I.4. Numération des micro-organismes
I-4-1. Dénombrement des légionelles + Par
densité optique
La concentration d'une suspension bactérienne peut
être estimée par spectrophotométrie à une longueur
d'onde de 600 nm. Comme l'ont signalé plusieurs travaux
antérieurs (Dupay, 2013), nous avons trouvé qu'à une
densité optique (DO) égale à 1 correspondait environ une
concentration de 109 bactéries/ml.
+ Par dénombrement des UFC sur milieu
gélosé
Le dénombrement des UFC sur milieux
gélosés est l'une des méthodes de référence
pour estimer le comptage des bactéries. Pour ce faire, un
échantillon de volume connu a été déposé sur
milieu gélosé, après incubation pendant 4 à 8 jours
à 37°C, le nombre de colonies a été
dénombré. Celui-ci correspond au nombre de bactéries
viables et cultivables présentes dans l'échantillon.
I-4-2. Dénombrement des amibes
La numération des amibes se réalise sur des
cellules de comptages Malassez. La cellule de comptage a été
remplie avec 10uL de suspension amibienne et observée au microscope au
grossissement de 40x et 100X. La cellule de Malassez se compose d'une grille de
10 carrés et le volume d'un carré est équivalant à
0,1 ul. Le comptage a été effectué pour les 10
carrés différents, leur moyenne a permis de définir la
concentration des amibes.
I-4. Les cultures témoins
I-5-1. Témoins amibes
Un contrôle positif a été
réalisé en introduisant dans un tube à essai 3 ml d'une
suspension amibienne (6.104 amibes/ml) de chaque souche amibienne
avec 0,5 ml d'une suspension d'Escherichia coli 105 et /ou
106 UFC/ml pour avoir les ratios 0,1 et 10 respectivement. Cette
culture a été incubée à 28°C pendant 10
jours.
I-5-2. Témoins légionelles.
Un contrôle de capacité de croissance des
légionelles a été réalisé en introduisant
dans un tube à essai 0,5 ml d'une suspension bactérienne de
Legionella pneumophila (105 et /ou 106
bactéries /ml) selon le ratio, avec 3 ml de tampon d'amibes. Cette
culture a été incubée à 37°C pendant 10
jours.
Etude de la relation entre des bactéries Legionella et
des amibes 11
Chapitre 2: Matériel et méthodes
I-6. Étude cinétique des
co-cultures
I-6-1. Pouvoir incubateur des amibes.
Les co-cultures ont été réalisées
en introduisant dans des tubes de culture cellulaire 3 ml de suspension de
6.104 amibes/ml en tampon Amibe supplémentée avec 10%
de milieu SCGYEM ou PYG, afin d'éviter l'enkystement des amibes. Un
volume de 180 ul d'une suspension bactérienne de 105
bactéries/ml est ajouté pour avoir un ratio de 0,1 et un volume
de
1,8 ml d'une suspension bactérienne à
106 bactéries/ml afin d'obtenir un
(rapport
bactéries/amibes) de 10. Les tubes ont été incubés
pendant 24 à 48 heures à une température de 28°C,
pour obtenir des légionelles intra amibiennes et de 72h pour obtenir des
légionelles post amibiennes. Les co-cultures sont suivies pendant au
moins 3 jours après l'infestation bactérienne. À chaque
intervalle de temps, un tube a été prélevé et
examiné à la fois du point de vue amibien et bactérien
après une agitation vigoureuse au vortex afin de détacher les
amibes des parois.
Pour chaque tube examiné, la numération des
amibes s'effectue directement sur cellule de Malassez. Après vortex
pendant 1 min pour favoriser la lyse des amibes, le dénombrement des
légionelles totales a été effectué par
étalement direct sur milieu de culture BCYE solide en triplicata
à raison de 100ul par boîte. Les boîtes sont alors mises en
incubation à 37°C pendant 6 jours au minimum. Une première
lecture a été réalisée le 4eme jour et
une deuxième lecture a été réalisé le
6eme jour pour confirmer les résultats.
Le nombre des bactéries de Legionella pneumophila
est exprimé en UFC/ml en tenant compte du facteur de dilution et en
supposant que chaque colonie correspond à une bactérie
initialement présente dans la suspension diluée. Pour chaque
souche amibienne, la courbe de croissance de Legionella pneumophila
est représentée en fonction du temps et correspond à
la moyenne de N-essais indépendants avec l'écart-type
correspondant.
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