Memoire Online - à‰tude de la relation entre des bactéries legionella et des amibes isolées d'un écosystème aquatique à Marrakech.

à‰tude de la relation entre des bactéries legionella et des amibes isolées d'un écosystème aquatique à Marrakech.

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Laboratoire d'accueil : Laboratoire de B iologie et Biotechnologie des Microorganismes

Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech à la Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech Faculté des Sciences Semlalia, Marrakech iences Semlalia, Marrakech

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, je tiens à remercier Dieu le tout puissant de m'avoir donné le courage, la volonté et la patience pour achever ce travail.

J'ai l'honneur et le plaisir de présenter ma profonde gratitude et mes sincères remerciements à mon encadrant le Professeur Boujamâa IMZILN pour sa précieuse aide et ses orientations.

Je remercie profondément Monsieur le Professeur Mohamed LOUDIKI, coordonnateur du Master « Eco-Aqua » pour sa bonne direction de la filière et pour la qualité de la formation qu'il nous a prodigué avec l'équipe pédagogique de la filière.

Mes remerciements vont également à tous les enseignants chercheurs qui m'ont encouragé et soutenu pendant mon cursus.

J'adresse également mes remerciements aux Professeurs : Mr. Yedir OUHDOUCH et Mr. Noureddine MEZRIOUI pour avoir accepté de juger ce travail.

Un très grand merci, aux membres du laboratoire de biologie et biotechnologie des microorganismes pour leurs aides, leurs conseils et pour leurs complicités.

Je remercie toute ma famille et plus particulièrement mes parents pour leur soutien, leur encouragement et leur confiance.

A mes amis de promotion, j'adresse un grand merci pour leur soutien et leur aide.

A tous ceux qui ont contribué de prêt ou de loin à la réalisation de ce travail, MERCI.

LISTE DES ABRÉVIATIONS

Culture axénique : Culture dépourvue d'une source nutritive constituée de

Culture non axénique : Culture avec source nutritive constituée de microorganismes.

Résumé

Le pouvoir incubateur de deux souches amibiennes environnementales a été mis en évidence envers une souche bactérienne de Legionella pneumophila sérogroupe 1, ainsi que l'effet cytotoxique de la bactérie sur ces amibes. L'étude a été réalisée par co-culture dans du tampon amibien avec un rapport de multiplicité d'infection de 0,1 et 10. Les deux souches amibiennes testées ont montré une capacité d'incubation pour la bactérie-testée. Le pouvoir incubateur de la souche amibienne 1 plus grand que celui obtenu avec la souche 2. La co-culture entre les amibes et la bactérie à différents rapports de multiplicité d'infection MOI nous a permis de déterminer le taux de cytotoxicité induit par la souche de Legionella pneumophila sur les amibes et de démontrer la faible résistance de la souche amibienne 1 par rapport à la souche amibienne 2. Des traitements par la chaleur, appliqués sur la souche de Legionella pneumophila nous ont montré que le choc thermique était capable de conduire à la formation de formes viables et non cultivables chez cette bactérie. Les suspensions bactériennes sont devenues moins détectables sur milieu de culture. Après passage pendant 72 h des cellules de Legionella pneumophila viables et non cultivables dans les deux souches amibiennes, les bactérie ont pu retrouver leur cultivabilité après prolifération intra-amibienne, ce qui confirme le rôle des amibes comme un facteur discriminant pour la multiplication de Legionella pneumophila.

Mots clés : Pouvoir incubateur; souches amibiennes; effet cytotoxique; co-culture; MOI;

Abstract

The incubator power of two environmental Amoeba strains was demonstrated for Legionella pneumophila serogroup 1 bacterial strain. The cytotoxic effect of this bacterium on two amoeba strains (N1 and N2) was also determined. The latest experiment was conducted by co-cultivation in buffer amoeba with a Multiplicity Of Infection (MOI) of 0.1 and 10. The two tested strains of amoeba showed an incubation capacity for the tested bacteria with a higher incubator power for the N1 strain than the strain N2.The co-culture of the bacterium and Amoebae cells in different MOI allowed us to determined the cytotoxicity rate did Legionella pneumophila induced on amoebas and demonstrate the low resistance of the strain amoebic one compared the amoebic strain two. However, the heat treatments on the strain of Legionella pneumophila shown us that these treatments were able to lead to the formation of VBNC in this bacterium. The bacterial suspensions had initially become less detectable on agar medium. After a co-culture for 72 hours of Legionella pneumophila with two amoeba strains, the bacteria could find their cultivability after intra- amoebic proliferation, confirming the role playing amoeba as a discriminating factor for the proliferation of L.pneumophila.

Keywords: Power incubator; Strain amoebic; Cytotoxic effect; Co-culture; MOI; Legionella pneumophila

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Sommaire

Liste des figures

Figure 1: La formation d'un biofilm par les légionelles (Costerton, 1999) 3

Figure 2: Cycle de vie schématique de L.p dans les macrophages (Swanson et Hammer, 2000). -4

Figure 3: Photos des souches amibiennes isolées dans différents types de cultures 15

Figure 4: Suivi de la cultivabilité de L.p dans le milieu de co-culture aux MOI 0,1 et 10. 16

Figure 5: Croissance des souches amibiennes (MOI 10) dans le milieu de co-culture 17

Figure 6: Prolifération L.p en Co-culture avec les deux souches à la MOI 0,1 18

Figure 7: Prolifération de L.p en Co-culture avec les deux souches à la MOI 10 18

Figure 8: Inhibition de la croissance des amibes sur 72 h de co-culture par L.p a un MOI de 10 19

Figure 9: Inhibition de la croissance des amibes sur 72 h de co-culture par L.p a un MOI de 0,1 19

Figure 10:Taux de trophozoïtes vivants après 72h de co-culture avec L.p MOI 0,1 20

Figure 11: Taux de trophozoïtes vivants après 72h de co-culture avec L.p MOI 10 21

Figure 12: Linéarisation de Lineweaver et Burke de la relation entre la vitesse spécifique de croissance (u)

Figure 13: Impact du traitement thermique sur la cultivabilité de Legionella pneumophila 23

Figure 14: L'état viable non cultivable de L.p après co-culture avec les amibes 24

Tableau 1: Souches bactériennes et amibiennes utilisées lors de l'étude et sont origines 9

Tableau 2: Valeurs de KS (bactéries/amibe) et umax (h-1) à partir de la linéarisation 22

INTRODUCTION GENERALE

L'eau est toujours considérée comme étant un élément indissociable de la vie et en particulier de celle des populations humaines dont elle a influencé l'histoire et conditionné le développement. Elle est aussi un des principaux vecteurs de la transmission de nombreuses maladies qui sont à l'origine d'importantes épidémies humaines ou animales. Ces maladies d'origine hydrique sont des infections essentiellement dues à des (bactéries, virus, algues et/ou protozoaires). Il peut s'agir de micro-organismes pathogènes ou potentiellement pathogènes (Opportunistes) et ce en quantité supérieure au seuil d'infectiosité. Le risque microbiologique provenant du pouvoir pathogène de ces germes est conditionné non seulement par les propriétés de l'agent infectieux mais aussi par la réceptivité de l'hôte (Dupay, 2013).

De nos jours, notre société est à la recherche d'un équilibre entre le développement et la préservation des ressources naturelles. L'anthropisation des milieux aquatiques, suite aux diverses activités humaines, n'est pas sans conséquence. Il en résulte souvent une modification de leurs qualités. De telles variations peuvent entraîner la prolifération de micro-organismes divers. Parmi ces germes, naturellement présents dans l'environnement, des bactéries du genre Legionella et des amibes libres sont souvent isolés de ces milieux (Fliermans et al., 1981). Ces derniers microorganismes sont souvent reconnus avoir colonisé des systèmes et des réseaux de distribution d'eau en générant généralement des biofilms. Malgré la mise en place de traitements divers, une recolonisation des réseaux par ces légionelles a été observée (Declerck et al., 2007).Le maintien de la contamination peut être favorisé par la présence de biofilms (Declerck et al., 2007). Les biofilms constituent des réservoirs pour plusieurs espèces de micro-organismes et fournissent une protection vis-à-vis des agressions extérieures. Ils permettent aussi aux bactéries de survivre à l'action des désinfectants et de reformer de nouveaux biofilms. La présence de protozoaires, surtout les amibes capables de résister aux désinfectants assure très probablement la protection de ces bactéries. En effet, les légionelles sont capables d'infecter des amibes, d'y survivre et de s'y multiplier (Borella et al, 2005). Ces dernières peuvent être par la suite libérées dans l'environnement et colonisées des biofilms ou infectées l'homme.

Dans ce contexte, ce présent travail vise l'étude de deux aspects biologiques et complémentaires chez les amibes et les légionnelles à savoir :la réplication de L.pneumophila chez deux souches amibiennes isolées à partir de certains écosystèmes aquatiques de Marrakech, d'une part et l'évaluation de la cytotoxicité des légionelles vis-à-vis de ces amibes, d'autre part.

I- Les légionelles

I.1. Historique

En 1976, lors de la 58^èmeconvention annuelle de l'Américain légion à Philadelphie, en Pennsylvanie, et à la suite d'une épidémie de pneumonie qui eut lieu, le genre Legionella a été établi en 1978 (McDade et al, 1977). Cette épidémie a touché parmi les 4400 vétérans réunis, 182 personnes dont 147 d'entre eux nécessitant l'hospitalisation et entraîna le décès de 29 individus (Fraser et al, 1977). Une année après, Joseph McDade et Charles Shepard (Center for Disease Control and prévention) réussissent à isoler l'agent responsable de cette épidémie par l'infection des cobayes par voie intra-nasale selon un protocole utilisé pour la recherche de Rickettsia (agent responsable du typhus) et de la lèpre (McDade et al, 1977). L'agent pathogène responsable isolé plus tard est baptisé Legionella pneumophila. Cette bactérie, jusqu'alors inconnue, avait colonisé le système de climatisation de l'hôtel et contaminé les vétérans par voie aérienne.

I.2. Caractéristiques générales de la bactérie

Les bactéries du genre Legionella, sont des bacilles à Gram négatif, hétérotrophe, transitoirement mobile, d'une taille qui varie de 0,3 à 0,9 um de large et de 2 à 20 um de long, aérobie, non sporulé, non acido-résistant et non capsulée. Ils peuvent se présenter en culture sous formes allongées parfois filamenteuses (Diederen et al,2008). Leur croissance est indispensablement liée au fer et la L-cystéine, aussi pour son isolement sur des milieux de culture (Fields et al, 2002). Les variations de taille des légionelles sont en partie dues, comme pour la plupart des bactéries, à la modification des conditions environnementales. De plus, chez les légionelles, la taille de la bactérie est significativement réduite, avec des longueurs de moins 1um, après leur passage intra-amibien. Ces bactéries sont capables de croître à des températures comprises entre 25 et 42 °C, ils survivent à une température de 60 °C et dans des environnements de pH compris entre 2,7 et 8,3 (Leoni et al., 2001). Généralement leurs mode de transmission se fait exclusivement par inhalation d'aérosols de légionelles issus d'eaux contaminées . Là encore, la flagellation des légionelles est variable, la présence ou non du flagelle dépendrait de la température du milieu puisqu'il est absent au-delà de 37°C. De plus, le flagelle est absent lorsque la bactérie se trouve à l'intérieur des macrophages ou protozoaires. Ce flagelle peut atteindre 8 um de long et 14 à 25um de diamètre, il est attaché à la paroi cellulaire par un corps basal formant un crochet comme c'est le cas pour les autres bactéries à Gram négatif (Winn et al, 1988 ).

I.3. Position taxonomique

Legionella appartient au phylum Gammaproteobacteria. À ce jour, la famille Legionellaceae se compose d'un seul genre, Legionella. Le nombre d'espèces de Legionella isolées par culture est de l'ordre de 48 espèces appartenant à 70 sérogroupes différents (Diederen et al., 2008). Legionella pneumophila est la plus fréquemment identifiée lors des épidémies de légionellose (80 à 85 % des cas). Elle comprend entre 15 et 16 sérogroupes selon les auteurs. Parmi lesquels les sérogroupes 1 et 6 qui sont responsables de deux tiers des infections (Diederen et al.,2008). Les espèces autres que L. pneumophila ne sont impliquées que dans environ 20 % des infections. Les espèces les plus souvent mises en cause sont L.micdadei (la seconde cause des maladies après L. pneumophila), L.longbeachae (la plus fréquente en Australie), L.dumoffii (la quatrième ou cinquième espèce engendrant la légionellose) et

L.bozemanii. Ces bactéries ont été isolées principalement chez des malades
immunodéprimés (Ohnishi et al, 2004).

I.4. Écologie des légionelles

I-4-1. Les réservoirs de légionelles

Les légionelles sont des germes ubiquitaires de l'environnement qui se développent dans les milieux aquatiques naturels et les niches hydriques artificielles : eau courante, eau stagnante, eaux thermales, conduites d'eau potable, pommes des douches, dispositifs de refroidissement à eau, bains bouillonnants, circuits avec recyclage d'eau. En 1987, Ortiz et Hazen ont étudié la présence des bactéries du genre Legionella sur différents sites du Porto Rico (16 sites marins, 8 d'eau douce et 2 échantillons provenant d'un estuaire). Sur l'ensemble des sites, l'espèce L. pneumophila était la plus abondante. De même, La bactérie est ainsi retrouvée dans les lacs, au niveau de rivières et de leurs rives, dans des eaux de pluie ou encore dans des nappes phréatiques (Fliermans et al., 1981). Souvent la bactérie peut coloniser des environnements hydriques artificiels lorsque les conditions sont favorables, des températures d'eau comprises entre 35°C et 45°C, une éventuelle stagnation de l'eau, la présence de certains minéraux (fer, silicone), les dépôts de tartre, la présence d'autres micro-organismes (Steinert et al, 2002).

I-4-2. Mode de vie sessile

L'activité microbiologique dans un écosystème (Environnement aquatique, sol, corps humain), provient en majeure partie d'une flore fixée aux surfaces formant une structure appelée biofilm (Sutherland, 2001). Le biofilm peut se former sur une large variété de surfaces comme les

Chapitre 1: Aperçu bibliographique

tissus vivants, les dispositifs médicaux et les systèmes de distribution d'eau potable ou industrielle. Les légionelles sont des colonisateurs secondaires s'associant rapidement à d'autres bactéries ayant déjà entamé la formation du biofilm. Il a été observé que L. pneumophila pouvait coloniser un biofilm en moins de deux heures (figure1) (Declerck et al., 2007). Pourtant, à ce jour, aucune étude n 'a pu montrer que les légionelles étaient en mesure de se multiplier par eux-mêmes dans l'eau. L'hypothèse de la multiplication extracellulaire des légionelles dans les biofilms est évoquée, mais dans la plupart des expérimentations, la multiplication des bactéries ne s'effectue qu'en présence de protozoaires (Declerck et al., 2007).

I-4-2. Cycle de réplication intracellulaire

Le mode de transmission à l'homme se fait par inhalation d'aérosols contaminés. Les aérosols de 1 à 10 um peuvent pénétrer dans la région alvéolaire des poumons, sachant que la transmission d'homme à homme n'est pas avérée (Fields, 1996 ). Les deux principales espèces de Legionella pathogènes pour l'homme sont L. pneumophila et L. longbeachae. Les légionelles pénètrent dans la cellule par phagocytose (Figure 2), une fois phagocytées, les bactéries résident dans un phagosome unique entouré par un réticulum endoplasmique rugueux (RER), véritable réserve de nutriments. Quelques heures après l'infection, le phagosome évolue en s'entourant d'une membrane multicouche issue du RER. Les bactéries se multiplient alors dans ce phagosome. En carence nutritionnelle, elles passent en phase stationnaire où elles expriment plusieurs gènes de virulence permettant à la fois leur libération et transmission vers une nouvelle cellule-hôte (Abu Kwaik et al., 1998).

Figure 2: Cycle de vie schématique de L.p dans les macrophages (Swanson et
Hammer, 2000).

I-5. Maladies du légionnaire

I-5-1. Légionellose

La légionellose est une infection pulmonaire aiguë dont l'incubation dure de 2 à 10 jours. Elle débute ensuite par un état grippal avec fièvre, toux sèche, céphalées, myalgies, anorexie avant qu'apparaisse un tableau plus sévère associant une température élevée, des malaises et douleurs abdominales parfois accompagnées de troubles neurologiques (délire, confusion). Les complications peuvent être un choc, une coagulation intra vasculaire disséminée, une insuffisance respiratoire et/ou rénale. Le taux de mortalité est estimé à 15 % mais peut atteindre 80 % chez certains patients selon la sévérité des signes cliniques, le statut immunitaire du patient, la source de l'infection (communautaire ou nosocomiale), et le choix du traitement antibiotique (Jarraud, 2007).

I-5-2. Fièvre de Pontiac.

Il s'agit d'une forme bénigne de légionellose découverte en 1968 lors d'une épidémie ayant eu lieu à Pontiac, qui est analogue à un syndrome pseudo-grippal : fièvre, frissons, céphalées, myalgies. D'autres symptômes ont également été recensés à travers différents épisodes de fièvre de Pontiac tels que des douleurs abdominales, rougeurs oculaires avec photophobie. Contrairement à la légionellose, la durée d'incubation de cette maladie est de 1 à 3 jours et l'infection a lieu dans la gorge douloureuse. La guérison est habituellement spontanée entre 2 et 5 jours (Glick et al., 1978).

II- Amibes

II.1. Historique

Les amibes sont décrites pour la première fois par August Johann « Rösel van Rosenhof », un microscopiste amateur, entomologiste et dessinateur, en 1755. Après le naturaliste, Félix Dujardin décrit en 1841, la famille des amibiens et définit ainsi les organismes de cette famille : «animaux formés d'une substance glutineuse, sans tégument, sans organisation appréciable, changeant de forme à chaque instant par la protension ou la rétraction d'une partie de leur corps, d'où résultent des expansions variables» (Dujardin, 1841). C'est dans la première partie du XX^ème siècle que les amibes libres furent mieux identifiées. L'amibe Amoeba polyphage a été isolée à partir de poussière par Pushkarew en 1913. En 1930 castellanii a isolé une amibe d'une contamination dans une culture de levures qui a été ensuite nommée Acanthamoeba castellanii par Volkonsky en 1931. Depuis, de nombreuses autres espèces d'amibes ont été décrites notamment pour le genre Acanthamoeba qui compte plus de 24 espèces (Dupuy, 2013).

II.2. Caractéristiques et morphologie générales de l'amibe

II-2-1. La forme végétative ou trophozoïtes

C'est la forme biologiquement active, capable de se déplacer, se nourrir et de se diviser, (Bouyer, 2008). Les trophozoïtes mesurent de 25à 40um en fonction des espèces. C'est uniquement sous cette forme que les amibes se multiplient, est la reproduction s'effectue par division binaire. L'organisation cellulaire correspond typiquement à celle d'une cellule eucaryote, avec différentes vacuoles. Les vacuoles cytoplasmiques sont des vacuoles contractiles permettant le contrôle du contenu en eau de la cellule, ainsi que des vacuoles de sécrétion (contenant des enzymes spécifiques de certaines fonctions) ou des vacuoles de phagocytose (Bowers & Korn, 1968). Ils sont nus, ne sont pas entourés d'une cuticule épaisse. La membrane plasmique est tri-lamellaire. À la surface de cette membrane plasmique, on distingue de petites projections appelées acanthopodes.

II-2-2. Forme kystique.

Le kyste est la forme de résistance, biologiquement inactive. Généralement, les kystes mesurent de 13 à 20 um en fonction des espèces est se forment lorsque les conditions environnementales deviennent défavorables à la forme végétative (froid, dessiccation ou épuisement du milieu nutritif), et permettent aux amibes de survivre longtemps en état de latence,

avec une activité métabolique réduite. La forme kystique permet également une dissémination aquatique ou aérienne et l'implantation dans de nouveaux biotopes. Le protoplasme kystique possède un cytoplasme fortement déshydraté, entraîne une augmentation de sa densité. De nombreuses vacuoles, certaines d'entre elles contiennent le matériel nécessaire à l'édification ou au maintien de la paroi kystique, d'autres riches en ribonucléoprotéines, sont probablement une source énergique pour le protoplasme, (Bouyer, 2008).

II-2-3. Cycle de vie

Il comprend deux étapes : une étape végétative où les amibes libres se multiplient par mitose ou promitose. Le temps de division est variable selon les genres, est d'une douzaine d'heures. La deuxième étape du cycle des amibes libres est une étape kystique. Celle-ci intervient lorsque les conditions environnementales deviennent défavorables. La cellule cesse de se déplacer est n'émet plus de pseudopodes, le cytoplasme s'arrondie au même temps que se condense, se déshydrate, et sécrète une paroi kystique. Certaines amibes comme Naegleria sp ou Willaertia sp, possèdent un stade supplémentaire « la flagellation, observée comme stade intermédiaire entre la forme enkystée et la forme végétative ». Certaines amibes ne possèdent pas de formes kystiques connues comme Vannella sp ou. Thecamoeba sp, (Dey et al., 2010).

II-3. Classification

Selon Adl et al, 2005, un consortium de biologistes, la classification a été révisée, les auteurs ont présenté une hiérarchie simplifiée pour chaque rang, sans titre formel. Ci-dessous le résumé de la classification des amibes libres.

II.4. Répartition dans l'environnement

Les amibes libres sont présentes dans une large gamme d'environnement, elles vivent généralement à la surface des sédiments, sur les matières en suspension dans l'eau mais aussi dans les biofilms. Acanthamoeba est le genre amibien qui a été le plus étudié. Ces amibes ont été isolées du sol, d'eau douce et saumâtre, de bouteilles d'eau minérale, de circuits de TAR, de réseaux de chauffages, de ventilations, de systèmes d'air conditionnés, d'humidificateurs, de Jacuzzis, dans des hôpitaux, d'unités dentaires, de machines de dialyse. (Visvesvara et al., 2007). La présence des amibes libres dans les biofilms est démontrée dans plusieurs études, elles participent à la formation et à l'équilibre des biofilms (Parry, 2004). Ces micro-organismes jouent également un rôle dans le cycle de l'azote et du phosphate notamment dans les environnements oligotrophes (Pickup et al. 2007b). Les amibes libres sont associées aux biofilms bactériens dans de nombreux habitats naturels ou artificiels. Le biofilm constitue un environnement particulièrement propice puisque leurs proies sont présentes en grand nombre, la prédation par les protozoaires est considérée comme une source majeure de la mortalité des bactéries dans les biofilms. Les amibes seraient capables de consommer 30 à 100% de la production bactérienne journalière.

II.5. Maladies Amibiennes.

Les effets pathogènes des amibes touchent électivement des sujets fragilisés avec des défenses immunitaires faibles, inexistantes ou inefficaces (patients immunodéprimés ou atteints d'affections chroniques et débilitantes).

II-5-1. Atteintes du système nerveux.

L'inoculation s'effectue soit à partir de l'appareil respiratoire par inhalation, soit à partir de la peau ou de l'oeil après effraction. La diffusion est hématogène ou par ascension le long des voies nerveuses optiques ou olfactives. Les amibes sont alors responsables de la formation dans le système nerveux central de granulomes tissulaires chroniques centrés par des kystes.

II-5-2. Kératites amibiennes

Dans les pays développés sont en forte augmentation à cause du port des lentilles de contact. Les kératites amibiennes se développent également chez des personnes immunocompétentes. Les atteintes par Acanthamoeba sp sont actuellement les plus fréquentes des kératites amibiennes (80% des cas sont des porteurs de lentilles de contact, les autres cas étant liés

à un traumatisme oculaire ou ne retrouvant pas de cause évidente). Elles sont dues aux trophozoïtes qui adhèrent et se développent sur l'épithélium cornéen. Après dépôt des amibes sur la cornée, l'incubation est brève. Les trophozoïtes sécrètent différentes protéases, en particulier collagénolytiques provoquant un abcès cornéen (Kim et al, 2006).

Différentes souches amibiennes ont été isolées à partir de différents écosystèmes aquatiques à Marrakech. La souche amibienne (SA1) a été isolée à partir des eaux usées rejetées par la station d'épuration de Marrakech, alors que La souche amibienne (SA2) a été isolée à partir de l'eau de puits de la Faculté des Sciences Semlalia (FSSM) de Marrakech.

Deux méthodes d'isolement ont été utilisées. La première consiste à filtrer les eaux prélevées par une pompe à vide sur une membrane de 0,22um à raison d'un litre d'échantillon par membrane. Le filtre est ensuite déposé sur de la gélose non nutritive « NN-Agar » recouvert d'un tapis d'Escherichia coli et incubée à 28°C pendant 10 jours. La deuxième méthode consiste à centrifuger un litre de l'échantillon d'eaux à une vitesse de 1200tpm pendant 10 min et à remettre le culot en suspension dans un volume précis d'eau distillée stérile. 500 ul de cette suspension sont ensemencés par étalement dans des boîtes de pétri contenant de la gélose non nutritive recouvert d'un tapis d'Escherichia coli. L'incubation a été faite à 28°c pendant 10 jours. Ci-dessous, le tableau 1 résume l'ensemble des souches utilisées dans ce présent travail ainsi que leurs origines.

Tableau 1: Souches bactériennes et amibiennes utilisées lors de l'étude et leur origines

I-3. Milieux et conditions de culture des micro-organismes

I-3-1. Culture d'Escherichia coli

La purification et l'identification de la souche bactérienne a été vérifiées avant toute utilisation. La bactérie a été cultivée sur milieu riche (Gélose nutritive) à 37°C pendant 24H. La composition du milieu est motionnée en annexe2.

I-3-2. Culture des légionelles

Après le contrôle de purification, la souche de Legionella pneumophila sérogroupe 1 a été cultivée dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu BYE liquide. Le milieu inoculé a été ensuite incubé sous agitation permanente de 150rpm à 37 °C dans un incubateur agitateur. Le milieu BYE liquide a été préparé selon la procédure mentionnée en (annexe 1). Il a été stérilisé par filtration sur membrane de porosité de 0,22 um puis complémenté par de la L-cystéine (0,4 g/l final) et du pyrophosphate de fer (0,25g/l final) préalablement stérilisés par filtration. La souche a été également cultivée sur milieu gélosé BCYE supplémenté en « glycine, Vancomycine, Polymyxine B et. Cycloheximide ». Afin de confirmer la pureté de la souche utilisée, la souche a été ensemencée sur milieu sélectif avec cystéine et sur milieu sélectif sans cystéine.

I-3-3. Culture d'amibes

La culture des amibes sur milieu solide a été réalisée sur la gélose non nutritive « NN-Agar » composé seulement de 15 g/L d'agar puis recouvert d'un tapis d'Escherichia coli (d'environ 2.10⁹ à 3.10⁹ bactéries/gélose). L'incubation a été réalisée à une température de 28 °C pendent 10 jours.

Le passage en milieu liquide non axénique des souches environnementales a été réalisé en déposant un carré de gélose découpé au niveau d'un front de migration d'une gélose NNA-coli dans une erlenmeyer contenant le milieu SCGYEM( Chang et al,2007) ou PYG additionné d'un mélange d'antibiotiques « ampicilline, Cycloheximide, l'acide nalidixique » (annexes 2 et 3), le milieu est renouvelé chaque 5 jours. Après croissance, les trophozoïtes ont été transférés dans un nouveau milieu.

I.4. Numération des micro-organismes

I-4-1. Dénombrement des légionelles + Par densité optique

La concentration d'une suspension bactérienne peut être estimée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 600 nm. Comme l'ont signalé plusieurs travaux antérieurs (Dupay, 2013), nous avons trouvé qu'à une densité optique (DO) égale à 1 correspondait environ une concentration de 10⁹ bactéries/ml.

Le dénombrement des UFC sur milieux gélosés est l'une des méthodes de référence pour estimer le comptage des bactéries. Pour ce faire, un échantillon de volume connu a été déposé sur milieu gélosé, après incubation pendant 4 à 8 jours à 37°C, le nombre de colonies a été dénombré. Celui-ci correspond au nombre de bactéries viables et cultivables présentes dans l'échantillon.

I-4-2. Dénombrement des amibes

La numération des amibes se réalise sur des cellules de comptages Malassez. La cellule de comptage a été remplie avec 10uL de suspension amibienne et observée au microscope au grossissement de 40x et 100X. La cellule de Malassez se compose d'une grille de 10 carrés et le volume d'un carré est équivalant à 0,1 ul. Le comptage a été effectué pour les 10 carrés différents, leur moyenne a permis de définir la concentration des amibes.

I-5-1. Témoins amibes

Un contrôle positif a été réalisé en introduisant dans un tube à essai 3 ml d'une suspension amibienne (6.10⁴ amibes/ml) de chaque souche amibienne avec 0,5 ml d'une suspension d'Escherichia coli 10⁵ et /ou 10⁶ UFC/ml pour avoir les ratios 0,1 et 10 respectivement. Cette culture a été incubée à 28°C pendant 10 jours.

I-5-2. Témoins légionelles.

Un contrôle de capacité de croissance des légionelles a été réalisé en introduisant dans un tube à essai 0,5 ml d'une suspension bactérienne de Legionella pneumophila (10⁵ et /ou 10⁶ bactéries /ml) selon le ratio, avec 3 ml de tampon d'amibes. Cette culture a été incubée à 37°C pendant 10 jours.

I-6-1. Pouvoir incubateur des amibes.

Les co-cultures ont été réalisées en introduisant dans des tubes de culture cellulaire 3 ml de suspension de 6.10⁴ amibes/ml en tampon Amibe supplémentée avec 10% de milieu SCGYEM ou PYG, afin d'éviter l'enkystement des amibes. Un volume de 180 ul d'une suspension bactérienne de 10⁵ bactéries/ml est ajouté pour avoir un ratio de 0,1 et un volume de

1,8 ml d'une suspension bactérienne à 10⁶ bactéries/ml afin d'obtenir un
(rapport bactéries/amibes) de 10. Les tubes ont été incubés pendant 24 à 48 heures à une température de 28°C, pour obtenir des légionelles intra amibiennes et de 72h pour obtenir des légionelles post amibiennes. Les co-cultures sont suivies pendant au moins 3 jours après l'infestation bactérienne. À chaque intervalle de temps, un tube a été prélevé et examiné à la fois du point de vue amibien et bactérien après une agitation vigoureuse au vortex afin de détacher les amibes des parois.

Pour chaque tube examiné, la numération des amibes s'effectue directement sur cellule de Malassez. Après vortex pendant 1 min pour favoriser la lyse des amibes, le dénombrement des légionelles totales a été effectué par étalement direct sur milieu de culture BCYE solide en triplicata à raison de 100ul par boîte. Les boîtes sont alors mises en incubation à 37°C pendant 6 jours au minimum. Une première lecture a été réalisée le 4^eme jour et une deuxième lecture a été réalisé le 6^eme jour pour confirmer les résultats.

Le nombre des bactéries de Legionella pneumophila est exprimé en UFC/ml en tenant compte du facteur de dilution et en supposant que chaque colonie correspond à une bactérie initialement présente dans la suspension diluée. Pour chaque souche amibienne, la courbe de croissance de Legionella pneumophila est représentée en fonction du temps et correspond à la moyenne de N-essais indépendants avec l'écart-type correspondant.

I-6-2. Cytotoxicité de L. pneumophila vis-à-vis des amibes

Des co-cultures des souches amibiennes ont également été réalisés dans des tubes de culture cellulaire contenant 3 ml d'une suspension de 6.10⁴ amibes/tube, infestées avec un ratio (bactéries/amibes) de 0,1 et 10, afin d'évaluer quantitativement l'effet cytopathogène de la bactérie vis-à-vis de l'amibe. La cytotoxicité a été également déterminée au bout de 24 ; 48 et de 72 heures de co-culture par un test d'exclusion au bleu de méthylène sur les souches amibiennes.

Les amibes sont récupérées par centrifugation douce des tubes de co-cultures, puis re-suspendues dans 200 uL de milieu PYG ou SCGYEM avant d'être mélangées avec le bleu de méthylène selon un ratio de 1/4. Les cellules sont examinées à l'hématimètre et en déterminant pour chaque souche amibienne le pourcentage de cellules apparaissant colorées en bleu.

I-7. Étude de l'état viable non cultivable de Legionella pneumophila

Pour comparer l'effet de la température sur la souche bactérienne de Legionella pneumophila sérogroupe1, nous avons appliqué des traitements de 1 heure et une gamme de températures correspondant à 50 ; 54 ; 58 et 62°C. Après le choc thermique les cellules ont été placées plusieurs jours à 25°C dans un milieu pauvre en nutriments constitué de BYE dilué au millième appelé milieu de repos. L'étude de la viabilité des échantillons traités et non traités, a été effectuée par test de cultivabilité sur milieu de culture solide.

I-7-1. Traitement thermique

Les bactéries en phase stationnaire (5 jours, bouillon BYE) ont été collectées par centrifugation, lavées deux fois avec de l'eau distillée stérile puis remis en suspension dans de l'eau distillée stérile de façon à obtenir une suspension ayant une _DO600nm de 1 correspond environ à une concentration de 10⁹ bactéries/ml. 40 ml de cette suspension sont ensuite incubées pendant 1 heure, sous agitation, dans des bains-marie à des températures comprises entre 50 et 62°C. Après traitement, les cellules sont récupérées par centrifugation (5 000 trm, 10 min, 4°C),

remises en suspension dans le milieu BYE dilué aux 1000^eme puis incubées à
25°C pendant plusieurs jours. L'impact du traitement thermique et la survie des légionelles sont estimés par observation de la cultivabilité sur milieu BCYE solide.

I-7-2. Étude de la viabilité des cellules

100 ul de chaque suspension bactérienne traitée diluée ont été étalés sur la gélose BCYE en duplicata. La souche a été ensuite incubée à 37°C dans l'étuve et les colonies formées sont comptées après 4 à 10 jours.

Afin de déterminer si les bactéries viables non cultivables sont capables de retrouver leur cultivabilité, nous avons décidé d'infecter les amibes. Pour cela, 0,5 ml de suspension bactérienne de Legionella pneumophila à une concentration de l'ordre de 10⁸ bactéries /ml traitées par la chaleur et non cultivables, ont été mises en présence de 3 ml de suspension d'amibes (souche 2) à une concentration de 8.10⁴ amibes/ml dans des tubes de culture cellulaire. 0,4 ml de la suspension de Legionella pneumophila sont mis en présence de 3 ml de suspension d'amibes (souche 1) à 6.10⁴ amibes/ml. Ces concentrations ont été choisies de façon à avoir un MOI de 200. Les co-culture sont ensuite incubées à 37°C pendant 3 jours. Un contrôle positif a été réalisé en incubant 50 ul d'une suspension de légionelles viables et cultivables à

10⁸ UFC/ml avec 3 ml de suspension d'amibes à 6.10⁵ amibes/ml et/ou à
8.10⁵ amibes/ml selon les souches. Cette culture a été incubée de la même façon que les tests précédents. Après incubation, 500 ul des co-culture sont centrifugées pendant 5 min à 12000g puis vortex pendant 1 min pour favoriser la lyse des amibes. 100 ul de cette suspension est étalée sur milieu BCYE en duplicata, puis incubée à 37°C pendant 6 à 10 jours.

I-8. Analyses statistiques

Dans notre étude, nous avons testé le pouvoir incubateur de deux souches amibiennes à permettre la prolifération d'une souche de Legionella pneumophila sérogroupe 1. Afin de déterminer qu'il est le facteur qui a influencé la vitesse spécifique de croissance de L. pneumophila, une étude statistique de l'ANOVA a été élaborée par le programme « SPSS 10.0» afin d'étudier l'effet de la souche ; le MOI et l'effet conjoint des deux. De même, pour comparer l'effet d'une co-culture après un traitement thermique à différents degrés sur le maintien et la récupération de la cultivabilité de la souche Legionella pneumophila sérogroupe 1, un test de corrélation a été effectué.

I-1. Validation de l'isolement des souches amibiennes

Figure 3: Photos des souches amibiennes isolées dans différents types de cultures

Les amibes ont été isolées sur la gélose non nutritive « NN-Agar »,les amibes ont été collectées en grattant la surface des géloses puis repiquées dans le milieu axénique PYG, une première observation microscopique a été effectuée sur les amibes du milieu gélosé puis une deuxième sur milieu liquide. Les résultats de validation des isolements sont montrés dans les photos ci-dessous.

I-2. Multiplication intra-amibienne de Legionella pneumophila

L'objectif des co-cultures était de tester la permissivité des amibes à L. pneumophila. Parallèlement, il s'agissait de tester l'influence du rapport de multiplicité d'infection sur la prolifération intra-amibienne de L. pneumophila.

I-2-1. Témoins légionelles

La figure 4 représente le suivi des concentrations de L. pneumophila sérogroupe 1 seule à une température 28°C et aux concentrations initiales de 10⁵ UFC/ml et 10⁶UFC/ml. Ces concentrations correspondent aux concentrations initiales en Legionella introduites pour les co-cultures lors de nos essais, ce sont les concentrations en Legionella qui ont été ajustées pour faire varier la MOI. Ces témoins de L. pneumophila seule montrent une diminution des concentrations bactériennes après 3 jours d'incubation dans le milieu de co-culture composé de tampon amibe, en passent de « log 5 à log 3,63 » pour le MOI 0,1 et de « log 6 à log 5 » pour MOI 10. La bactérie n'est plus donc capable de proliférer dans ce milieu. En revanche, elle ne conserve pas sa cultivabilité pendant au moins 72 heures quelque soit le MOI.

10 9 8 7 6 5 4


3 2 1 0

Figure 4: Suivi de la cultivabilité de L. p dans le milieu de co-culture aux MOI 0,1 et 10.

I-2-2. Témoins amibes

La figure 5, montre l'évolution des souches amibiennes pendant 3 jours d'incubation en présence d'une concentration d'Escherichia coli de 10⁶ UFC/ml à 28 °C dans le milieu de co-culture composé de tampon amibe supplémenté de 10% de milieu PYG. La croissance des amibes est exponentielle durant les premières 24 heures, pour les deux souches, avec un nombre d'amibes/ml de 8,20.10⁴ pour la souche-A1, et de 7,20.10⁴ pour la souche-A2. Après 24h de co-culture, la croissance des amibes entame la phase stationnaire. Toutefois, la vitesse de croissance est variable d'une souche à l'autre en fonction de la capacité prédatrice de chaque souche.

9,00E+04
8,00E+04 7,00E+04 6,00E+04
5,00E+04
4,00E+04 3,00E+04

Figure 5: Croissance des souches amibiennes (MOI 10) dans le milieu de co-culture I-2-3. Permissivité des souches d'amibes aux L. pneumophila

Afin de tester la permissivité des souches amibiennes, les co-cultures ont été réalisées à des ratios de 0,1 et 10. Les figures 6 et 7 montrent que les deux souches testées permettent la prolifération de Legionella pneumophila. Néanmoins, nous n'avons pas observé de différences entre les deux souches. Il semble que les deux souches amibiennes se sont montrées permissives à la souche de L.pneumophila qui atteint environ « 8,676 unités log (UFC) » en co-culture avec la SA1 et « 8,783 unités log(UFC) » en co-culture avec la deuxième souche amibienne après 48h au ratio de 10. Le constat est identique pour les co-cultures réalisées à un MOI 0,1. Par ailleurs, la vitesse de croissance observée entre les deux souches ne montre pas de différence statistiquement significative. D'une manière générale, nous avons noté que les souches d'amibes testées sont permissives à Legionella pneumophila.

Log UFC

MOI 0,1

LP SA1

LP SA2

Jours

Figure 6: Prolifération L.p en Co-culture avec les deux souches à la MOI 0,1
durant 72H d'incubation

Log UFC

MOI 10

LP SA1
LP SA2

Jours

Figure 7: Prolifération de L.p en Co-culture avec les deux souches à la MOI 10
durant 72H d'incubation

Les résultats indiqués dans les figures 8 et 9 ont montré que Legionella pneumophila a induit une inhibition de la croissance des souches amibiennes. Elle est différemment affectée en fonction de la souche amibienne et du ratio (bactéries/amibes). Pour le MOI (0,1), nous avons observé que la souche 1 est plus sensible à la cytopathogènicité de Legionella pneumophila avec environ (1,8.10⁴ amibes /ml à 48h) par rapport à la souche 2 avec environ (2,4.10⁴ amibes/ml). Inversement au la MOI de 10 où la souche 1 qui est la plus résistante (4,4.10⁴ amibes/ml) par rapport a (3,2.10⁴ amibes/ml) pour la souche 2 à 24h. Donc le comportement des souches vis-à-vis de la résistance à l'effet cytopathogène varie en fonction du ratio. L'analyse statistique de la variance selon le test de Duncan, montre la présence

d'une différence significative entre les témoins et les souches à différents ratios avec (p < 0,05), et une différence significatif (p<0,05) à l'intérieur de la SA2 entre les ratios 0,1et 10. Par contre entre la SA1 et la SA2 il n'y a pas de différence ( p>0,05). Aussi bien, à l'intérieur de la souche amibienne 1, le test a montré une différence non significatif (p>0,05). Ces résultats sont une preuve que la présence de la souche amibienne est essentielle à la prolifération de L. pneumophila.

Amibes/ml	MOI 10
8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 2,0E+04			SA1 SA2
0,0E+00		Jours

Figure 8: Inhibition de la croissance des amibes sur 72 h de co-culture par L.p a un MOI de 10

Figure 9: Inhibition de la croissance des amibes sur 72 h de co-culture par L.p a un MOI de 0,1

I-2-1. Cytotoxicité de L.pneumophila vis-à-vis des souches amibiennes

Afin d'étudier l'effet cytopathogène de L.pneumophila, deux ratios ont été utilisés pour les co-cultures. Les résultats obtenus nous ont permis d'observer un taux de cytotoxicité important vis-à-vis des deux souches. Pour le ratio de 0,1 à J1 (24 h) Legionella pneumophila a induit un taux de mortalité d'amibes de l'ordre de 36% pour la souche SA1 et de 19% pour la souche SA2. Alors que pour le ratio de 10, nous avons trouvé 62% pour la souche SA1 et de 22 % pour la souche SA2. À J2 (48 h), le nombre de trophozoïtes continue à diminuer jusqu'à la moitié 50% pour la SA1 et jusqu'à 28% pour la souche SA2 au ratio de 0,1. La diminution est de 70% pour SA1 et 40% pour SA2 au MOI de 10. La confirmation de la mortalité des trophozoïtes est constatée par un nombre de trophozoïtes dénombré à J3(72 h) dans lequel nous observons une inhibition cytotoxique des amibes par Legionella pneumophila qui atteint 68% et 48% pour la SA1 et SA2 respectivement au ratio de 0,1 et un taux d'inhibition de 72% et 62% pour la souche SA1 et SA2 respectivement au ratio de 10. Donc, le rapport de multiplicité d'infection à jouer le rôle de facteur discriminant dans la mortalité des amibes, que ça soit pour la souche amibienne 1 ou 2 avec une différence (résistance) de la souches SA2 par rapport à la souche SA1.

Figure 10:Taux de trophozoïtes vivants après 72h de co-culture avec L.p MOI 0,1

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
		24h 48h 72h
SA1 SA2	Souches

Figure 11: Taux de trophozoïtes vivants après 72h de co-culture avec L.p MOI 10 I-2-2. Affinité de L.pneumophila pour le substrat (amibes)

Afin de calculer la constante d'affinité KS, la linéarisation de Lineweaver et Burke, fondée sur le modèle cinétique de Michaelis-Menten a été élaborée. Elle permet d'approcher des valeurs des constantes de croissance par l'équation :y = x/S + 1/u Où « S » est la concentration en substrat (densité amibienne) et « 1/u » est l'inverse de la vitesse de croissance.

Figure 12: La relation entre la vitesse spécifique de croissance (u) de Legionella pneumophilla et du ratio initial (bactéries/amibes)

Dans ce cas, l'intersection entre la droite et l'axe des ordonnées correspond à la valeur 1/pmax, alors que l'intersection entre la droite et l'axe des abscisses correspond à la valeur - 1/KS. KS est la constante d'affinité pour le substrat, en d'autres termes il correspond au nombre d'amibes initiales nécessaires pour que la bactérie Legionella pneumophila puisse croître à une vitesse égale à la moitié de sa vitesse maximale de croissance, pmax étant la valeur maximale théorique de p pouvant être atteinte. Le tableau ci-dessous résume l'ensemble des paramètres calculés.

Tableau 2: Valeurs de KS (bactéries/amibe) et umax (h-1) à partir de la linéarisation

SA1	-7,80E-01	29,5	1,2821	0,034	20,38	0,537
SA2	-2,10E-01	19,5	4,7619	0,051	13,59	0,906

La valeur de KS calculée est plus faible pour l'essai avec la souche amibienne SA1 que pour la souche amibienne SA2. En particulier, Legionella pneumophila semble donc avoir besoin d'une plus grande quantité d'amibe de la souche amibienne SA1 par rapport à la souche amibienne SA2 pour assurer une croissance rapide. Le fait que la valeur de KS obtenue ici soit plus élevée pour Legionella pneumophila vis-à-vis de la SA2 viendrait étayer que la souche amibienne SA2 peut rapidement augmenter son activité prédatrice. Cependant, cette observation n'est valable que si les conditions (température ; souches), plus spécifiquement la quantité de substrat (amibes) disponible, sont favorables. Les valeurs de pmax sont corrélées aux valeurs de KS. En effet, la vitesse spécifique de croissance maximale la plus élevée correspond au KS le plus grand. Les temps de génération correspondants sont de 20,38 heures pour Legionella pneumophila en co-culture avec la souche amibienne SA1,et 13,59 heures en co-culture avec la souche amibienne SA2. Ces données devront être complétées par d'autres études. En effet, les données de départ sont insuffisantes pour l'application du modèle de Michaelis-Menten ou ce modèle ne peut pas s'appliquer à la cinétique d'absorption de bactéries par les amibes.

I-3. Impact du traitement thermique sur Legionella pneumophila

L'objectif de nos travaux, est de chercher la capacité des bactéries viables non cultivables à se revivifier suite au passage dans les amibes après un traitement thermique préliminaire (Figure 13).

	5,90 5,80 5,70 5,60 5,50	Témoin
*Log ufc/ml*	5,90 5,80 5,70 5,60 5,50
	5,40
	5,30 5,20

Figure 13: Impact du traitement thermique sur la cultivabilité de Legionella pneumophila

La figure 13 présente l'évolution du nombre de bactéries cultivables/ml en fonction du choc thermique appliqué. Pour les suspensions témoins (sans traitement thermique) la concentration bactérienne était de 6,53.105 cellules cultivables/ ml. Après le choc thermique nous observons que le nombre de bactéries cultivables diminue (0,36 unités log environ) suite à un traitement de 1 h à 62°C. Plus la température augmente, plus le nombre de cellules cultivables diminue sans qu'il atteigne le zéro UFC/ml, donc nous ne pouvons pas déterminer la température moyenne d'inhibition, (TMI) « c'est-à-dire la température minimale pour laquelle nous n'observons pas de bactéries cultivables ». Ceci pourrait laisser supposer que les bactéries à l'état VBNC sont plus résistantes aux stress environnementaux et spécifiquement la température, ce qui a déjà été suggéré par Chang et al, 2007.

			*Témoin* *SA1* *SA2*

			*T °c*

Figure 14: L'état viable non cultivable de L. p après co-culture avec les amibes

En ce qui concerne la capacité des bactéries viables non cultivables à se revivifier suite à une prolifération intra-amibienne, nous pouvons observer qu'après infection, les bactéries récupèrent leur cultivabilité que ça soit pour la souche amibienne SA1 dont la concentration bactérienne a augmenté à environ 8,13.105 cellules cultivables/ ml pour les bactéries sans traitement avec une augmentation de (0,1 unités log environ), ou pour la souche amibienne SA2 qu'après l'incubation des légionelles à l'intérieur d'elle n'arrivent qu'à une concentration de 7,47.105, ce qui fait une augmentation de (0,06 unités log environ). Aussi, pour les bactéries traitées pendant 1 h à 62°C et incubées par la SA1 une augmentation de concentration d'environ (0,06 unités log) correspond à 3,28.10⁵ par rapport au témoin qui était de 2,87.10⁵. Par contre les concentration bactéries, incubées par la SA2 leur concentration augmente faiblement et atteint un nombre de 2,98.105 cellules cultivables/ ml ( environ 0,02 unités log) sur la courbe d'évolution. Donc d'après ces résultats on peut dire que nos souches amibiennes permettent à la Legionella pneumophilla sérogroupe 1 de retrouver sa cultivabilité après une incubation en co-culture. L'analyse statistique de corrélation a montré une différence très hautement significative (p<0,01) entre les résultats témoin (avant co-culture) et les résultats obtenus après une co-culture avec la SA1 et la SA2. Donc les résultats témoin et (R-SA1 ; R-SA2) sont corrélées, ainsi l'analyse a montré une corrélation entre les résultats de la souche amibienne 1 et celles de la souche amibienne 2 avec (p<0,01).

Notre étude s'est intéressée à la problématique Legionella et notamment à la relation amibes-légionelles. En effet, dans la littérature 3 genres amibiens (Acanthamoeba, Naegleria et Hartmannella) permettent la prolifération de Legionella sont les plus décrites (Declerck et al, 2007). Pour étudier la problématique dans notre écosystème, deux souches amibiennes ont été isolées. Les essais, portant sur les co-cultures, ont montré que les 2 souches d'amibes testées sont perméables à L. pneumophila. Dans un premier temps, nous avons cherché à déterminer la capacité de ces 2 souches amibiennes issues de différents endroits à permettre la prolifération d'une souche de L. pneumophila. La souche amibienne est apparue comme un facteur discriminant pour la prolifération de Legionella, ce qui est en accord avec ce qui est décrit dans la littérature (Dey et al, 2010). La souche amibienne SA1 apparaît comme la plus propice à la multiplication de Legionella pneumophila. Cependant, la comparaison des proliférations dans différents souches laisse entrevoir une influence du genre (souche) sur la prolifération. Ce qui est en accord avec la littérature (Dupuy et al, 2013).

Dans notre étude, nous n'avons pas observé de différences significatives de prolifération entre les différentes souches amibiennes. En effet, après 72 heures de co-culture à la température de 28°C et pour une MOI de 0,1, une multiplication d'environ 3,8 unités logarithmiques a été observée dans les 2 souches. Malgré l'absence de différences significatives, nous avons, tout de même, pu observer une tendance à une prolifération de Legionella plus importante dans la souche amibienne SA1. Au regard de nos résultats, est vu l'absence de différence significative entre les souches vis-à-vis de la MOI on peut dire que la prolifération de Legionella est dépendante de la souche et non du ratio.

Ainsi, la souche de Legionella pneumophila sérogroupe 1 a induit une diminution du nombre de trophozoïtes due à l'effet cytotoxique. Cependant, après 3 jours de co-culture au MOI de 10, nous avons observé une résistance de la souche amibienne SA2 plus que la souche SA1. D'après Messi et al. (2013), la virulence des souches de Legionella pourrait être liée à leur capacité à proliférer au sein des amibes et aussi à leur cyto-phatogénicité, c'est-à-dire à leur capacité à lyser la cellule hôte. D'après d'autres auteurs, les souches peu virulentes de Legionella seraient moins aptes à se multiplier dans les amibes (Tyndall et Domingue, 1982). Ainsi, au vue des résultats que nous avons obtenus, nous pouvons dire que notre souche Legionella est plus virulente.

Notre travail porté sur l'impact des traitements par la chaleur sur la souche de Legionella pneumophila nous a permis d'observer que ces traitements étaient capables de conduire à la formation de bactérie viables non cultivables. Après une co-culture de 72 h de Legionella pneumophila avec les deux souches amibiennes, Legionella a pu retrouver leur cultivabilité. Ces résultats correspondent à l'hypothèse selon laquelle les bactéries à l'état VBNC sont potentiellement infectieuses et virulentes pour les cellules hôtes. Ainsi, si ces bactéries à l'état VBNC se retrouvent inhalées par l'Homme, on peut envisager qu'elles puissent être responsables du développement de la maladie chez celui-ci.

Au final, cette étude a montré la capacité de Legionella à s'adapter à son hôte amibien et à se proliférer au sein des amibes. Non seulement, la présence des amibes permet une prolifération rapide de Legionella mais la multiplication intracellulaire de Legionella permet de diminuer la sensibilité de la bactérie aux traitements (monochloramine, ozonation, etc..). La protection de Legionella dans les amibes contre la désinfection est un phénomène bien connu (Greub et Raoult, 2004).

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

L'objectif principal de ce stage de fin d'études était d'une part, d'améliorer les connaissances sur les associations des légionelles avec les amibes. D'autre part, c'est d'apporter des éléments pour mieux évaluer leur sensibilité au traitement par la température. Les deux souches amibiennes testées ont montré une capacité d'incubation vis-à-vis de la bactérie test. Ainsi, le taux de cytotoxicité induit par Legionella pneumophila sur ces amibes a démontré la faible résistance de la souche amibienne SA1 par rapport à la souche SA2. En effet, la souche de Legionella pneumophila sérogroupe 1 s'est montrée capable de se revivifier après un choc thermique. Donc le protocole utilisé in vitro dans notre étude nous a permis d'obtenir des résultats plus proches d'une réalité environnementale tout en s'affranchissant des contraintes liées au maintien d'un véritable biofilm. Ces résultats complètent les données de la littérature est devraient permettre, en particulier, d'identifier quelles amibes sont les plus susceptibles d'héberger et de constituer un réservoir de légionelles. Suite aux résultats obtenus, nous pouvons conclure que la croissance de L. pneumophila dépend de la souche bactérienne en elle-même et de la souche amibienne hôte. Généralement, il est reconnu que les amibes libres jouent le rôle des vecteurs grâce auxquels les légionelles se prolifèrent et se propagent dans l'environnement. A ce jour, les techniques utilisées pour lutter contre les légionelles font appel à des traitements physiques (rayons UV, chocs thermiques) ou à des traitements chimiques, ces derniers étant de loin les plus utilisées. Néanmoins, ces traitements ne donnent pas entière, satisfaction vue de la résistance acquise à chaque fois par les légionelles et les amibes.

Cependant, de nombreuses recherches restent encore à faire notamment sur l'identification des souches isolées et d'isoler d'autres hôtes pouvant potentiellement héberger Legionella. De plus, étudier le biofilm dans différents réseaux d'eau permettrait de mieux connaître l'effet de différents paramètres (composition de l'eau, vitesse d'écoulement, température ...) sur la structure du biofilm et d'améliorer ainsi les traitements anti-Legionella.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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ANNEXES

ANNEXE 1

Préparation des milieux de culture pour L. pneumophila Milieu gélosé BCYE : Composition pour 1 litre :

% cellules vivantes

MOI 0,1

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

0%

Souches