l'appareil respiratoire, causée par inhalation des spores de moisissures du genre Aspergillus ( Kamanfu et al.,1993).

Plusieurs champignons produisent des composés biologiquement actifs, parmi lesquels des mycotoxines. A titre indicatif, les espèces d'Aspergillus, notamment Aspergillus favus, produisent des aflatoxines, toxines du foie qui croissent dans ou sur les graines d'arachides. La consommation de ces graines contaminées conduit à une aspergillose hépatique récurrente dans le tiers-monde (Maslin, 2004).

Certains champignons peuvent causer des maladies graves voir fatales si elles ne sont pas traitées. Les levures du genre Candida, sont responsables du muget chez les nouveaux nés caractérisé par un dépôt blanchâtre sur la langue.

Les champignons s'attaquent également aux plantes et constituent un obstacle considérable pour l'agriculture. Parmi ces champignons phytopathogènes, on peut citer Phytophthora infestans, responsable du mildou des solanacées (Tamokou, 2002).

I.2 Les mycoses

I.2.1Facteurs favorisant les infections fongiques

Les mycoses sont des infections causées par des champignons pathogènes (Feuilhade et al.,2002). La réceptivité des individus aux champignons pathogènes dépend principalement des facteurs extrinsèques et intrinsèques (Böhlen et al.,2001) :

Les facteurs extrinsèques comprennent l'état de santé de l'individu, les conditions d'hygiène et l'abus des médicaments. Certains troubles métaboliques aggravent des infections mycosiques habituellement peu graves et favorisent la dissémination viscérale des champignons pathogènes. Les personnes souffrant d'une déficience immunitaire sont particulièrement susceptibles aux mycoses causées par les champignons des genres Aspergillus, Candida et Cryptococcus (Hube, 2004 ; Brakhage, 2005). La vie en milieux chaud et humide, propice au développement et à la conservation des champignons dans le milieu extérieur, favorise l'infection de l'homme et des animaux. La prise prolongée de certains médicaments peut perturber la flore intestinale et entrainer des formes très graves de mycoses.

Les facteurs intrinsèques font intervenir la spécificité à une espèce animale, la race, l'âge et le sexe. Les souris mâles sont plus sensibles que les femelles à l'infection par Coccidioïdes immitis. Microsporum audouinii qui n'infecte que l'Homme, ne se développe que chez les enfants avant la puberté. Les individus de race blanche sont moins sensibles à la coccidioïdomycose que les sujets de race noire.

I.2.2 Classification

Les mycoses suivent plusieurs modes de classification. Elles peuvent être classées suivant la partie du corps envahie (dermatomycose et onymycose), le syndrome provoqué ( pieds d'athlète ), et le champignon infectieux (aspergillose, candidose).

En fonction de l'affinité de l'agent causal pour un tissu de l'organisme, les mycoses peuvent être réparties en 3 grands groupes (Daniel et Elewski, 2000) :

· Les mycoses superficielles qui se localisent au niveau de l'épiderme et des muqueuses, n'induisent aucune réponse cellulaire de l'hôte, ni aucun changement pathologique. C'est le cas de la malasseziose, causée par une levure lipophile, saprophyte de la peau Malassezia fufur. D'autres mycoses superficielles par contre, induisent des changements pathologiques. Parmi ces mycoses, on peut citer les dermatophytoses où la présence du dermatophyte et ses produits métaboliques induisent généralement une allergie et une réponse inflammatoire chez l'hôte (Feuilhade et al.,2002).

· Les mycoses sous-cutanées sont des infections chroniques localisées de la peau et des tissus sous-cutanés. La sporotrichose à titre d'exemple, mycose sous-cutanée due à l'implantation dans la peau ou quelques fois à l'inhalation de Sporothrix schenckii, affecte le tissu conjonctif et les voies lymphatiques (Aubry, 2002).

· Les mycoses profondes ou systémiques sont des infections fongiques du corps. Elles peuvent être opportunistes ou dimorphiques. Les mycoses systémiques opportunistes sont causées par des champignons (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) qui n'expriment leur pouvoir pathogène qu'en présence de facteurs de risques. Les mycoses systémiques dimorphiques sont causées par des champignons pathogènes dimorphiques (Histoplasma capsulatum var. duboisii), qui peuvent pénétrer les défenses physiologiques et cellulaires d'un hôte normal en changeant leur morphologie (Aubry, 2002 ; Sangaré et al.,2008). Les mycoses systémiques surviennent généralement chez les patients immunodéprimés (Aubry, 2002).

I.3 Les dermatophytes et les dermatophytoses

I.3.1 Les dermatophytes

Les dermatophytes sont des champignons microscopiques filamenteux qui attaquent avec prédilection les structures kératinisées chez l'homme et les animaux (Feuilhade et al., 2002).

Les dermatophytes sont classés en trois genres d'importance inégale, définis d'après les caractéristiques morphologiques des éléments de reproduction rencontrés en culture (Baran et al., 2001):

· Le genre Epidermophyton qui est caractérisé par une absence de microconidies et des macroconidies en forme de massues et à parois minces.

· Le genre Microsporum qui est caractérisé par des microconidies piriformes et des macroconidies en fuseau et à parois épaisses. Les espèces de ce genre attaquent la peau, les poils et les cheveux.

· Le genre Trichophyton caractérisé par des microconidies rondes ou piriformes. Les macroconidies ont des parois minces et lisses, à bouts arrondis. Les espèces de ce genre attaquent la peau, les ongles, les poils et les cheveux.

Sur la base de leurs habitats naturels et de leurs hôtes préférentiels, on distingue trois espèces de dermatophytes (Feuilhade et al.,2002):

· Les espèces anthropophiles, parasites humains exclusifs, se transmettent soit directement par contact interhumain, soit indirectement par le linge ou les vêtements. Trichophyton tonsurans en est un exemple (Maleska et Ratka,1998).

· Les espèces zoophiles telles que Microsporum canis, se transmettent à l'homme par le contact d'un animal contaminé ou par l'intermédiaire de ses poils parasités.

· Les espèces géophiles telles que Microsporum gypseum , qui se retrouvent dans le sol, sont rarement impliquées en pathologie humaine. Toutefois, certaines espèces zoophiles comme Trichophyton mentagrophytes, sont souvent retrouvées dans le sol.

Les dermatophytes causent des maladies dont la propagation est associée à leurs structures. Ainsi, les espèces dont la sporulation est faible se révèlent très contagieuses ; ceci dû au fait qu'elles possèdent des formes de résistances (chlamydospores et arthospores) attachées extérieurement aux extrémités des cheveux ou à des squames de la peau. Ces dermatophytes sont majoritairement des espèces anthropophiles (Weitzman et Summerbell, 1995). En général, plus l'infection est chronique et l'agent pathogène adapté à l'hôte, moins sévère est la réponse inflammatoire (Böhlen et al., 2001). De même, les espèces zoophiles et géophiles ont tendance à produire des lésions qui sont plus inflammatoires que celles des espèces anthropophiles mais qui se résorbent facilement (Feuilhade et al., 2002).

Le parasitisme des dermatophytes débute par l'adhérence d'une spore qui germe. Les filaments produits vont progresser de façon centrifuge et pénétrer dans la couche cornée grâce aux enzymes protéolytiques, créant ainsi une lésion arrondie érythématosquameuse où le champignon est actif sur le pourtour. Dans le poil et le cheveu, l'envahissement du dermatophyte se fait à partir de l'ostrium folliculaire, avec une propagation descendante vers le bulbe.

Dans les ongles, le dermatophyte pénètre généralement par le bord libre et progresse en direction de la matrice sans la détruire (Feuilhade et al., 2002).

c) Caractéristiques macroscopiques et microscopiques des dermatophytes étudiés

Microsporum gypseum est un dermatophyte géophile qui cause chez l'animal des herpès circinées. Chez l'enfant, il cause des kérions du cuir chevelu, et chez l'adulte, des kérions de la barbe. Sur milieu de Sabouraud dextrose agar, la culture de M. gypseum est granuleuse, légèrement plâtreuse, avec une teinte chamois. Le verso de la boîte de Pétri est identique. L'aspect microscopique, présente peu de filaments qui sont généralement cachés dans l'abondance des macroconidies. Les macroconidies sont de petites taille (30-60 um × 8-12 um), en forme de cocon à cloisons minces et parois échinulées. Certaines souches montrent des microconidies.

Photographie 1:aspects a) macroscopique b) microscopique de Microsporum gypseum (Ellis, 2006)

Trichophyton equinum est un dermatophyte zoophile, de forme sexuée inconnue qui provoque chez l'animal des teignes tondantes avec de nombreuses plaques d'alopécies, et chez l'homme des herpès circinés, folliculites et kérions. La culture de T. equinum est lente, a un aspect duveteux. Le verso est jaune acajou. Les microconidies sont piriformes et en grappe. Les macroconidies sont de formes variées, ont une paroi lisse et mince avec plusieurs cloisons (1- 10), et ont des cloisons variant de 10- 85 um sur 4 - 15 um.

Photographie 2:aspects a) macroscopique b) microscopique de Trichophyton equinum (Ellis, 2006)

Trichophyton mentagrophytes est responsable de 90% de dermatophytoses chroniques (Ikuta et al.,1997). Il est par ailleurs responsable des teignes inflammatoires et des kérions du cuir chevelu chez la femme et l'enfant. Chez l'homme, il cause des kérions de la barbe. Il s'agit d'un dermatophyte géophile. La culture sur milieu de Sabouraud dextrose agar diffère selon les variétés. On observe des filaments articulés avec des branchements à angles droits sur lesquels se greffent de nombreuses microconidies rondes et parfois allongées. Les macroconidies, lorsqu'elles sont présentent, ont des parois minces.

Photographie 3:aspects a) macroscopique b) microscopique de Trichophyton mentagrophytes (Ellis, 2006)

Trichophyton terrestre est un dermatophyte présent dans le sol et le pelage des animaux. Sur milieu de Sabouraud dextrose agar, les cultures de T. terrestre sont planes, poudreuses, rapides et extensives, devenant un peu duveteuses en périphérie. Les microconidies sont nombreuses et piriformes. Les macroconidies sont lisses, allongées avec 4-8 logets.

Photographie 4:aspects a) macroscopique et b) microscopique de Trichophyton terrestre (Ellis, 2006)

I.3.2 Les dermatophytoses

Les dermatophytoses sont des infections causées par des champignons filamenteux, à mycélium cloisonné, appartenant aux trois genres Microsporum, Epidermophyton et Trichophyton (Feuilhade et al., 2002). Elles peuvent affecter le scalp, la barbe, la bouche, les ongles, les pieds. Elles se caractérisent par des affections variant des inflammations moyennes aux réactions vésiculaires aiguës.

· Diagnostic : prélèvement, isolement et identification des dermatophytes

Le diagnostic des dermatophytoses n'est pas toujours évident cliniquement. Devant une lésion évoquant une dermatophytose, un examen mycologique s'impose. Pour obtenir des résultats fiables, le biologiste doit surmonter plusieurs niveaux d'obstacles : la réalisation du prélèvement selon le type de lésion, l'examen direct des différents produits biologiques ainsi que leur mise en culture, l'identification des champignons isolés et l'interprétation des résultats (Chabasse et Pihet, 2008).

L'examen direct repose sur la recherche du dermatophyte à partir d'un prélèvement local de squames, ongles, cheveux, etc. La culture est réalisée sur milieu gélosé supplémenté aux antibiotiques (Boiron, 2005). L'identification, qui se fait entre le 3^ème et le 10^ème jour après la mise en culture, est basée sur l'observation des caractéristiques morphoculturales (couleur, diamètre des colonies), biochimiques (ADN et ARN) et physiologiques du dermatophyte (Patterson et Bridge, 1994).

II Traitement des mycoses et perspectives offertes par les plantes

Le traitement des dermatophytoses, qui se fait par des antifongiques administrés soit par voie orale, soit par application cutanée est généralement de longue durée. Le traitement est généralement double. Il est général par administration d'un antifongique (très souvent la griséofulvine per os à la dose 15- 20 mg/kg/j), en association avec une application locale d'un antifongique pendant au moins six mois (Hamoir et al.,2001).

II.1 Les antifongiques de synthèse utilisés dans le traitement des mycoses

En fonction de leurs structures chimiques, on distingue plusieurs classes d'antifongiques de synthèse (Hamoir et al., 2001).

II.1.1 Les azoles

Les azoles (ketonazole, fluconazole) sont des substances synthétiques qui dérivent soit de l'imidazole, soit du triazole (Colanceska-Ragenivic et al.,2001). Ces substances modulent la synthèse de l'ergostérol, biorégulateur de la fluidité et de la symétrie membranaire (Boiron, 2005), en interagissant avec la lanostérol 14-á-déméthylase qui forme un complexe avec le cytochrome P-450. L'inhibition de cette enzyme induit un changement de la fluidité membranaire, puis une diminution de la croissance de la cellule fongique, et la mort de celle-ci. Mais, une inhibition croisée du système cytochrome P-450 de l'hôte peut faire apparaître des effets secondaires tels que la perturbation du métabolisme des molécules endogènes et exogènes (Hamoir et al.,2001). Les champignons résistent aux azoles soit par modification de la qualité et la quantité de la 14-á-déméthylase qui est l'enzyme cible (Sanglard et Odds, 2002) soit par diminution de la concentration intracellulaire d'ergostérol par un système de pompe à efflux (Ghannoum et Rice, 1999).

II.1.2 Les polyènes

Cette classe d'antifongiques renferme notamment l'Amphotéricine B et la nystatine qui sont d'origine bactérienne. Ils possèdent une grande affinité pour l'ergostérol et provoquent la formation de pores aqueux qui altèrent la perméabilité la membrane fongique, ce qui aboutit à une fuite du matériel intracellulaire et la mort de la cellule fongique (Ghannoum et Rice, 1999). Les polyènes sont relativement actifs contre les levures, certains champignons filamenteux , mais, sont réputés moins efficaces contre les dermatophytes (Hamoir et al., 2001).

L'Amphotéricine B, dont le spectre d'action inclut Candida, Aspergillus, est utilisée dans le traitement des mycoses profondes. Malgré sa néphrotoxicité, l'Amphotéricine B est un outil thérapeutique de choix pour le traitement de certaines mycoses profondes (Hamoir et al.,2001). La résistance aux polyènes serait due aux modifications de l'ergostérol membranaire ayant une faible affinité avec les polyènes, et une diminution de l'ergostérol cellulaire qui entrainerait une baisse de la sensibilité des cellules fongiques aux polyènes (Ghannoun et Rice, 1999).

II.1.3 Les pyrimidines

La classe des pyrimidines comprend la Flucytosine ou 5-Fluorocytosine (5-FC). Cet antifongique présente une activité inhibitrice contre les levures (Candida et Cryptococcus). La Flucytosine interfère avec le métabolisme des pyrimidines de l'ARN et la synthèse protéique de la cellule fongique. Elle y pénètre à l'aide d'une perméase, puis est convertie en 5- Fluorouracyl (5-FU) par la cytosine déaminase. La 5-FU est à son tour convertie en acide 5-Fluorourydilique par l'UMP pyrophosphorylase. Tout ce mécanisme aboutit à l'arrêt de la synthèse protéique. La résistance à la 5-FC serait due au blocage de la formation de l'acide 5-Fluorourydilique par perte de l'activité de la cytosine déaminase (Ghannoun et Rice, 1999).

II.1.4 Les allylamines

Cette classe d'antifongiques possède un spectre d'action relativement large qui englobe les espèces de Trichophyton, Microsporum, mais aussi certains Aspergillus, Candida albicans et cryptococcus neoformans (Hamoir et al.,2001). On retrouve dans ce groupe des antifongiques tels que la terbinafine et la naftifine. Les allylamines inhibent la squalène époxydase, enzyme de la conversion du squalène en squalène-2,3-epoxide, première étape de la biosynthèse de l'ergostérol, ce qui provoque une accumulation intracellulaire du squalène (Ryder et Favre, 1997). Un taux élevé de squalène peut augmenter la perméabilité membranaire et désorganiser la cellule fongique (Ghannoum et Rice, 1999). Contrairement à la 14-á-déméthylase, la squalène époxydase n'est pas liée au système cytochrome P-450. Les allylamines ne perturbent donc pas le métabolisme des molécules endogènes et exogènes de l'hôte (Hamoir et al.,2001). La résistance aux allylamines n'a pas encore été rencontrée chez les champignons pathogènes de l'Homme (Ghannoum et Rice, 1999).

II.1.5 Les échinocandines

Les échinocandines (caspofongine) agissent comme inhibiteurs non compétitifs de la â(1,3)-D-glucane synthase, enzyme responsable de synthèse du â(1,3)-D-glucane, constituant important de la paroi des champignons. De cette inhibition, résultent des changements cytologiques et structuraux tels que l'épaississement de la paroi fongique et l'absence de bourgeonnement. Les échinocandines ont une activité fongicide in vitro et in vivo contre les espèces de Candida et Aspergillus. La résistance aux échinocandines pourrait être due à une mutation du gène codant pour l'une des sous-unités de la â(1,3)-D-glucane synthase (Letscher-Bru et Herbrecht, 2003).

Il existe d'autres antifongiques qui interviennent dans le traitement des dermatophytoses, notamment la griséofulvine. C'est un antifongique isolé de Penicillium griseofulvum qui inhibe la division cellulaire des champignons par désorganisation du fuseau mitotique, bloquant ainsi le processus en métaphase (Hamoir et al.,2001). La griséofulvine a un effet fongistatique contre les dermatophytes, est peu onéreuse et présente généralement peu d'effets secondaires (troubles gastrointestinaux, neurotoxiques) bien que certains adultes la tolèrent mal (Feuilhade et al., 2002).

II.2 Les perspectives offertes par les plantes médicinales

Malgré les progrès en chimie de synthèse, les plantes restent une source importante de composés pharmaceutiques (Zhang et Björn, 2009). Environ 80% de la population mondiale ont recours aux plantes pour des soins de santé primaires, et il est estimé à environ 25% les prescriptions médicales dérivées directement ou indirectement des plantes (Fowler, 2006). La recherche de nouveaux principes actifs menée par les laboratoires universitaires a déjà permis d'expliquer certaines utilisations traditionnelles (Kuiate et al.,2006 ; Kuete et al.,2008 ; Tamokou et al.,2009^a; Tamokou et al.,2009^b; Tene et al.,2009). Ces travaux font ressortir une grande diversité de structures chimiques ayant des activités antimicrobiennes potentielles.

II.2.1 Les principaux groupes de composés phytochimiques antimicrobiens

Les principaux groupes de métabolites secondaires rencontrés dans les plantes et qui possèdent généralement une activité antimicrobienne sont : les composés phénoliques, les alcaloïdes, les terpénoïdes et stéroïdes.

Les composés phénoliques et les polyphénols constituent le plus vaste groupe de métabolites secondaires retrouvé dans les plantes. On distingue comme principaux composés phénoliques : les phénols simples et les acides phénoliques, les flavonoïdes, les coumarines, les quinones, les saponines et les tannins (Robbers et al., 1996).

Les phénols simples et les acides phénoliques sont les plus simples composés phytochimiques qui consistent en un seul noyau aromatique substitué (Cowan, 1999). Les phénols simples et les acides phénoliques possèdent des activités antivirale, antibactérienne et antifongique (Brantner et al., 1996). L'acide caféique et le catéchol, contenus dans le thym et le piment de Bethel respectivement, sont responsables des propriétés antimicrobiennes de ces plantes (Cowan, 1999). Leur mécanisme d'action n'est pas bien connu, mais, il pourrait inclure une inhibition enzymatique, probablement à travers une réaction avec les groupes sulfhydriles ou des interactions non-spécifiques avec les protéines. De plus, le nombre et la position des groupements hydroxyles sur le noyau aromatique pourrait être en relation avec leur toxicité relative sur les microorganismes (Cowan, 1999).

Les quinones sont des molécules très réactives, à noyaux aromatiques, avec deux substitutions cétoniques (Cowan, 1999). Les quinones sont des composés qui régénèrent des radicaux libres et par conséquent, se complexent irréversiblement aux acides aminés nucléophiles des protéines (Stern et al., 1996). Les quinones sont ubiquitaires et possèdent généralement des propriétés antimicrobiennes (Kazmi et al., 1997). Leurs principales cibles dans la cellule microbienne sont les adhésines, les polypeptides et les enzymes membranaires. Aljabre et al.(2005) ont décrit le thymoquinone isolé de l'extrait de Nigella sativa comme responsable des propriétés antidermatophytiques de cette plante vis-à-vis de Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton flococcum et Microsporum canis. L'hypéricine , un anthraquinone isolé de Hypericum perforatum, possède également des propriétés antifongiques (Cowan, 1999).

Les flavonoïdes sont des composés phénoliques qui possèdent une unité C6-C3 liée à un noyau aromatique (Zhang et Björn, 2009). Etant donné que les flavonoïdes sont synthétisés par les plantes suite à une infection microbienne, il n'est donc pas surprenant qu'ils possèdent des propriétés antimicrobiennes (Cowan, 1999). La catéchine, flavonoïde isolée du thé vert, est douée de propriétés antimicrobiennes (Cowan, 1999). Prasad et al.(2004) ont décrit la 4'-méthoxyflavone extraite de Psoralea corylifolia comme possédant des propriétés antidermatophytiques contre Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Microsporum gypseum et Epidermophyton flococcum. Leur activité est probablement due à leur capacité de se complexer aux protéines extracellulaires et solubles. Mais, les flavonoïdes à caractère lipophile peuvent détruire les membranes microbiennes en augmentant la fluidité des lipides membranaires (Prasad et al., 2004).

Le terme « Tannin » décrit en général un groupe de composés phénoliques polymériques capables de tanner le cuir ou de précipiter la gélatine (Cowan, 1999). Plusieurs activités physiologiques humaines et une large variété d'actions anti-infectives sont attribuées aux tannins (Haslani, 1996). Les tannins possèderaient une activité toxique contre les champignons filamenteux, les levures et les bactéries (Scalbert, 1991). Souza et al.(2008) ont montré que les tannins isolés de l'écorce de Mimosa tenuifloria seraient responsables de l'activité de cette plante contre les dermatophytes Microsporum canis, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes et Trichophyton rubrum. L'activité antimicrobienne des tannins serait due à leur capacité à se complexer aux protéines de transport (Stern et al., 1996).

Les coumarines sont des composés phénoliques constitués d'un benzène et des noyaux á-pyrènes (Cowan, 1999). Les coumarines possèdent des propriétés physiologiques et antimicrobiennes (Fernandez et al., 1996). La warfarine est une coumarine utilisée comme anticoagulant qui possèderait également des propriétés antivirales (Cowan, 1999). De même, les coumarines présentes dans la plante Galium odoratum, seraient responsables de l'activité antibactérienne et antifongique de cette plante (Hambeuger et Hostettmann, 1991).

Les saponines sont des métabolites secondaires constitués d'un noyau glucidique attaché à un aglycone. Suivant la structure de l'aglycone, on distingue deux types de saponines : le type triterpénoïde tétracyclique et le type triterpénoïde pentacyclique. Les saponines sont présents dans plusieurs espèces végétales et sont doués de propriétés antimicrobiennes. A titre illustratif, on peut citer les saponines contenus dans les racines du ginseng (Panax notoginseng) actifs contre les espèces de Trichophyton (Cowan, 1999). De même, le 3-O-(4-acétyl-â-D-xylopyranosyl)-(1?3)-á-L-rhamnopyranosyl-(1?2)-á-L-arabinopyranosyl-hederagenine, saponine isolé de la fraction hydroalcoolique du péricarpe de Sapindus saponaria possède une activité antifongique importante contre Candida parapsilosis (Tsuzuki et al.,2007).

3-O-(4-acétyl-â-D-xylopyranosyl)-(1?3)-á-L-rhamnopyranosyl-(1?2)-á-L-arabinopyranosyl-hederagenine (Tsuzuki et al.,2007)

Les alcaloïdes sont des composés organiques azotés de faibles poids moléculaires. Ils possèdent des structures hétérocycliques et se retrouvent dans environ 20% de toutes les espèces de plantes (Zhang et Björn, 2009). Les alcaloïdes sont connus comme doués de propriétés antimicrobiennes (Faizi et al., 2003). Ainsi, la berbérine isolée de Hydrastis canadensis, est un important représentant des alcaloïdes. Il est potentiellement actif contre les trypanosomes et les plasmodiums (Freiburghaus et al.,1996). Le mécanisme d'action des alcaloïdes est attribué à leur capacité à s'intercaler avec l'ADN.

Les terpènes constituent un groupe de composés dont la structure de base est une unité isoprénique. Lorsque le composé contient un autre élément (généralement l'oxygène), on parle de terpénoïde. Les terpénoïdes sont connus comme doués de propriétés antifongiques (Rana et al., 1997) et antibactériennes (Amarel et al., 1998). A titre illustratif, la buteline et l'acide 12-oxohardwickique isolés de l'écorçe de Croton macrostachys, ont montré des activités antifongiques et antibactériennes (Tene et al.,2009). Le mécanisme des terpénoïdes n'est pas bien connu mais, il pourrait induire une destruction de la membrane du microorganisme par une action lipophilique (Cowan, 1999). Les terpénoïdes sont les plus représentés dans la constitution chimique des huiles essentielles (Brunetton, 1999).

II.3 Méthodes d'évaluation de l'activité antidermatophytique

Pour une analyse scientifique des extraits de plantes, différentes méthodes d'évaluation de l'efficacité de celles-ci sont utilisées.

II.3.1 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

Plusieurs méthodes permettent d'évaluer l'activité antidermatophytique in vitro. Cette évaluation peut se faire avec des substances pures (Afolayan et Meyer, 1996) ou des extraits bruts (Freiburghaus et al., 1996). Les principales méthodes généralement utilisées sont : la méthode d'incorporation en milieu solide et la méthode de dilution en milieu liquide (Cowan, 1999).

La substance à tester est incorporée au milieu de culture en surfusion, puis l'homogénat est coulé dans une boite de Pétri ou dans des puits d'une plaque de macrotitration. Après gélification, un explant fongique (mycélium, spores) y est ensemencé. Pendant toute la durée de l'incubation, le diamètre de la croissance des champignons est mesuré (Kuiate, 2005). Cette méthode est généralement utilisée pour des substances hydrophobes (Rios et al., 1998).

La méthode de dilution en milieu liquide est généralement utilisée pour la détermination des concentrations minimales inhibitrices. Dans le milieu de culture, des volumes d'extraits sont introduits pour des concentrations précises. Un même volume d'homogénat obtenu est ensuite coulé dans des puits. L'inoculum y est ensuite ajouté. Après incubation, la CMI est déterminée soit par colorimétrie (Eloff, 1998) ou par observation de la turbidité (Santos et Hamdan, 2005).

II.3.2 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo

L'utilisation du modèle expérimental animal constitue une étape importante en pharmacologie moderne. Cette étape apporte des informations indispensables pour le traitement de certaines infections. En effet, elle permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques prédictifs de l'activité in vivo. L'étude in vivo aide également à donner des recommandations sur les modalités optimales d'administration chez l'homme.

Pendant plusieurs années, des infections dermatophytiques expérimentales ont été produites sur la peau de l'homme et des animaux avec des succès variés (Knight, 1972). Plusieurs techniques ont été utilisées, mais quelques ont été standardisées pour les cochons d'Inde expérimentaux (Greenberg et al.,1976). Ces procédures permettent une observation directe du développement des lésions chez les individus vierges et ceux ayant subi une première infection. Elles donnent également une idée du nombre de spores nécessaire pour initier une infection. Le meilleur model expérimental pour l'induction des dermatophytoses est le cochon d'Inde (Cavia porcellus). Cette position remarquable occupée par cet animal est due au fait qu'il est facilement manipulable et susceptible à une grande variété de maladies infectieuses qui attaquent l'Homme et les animaux (Harkness et Wagner, 1989).

II.3.3 Les facteurs qui influencent l'activité antimicrobienne

Plusieurs facteurs influencent de façon significative l'activité antimicrobienne in vitro (Jawetz et al.,1973):

· Le pH de l'environnement : certains agents antimicrobiens sont plus actifs à pH acide.

· Les composantes du milieu : les sels peuvent inhiber fortement l'activité antimicrobienne.

· Etendue de l'inoculum : en général, plus l'inoculum est grand plus la sensitivité du microorganisme est faible.

· Durée d'incubation : plus l'incubation persiste, plus il y'a de fortes chances que des souches mutantes résistantes émergent ou que les membres les moins susceptibles de la population microbienne commencent à se multiplier à mesure que l'agent antimicrobien se détériore.

· Stabilité de l'agent antimicrobien : à température d'incubation, plusieurs agents antimicrobiens perdent leur activité.

Le problème de l'activité des agents antimicrobiens in vivo est beaucoup plus complexe qu'in vitro. Il implique non seulement l'agent antimicrobien et le parasite, mais aussi l'hôte (Jawetz et al.,1973):

· La distribution de l'agent antimicrobien : dans l'organisme, l'agent se distribue inégalement dans les liquides et tissus.

· La concentration de l'inoculum: in vitro, les microorganismes sont exposés à des concentrations invariables d'inoculum, dans le corps il en est autrement. Suite à l'absorption, l'agent antimicrobien peut être inactivé ou éliminé. Par conséquent son taux disponible dans le corps est soumis à des fluctuations constantes.

· Substances interférentes : l'agent antimicrobien peut se lier à des protéines sanguines et tissulaires ou à des lipides.

II.4 Généralités sur les plantes étudiées

II.4.1 Acalypha manniana

Acalypha manniana Müll Arg. est une herbe forestière de la classe des dicotylédones et de la famille des Euphorbiacées. Elle possède des tiges cylindriques à la base de l'axe principal. Les feuilles, d'environ 1,5 - 4 cm de long et 1- 2,5 cm de large, sont de forme ovale, graduellement troncaturées à leur base, grossièrement dentées, membraneuses, peu velues de chaque face et portant 5 - 6 nervures latérales de chaque côté. Le pétiole, d'1,5 - 4 cm de long, est mince. Les fleurs sont rares et lorsqu'elles sont présentes, sont rosâtres et monoïques. Le genre Acalypha comprend environ 460 espèces et se localise dans les tropiques et les régions chaudes, excluant l'Europe. Au Cameroun, on retrouve surtout Acalypha manniana à Buea, Manfé et Yaoundé (Schmelzer et al., 2008).

Acalypha manniana est utilisée en médecine traditionnelle à l'Ouest Cameroun pour soigner les mycoses. Au Ghana, en Ouganda, au Rwanda et au Burundi elle est utilisée comme antidiarrhéique (Schmelzer et al., 2008). A notre connaissance, Acalypha manniana n'a pas encore fait l'objet d'études antimicrobiennes et chimiques.

II.4.2 Tristemma hirtum

Tristemma hirtum P. Beauv. est un arbuste forestier d'environ 1,25 m de haut, appartenant à la famille des Mélastomatacées. Les tiges sont angulées (4 côtés) et les feuilles, d'environ 16 cm de long et 7,5 cm de large, ont une base légèrement atténuées, sont recouvertes de petits poils sur chaque face et sont légèrement dentées. Les nervures, au nombre de 5-7, sont protubérantes en dessous de la feuille. Le pédoncule a une longueur inférieure à 5 mm. Le pétiole, de plus de 2,5 cm de long, a une inflorescence terminale. La couleur des fleurs varie de lilac à rouge.

Tristemma hirtum croît dans des zones marécageuses et humides du Sénégal, de l'Ouest Cameroun, au Nigéria, au Congo démocratique, au Libéria et en Côte d'Ivoire. Dans ce dernier pays, cette plante est utilisée comme emménagogue et ses fruits y sont également consommés (Parmentier et Geerinck, 2003). A l'Ouest Cameroun, cette plante est utilisée en association avec d'autres plantes pour le traitement de la fièvre typhique, pour soigner les hémorroïdes, pour des problèmes de reproduction et pour des maladies de la peau. A notre connaissance, Tristemma hirtum n'a pas encore fait l'objet d'études chimiques et antimicrobiennes.

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

I Matériel

I.1 Matériel végétal

Cinq kilogrammes de feuilles d'Acalypha manniana et de tiges et feuilles de Tristemma hirtum ont été récoltés dans la ville de Dschang au mois de Février. Ces plantes ont été identifiées à l'Herbier Nationale du Cameroun (Yaoundé) par comparaison aux échantillons authentiques de codes 18223/SRF/CAM et 12725/HNC respectivement.

I.2 Matériel animal

Trente cochons d'Inde mâles de deux mois d'âge, de poids corporels compris entre 400 g et 450 g, ont été répartis à raison d'un animal par cage pour l'évaluation de l'activité antidermatophytique in vivo.

I.3 Microorganismes et milieux de culture

Les dermatophytes utilisés dans cette étude proviennent du Laboratoire de Microbiologie et des Substances Antimicrobiennes (LAMSA) de l'Université de Dschang. Les souches de dermatophytes étudiés sont Trichophyton mentagrophytes (E1425), Trichophyton terrestre (E1501), Microsporum gypseum (E1420) et un isolat Trichophyton equinum. L'entretien des dermatophytes et l'évaluation des activités antidermatophytiques ont été effectués avec les milieux Sabouraud dextrose agar (SDA) et le bouillon de Sabouraud dextrose (SDB, Conda, Madrid).

II Méthodes

Afin de guider le choix des plantes, une enquête a été effectuée dans la ville de Dschang et ses environs (Annexe III). Suite à cette enquête, à l'identification et à une étude bibliographique, des échantillons de plantes ont été récoltés et séchés avant extraction.

II.1 Extraction et partitionnement

Les tiges et feuilles de Tristemma hirtum d'une part, et les feuilles d'Acalypha manniana d'autre part, ont été découpées et séchées à l'abri de la lumière, à température ambiante pendant environ 5 jours puis réduites en poudre. Un kilogramme de poudre de chaque plante a été macéré dans 4 L de méthanol pendant 3 jours. Le mélange était remué deux fois par jour . Le macérât a ensuite été filtré à l'aide du papier Watmann N°3, puis le solvant des filtrats a été évaporé à 65°C à l'aide d'un évaporateur rotatif (BÜCHI R-200/205). Deux extractions ont été effectuées pour chaque échantillon et le rendement d'extraction a été calculé par rapport à la masse du matériel végétal sec.

Les extraits de plantes ont été épuisés successivement à l'hexane et à l'acétate d'éthyle comme suit. Cent grammes d'extrait au méthanol ont été dissouts dans 1litre d'hexane. La phase supérieure hexanique a ensuite été récupérée après 2h de repos par décantation et l'hexane a été évaporé à 70°C. Le résidu a une fois de plus été dissout dans 1 litre d'acétate d'éthyle, puis, le mélange a été laissé au repos pendant 2 heures. La phase supérieure à l'acétate d'éthyle a ensuite été récupérée par décantation, puis son solvant évaporé à 78°C. Toutes les fractions obtenues (hexanique, à l'acétate d'éthyle et résiduelle) ont été séchées à l'étuve à 40°C pour évaporation complète des solvants et le rendement d'extraction a été déterminé par rapport à la masse d'extrait brut.

II.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

Les principaux groupes de substances antimicrobiennes ont été recherchés dans les différents extraits et fractions par les méthodes standards décrites par Brunetton (1999).

II.2.1 Les flavonoïdes : test de Shinoda

L'extrait/fraction (0,1 g) a été dissout dans 3 ml de méthanol. 0,05 g de copeau de magnésium et 4 gouttes d'acide sulfurique y ont ensuite été ajoutés. Le développement de la couleur orange a indiqué la présence des flavonoïdes.

II.2.2 Les alcaloïdes :test de Mayer

Cent milligrammes d'extrait/fraction ont été introduits dans un tube à essai contenant 3 ml d'acide sulfurique 1%. L'ensemble a été porté à ébullition au bain-marie (100°C) pendant 5 min. Après refroidissement et filtration, 5 gouttes de réactif de Meyer ont été ajoutées. La formation d'un précipité blanc a indiqué la présence des alcaloïdes.

II.2.3 Les triterpènes et les stéroïdes : test de Liebermann-Burchard

Cent milligrammes d'extrait/fraction ont été dissouts dans 3 ml de chloroforme et 4 gouttes d'anhydride acétique et d'acide sulfurique concentré y ont été ajoutées. La formation d'une phase supérieure rouge-violacé a indiqué la présence des triterpènes, alors que le développement d'une coloration bleue à l'interface a indiqué la présence des stéroïdes.

II.2.4 Test des composés phénoliques

L'extrait/fraction (0,1 g) a été dissout dans 3 ml d'éthanol et 5 gouttes de FeCl₃ y ont été ajoutées. Le développement de la coloration verdâtre a indiqué la présence des phénols. La présence des composés phénoliques a été marquée par l'apparition de la coloration bleue-verdâtre.

II.2.5 Test des saponines

Cent milligrammes d'extrait/fraction ont été introduit dans un tube à essai contenant 5 ml d'eau et l'ensemble a été chauffé pendant 5 min. Après refroidissement et filtration, 10 ml de filtrat ont été introduits dans un second tube à essai et agités pendant 1 min. Après 15min de repos, l'épaisseur de la mousse a été mesurée à l'aide d'une règle graduée. Une hauteur de mousse d'au moins un centimètre a indiqué la présence des saponines.

II.2.6 Test des tannins

Cent milligrammes d'extrait/fraction ont été dissouts dans 5 ml d'eau distillée et la solution a été chauffée pendant 5 min. Après refroidissement et filtration, 4 gouttes de chlorure de fer 0,5% ont été ajoutés à 2 ml de filtrat. La présence des tannins a été indiquée par la formation d'un précipité bleu.

II.2.7 Test des anthraquinones

L'extrait/fraction (0,1 g) a été ajouté à 4 ml du mélange éther-chloroforme (1:1 v/v). La solution ainsi obtenue a été traitée avec 4 ml de soude 10% et l'apparition d'une coloration rouge a indiquée la présence des anthraquinones.

II.2. 8 Test des anthocyanines

L'extrait/fraction (0,1 g) a été ajouté à 5 ml d'une solution d'acide sulfurique 1%. L'apparition d'une coloration orange a montré la présence des anthocyanines.

II.2.9 Test des coumarines

Cent milligrammes d'extrait/ fraction ont été dissouts dans 3 ml de méthanol contenu dans un tube à essais, puis le tube a été recouvert d'un morceau de papier imbibé d'une solution de soude 10%. L'absence de la fluorescence jaune-vert à l'UV (254 nm) a révélé l'absence des coumarines.

II.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

II.3.1 Evaluation de l'effet des extraits et fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes

Le front de croissance d'une culture de dermatophyte âgée de 10 jours a été inondé avec 10 ml d'eau physiologique stérile (NaCl 0,9%). Après agitation et filtration, 1 ml de la suspension obtenue a été répandu sur la surface du milieu Sabouraud dextrose agar (SDA) préalablement coulé et gélifié dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre intérieur. Les boîtes de Pétri ont ensuite été incubées pendant 10 jours à 30°C (Kuiate et al.,2006).

L'extrait/fraction (0,08 g) a été dissout dans 500 ul de diméthylsulfoxide (DMSO), puis le volume de la suspension a été complété à 5 ml avec de l'eau distillée stérile pour une concentration finale de 16 mg/ml. A partir de cette solution mère des dilutions successives en série de 2 ont été effectuées pour obtenir des concentrations tests comprises allant de 8 à 0,25 mg/ml (Tableau 1).

Tableau 1: protocole de préparation des différentes concentrations d'extraits et fractions testées

L'évaluation de l'inhibition de la croissance radiale mycélienne a été réalisée par la méthode d'incorporation en milieu solide (Kuiate et al., 2006). A cet effet, nous avons utilisé des plaques de 24 puits (NUNC^®). Nous avons introduit 1,5 ml de SDA supplémenté à différentes concentrations d'extrait/fraction dans chaque puit. Trois essais ont été réalisés pour chaque concentration. Après gélification du milieu, chaque puit a été inoculé en son centre à l'aide d'un explant (2 mm de diamètre intérieur) prélevé du front de croissance d'une culture âgée de 10 jours. Les plaques ont ensuite été recouvertes et incubées à 30°C pendant 7 jours. La croissance radiale mycélienne des dermatophytes a été mesurée chaque jour, à la même heure, à l'aide d'une règle graduée, dans deux directions perpendiculaires passant par le centre de l'explant et ôtée du diamètre de l'explant. A partir de ces mesures, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale mycélienne de chaque dermatophyte par l'extrait/fraction ont été calculés en utilisant la formule :

Les explants dont la croissance a été totalement inhibée ont été prélevés et ensemencés sur un autre milieu non supplémenté en extraits ou fractions, puis incubés pendant 7 jours à 30°C pour déterminer si la substance est fongicide ou fongistatique (Thompson, 1989).

II.3.2 Détermination des Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF)

Les CMI et CMF ont été déterminées par la méthode de microdilution en milieu liquide, dans des plaques de microtitration de 96 puits (Santos et Hamdan, 2005).

Les suspensions de spores ont été préparées à partir de cultures âgées de 10 jours, incubées à 30°C sur milieu SDA. Les colonies fongiques ont été immergées avec 5ml d'eau physiologique stérile et la surface de culture a été grattée doucement à l'aide d'une anse stérile. La suspension obtenue a ensuite été filtrée à l'aide d'un papier filtre qui retient les fragments de mycélium et laisse passer les spores. Des dilutions successives ont permis d'ajuster le nombre de spores à environ 10⁴UFC/ml.

L'extrait/ fraction (16,4 mg) a été dissout dans 400ul de diméthylsulfoxide, puis le volume de la solution a été complété à 2 ml pour une concentration finale d'extrait/fraction de 8192 ug/ ml.

Des dilutions en série de deux des solutions d'extraits et fractions ont été effectuées dans chaque puit. Pour se faire, 100 ul de bouillon de Sabouraud dextrose (SDB) supplémenté à un extrait/fraction (8192ug/ml) ont été introduits dans un puit. 100 ul de SDB supplémenté à l'inoculum y ont été ajoutés pour donner une concentration de 4096 ug/ml. 100 ul de cette dernière solution a été prélevée et additionnée à 100 ul de SDB contenant l'inoculum pour donner une concentration de 2048 ug/ml et ainsi de suite jusqu'à la plus petite concentration (32 ug/ml). Trois essais ont été réalisés pour chaque concentration, et trois contrôles ont été effectués : le contrôle stérile (SDB), le contrôle négatif (SDB et inoculum) et le contrôle positif (SDB, inoculum et griséofulvine). La griséofulvine, antifongique de référence a été testée selon la même procédure. Les plaques ont ensuite été recouvertes de parafilm dans des conditions aseptiques, puis incubées à 30 °C pendant 7 jours. Au terme de cette période, l'inhibition de la croissance des dermatophytes a été vérifiée par ajout de 25 ul de para- iodonitrotétrazolium (INT) 0,3M dans chaque puit (Eloff, 1998), suivi d'une incubation à 30°C pendant 2 heures. La CMI a été définie comme la plus petite concentration d'extrait/ fraction pour laquelle il n'ya pas eu apparition d'une coloration rose après ajout d'INT.

La nature fongistatique ou fongicide a été confirmée par repiquage sur SDA (en stries d'environ 5 cm de long) de 10 ul du contenu des puits ne présentant aucune croissance visible. Après 7 jours d'incubation à 30°C, l'absence d'une reprise de croissance a été considérée comme indicatrice d'une action fongicide, alors qu'une reprise de croissance a indiqué une action fongistatique (Escaliente et al., 2002).

II.4 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo de la fraction résiduelle de Tristemma hirtum

L'évaluation de l'activité antidermatophytique in vivo a été effectuée en plusieurs étapes suivant les méthodes décrites par Iwata et al.(1989) et Cavalcanti et al.(2002).

II.4.1Préparation de l'inoculum et conditionnement des animaux

Dans un premier temps, une suspension de spores a été préparée en ajoutant 5 ml d'eau physiologique dans une boîte de Pétri de 55 mm de diamètre contenant une culture de T. mentagrophytes âgée de trois semaines. La surface de cette culture a été brossée très doucement. La suspension obtenue a été filtrée à l'aide d'un papier filtre qui retient les fragments de mycélium et laisse passer les spores. Des dilutions successives ont permis d'ajuster le nombre de spores à environ 10⁶ UFC/ml. L'inoculum ainsi préparé a été utilisé pour l'infection des animaux.

Une aire de 4×4 cm du dos de chaque cochon d'Inde a été rasée à l'aide d'une lame, puis une zone de 2 cm de diamètre à l'intérieur de cette aire a été frottée avec du papier vert n° 120 tout en évitant de blesser l'animal.

II.4.2 Infection des animaux

Cinq cents ul d'inoculum (10⁵ spores) préalablement préparé ont été déposés sur la zone frottée. Cette zone a ensuite été recouverte d'une compresse maintenue en place à l'aide d'un ruban adhésif pour une durée de 24 h. Trois jours après inoculation, des observations microscopiques et des cultures des prélèvements sur milieu SDA, ont permi de savoir si l'infection était établie.

II.4.3 Formulation de la pommade et traitement des animaux

Trente grammes de beurre de karité ont été introduits dans un mortier, puis chauffés au bain marie (100°C) jusqu'à dissolution complète (5 min environ). 15 ml d'eau distillée et 0,25 g de sulfure y ont été ajoutés, et le mélange a été agité jusqu'à homogénéisation totale. 7,5 g de cire d'abeille ont ensuite été ajoutés, et le tout a été porté au bain marie (100°C) pour une solubilisation totale. Deux concentrations de la fraction dans la pommade ont été obtenues comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

Les aspects physiques des pommades obtenues sont illustrés par la photographie5

II.4.2 Tristemma hirtum

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

I Matériel

I.1 Matériel végétal

I.2 Matériel animal

I.3 Microorganismes et milieux de culture

II Méthodes

II.1 Extraction et partitionnement

II.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

Les principaux groupes de substances antimicrobiennes ont été recherchés dans les différents extraits et fractions par les méthodes standards décrites par Brunetton (1999).

II.2.1 Les flavonoïdes : test de Shinoda

II.2.2 Les alcaloïdes :test de Mayer

II.2.3 Les triterpènes et les stéroïdes : test de Liebermann-Burchard

II.2.4 Test des composés phénoliques

II.2.5 Test des saponines

II.2.6 Test des tannins

II.2.7 Test des anthraquinones

II.2. 8 Test des anthocyanines

L'extrait/fraction (0,1 g) a été ajouté à 5 ml d'une solution d'acide sulfurique 1%. L'apparition d'une coloration orange a montré la présence des anthocyanines.

II.2.9 Test des coumarines

II.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

II.3.1 Evaluation de l'effet des extraits et fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes

Tableau 1: protocole de préparation des différentes concentrations d'extraits et fractions testées

II.3.2 Détermination des Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF)

Les CMI et CMF ont été déterminées par la méthode de microdilution en milieu liquide, dans des plaques de microtitration de 96 puits (Santos et Hamdan, 2005).

II.4 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo de la fraction résiduelle de Tristemma hirtum

L'évaluation de l'activité antidermatophytique in vivo a été effectuée en plusieurs étapes suivant les méthodes décrites par Iwata et al.(1989) et Cavalcanti et al.(2002).

II.4.1Préparation de l'inoculum et conditionnement des animaux

II.4.2 Infection des animaux

II.4.3 Formulation de la pommade et traitement des animaux

Les aspects physiques des pommades obtenues sont illustrés par la photographie5

II.4.2 Tristemma hirtum

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

I Matériel

I.1 Matériel végétal

I.2 Matériel animal

I.3 Microorganismes et milieux de culture

II Méthodes

II.1 Extraction et partitionnement

II.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

Les principaux groupes de substances antimicrobiennes ont été recherchés dans les différents extraits et fractions par les méthodes standards décrites par Brunetton (1999).

II.2.1 Les flavonoïdes : test de Shinoda

II.2.2 Les alcaloïdes :test de Mayer

II.2.3 Les triterpènes et les stéroïdes : test de Liebermann-Burchard

II.2.4 Test des composés phénoliques

II.2.5 Test des saponines

II.2.6 Test des tannins

II.2.7 Test des anthraquinones

II.2. 8 Test des anthocyanines

L'extrait/fraction (0,1 g) a été ajouté à 5 ml d'une solution d'acide sulfurique 1%. L'apparition d'une coloration orange a montré la présence des anthocyanines.

II.2.9 Test des coumarines

II.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

II.3.1 Evaluation de l'effet des extraits et fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes

Tableau 1: protocole de préparation des différentes concentrations d'extraits et fractions testées

II.3.2 Détermination des Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF)

Les CMI et CMF ont été déterminées par la méthode de microdilution en milieu liquide, dans des plaques de microtitration de 96 puits (Santos et Hamdan, 2005).

II.4 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo de la fraction résiduelle de Tristemma hirtum

L'évaluation de l'activité antidermatophytique in vivo a été effectuée en plusieurs étapes suivant les méthodes décrites par Iwata et al.(1989) et Cavalcanti et al.(2002).

II.4.1Préparation de l'inoculum et conditionnement des animaux

II.4.2 Infection des animaux

II.4.3 Formulation de la pommade et traitement des animaux

Les aspects physiques des pommades obtenues sont illustrés par la photographie5

Deux lots d'animaux (L1, L2) ont été traités respectivement à l'aide des pommades à 2,5% et 5% à raison de 0,1g par application et deux applications par jour. Les animaux des lots L3 et L4 ont été traités de la même manière à l'aide du véhicule et de la griséofulvine (témoin positif) respectivement. Le lot L5 n'a reçu aucun traitement (témoin négatif). Le traitement a duré 3 semaines au cours desquelles les animaux étaient observés quotidiennement.

II.5Analyses statistiques

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS (version 12.0) pour Windows. Les résultats ont été comparés par le test de Waller-Duncan au seuil de probabilité 5% et exprimés sous forme de moyenne #177; erreur standard moyenne (ESM).

CHAPITRE 3: RESULTATS ET DISCUSSION

I Résultats

I.1Extraction et fractionnement

Les extraits et fractions obtenues ont présenté des aspects physiques et des rendements différents (Tableau 3).

Tableau 1: Rendement d'extraction et caractéristiques physiques des extraits et fractions

Le rendement de l'extrait au méthanol d'A. manniana est environ le double de celui de T. hirtum. En général, les rendements d'extraction des fractions résiduelles sont plus grands que ceux des fractions à l'acétate d'éthyle et à l'hexane.

I.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

Les tests phytochimiques des extraits et fractions ont révélés des différences de composition chimique plus ou moins importantes entre les extraits bruts et les fractions (Tableau 4).

On a noté l'absence des coumarines et la présence des anthocyanines dans tous les extraits et fractions. L'extrait brut de T. hirtum contient les saponines et les triterpènes qui sont absents dans l'extrait brut d'A. manniana et toutes ses fractions. Les alcaloïdes, les tannins, les composés phénoliques, les flavonoïdes, sont présents dans tous les extraits bruts et fractions à l'acétate d'éthyle. La fraction résiduelle de T. hirtum contient des stérols et des flavonoïdes qui sont absents dans la fraction résiduelle d'Acalypha manniana. Les fractions hexaniques des deux plantes ont une même constitution chimique.

Tableau 2: Groupes de constituants chimiques identifiés dans les extraits et fractions de T. hirtum et A. manniana

I.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

Les différents extraits et fractions ont exercé des effets dépressifs variables sur la croissance radiale des différents dermatophytes. Ces effets dépendent de la durée d'incubation, de la concentration des extraits et fractions et du dermatophyte étudié.

I.3.1 Influence de la durée d'incubation et de la concentration des extraits et fractions sur l'activité antidermatophytique

Indépendamment du champignon, on constate que l'effet dépressif des extraits et fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes diminue progressivement avec la période d'incubation lorsque l'inhibition n'est pas totale (Annexe II). Par ailleurs, pour un champignon et un extrait/fraction, l'effet dépressif augmente avec la concentration (Figure 1).

Figure 1: Evolution de l'inhibition de la croissance radiale mycélienne des dermatophytes par l'extrait au méthanol de T. hirtum en fonction de la durée d'incubation

I.3.2 Activité antidermatophytique comparée des extraits et fractions

On observe une saturation de l'activité à la concentration 8 mg/ml vis-à-vis de tous les dermatophytes, exceptés pour les fractions hexanique et à l'acétate d'éthyle d'A. manniana sur T. terrestre, et la fraction à l'hexane de T. hirtum sur M. gypseum (Tableau 5). Les extraits bruts des deux plantes et la fraction résiduelle de T. hirtum présentent en général une meilleure activité sur T. mentagrophytes et M. gypseum. De plus, la fraction résiduelle de T. hirtum présente également une meilleure activité sur T. equinum. Sur T. terrestre, l'activité de cette dernière fraction atteint la saturation à partir de 2 mg/ml.

Tous ces résultats sont confirmés par les valeurs de CMI et CMF obtenues (Tableau 6) avec de légères variations. La fraction résiduelle de T. hirtum présente une CMI de 128 ug/ml vis-à-vis de T. mentagrophytes, T. equinum , T. terrestre et une CMI de 256 ug/ml contre M. gypseum. L'extrait au méthanol de T. hirtum ne présente pas de valeurs de CMI aussi faibles que celles de la fraction résiduelle, mais montre cependant les plus petites valeurs de CMF (4096 ug/ml) vis-à-vis de T. mentagrophytes, T. equinum et M. gypseum. Les résultats montrent par ailleurs que l'extrait brut d'A. manniana a une nature fongicide vis-à-vis de T. equinum à partir de la concentration 4 mg/ml (Tableau 7). L'extrait brut de T. hirtum et sa fraction résiduelle sont fongicides vis-à-vis de T. terrestre à partir de la concentration 4 mg/ml et 2 mg/ml respectivement.

Tableau 3: Activité antidermatophytique (%#177; ESM) des extraits et fractions en fonction du champignon et de la concentration

Extraits

Dermatophytes

Concentration (mg/ml)

A.m. MeoH

A.m.Hexane

A.m. AE

A.m.Résidu

T.h.MeoH

T.h.Hexane

T.h.AE

T.h.Résidu

Griséofulvine(10ug/ml)

100^a

54,3#177;0,45

100^a

91,74#177; 2,64^b

62,46#177; 2,64^d

78,97#177; 2,64^c

100^a

85,13#177;2,64^bc

100^a

76,38#177;3,45^c

77,06#177;3,45^c

36,57#177;3,45^e

88,67#177;3,45^b

97,99#177;3,45^a

46,30#177;3,45^d

46,48#177;3,45^d

100^a

T. mentagrophytes

48,99#177;3,22^c

19,95#177;3,22^e

29,76#177;3,22^d

53,37#177;3,22^bc

60,18#177;3,22^b

16,93#177;3,22^e

45,64#177;3,22^c

91,76#177;3,22^a

0,5

36,73#177;4,31^b

19,79#177;4,31^c

22,54#177;4,31^c

36,88#177;4,31^b

56,14#177;4,31^a

16,48#177;4,31^c

40,59#177;4,31^b

40,22#177;4,31^b

0,25

19,32#177;4,42^bc

9,35#177;4,42^cd

7,93#177;4,42^cd

24,82#177;4,42^ab

23,34#177;4,42^ab

4,78#177;4,42^d

28,63#177;4,42^ab

33,41#177;4,42^a

100^a

40,77#177;0,79

100^a

85,24#177;1,77^b

96,73#177;1,77^a

100^a

86,06#177;1,94^b

100^a

T. equinum

47,55#177;4,33^c

75,59#177;4,33^b

78,53#177;4,33^b

48,78#177;4,75^c

54,11#177;4,33^c

68,40#177;4,33^b

53,19#177;4,75^c

100^a

0,5

36,63#177;5,96^bc

58,85#177;5,96^a

40,07#177;5,96^b

18,63#177;6,53^c

32,78#177;5,96^bc

41,20#177;5,96^ab

32,86#177;6,53^bc

41,52#177;6,53^ab

0,25

8,34#177;2,55^c

24,44#177;2,55^a

7,41#177;2,55^c

8,55#177;2,79^c

7,76#177;2,55^c

20,37#177;2,55^a

12,99#177;2,79^bc

17,88#177;2,79^ab

100^a

87,69#177;0,94^c

97,26#177;0,94^b

100^a

73,53#177;0,19

100^a

83,36#177;1,59^b

80,14#177;1,59^b

100^a

97,39#177;1,59^a

100^a

84,04#177;2,70^d

72,60#177;2,70^e

73,48#177;2,70^e

72,15#177;2,70^e

97,17#177;2,70^ab

92,86#177;2,70^bc

86,06#177;2,70^cd

100^a

T. terrestre

39,82#177;3,93^d

53,31#177;3,93^c

63,74#177;3,94^b

46,35#177;3,93^cd

75,46#177;3,93^a

80,51#177;3,93^a

76,53#177;3,93^a

53,62#177;3,93^c

0,5

17,28#177;4,37^e

36,07#177;4,37^c

19,19#177;4,37^de

23,94#177;4,37^de

63,57#177;4,37^b

54,91#177;4,37^b

75,13#177;4,37^a

29,25#177;4,37^cd

0,25

11,77#177;3,96^de

27,67#177;3,96^bc

7,20#177;3,96^e

8,69#177;3,96^de

52,94#177;3,96^a

18,21#177;3,96^cd

32,50#177;3,96^b

17,46#177;3,97^d

100^a

89,48#177;1,51^a

100^a

80,04#177;1,51^c

100^a

69,40#177;0,16

100^a

68,55#177;2,58^c

91,54#177;2,58^b

57,21#177;2,58^d

100^a

47,99#177;2,58^e

86,02#177;2,58^b

100^a

73,79#177;3,56^b

48,32#177;3,29^c

51,57#177;3,29^c

37,66#177;3,29^d

100^a

39,91#177;3,29^d

54,25#177;3,29^c

93,71#177;3,29^a

M. gypseum

65,67#177;3,92^a

36,55#177;3,63^bc

31,88#177;3,63^c

31,01#177;3,63^c

66,85#177;3,92^a

27,43#177;3,63^c

42,90#177;3,63^b

42,05#177;3,92^b

0,5

55,22#177;3,46^a

23,75#177;3,20^b

25,95#177;3,20^b

13,32#177;3,20^c

26,94#177;3,46^b

14,65#177;3,20^c

20,80#177;3,20^bc

27,73#177;3,28^b

0,25

26,53#177;3,44^a

14,29#177;3,37^bc

17,43#177;3,27^abc

9,99#177;3,27^c

9,79#177;3,54^c

7,91#177;3,35^c

12,26#177;3,27^c

22,58#177;3,27^ab

MeOH : méthanol, AE : acétate d'éthyl; A. m. : Acalypha manniana, T. m.: Tristemma hirtum . Pour chaque ligne , les valeurs affectées des mêmes lettres ne sont pas significativement différentes au seuil de probabilité 5% (test de Waller-Duncan). ESM : Erreur Standard Moyenne

Tableau 4: Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) et Fongicides (CMF) des extraits et fractions sur les spores (en ug/ml) des dermatophytes étudiés

Les résultats (Tableau 7) montrent par ailleurs que l'extrait brut d'A. manniana a une nature fongicide vis-à-vis de T. equinum à partir de la concentration 4 mg/ml. L'extrait brut de T. hirtum et sa fraction résiduelle sont fongicides vis-à-vis de T. terrestre à partir de la concentration 4 mg/ml et 2 mg/ml respectivement.

Tableau 5: Concentrations Minimales Inhibitrices et Fongicides (ug/ml) des extraits et fractions sur le mycélium

I.3.3 Effet des extraits et fractions sur la morphologie et la structure des dermatophytes

Les extraits et fractions ont des effets plus ou moins marqués sur l'aspect général, la production et la structure du mycélium, des éléments de dissémination et de résistance que sont les microconidies, les macroconidies et les chlamydospores.

On observe sur la photographie 6 que les filaments mycéliens de T. equinum sont d'avantage cloisonnés avec l'augmentation de leur densité. A la concentration 8 mg/ml, les filaments mycéliens sont plus robustes et tendent à se déformés pour laisser apparaître des chlamydospores. Cette évolution s'observe également pour T. equinum et T. terrestre (photographies 8 et 9). L'augmentation de la concentration en extrait entraine une diminution du nombre de macroconidies de M. gypseum et un changement de leur morphologie (Photographie 7). Ainsi, à 1 mg/ml, les macroconidies bien qu'elles soient cloisonnées, sont plus translucides que celles du témoin négatif. Par contre, à la concentration 4 mg/ml, les cloisons sont beaucoup moins visibles et les macroconidies sont translucides, comme vidées de leur contenu.

Evaluation de l'activité antidermatophytique des extraits au méthanol et fractions d'acalyphamanniana (euphorbiacées) et tristemma hirtum (mélastomatacées)

Table des matières

FICHE DE CERTIFICATION DE L'ORIGINALITE DU TRAVAIL

FICHE DE CERTIFICATION DES CORRECTIONS APRES SOUTENANCE

DEDICACES

REMERCIEMENTS

LISTE DES PHOTOGRAPHIES

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES ABREVIATIONS

RESUME

ABSTRACT

INTRODUCTION

CHAPITRE 1 : REVUE DE LA LITTERATURE

I Généralités sur les champignons

I.1 Les champignons

I.1.1 Définition

I.1.2 Caractéristiques structurales

I.1.3 Reproduction

I.1.4 Classification

I.1.5 Importance des champignons

I.2 Les mycoses

I.2.1Facteurs favorisant les infections fongiques

I.2.2 Classification

I.3 Les dermatophytes et les dermatophytoses

I.3.1 Les dermatophytes

I.3.2 Les dermatophytoses

II Traitement des mycoses et perspectives offertes par les plantes

II.1 Les antifongiques de synthèse utilisés dans le traitement des mycoses

II.1.1 Les azoles

II.1.2 Les polyènes

II.1.3 Les pyrimidines

II.1.4 Les allylamines

II.1.5 Les échinocandines

II.2 Les perspectives offertes par les plantes médicinales

II.2.1 Les principaux groupes de composés phytochimiques antimicrobiens

II.3 Méthodes d'évaluation de l'activité antidermatophytique

II.3.1 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

II.3.2 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo

II.3.3 Les facteurs qui influencent l'activité antimicrobienne

II.4 Généralités sur les plantes étudiées

II.4.1 Acalypha manniana

II.4.2 Tristemma hirtum

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

I Matériel

I.1 Matériel végétal

I.2 Matériel animal

I.3 Microorganismes et milieux de culture

II Méthodes

II.1 Extraction et partitionnement

II.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

II.2.1 Les flavonoïdes : test de Shinoda

II.2.2 Les alcaloïdes :test de Mayer

II.2.3 Les triterpènes et les stéroïdes : test de Liebermann-Burchard

II.2.4 Test des composés phénoliques

II.2.5 Test des saponines

II.2.6 Test des tannins

II.2.7 Test des anthraquinones

II.2. 8 Test des anthocyanines

II.2.9 Test des coumarines

II.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vitro

II.3.1 Evaluation de l'effet des extraits et fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes

II.3.2 Détermination des Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF)

II.4 Evaluation de l'activité antidermatophytique in vivo de la fraction résiduelle de Tristemma hirtum

II.4.1Préparation de l'inoculum et conditionnement des animaux

II.4.2 Infection des animaux

II.4.3 Formulation de la pommade et traitement des animaux

II.4.2 Tristemma hirtum

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

I Matériel

I.1 Matériel végétal

I.2 Matériel animal

I.3 Microorganismes et milieux de culture

II Méthodes

II.1 Extraction et partitionnement

II.2 Criblage phytochimique des extraits et fractions

II.2.1 Les flavonoïdes : test de Shinoda

II.2.2 Les alcaloïdes :test de Mayer

II.2.3 Les triterpènes et les stéroïdes : test de Liebermann-Burchard

II.2.4 Test des composés phénoliques