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Recherche de substances bio actives de centaurea microcarpa coss et dur.

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par Maroua FERHAT
Université de M'sila - Diplôme étude supérieur de biochimie 2009
  

Disponible en mode multipage

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    :ÜÜÜÜÜ?ÈÚÔ1Ç -~ØÇÑÜÞã-Ï~Ç .7ÑÆÇÒÜÜÌ~Ç .ÜÜ.ÑæåãÜÌ~Ç

    REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

    íÜÜãáÚ~Ç ËÍÈ1Ç æ íÜÜ~~ÚiÇ ã.ÜÜáÚÊ1Ç ÉÑÇÒæ

    MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

    AÜÜÜÜÜá~Óã1Ç ~ÖæÈ ÏãÍã ZÚã1Ì

    UNIVERSITE MOHAMED BOUDIAF - M'SILA

    MEMOIRE

    présenté

    A LA FACULTE DES SCIENCES ET DES SCIENCES DE L'INGENIORAT
    DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

    pour obtenir

    Le Diplôme des Etudes Supérieures en Biologie
    (DES)

    OPTION : BIOCHIMIE
    par
    Ferhat M., Kadi I. et Lahouaou A.

    THEME :

    Recherche de substances bioactives de l'espèce
    Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Encadré(e)(s) par :

    Mr Benkhaled A. M.A.C.C.

    Remerciements :

    On remercie tout d'abord Dieu tout puissant de nous avoir donné le courage, la force et la patience d'achever ce modeste travail.

    Nous tenons à remercier aussi :

    Nos chères familles.

    Notre encadreur Monsieur Benkhaled.A.

    Monsieur Sghiri.K, résponsable du laboratoire de Biologie ainsi que les ingénieurs de laboratoire, de nous avoir acceptés au sein de leur laboratoire et de nous avoir fournis les conditions les propices au bon déroulement de notre travail.

    Monsieur Zitouni A. responsable du laboratoire de Chimie, qui nous à accueillie dans son laboratoire. Ainsi que mlle Akrib pour ces précieux conseils.

    Tous les enseignants du département de Biologie et les étudiants de la promotion 2008 /2009. Et tous ceux qui ont participés de prés ou de loin à la réalisation de ce mémoire.

    Dédicaces

    Je dédie ce travaille, qui est le couronnement de toutes les années d'étude et qui ne s'est achevé sans votre amour et encouragement:

    Je remercie Dieu de tout puissant de m'avoir donné le courage, la patience et la volante pour réaliser ce travail.

    · A ma mère pour son amour et son encouragement depuis toujours, je la dit merci ma mère, tu es la meilleure j'en suis sure.

    · A mon père qui ma su encouragé et me soutenir sur tout les plans.

    · A mes soeurs et mes frères chaq'un par son nom.

    · A mes amies Maroua, Imane, Sara, Wahiba et Imene.

    · Monsieur Sghiri.K, responsable du laboratoire de Biologie ainsi que les ingénieurs de laboratoire, de nous avoir acceptés au sein de leur laboratoire et de nous avoir fournis les conditions les propices au bon déroulement de notre travail.

    · A monsieur le chef de département de Biologie: Sari M. et à tous les enseignants du département de Biologie

    · A tous les étudiants de biologie.

    Amel

    oédicace

    Mes remerciments vont tout d'abord à Dieu Tout puissant pour m'avoir donné la volonté, la patience et le courage de réaliser ce modeste travail.

    Je dédie ce travail à ma chère famille en particulier mon très cher et regretté père, ma mère et petite soeur ; Safa.

    Je remercie aussi :

    · Mes amis : Amel A., Imene B., Sara C., Wahiba A. et Imene K. pour tous les bons moments passées ensembles.

    · A mon encadreur Mr Benkhaled A. pour sa présence et ses conseils.

    · Le résponsables de laboratoire de Biologie Mr Sghiri Kamel et ses ingénieurs de laboratoire : Bilal, Benyahia et Aicha pour nous avoir admis au sein de leur laboratoire et nous avoir octroyé les conditions propices au bon déroulement de notre travail pratique ainsi qu' Wahiba, Zahra et Sara pour leur présence.

    · A monsieur le chef de département de Biologie: Sari M. et à tous les enseignants du département de Biologie sans exception pour leur efforts fournis durant ces quatre agréables années.

    · A l'ensemble des étudiants de ma promotion 2008 /2009.

    Et a tous ceux qui ont participés de prés ou de loin à l'accomplissement de se modeste travail.

    Merci, merci, merci

    aVarouor

    Dédicaces

    Je dédie ce travaille, qui est le couronnement de toutes les années d'étude et qui ne s'est achevé sans votre amour et encouragement:

    Je remercie dieu de tout puissant de m'avoir donné le courage, la patience et la volante pour réaliser ce travail.

    · A ma mère pour son amour et son encouragement depuis toujours, je la dit merci ma mère, tu es la meilleure j'en suis sure.

    · A mon père qui ma su encouragé et me soutenir sur tout les plans.

    · A mes soeurs et mes frères chaq'un par son nom.

    · A mes amies Amel, Maroua, Imane, Sara, Wahiba, Sara et Hala.

    · A tous les étudiants de biologie.

    Imene

    Résumé

    Centaurea microcarpa Coss et Dur., une espèce présente dans la région de M'sila (Hourane) a été étudié afin d'extraire des huiles essentielles par hydrodistilation, des polyphénols et des flavonoïdes ; par plusieurs méthodes utilisant des solvants de polarité différente, et de mettre en évidence la présence des composées phénoliques par une analyse chromatographique(CCM) en utilisant plusieurs systèmes solvants.

    Les résultats ont montrés que cette espèce contient des huiles en quantité moyenne (1,231%), des polyphénols(21%), des flavonoïdes majoritairement glycosylés (14, 074%), et les tests de mise en évidence ont confirmés la présence de coumarines, des tanins, d'anthocyanes et une faible quantité de saponosides.

    Abstract :

    Centaurea microcarpa Coss and Dur., A species present in the region of M'sila (Hourane) was studied to extract essential oils by hydroditilation, polyphenols, and flavonoids unsing different solvant. And to detect the presence of a phenolic compound by chromatography analysis (TLC).

    The results showed that this species contains essential oils (1.231%), polyphenols (21%) and flavonoids (14, 074%), and tests have underscored confirmed the presence of coumarins ,tannins, anthocyanin and a small amount of saponosides.

    ÕÎáã:

    ìÇÓìr~Ç Ê~Øñæ~ Õ~D Úìð ìáE ~ñÎÓÇÓÏ ÌñÔÌÇCross et Dur. .Centarea microcarpa íñÇ

     
     
     

    ÊòÓ~ÓáÇÇ ËìñÖ~Ç æ ËÇÐñìðì~~1Ç áìñò~Ç ËÇÐñÐ~ ìáE Êñìð~~~Ç Ë1È3Ôæ~Ç

    ÕEÎÎÓÇ ÊòáæF ÌáæÎÔ Ç.

     
     
     

    íòÎ~ñÔØ~ ÌæÍ

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    ð~ ìIæáÇÇ Akowah et al 5 ãÇÐÎÎÓ ~ 2005 4 ÉÐæ~ ÊáÎÎå ÊòÈØÞ íæÑ Ë~ÈñÒæ~Ç

    íå ÚÇìðÇË~ElÓ 8 .Ë~~~Ó

     
     
     


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    Ê~ñÔØ ðT íZÍáÇÇ ÏæÏÔæ~Ç AkowahÁ~æ~Ç ÊØÓÇì~ åòáE áì1~~Ç äÍ ) 18 (% Ê~ñÔØ ð~ ~åÇ Owens æ Johens ÏæÏÔæ~Ç ì~ß~ )21

    (%. ã1Î~Ç áìñò~Ç ËÇÐñÐ~ ÕáÎÎ~æ~ ÊÎÈñ~Ç ìñÛ Ð~Äñ 7å ÇÒE

    áìð~~òæ~~~ ËÇÐñìðì~~~Ç ÕáÇ ÎÎÓÇ äÍ)85(% æ )50(% ðÆ~æ~Ç ÆÖ11Ç ð1 íZÍáÇÇ ÏæÏÔæ~Ç ì~~ ËòÍ )14(% ÌÆ~Îð Ð~Äñ ~å ÇÒ~

    . Õì~ìá~~Ç Êò~1~Ó æ ÊòË~Ë ÊòÆ~ñË ËÇÐòðì~~~Ç ÏìÌæ æ íòÎ~YO Ç íòÎ~ñÔØ~Ç

    ÌæÍ ÊòÆ~òæòEìÎò~Ç ËÇÓ~ÈÎNáÇÇ ÖÚ~ ÊØÓÇì~ áìñò~Ç ËÇÐñÐ~æ ËÇÐñìðì~~IÇ ËÇÐñÕìðì~15~Ç íñÓ~åìß~Ç íòð~òÓìÎðáÇÇ ÏìÌæ Ë~ÈËÇ ÐÚ~

    . ðTEñÈ~Ç Þì~ æ ðÆÔæ~Ç íò~~~æ~Ç ð~ ðòØ Ç ÁÇìÖÎÓáÇÇ æ Ê~òÞÓ Ê~òÕ ìá~ ~ò1ÇÔÛìÍ1åæÔ~ ÊØÓÇì~ ÖòòæÎ~Ç ÊòáæU

    ÊòÆ~òæòß~Ç ÊÓÇÓÐ~Ç ÐÚ/ Centaurea microcarpa Cross et Durðáñ ~å íå ììßÎÍ :

    áìñò~Ç Ë ÇÐñÐ~

    , ËÇÐñìðì~~~Ç , ÊòÓ1ÓáÇÇ ËìñÖ~Ç , ËÇÐñÕìðìTh Ç , Û~~Ð~Ç ,íòð~òÓìÎðæáÇÇ, Ë~ññÓ~åìß~Ç

    Sommaire :

    Introduction

    Chapitre I: Les polyphénols et mesure de l'activité antioxydante. I.1. Polyphénols

    I.2.Les flavonoides.

    I.3. Activitées biologiques des polyphénols

    Chapitre II: Les huiles essentiels et mesure de l'activité antibactérienne

    II.1. Les huiles essentielles

    II.2. Méthodes d'extraction des huiles essentielles

    II.3. Activité antimicrobienne des huiles essentielles

    II.4. méthodes de mesure de l'activité antimicrobienne de HE

    Chapitre III. Plante d'étude III.1. La plante d'étude II.2. Région d'étude

    Chapitre IV. Matériel et méthodes

    IV.1. Matériel végétal

    IV.2. Extraction des extraits bruts polyphénoliques

    IV.3. Extraction des flavonoides

    IV.4. Extraction des huiles essentielles par hydrodistillation

    IV.5. Tests phytochimiques

    IV.6. Séparation des extraits méthanoliques bruts par CCM

    IV.7. Spéctrophotométrie UV-visible

    Chapitre V. Résultats et interpretation

    V.1. Tests d'humidité et séchage

    V.2. Extractions

    V.3. Extraction des flavonoides

    V.4. Extraction des HE

    V.5. Caractérisation des extraits bruts polyphénoliques

    V.6. Chromatographie sur couche mince

    V.7. Spectrophotométrie UV-visible

    Liste des figures :

    Figure 01 : Répartition des polyphénols dans quelques fruits et légumes.

    Figure 02 : Structure générale des flavonoïdes (C6-C3-C6)

    Figure 03 : Structure chimique du DPPH.

    Figure 04 : Structure du précurseur des huiles essentiels : l'isoprréne.

    Figure 05 : Photo de Centaurea microcarpa Coss. et Dur.

    Figure 06 : Localisation de la zone d'étude.

    Figure 07: Test d'humidité de la partie aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur. Figure 08 : Protocol d'extraction des polyphénols selon la méthode d'Akowuah et al., 2005 Figure0 9 : Filtration des extraits (à travers un tissus)

    Figure 11: Extrait méthanolique

    Figure10 : Evaporation des extraits par rotavapor.

    Figure 12 : Protocol d'extraction des EBP selon la méthode d'Owen et Johns, 1999.

    Figure13: Protocol d'extraction des flavonoïdes totaux selon la méthode de Mabray et Makhram, 1982.

    Figure 14: Schéma de principe d'une extraction par hydrodistilation.

    Figure 15 : Extraction des HE par hydrodistilation.

    Figure 16 : Principe d'une séparation CCM.

    Figure 17: Pourcentage en eau de la partei aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Figure18 : Rendements d'extraction en fonction du type de solvant et du temps d'extraction

    des parties aériennes de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Figure 19: Rendement en flavonoïdes totaux chez Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Figure 20: Répartition des différentes fractions flavonoides de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Figure21: Pourcentage en HE de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Liste des tableaux :

    Tableau 01 : Classement des fruits et deslégumes riches en polyphénol. Tableau 02 : Principales méthodes d'études des composées phénoliques. Tableau 03 : Principales activités biologiques des composées phénoliques.

    Tableau 04 : Déscription botanique de quelques especes du genre Centaurea.

    Tableau 05 : Aire de répartition de quelques espèces du genre Centaurea. Tableau 06: Composition chimique de quelques espèces du genre Centaurea. Tableau 07: Propriétés thérapeutiques de quelques espèces du genre Centaurea.

    Tableau 08: Les parties de la plante utilisées de quelques espèces du genre Centaurea. Tableau 09: Les différents systémes solvants utilisées pour la ccm

    Tableau 10: Teneur en eau de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Tableau 11: Ensemble des résultats de l 'extraction des EBP.

    Tableau 12 : Rendement de l'extrait méthanolique.

    Tableau 13: Rendement en flavonoides totaux de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Tableau 14: Résultats des tests phytochimiques.

    Tableau 15 : Plaques CCM après élution et observation sou UV.

    Tableau 16: Propriétés physicochimiques des étalons utilisées en CCM.

    Tableau 17: composés phénoliques identifiés par CCM (Markham, 1982). Tableau 18: Révélation des flavonoïdes après séparation CCM (Markham, 1982). Tableau 19: Composés phénoliques probables identifiés par CCM .

    Tableau 20 : Résultats de l'analyse spectral.

    Introduction :

    Les plantes véritable usine chimique ne cessent de nous épater encore et encore par la richesse des constituants qu'elles synthétisent que par les multiples utilisations qu'elles trouvent dans notre vie quotidienne. Cela nous fait ouvrir les yeux sur la terre, sur sa végétation et sur les possibilités médicinales car malgré les énormes progrès réalisés par la médecine moderne l'homme n'a eu que les plantes pour le guérir et prévenir depuis la nuit des temps du fait que les plantes présentent des remèdes naturels bien acceptés par l'organisme .

    La recherche sur les substances naturelles est un thème porteur de puis quelques années et les laboratoires pharmaceutiques sont toujours prêts à l'élaboration de nouveaux composés actifs, à l'identification, à la caractérisation des molécules naturelles et à la mise au point des médicaments qui ont pour origine des substances naturelles et de s'inspirer de leurs structures moléculaires pour imaginer de nouveaux médicaments. Ces molécules que constitue le principe actif des plantes médicinales appartiennent majoritairement aux métabolites secondaires tels que les polyphénols, les huiles essentiels et les alcaloïdes.

    On s'est intéressé dans notre travail aux molécules ayant des propriétés antioxydantes. Dans ce cadre, on a étudié les extraits d'une espèce végétale ; Centaurea microcarpa Coss et Dur., suivant deux approches

    - Une approche théorique visant:

    · Présenter les polyphénols et les huiles essentielles de façon générale

    · Mettre en avant les activités anti oxydantes des polyphénols et l'activité

    antimicrobienne des huiles essentielles.

    - Une approche expérimentale consistant à :

    · Extraire des polyphénols, des flavonoïdes et des huiles essentielles par différents

    méthodes et déterminer les différents facteurs qui influencent leur extraction ainsi que

    les rendements.

    (CCM) et une analyse spectrale par spectrophotométrie UV-visible.

    · Soumaitre les extraits brutes polyphénoliques a une analyse chromatographique

    Les polyphénols et

    mJsXtJ IdJ Il'LF\ivité

    antioxydante

    I.1. Les polyphenols :

    I.1.1. Définition des polyphénols:

    Avec environ 9000 structures naturelles élucidées à ce jour, les polyphénols constituent une famille importante de métabolites secondaires de faible poids moléculaire du règne végétal (Akowah et al, 2004), qui correspondent à une très large gamme de structures chimiques et sont un bon témoin de l'extraordinaire capacité de biosynthèse des plantes. Ce sont des corps dont la molécule contient plusieurs fonctions phénols (Ferguson L, 2000), ces corps jouent un rôle fondamental car sont des éléments importants de qualités sensorielles (couleur et caractère organoleptique.) et nutritionnelles des végétaux que consomme l'homme et leur intervention dans la santé et maintenant reconnue dans des domaines variés,anticoncerigene ,antioxydant, la lutte contre le vieillissement des cellules (Sarni-Manchado et Cheynier,2006), anti oestrogenique et anti inflammatoire, certains d'eux sont dits non nutritionnels car ils ne jouent aucun rôle dans la plantes.

    I.1.2 Localisation au niveau cellulaire et tissulaire:

    Une bonne reconnaissance de la localisation des composés phénoliques dans les différents tissus et organes végétaux est souvent essentielle pour orienter l'utilisation que l'homme souhaite en faire.

    A l'échelle cellulaire, la localisation des composés est très caracteristique.Ils s'accumulent principalement dans deux sites : d'une part la paroi cellulaire ou sont présentes les lignines et la

    vacuole RX \RQ \tRFké\ O\ SNénRl\ \RlXRe\ [lntNRF l11\, KlMRnRl\, Ilnin\, I FRtlin\

    flavonoïdes (quercétine, kamphérol) pourraient également être présents au niveau du noyau et de la membrane plasmique mais toujours à très faible concentration.

    A l'échelle tissulaire, on observe également des repartions très inégales des différents composés phénoliques. Ainsi les anthocyanes et les pigments de type flavonols sont généralement présent dans les couches cellulaires externes des organes végétaux en particulier les épidermes de fruits et des feuilles.(Sarni et Cheynier ,2006).

    =Répartition au niveau des fruits et légumes:

    Plusieurs milliers de polyphénols ont été identifiés chez les plantes dont plusieurs centaines dans les plantes comestibles. Il est généralement admis que les humains ingèrent environ 1 gramme de polyphenols par jour (Akowah et al, 2004).

    Tableau 01 : Classement des fruits et légumes les plus riches en polyphénols :
    ( Brad et al., 2008 )

     

    Fruits et légumes

    PP totaux ( mg GAE/100 g )

    01

    $ EtiFKIIIXtJ(JF IXEJI

    321.3

    02

    Persil

    280.2

    03

    Fraise

    263.8

    04

    Choux de Bruxelles

    257.1

    05

    Litchi

    222.3

    06

    Raisin

    195.5

    07

    Abricot

    179.8

    08

    Pomme

    179.1

    09

    Echalote

    104.1

    10

    Datte

    99.3

    11

    Brocoli

    98.9

    12

    Cerise

    94.3

    13

    Figue

    92.5

    14

    Célerie

    84.7

    15

    Oignon

    76.1

    16

    Nectarine blanche

    72.7

    17

    Fruit de passion

    71.8

    18

    Poire

    69.2

    19

    Mangue

    68.1

    20

    Aubergine

    65.6

    60%

    0% 0%

    40%

    légume fruits

    Figure 01 : Répartition des polyphénols dans les fruits et légumes.

    Les polyphénols sont particulièrement abondants dans les fruits. Leur teneur Peut atteindre 263.8. mg GAE / 100 g dans certains fruits comme les fraises, les pommes, les raisins.

    Les légumes contiennent aussi des quantités importantes de PP. le champion toute catégories est l'artichaut avec une concentration de 321.3 mg GAE / 100 g.

    Parmi les 20 premiers fruits et légumes les plus riches en polyphénols. 60 % représentent les fruits et le reste des 40 % est représenté par les légumes

    q 11141 1 plKEdl-lafpWdl-f al-s SEOSKpnEC :

    L'extraction, la séparation, la caractérisation et le dosage des composées phénoliques se fait selon plusieurs méthodes, les plus utilisées et employées sont résumé dans le tableau qui suit :

    Tableau 02 : Principales méthodes d'études des composées phénoliques :

     

    Techniques :

    Principe:

    Référence :

    Extraction

    Extraction par les

    solvants (macération)

    Le contacte entre le solvant(liquide) et la matière

    végétale (solide) a pour but de libérer les polyphénols présents dans les cellules par rupture du tissus végétale et par diffusion.

    Owen et johns, 1999

    Hayouni et al.,2007

    Extraction par

    chromatographie sur

    colonne

    Elle consiste à absorber sur une résine du type C18 pour les polyphénols et flavonoïdes des extraits végétaux puis à éluer sélectivement les substances polyphénoliques au moyen d'éthanol ou méthanol aqueux .

     

    Extraction supercritiques (SFE)

    -Le CO2 supercritique, utilisé comme solvant

    d'extraction, du fait de sa faible viscosité lui confère une grande capacité de diffusion lui permettant d'avoir accès à des composées phénoliques liés a la paroi cellulaire et sa densité relativement élevé lui confère un pouvoir de solvatation ce qui permet un meilleur taux d'extraction. -Procédé non dénaturant.

    -Temps d'extraction réduit.

    Chan et Maznah ,2009

    Separation et purification

    Chromatographie sur couche mince (CCM)

    Séparation et purification des différents constituants en fonction de leur taille et de leur forme Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et

    moins adsorbé sur la phase stationnaire.

    Tissut, 1967

    Chromatographie liquide haute
    performance (HPLC)

    L'échantillon à analyser est poussé par un liquide
    (appelée phase mobile) dans une colonne remplie d'une

    CastanedaOvando et al.,2009.

    phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire

    Chromatographie
    phase gaz (CPG)

    Les différents solutés gazeux vont se séparer par

    migration différentielle le long de la phase stationnaire.

    Colin-Henrion et al.,2008

    Caracterisation

    Chromatographie sur couche mince (CCM

    Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et

    moins adsorbé sur la phase stationnaire.

    Lawson,2006

    Spectrophotométrie UV-visible

    méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.

    Harbourne et al.,2009

    HPLC-MS et RMN

     

    Bassomo et al.,2004

    Dosage

    Dosage par

    spectrophotométrie

    Par méthode de Folin ( non spécifique)

    Harbourne et al.,2009

    Dosage par HPLC

    Séparation sur colonne phase inverse C18 et détection à l'aide d'un spectrophotomètre UV 171

    Lawson,2006

    ².2. Les flavonoïdes

    Les flavonoïdes présentent la plus grande classe de polyphénols, ils relèvent du métabolisme secondaire et sont très répondus dans le règne végétal. On estime que 2% de l'ensemble du carbone photo-synthétisé par les plantes est transformé en flavonoïdes (Alothmane et al.,2009).

    Ils sont présent dans les feuilles, les fleurs, le pollen et les fruits, leur concentration augmente avec l'exposition au soleil et constituent de ce fait un écran protecteur contre la photo et la thermodégradation (protègent la plante des agressions du rayonnement UV) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Ils participent aussi à la coloration des fleurs et des fruits et existent le plus souvent a l'état naturel sous forme d'hétérosides.

    Les flavonoïdes sont des molécules polyphénoliques avec un squelette diphenylpropane (C6-C3- C6) (Alothmane et al., 2009), fait de 15 atomes de carbone, avec une grande diversité structurale, en effet, on en dénombre 5000 composés différents et présentant des propriétés de solubilités différentes influençant leurs extraction (Alothmane et al.,2009).

    Plusieurs études ont soulignés que les flavonoïdes de différentes sources botaniques agissent comme antioxydants puissant encor plus que la vitamine C (Alothmane et al.,2009),

    due principalement à la configuration catéchol du noyau B. Cette activité s'exerce surtout dans les milieux émulsionnés car ils sont peu solubles dans les phases lipidiques et protègent efficacement les lipoprotéines ou liposomes (Sarni-manchado et Cheynier, 2006). Les flavonoides agissent comme antioxydants primaires et stabilisent les radicaux peroxydes, mais peuvent aussi désactiver l'ion super-oxyde, le radical OH* ou l'oxygène singulet, inhiber la lipoxygénase ou encor chélater les métaux (surtout les flavonoïdes) (Sarni-manchado et Cheynier, 2006).

    Figure 02: Squelette flavonoïdique ( C6-C3-C6)

    Deux cycles aromatiques de type phényl A et B liés par une chaine de trois carbone généralement cycliques.

    Le degré d'oxydation du cycle détermine les différentes classes de flavonoïdes

    qiim Activités biologiques des polyphénols :

    Les composées phénoliques sont douées d'activités diverses, probablement su a leurs diversités structurales, le tableau suivant, englobe les activités biologiques des polyphénols les plus importantes :

    Tableau 03 : Principales activités biologiques des composées phénoliques :

    Classes de polyphénols

    Activités

    Références

    Acide phénoliques

    Anti carcinogènes Anti mutagènes

    Anti oxydants

    Ferguson, 2001

    Sarni-Manchado et Chenyier ,2006

    Stilbénes

    Inhibent l'oxydation des LDL et l'agrégation des plaquettes

    Anti carcinogènes Anti mutagènes

    Sarni-Manchado et Chenyier, 2006

    Ferguson, 2001

    Coumarines

    Anti carcinogènes Anti mutagènes

    Digestibilité des protéines

    Ferguson,2001

    Lazoui et al ,2006

    Flavonoïdes

    Anti carcinogènes Anti mutagènes

    Anti oxydants

    Ferguson, 2001

    Alothane et al ,2009

    Anthocyanes

    Anti oxydants Colorants

    Sarni-Manchado et Chenyier ,2006 Ferguson, 2001

    Lignines

    Anti carcinogènes Anti mutagènes

    Ferguson,2001

    Tanins

    Anti oxydants Anti tumoral

    Digestibilités des protéines

    Mousavinejade et al. ,2009

    Lazoui et al ,2006

    Proanthocyanidines

    Anti inflammatoires

    Anti bactériens Anti fongiques

    Ferguson,2001

    ²I.3.1 . L'activité anti oxydantes des polyphénols :

    L'activité des composés phytochimiques attire notre attention du fait leur rôle potentiel dans le prévention des maladies humaines. Les composés phénoliques sont considérés comme étant le groupe majeur de métabolites secondaires, qui contribue à l'activité antioxydante des plantes.

    a. Définition de l'oxydation :

    L'oxydation est les phénomènes qui fait rouiller les métaux, qui fait flétrir les légumes et les fruits, rancir les graisses, il modifie le gout et la couleur des aliments.

    Sur le plan chimique l'oxydation est générée par des radicaux libres; espèces chimiques neutres ou chargées instables qui ne cherchent qu'à récupérer un électron dans leur environnement pour retrouver un état stable, très rapide et se propage en cascade. Ils ciblent tous les corps gras comme les phospholipides des membranes cellulaires mais aussi les proteines.Dans le cas des enzymes, l'oxydation entraine une modification ou perte de l'activité biologique de la molécule ce qui provoque des désorganisations cellulaires par fois irréversibles entrainant la mort cellulaire .Il on est de même quand l'oxydation touche l'ADN (Rolland Y, 2004).

    b. Mécanisme de l'oxydation :

    On décrit l'oxydation en trois phases distinctes, mais pratiquement simultanées:

    - L'initiation : Formation d'hydroperoxydes, initiée par la chaleur et l'UV ou les ions métalliques et aboutit a la formation des espèces très réactives :ROOH et R*.

    - Propagation :Destruction des hyperoxydes et apparition des composés responsables des gouts et odeur de rance par rupture des liaisons O-O.

    -Terminaison :Apparition de nouvelles espèces moléculaires anarchiques (formation des polymères ou au contact avec un autre radical),les molécules crées n'ont plus de fonctions biologiques.

    Les espèces radicalaires produites par les premières réactions sont hautement réactives et vont à leur tour arracher un hydrogène à une autre molécule (Rolland ,2004).

    c. Les antioxydants:

    Ce sont des molécules qui fixent les radicaux libres et protègent les protéines essentielles et qui diminuent ou empêchent l'oxydation d'autres substances chimiques (Weber B 2009).

    Il existe deux types d'anti oxydants :

    Les antioxydants primaires ou vrais :

    Ils permettent l'interruption de la chaine auto catalytique

    AFT + R* = A*+ RFT

    La molécule AFT est antioxydante, si le radical A* peut s'expliquer par sa conversion en composés non radicalaires A* + A° =A-A ou A* + R° =AR.

    Les antioxydants secondaires ou préventifs; qui assurent l'inhibition des la production des radicaux libres. Ce sont des substances décomposant les hyperoxdes en alcool, des thiols (glutathion, acide aminés soufrés) ou les disulfures, des protecteurs vis-à-vis des UV, comme les carotènes, des chélatants des métaux promoteurs d'oxydation type fer et cuivre, comme l'acide citrique et le lécithine)ou en fin des séquestrant d'oxygène comme l'acide ascorbique.(Rolland ,2004).

    Lorsque les mécanismes de défense sont insuffisants et/ou lorsque un excès est gêner et/ou l'apport d'antioxydants est réduits suite à une alimentation déséquilibrée, le stress oxydatif peut induire des dégâts cellulaires ,des troubles métaboliques et générer une réaction inflammatoire.une prédisposition génétique également être la cause d'une capacité de décence anti oxydative diminuée .

    Le stresse oxydatif est donc le résultat d'un équilibre entre la balance des pro-oxydants et les systèmes de défense (antioxydants) (Weber B,2009).

    ²I.3.2. Les méthodes de mesure de l'oxydation:

    Toutes les méthodes de mesure du pouvoir antioxydant d'un principe actif reposent sur le même principe également provoquer une oxydation sur une matrice sensible, et mesurer le ralentissement de dégradation de la matrice protégée par l'antioxydant par rapport à un témoin sans protection.(Rolland ,2004).

    ²I.3.2.1 . Mesure en milieu lipidique :

    a. Mesure de l'oxydation en temps réel:

    Elle se fait par la mesure de l'indice de peroxyde (le nombre de 1 gramme d'oxygène actif du peroxyde contenus dans 1 gramme de corps gras susceptible d'oxyder l'iodure de potassium avec libération d'iode).l'efficacité de l'antioxydant liposoluble est mesurée par une augmentation plus lente de l'IP par rapport à 1 témoin sans protection. (Rolland , 2004).

    Chapitre I : Les polyphénols et activité anti oxydante.

    b. Mesure de l'oxydation par tests de vieillissements accélérés:

    - Test de swift ou AOM (Active Oxygen Méthod ):

    Ce test consiste à faire passer un courant d'air purifié dans un échantillon d'huile à 97,8°C à des intervalles régulières ,on mesure l'IP, et on détermine le temps nécessaire à un indice de peroxyde de 100 meq d'oxygène actif/Kg de matière grasse .

    Ce mode de mesure peut être réalisé par d'autres tests :

    .l'utilisation de l'appareil "Oxypress"
    .l'utilisation de l'appareil "Rancimat"

    9ETE2E2E 2F1) isuai2Fil2FP laiu2FDDiN :

    a. Mesure au DPPH :

    Le DPPH (1,1 Diphényl 2 Pycril Hydrazil) est un radical libre stable de couleur violette intense. La mesure de l'efficacité d'un antioxydant (capacité à fixer des radiaux libres, donc arriter la propagation de la réaction en chaîne). (Rolland, 2004).

    ,en particulier l'utilisation du paramètre CE50 (Concentration efficace de substrat pour produire 50% de réduction du DPPH ) (Molyneux ,2004) ,se fait en mesurant la diminution de la coloration violette, à 515nm-517nm, due à une recombinaison des radicaux DPPH .

    Lorsqu'une solution de DPPH est mélangé avec une substance qui peut donner un hydrogéne, alors cette réaction donne lieu à la forme réduite avec perte de la couleur violette ( avec une couleur jaune pale résiduelle du groupements picryl encor présent).

    Représentons le radical DPPH par Z*, et le donateur de proton par AH. La reaction primaire est :

    Z* + AH ZH+ A*

    Ou : ZH est la forme réduite du DPPH.

    A* est le radical produit par cette première étape.

    Ce dernier subira d'avantages de réactions et réagira avec une autre molécule de la mrme espèce, produite par une réaction parallèle avec inhibition du radical.

    Ainsi le DPPH visa à représenter un radical libre dont l'activité doit etre supprimé par la substance antioxydante (polyphénol)

    a: Diphenylpicrylhydrazyl (radical libre) b: Diphenylpicrylhydrazine (non radicalair)

    Figure 03 : Structure du DPPH (Molyneux ,2004).

    b. Les paramètres influençant la mesure au DPPH:

    Cette mesure se fait grâce à un spectrophotomètre visible, la solution est mise dans une cuve d'1 cm de largeur avec un volume maximal de 4ml, pour une précision d'analyse, les mélanges devraient être utilisés (comme 0,1 ml et 3,9ml et vise vers ca) mais cela peut réduire la précision de la mesure.

    b.1. Solvantet et pH:

    En ce qui concerne le solvant à utiliser, la méthode semble fonctionner aussi bien avec du méthanol ou l'éthanol qui interférent avec la réaction (ce sont les 2 solvants les plus communaiment utilisés), tandis que l'utilisation d'extraits d'eau ou d' acétones semble donner des valeurs inferieures (moindre).

    Pour le pH, il a été suggéré que le système devrait être maintenu à un pH se situant dans une fourchette de 0,5 à 6,5 à l'aide de tampon d'acétates mais ,cette précaution semble être abandonnée dans la pratique actuelle. En effet, il existe une grande incertitude dans le sens du pH dans ces valeurs principalement en milieu organique tels que le méthanol et l'éthanol.

    b.2. La concentration en DPPH:

    En spectrophotométrie, la concentration en DPPH dans la cuvette doit être

    choisie de façon à donner des valeurs d'absorbances inferieures à 01 (ce qui correspond à l'intensité lumineuse que décroit en passant par l'échantillon).Cela suppose une concentration entre 50 à 100 Um.

    b.3. Longueur d'onde: L'absorbance est mesurée à 515 nm, ce qui correspond au maximum d'absorbance.

    b.4. Le temps de réaction:

    Dans la méthode originale décrite par Blois, un temps de température de 30minutes a été recommandé, compte tenu du fait que le taux de la température est très variable entre les substrats. La meilleure pratique semble être de suivre la température jusqu'à la fin (en plateau).

    -Le taux de température a été proposé comme un autre paramètre pour caractériser les activités antioxydantes.

    Les huiles essentiels et

    mesure de l'activité

    antibactérienne

    II. 1.Les huile essentielles :

    II.1.1. Définition, localisation et répartition :

    Huile essentielle ou huile aromatique sont des produits obtenus a partir d'une matière première végétale, elles sont classées parmi les métabolites secondaires, leur synthèse et accumulation se font généralement au niveau des structures histologiques spécialisées, souvent localisées sur la surface de la plante. Ces huiles peuvent êtres stockées dans divers organes ; fleurs (origan), feuilles (citronnelle, eucalyptus), écorces (cannelier), bois (bois de rose, santal), racines (vétiver), rhizomes (acore), fruits (badiane) ou grains (carvi) (Hernández, 2005).

    Les huiles essentielles n'ont pas une présence générale chez les végétaux. Environ 1%

    des espèces élaborent des essences. Certaines familles se caractérisent par le grand nombre d'espèces à essences qu'elles groupent et en particulier les labiés (Thym, Menthe, Lavande, Origan, Sauge, etc.), les Ombellifères (Anis, Fenouil, Angélique, Cumin, Coriandre, Persil, etc.), les Myrtacées (Myrthe, Eucalyptus), les Lauracées (Camphrier, Laurier-sauce, Cannelle) (Benayad N, 2008).

    II.1.2. Chimie des HE :

    Sur le plan chimique, les huiles essentielles sont des molécules très volatiles, de structure extrêmement complexe, synthétisées à partir d'unités méthyle-2-buta-1,3-diène (isoprène) (figure04). Les diverses combinaisons de ces unités, par réaction d'additions, conduisent aux terpènes, sesquiterpènes, diterpènes, mais aussi à leurs produits d'oxydation tels que les alcools, aldéhydes, cétones, éther et ester terpéniques (Hernández, 2005).

    Les HE doivent leur nom à ce qu'elles sont très réfringentes, hydrophobes et lipophiles. Elles ne sont que très peu solubles ou pas du tout dans l'eau et on les retrouve dans le protoplasme sous forme d'émulsion plus ou moins stable qui tende à se collecter en gouttelettes de grosse taille. Par contre, elles sont solubles dans les solvants des lipides (acétone, sulfure de carbone, chloroforme, etc.) et, à l'inverse des glycérides, dans l'alcool (Delaquis et al., 2002).

    II.1.3. Propriétés des HE :

    Elles ont des propriétés et des modes d'utilisation particuliers et ont donne naissance a une branche nouvelle de la phytothérapie : l'aromathérapie (Delaquis et al., 2002).

    Les huiles essentielles possèdent de nombreuses activités biologiques. En phytothérapie, elles sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques contre les maladies infectieuses, cependant, elles possèdent également des propriétés cytotoxiques qui les rapprochent donc des antiseptiques et désinfectants entant qu'agents antimicrobiens à large spectre (Hernendez, 2005).

    Chapitre II : Les Huiles essentielles et activité anti bactérienne

    Figure 04 : Structure du précurseur des HE : l'isoprène.
    (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006)

    IIM. AD plbaISHAIS'exMLFIKQAISHA (:

    II.2. 1.Entraînement à la vapeur :

    La plupart des huiles essentielles sont obtenues par distillation et entraînement à la vapeur d'eau, trois variantes sont possibles selon la texture et la fragilité de la matière première à traiter.

    II.2. 1.1. Hydro-distillation simple :

    La plante est mise en contact avec l'eau dans un ballon lors d'une extraction au laboratoire ou dans un alambic industriel. Le tout est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les HE se séparent de l'eau par différence de densité.

    II.2. 1.2.Distillation à vapeur saturée :

    Le matériel végétal n'est pas en contact avec l'eau, il est placé sur une grille perforée au-dessus de la base de l'alambic. Les composés volatils entraînés par la vapeur d'eau vont pouvoir ~tre séparés par décantation du distillat refroidi.

    II.2.2. Hydrodiffusion :

    L'hydrodiffusion consiste à faire passer un courant de vapeur d'eau à très faible pression à travers la masse végétale. La composition des produits obtenus est sensiblement différente au plan qualitatif de celle des produits obtenus par les méthodes précédentes. L'industrie des parfums a utilisé jadis l'enfleurage pour les organes fragiles comme les fleurs, c'est-à-dire le contact avec un corps gras qui se sature d'essence. Le corps gras est épuisé par l'alcool absolu et ce solvant est évaporé sous vide à 0°C.

    II.2. 3.Extraction par CO2 super critique :

    La technique se base sur la solubilité des constituants dans le CO2 et de son état physique. Grâce à cette propriété, il permet l'extraction dans le domaine supercritique et la séparation dans le domaine gazeux. Le CO2 est liquéfié par refroidissement et comprimé à la pression d'extraction choisie, ensuite il est injecté dans l'extracteur contenant le matériel végétal, après le liquide se détend pour se convertir j à l'état gazeux pour ~tre conduit vers un séparateur où il sera séparé en extrait et en solvant.

    II.2. 4.Extraction assistée par micro-onde :

    La technique d'extraction par micro-onde à été développée au cours des dernières décennies à des fins analytiques. Le procédé d'extraction est basé sur l'absorption de l'énergie de la micro-onde par les composantes du matériel végétal et qui sont mesurées par une constante diélectrique, cette absorption dépend aussi de la fréquence de l'onde et de la température du matériel végétal.

    II.3. / 4111151WWi HIFIERIKIRR auiles essentielles :

    Les HE les plus étudiées en littérature sont reconnus par une forte activité antimicrobienne, antifongique et antiparasitaire, en effet plusieurs auteurs ont mis l'accent sur cette activité (Benayad, 2008, Delaquis et al., 2002, Sudjanaa et al., 2009). Ces derniers présentent des activités remarquables contre des souches bactériennes à Gram négatif et à Gram positif.(Hong Yao et al.,2009).

    Etant donné la grande complexité de la composition chémotypique des HE et malgré les possibilités de synergie certains auteurs préfèrent étudier l'effet d'un composé isolé pour pouvoir ensuite le comparer à l'activité globale de l'huile. Ainsi l'activité fongistatique des composées aromatiques semble être liée à la présence de certaines fonctions chimiques. CHAUMONT et LEGER ont testé 12 composées aromatiques vis-à-vis de huit souches pathogènes pour l'homme (Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Microsporum canis et cinq Trichophyton ssp). Ils conclurent que les phénols (eugénol, chavicol, 4-alhyl-2,6-diméthoxyphénol) sont plus antifongiques.

    Cette activité est estimée selon la durée d'inhibition déterminée par simple observation macroscopique. L'activité antifongique décroit selon le type de fonctions chimiques (Hernandez, 2005) :

    Phénols > Alcools >Aldéhydes > Cétones > Ethers > Hydrocarbures.

    II.4. Méthodes de mesure de l411115iINVi HIFIERInHas HE :

    Les techniques de détermination du pouvoir antimicrobien des HE à une grande influence sur les résultats. Les difficultés pratiques viennent de l'insolubilité des constituants des HE dans l'eau, de leur volatilité, de la nécessité de les tester à faible concentration et des problèmes de standardisation des méthodes.

    Les techniques existantes se répartissent en deux catégories principales :

    · Techniques de micro-atmosphère.

    · Technique de contacte directe (en milieu solide ou en milieu liquide).

    II.4.1.Technique de micro-atmosphère :

    Elle consiste à adapter un disque de papier filtre imprégné d'HE au centre du cercle d'une boite de Pétrie, sans que l'HE entre en contacte avec la gélose ensemencée par les microorganismes. La boite est hermétiquement fermée. Il se produit une évaporation des substances volatiles dans l'enceinte de la boite et les cellules sensibles de l'inoculum.

    Cette méthode ne quantifie pas l'activité antimicrobienne réelle des HE, elle montre seulement l'activité des constituants volatiles à la température d'incubation. On considère que l'espace occupé par l'air est très petite (le disque imprégné d'HE est prés d'environ 5mm de la surface de l'agar) et ne permet pas de mesurer la concentration des vapeurs de l'HE, c'est pour cette raison qu'on emploi une boite en verre hermétiquement clos d'un volume d'air de un litre.

    II.4.2. Technique par contact directe :

    Les techniques par contact directe consistent à mettre en présence l'HE et les microorganismes, puis d'observer la croissance de ces derniers. Le contacte peut avoir lieu en milieu gélosé ou liquide. II.4.2.1. Aromatogramme :

    C'est l'un des teste les plus simples et le plus ancien, il a été développé dans les années 1940, l'antibiogramme par diffusion, testant l'action des antibiotiques sur les microorganismes en mesurant leurs zones d'inhibition. Etant plus facile a mettre en oeuvre, cette technique adoptée par les aromathérapeutes, fut baptisé : Aromatogramme.

    L'aromatogramme est basé sur la diffusion en milieu gélosé. Ce test est réalisé à l'aide de disques de cellulose imprégnés d'une quantité connue d'HE déposé à la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec la suspension bactérienne. Après incubation, chaque disque apparait entouré d'une zone d'inhibition de la croissance.

    II.4.2.2. Méthode du puits ou cylindre :

    Proposé par Cooper et Woodman en 1946, reprise par Shroder et Messing (1949), elle mesure une diffusion radiale de l'HE a partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition clair et facilement mesurable. Elle consiste à découper un tronc circulaire vertical dans la gélose et d'y verser une solution d'HE de concentration connu. L'HE diffusant radialement créant une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne.

    II.4.2.3. Méthode de dilution et micro-méthode :

    Les HE à tester peuvent également être directement mélangées en concentration connue au milieu de

    ulture, qu'il soit solide ou liquide sans oublier que les techniques de dilutions exigent une dispersion

    homogène. Le milieu est ensuite inoculé à un taux déterminé de microorganismes et après incubation,

    on note la présence ou l'absence de culture; la lecture peut ~tre visuelle ou spectrophotométrique car le degré d'inhibition est en rapport avec la turbidité du milieu.

    Des micro-méthodes en milieu liquide ont été mises au point, ce type de méthode sert à déterminer les paramètres définissant l'activité antimicrobienne en introduisant des concentrations connues dans le milieu.

    Plante d'é\MIe

    III.1. La Plante d'étude

    Le genre botanique Centaurea (les centaurées, à ne pas confondre avec les espèces du genre Centaurium, de la famille des Gentianacées) regroupe de nombreuses plantes de la famille des Astéracées (ou Composées),en effet , ce genre comprend 500-600espèces (Mishio et al.,2006).

    Notre plante d'étude est connu sous le nom de Centaurea microcarpa Coss. et Dur. (fig.05). III.1.1. Classification

    Régne : Plantae.

    Division : Magnoliophyta

    Classe : Magnoliopsida

    Ordre : Asterales

    Famille : Asteraceae

    Genre : Centaurea

    Espece : Centaurea microcarpa Coss. et Dur.

    Figure 05: Centaurea microcarpa Coss. et Dur.

    III.1.2. Déscrioption botanique :

    Les centaurées sont des plantes herbacées annuelles, bisannuelles ou vivaces, à feuilles alternes. Comme pour toutes les composées, les fleurs, ou fleurons, sont disposées en capitule multiflores homomorphes ou dimorphes, entourées d'un involucre ovoïde ou globuleux à bractées imbriquées sur plusieurs rangs . Dans le cas des centaurées, les fleurs sont toutes tubulées, multiflores homomorphes ou dimorphes, celles de la périphérie (souvent stériles) s'ouvrant largement en cinq lobes. Leur couleur varie le plus souvent entre le rose, le pourpre et le violet, mais il existe aussi quelques espèces à fleurs jaunes. Ces fleurs entourées d'un involucre ovoïde ou globuleux à bractées imbriquées et inégales sur plusieurs rangs, à la manière des artichaut .Ces bractées peuvent être ciliées (cas le plus fréquent) ou épineuses. Leur observation est essentielle pour déterminer les espèces. Le réceptacle plan ou sub plan est garni de soies abondantes, Les fruits sont des akènes longues ou ovoïdes, lisses, à hile latéral, profond, barbu ou non, portant une aigrette assez courte, simple ou double , persistante ou caduque (Quezel et Santa, 1963).

    Centaurea microcarpa Coss. et Dur. Présente des bractées de l'involucre à épines médiane très forte et valnérante (1,5-2,5cm de long ),akénes chauves

    III.1.3. Aire de répartition :

    Le genre Centaurea présente une large distribution géographique. Ce genre ce rencontre en Europe, en Asie, en Afrique, en Amérique du Nord (Canada et USA) et en Australie (Mishio et al.,2006). Quelques exemples sont résumés dans le tableau qui suit :

    Tableau 04 : Aire de répartition de quelques espèces du genre Centaurea.

    Taxon :

     

    Nom commun :

    Origine :

    Référence :

    Centaurea benedicta L.

     

    Région méditerranéenne .

    Van wyk et wink, 2004

    Centaurea calcitrapa L.

     

    Afrique du Nord

    Bellakhder, 1997

    Centaurea chamaerhaponticum Ball.

     

    Tafga (ar).

    Afrique du Nord

    Bellakhder, 1997

    Centaurea cyanus L.

     

    Toute l'Europe .

    Schauenberg et Paris ,2006

    Centaurea maroccana Ball.

     

    Endémiqued'Afri que du Nord

    Bellakhder, 1997

    Centaurea montana L.

     

    Centaurée des

    montagnes(fr).

    Régions montagneuses de l'Europe et
    l'Afrique du Nord

    Schauenberg et Paris ,2006

    Centaurea pugens Pomel.

     

    Neggir (ar).

    Saharienne

    Bellakhder, 1997

    Centaurea ruthencia Lam.

     

    Europe de l'Est .

    Mishio et

    al.,2006

    Centaurea solstitialis L.

     
     

    Régions halophytique,Afri que du Nord

    Mishio et

    al.,2006

     

    III.1.4. Composition chimique :

    Le genre Centaurea est connu pour produire des lactones sesquitérpeniques du groupe desgermacranolides et des guainolides, du type de le solstitialine et de la répine ( Bellakhder, 1997).

    Les flavonoïdes ont été signalés dans de nombreuses espèces Centaurea et près de 80 taxons ont été étudiés pour leur contenu en flavonoïdes, isolées à partir des feuilles, des parties aériennes et parfois des racines de nombreuses espèces de Centaurea, et identifiés comme des flavones, des flavonols, 6-deoxyflavones, et leurs O-et C-glycosides. .(Mishio et al.,2006).

    Tableau 05: Composition chimique de quelques espèces du genre Centaurea.

    Taxon :

     

    Nom commun :

    Composition chimique :

    Références :

    Centaurea acaulis L.

     

    Nagour (ar).

    Lactones sesquiterpeniques comme

    la costunolide et la zaluzanine germacranolides, eudesmanolides et guaianolides

    Bentamène et al., 2005

    Centaurea calcitrapa L.

     

    Substance amère, l'acide

    calcitrapique, un glucoside ;la

    cnicine.

    Bellakhder, 1997

    Centaurea cyanus L.

     

    Principe amère : la cnicine ou

    centaurine , les fleurs renferment un glucoside, la cyanidine.

    Schauenberg et Paris ,2006

    Centaurea montana L.

     

    Centaurée des montagnes

    (fr).

    Substance amère ,centaurine,

    quelques traces d'hétérosides, de la cichoriine, des tanins, des cyanines sensibles à la lumière et du

    potassium.

     
     
     

    10,5 % de protéines par rapport au poids sec, et deux lactones sesquitérpeniques.

    Bellakhder, 1997

     

    III.1.5.Propriétés thérapeutiques :

    Les propriétés thérapeutiques de quelques espèces du genre Centaurea sont résumées dans le tableau qui suit :

    Tableau 06: Propriétés thérapeutiques de quelques espèces du genre Centaurea.

    Taxon :

     

    Nom commun :

    Propriétés thérapeutiques :

    Références :

    Centaurea calcitrapa L.

     

    Contre les palpitations

    Bellakhder, 1997

    Centaurea chamaerhaponticum Ball

     

    Tafga(ar).

    Traitement des maladies du foie, de l'estomac et de l'intestin .

     
     

    Bleuet(fr).

    Diurétique. Il est utilisé contre les

    dyspepsies. Employé en collyre ou compresse pour soigner les affections des yeux.

    Schauenberg et Paris ,2006

    Centaurea montana L.

     

    Centaurée des montagnes(fr)

    Le thé de centaurée s'emploie en cas de dyspepsie ( difficulté de digestion ), et comme diurétique. On en fait aussi des compresses calmantes pour les yeux .

     
     

    Combat le refroidissement

    Bellakhder, 1997

     

    III.1.6. Parties utilisées :

    Différents parties sont utilisées, quelques unes sont résumées dans le tableau qui suit : Tableau 07: Les parties de la plante utilisées de quelques espèces du genre Centaurea.

    Taxon :

     

    Nom commun

    Parties utilisées :

     

    Références :

     

    Centaurea calcitrapa L.

     

    Sommités fleuris .

     

    Bellakhder, 1997

     

    Centaurea chamaerhaponticum Ball

     

    Tafga

    Racines ( fraiches

    sèches) .

    ou

     
     

    Les fleurs,.

     

    Schauenberg Paris ,2006

    et

    Centaurea montana L.

     

    Centaurée des

    montagnes

    Les fleurs.

     
     
     

    Sommités fleuris .

     

    Bellakhder, 1997

     
     

    III. 2. 5 pJiI4Id'ptude :

    III.2.1. Localisation géographique :

    Le canton d'El Haourane fait partie de la forêt domaniale de dréat, qui comprend environ 23

    canton dont la superficie totale est égale à 16879 hectare, elle est localisée à environ 15km au Nord de la commune de Hammam dalaâ (wilaya de M'sila ), entre les coordonnées suivantes :

    Latitude 35°36'-I I ° 9' IL R[1 X (651,80-657,85) km.

    Longitude 4°23'-4°27' Est Y (295,15-299.55) km.

    Légende:

     
     

    : Limite du canton d'El Haourane

     

    de la superficie totale de ar Doar Dréat, à l'Ouest le canton de Boustéila.

    Figure 06 : Localisation de la zone d'étude.
    (Extrait de la carte topographique feuille de Tarmount, Echelle: 1/50000)

    Partie pratique

    Matériels et méthodes

    Chapitre IV : Matériels et méthodes.

    IV.1.Matériel végétal :

    IV.1.1. Origine:

    L'étude a été menée sur une espèce végétal ; Centaurea microcarpa Coss. et Dur. Une plante choisis selon sa présence dans la région. La partie aérienne servira comme matière première pour l'extraction des substances polyphénoliques et des HE.

    IV .1.2 Echantillonnage :

    Les échantillons sont collectés prés de la cimenterie de Hammam Dalâa. (figure06). L'échantillonnage est effectué d'une manière aléatoire et à partir de plusieurs points du site. IV.1.3.Préparation des échantillons:

    IV.1.3.1.Test d'humidité :

    Le taux d'humidité est mesuré en déposant une masse représentative de la plante, de 2 grammes (trois fois) dans un incubateur (Memmert) pendant 4 heurs à 104°C (figure07).Le test est très important car il nous permet de suivre au mieux l'étape de séchage.

    mf - ms

    Teneur en eau (%) = .100

    mf

    mf : Masse fraiche. ms : Masse sèche.

     

    104°C pendant 4h

     
     
     

    Avant séchage Après séchage

    Figure 07: 7Tste d']KXP idité Tde la partie aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    IV.1.3.2.Séchage de l'échantillon :

    Les échantillons étales sont placés dans un incubateur (Memmert) à 45°C pendant une semaine (168 heurs), pour subir l'opération de séchage.

    IV.1.3.3.Broyage :

    Les échantillons séchés sont broyés dans un broyeur de cuisine (Seb) puis mis dans des bocaux hermétiques et conservés à sec (température ambiante) à l'abri de l'humidité.

    Le broyage de la plante permet d'augmenter la surface de contact solvant-échantillon, une meilleure filtration du solvant au sein du matériel végétal ce qui à pour conséquence une augmentation de l'extraction (solide-liquide).

    IV.2. Extraction des extraits bruts polyphénoliques :

    Plusieurs procédés d'extraction peuvent être utilisés, du fait de la diversité des métabolites secondaires, en particulier des polyphénols.

    Pour l'extraction des polyphénols on a opté pour l'utilisation de deux méthodes, dont le principe général est le mrme, mais différent en ce qui est des conditions d'extraction. La première est celle utilisée par Akowuah et al., 2005, et la deuxième est celle utilisée par OWEN et JOHNS 1999.

    Tous les extraits obtenus subissent une filtration et une évaporation.

    IV.2.1. Principe des deux méthodes d'extraction :

    Ces deux méthode d'extraction ne sont qu'une extraction par macération ,qui est un procédé d'extraction solide-liquide discontinu qui consiste à laisser tremper le solide dans un solvant à température ambiante ,durant elle ou on a fait l'ébullition ,pour en extraire les constituants solubles . IV.2.2. 0 pINI13e11133exNIDRIQ111335 WXD111e111Da11TEM :

    Dix grammes (10g) de chaque échantillon sont pesés puis trompé respectivement et séparément dans 100ml de Chloroforme (Prolabo), Méthanol pure (Biochem), Acétone70%, (Chemopharma), Méthanol 50% (Biochem) et Eau.

    La verrerie utilisée (Béchers, pipettes, entonnoirs et fioles), est préalablement lavée et séchée.

    Les fioles (d'une capacité de 250ml) contenant les solutions d'échantillons sont incubées dans un bain marie (Memmert) à une température de 40°C pendant 4h et 8h (figure 08).

    Incubation à 45 °C

     

    10g dans
    chaque fiole

    10g dans chaque fiole

    Plante broyée
    (parties aériennes )

    Chlorof

    MeOh
    50%

    MeOh

    MeOh

    Eaue Eaue

    50%

    Acétone
    70%

    Chlorof

    MeOh

    Acétone

    70%

     
     

    8h

    4h

     
     
     
     

    Filtrations

    Evaporation sous vide à 55°C

    Figure 09 : 31R1RFRCEVIIIIFtIRCdeNSROSKpCROARRC SIRZEK It Il., TE05

    Après filtration sur tissu (Figure10.a), sur papier Watman (n°=1) (Figure11.b) et sous vide (Fig12), lse filtrats sont soumis à une évaporation à basse pression à 45°C (rotavapor R-210 BUCHI), jusqu'à l'obtention d'extraits sec. Le poids des extraits sec est pesé puis solubilisé par un volume connu de solvant.

    a. La filtration :

    La filtration permet de clarifier les solutions d'échantillons et d'éliminer les particules solides issues des déchets de la plante. (Figure09)

    - Une première filtration se fait à travers un tissu de fina placé dans un bécher ; la pate ainsi

    obtenue est pressé à la main pour chasser le maximum de solvants et de solides solubles. - Une deuxième filtration est assurée par le papier Watman porosité 1.

    - Une dernière filtration, sous vide est suivie à l'aide d'un filtre en verre fritté (porosité 4) pour éliminer les imputées solubles.

    a. Filtration à travers tissus b. Filtration sur papier Watman.

    c. Filtration sous-vide. Figure09: Filtration des extraits.

    Chapitre IV : Matériels et méthodes.

    b.Evaporation :

    Les filtrats obtenus subissent une évaporation sous vide dans un rotavapor (rotavapor R-210 BUCHI) jusqu'à l'obtention d'extraits sec de PP (figure10).Ces extraits brutes de polyphenols (EBP) sont alors récupérés et pesés.

    Poids de l'extrait sec après évaporation

    Extraits brut de polyphénols (EBP) en % = X 100

    Poids de l'échantillon

    Figure 10: Evaporation des extraits par rotavapor (R-210 BUCHI).

    Chapitre IV : Matériels et méthodes.

    IV.2.3. Méthode d'extraction d'OWEN et JOHENS :

    L'extraction a été réalisée avec du Méthanol pur (99% Biochem). D'après le protocole suivie 200 mg de poudre des parties aériennes de Centaurea microcarpa Coss et Dur. Sont dissous dans un volume de 500 ml de Méthanol, le mélange est conservé à température ambiante sous agitation pendant une semaine de temps IIIIDCHE)lSRurldRnneill'eiIDiIlP pINDnRlirN lIIILI E8).Après filtration par le papier Watman (n°=1), le filtrat est soumis à une évaporation à basse pression à 45°C (rotavapor R-210 BUCHI), avru'àll'RniviRnld'pnleItrDplseF lLe lSRIdsldI ll'extrait sec est pesé puis solubilisé par un volume connu de Méthanol (figure12).

    Figure 11: Extrait méthanolique

    La quantification de l'extrait est calculée comme suit :

    (P1 #177; P2)

    Le taux de la matière extraite (%)= x 100X X 100.

    E

    P1: poids du ballon vide (g)

    P2:poids du ballon après évaporation (g). E: poids de l'extrait sec (g).

    Broyage

    500ml de Méthanol pure Agitation (168h à température ambiante)

    éthanoli

    Extrait

    Filtration Evaporation à 55°C

    Extrait sec

    Figure : Protocol d'extraction des composés phénoliques de la partie
    aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    IV.3.Extraction des flavonoïdes:

    · Principe:

    Tous les flavonoïdes n'ont pas la même propriété de solubilité car certains flavonoïdes sont solubles dans l'eau et l'alcool alors que d'autres ont des propriétés hydrosolubles extrêmement faible (Bruneton, 1999) de ce fait le principe utilisé pour l'extraction des flavonoïdes est basé sur le degré de solubilité des flavonoïdes dans les solvants organiques.

    · Mode opératoire :

    Environ 20g de matière sèche finement broyée de Centaurea microcarpa Coss. et Dur. est mélangée avec 200 ml de Méthanol (85%). Le mélange est filtré sur un tissu 24 heurs plus tard. Après deux extractions successives avec le Méthanol, 85%, trois fois et du Méthanol, 50%, deux fois, les filtrats sont combinés, filtrés sur du papier filtre puis soumis à une

    évaporation à basse pression à 35°C (Rotavopor, Buchi 461) la phase aqueuse ainsi obtenue est conservée pendant 48 heurs à 4°C puis filtrée. Le filtrat est débarrassé des cires, des lipides et de la chlorophylle par trois lavages successifs avec du n-hexane (v/v) pour donner une phase aqueuse.

    Afin de séparer les flavonoïdes en fraction aglycone et glycosilées.la phase aqueuse est mélangée à volume égale avec du chloroforme pour obtenir une phase organique contenant les flavonoïdes aglycones et les aglycones méthoxylés .la phase aqueuse restante subit une série d'extraction avec l'acétate d'éthyle (10fois) afin de récupérer dans la phase organique certains flavonoïdes aglycones ,mais sur tout les mono et les diglycosidiques .La phase aqueuse restante contient les flavonoïdes glycosylés plus polaires comme les di,tri et tetraglycosidiques .les extraits obtenus sont dénommés selon le solvant qui a permis leur séparation : extrait chloroformique et extrait d'acétate d'éthyle et extrait aqueux. Les trois fractions récupérées sont soumises à une concentration à basse pression à 35°C puis pesé pour déterminer les rendements d'extraction exprimés par rapport à100g de matière sèche (figure13).

    Figure : Protocole d'extraction des flavonoides :

    IV.4.Extraction des huiles essentielles par hydrodistilation :

    · Principe:

    La plante est mise en contact avec l'eau dans un ballon lors d'une extraction au laboratoire ou dans un alambic industriel. Le tout est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les HE se séparent de l'eau par différence de densité. (Benayad N, 2008) (figure14).

    Figure 14: Schéma de principe d'une extraction par hydrodistilation.

    · Protocole expérimental d'extraction:

    La matière végétale, constituée des parties aériennes (50g) est introduite dans un ballon en verre , à trois cols, de 1L, remplie au 2/3 d'eau distillée (700 ml).

    Une fois placé, le dispositif d'hydrodistilation est mis en marche. La température dans le ballon contenant l'eau et la plante est réglé tout au long de l'extraction à 100 °C au moyen d'yn thermomètre placé dans l'autre col du ballon.

    L'ensemble est porté à ébullition et la vapeur chargé d'eau et d'huilese condensent dans un réfrigérant inclinée.Le distillat, s'écoule goutte à goutte et est recueilli dans une ampoule à décanter située à l'extrémité.

    L'HE est séparée de l'eau distillée par décantation après relargage au NaCl (Prolabo) et traitement par l'acétate d'éthyle (Prolabo) afin d'extraire l'huile solubilisée le surplus d'eau est éliminé par ajout du sulfate de sodium anhydre (Na2 SO4) (Prolabo) puis filtrer sur un papier plissé. L'ensemble HE et le solvant est conservée dans des flacons, dans un endroit frais et obscure à l'abri de la lumière, pour permettre l'évaporation du solvant (figure15).

    Chapitre IV : Matériels et méthodes.

    .

    Figure 15 : Extraction des HE par hydrodistilation.

    / I- rI-TI-P I-WI- ITF ( II-AMEDINI TRP P I- MIA : MHE

    R%= X 100.

    Ou : MS

    Ms : Masse de la matière végétal sèche. MHE : Masse en HE.

    IV.5. Tests phytochimiques :

    Le bute de ces tests est de connaître la composition des principales classes de métabolites secondaires qui entrent dans la composition de Centaurea microcarpa Coss. et Dur., les tests sont effectués sur un infusé.

    IV.5.1. Préparation de l'infuser:

    Environ 10 grammes (10g) de poudre sont mit à infuser dans 100ml d'eau bouillon pendant 15 min. le filtrat est ajusté à 100 ml avec l'eau distillée.

    IV.5.1.1. Mise en évidence des polyphénols:

    Quelques goutes d'HCL, sont ajoutées à 5ml d'infuser, la réaction donne une coloration rouge en présence de polyphénols.

    IV.5.1.2.Mise en évidence des tanins:

    Quelques goutes d'une solution de FeCl3 à 5% sont ajoutées à 5 ml d'infuser la réaction donne une coloration bleue noir en présence des tanins.

    IV.5.1.3. Mise en évidence des anthocyanes:

    Quelques goutes d'ammoniaque (1/2) sont ajoutées à 5 ml d'infuser la réaction donne une coloration bleu en présence d'anthocyanes (Mamyrbékova-Békro et al., 2008).

    IV.5.1.4. Mise en évidence des coumarines :

    Mettre environ 1g d'un échantillon de la plante humide dans un tube à essai, couvrir. le tube avec du papier filtre imbibé avec une solution de NaOH diluée, papier filtre est examiné sous lampe UV (254nm) .une coloration de jaune fluorescent indique la présence des coumarines (Dohou et al ,2003). IV.5.1.5. Mise en évidence des saponosides :

    Leur présence est déterminée quantitativement par le calcul de l'indice de mousse. Ajouter 2ml d'eau distillée jà 5ml d'infuser, bien agiter le tout pendant 2min. Après un repos de 15 min en position verticale, on relève la hauteur de la mousse persistante en cm. (Dohou et al., 2003).

    IV.6.Séparation des extraits méthanoliques brutes par Chromatographie sur couche mince(CCM):

    V.6.1. Principe de la méthode:

    La séparation et la purification des différents composés phénoliques sont fondées sur des techniques chromatographiques sur polyamide, Cellulose, gel de Sephadex, etc.....

    Pour ce qui est de notre analyse, on se sert de la chromatographie sur couche mince (CCM) pour identifier les substances en fonction de leur façon de migrer dans les conditions données .La migration est en fonction de la polarité des substances, de la polarité de l'éluant et du pouvoir d'adsorption de la phase stationnaire. La méthode CCM est efficace et rapide et associe la sensibilité à la simplicité (Kolai et al, 2006) (figure16).

    Figure 16 : Principe d'une séparation CCM

    IV.6.2. Mode opératoire :

    Les deux extraits méthanoliques obtenus des deux méthodes ont fait l'objet de la séparation par CCM suivant les étapes décrites ci-dessous :

    IV.6.2.1. Préparation de la plaque :

    Les plaques de gel de silice (60 F 254, Merck), sont découpées selon les dimensions suivantes ; 5, 5et6cm de largeur pour 8, 10 et 12cm de hauteur.

    On tracer au crayon gris, délicatement, une ligne, appelée ligne de dépôt, à environ un centimètre du bord inférieur de la plaque à chromatographie. On repère la position des dépôts à effectuer sur la ligne tracée précédemment par des lettres qui désignent les extraits, exemples (Ex1, Ex2,...., etc.) en veillant à les espacer régulièrement

    IV.6.2.2. Préparation de la cuve :

    On introduit l'éluant (système solvant) dans la cuve à chromatographie, d'une largeur de 12 cm et de 14 cm de longueur, de manière à ce que son niveau atteigne une hauteur d'environ un demicentimètre. On couvre la cuve avec un couvercle hermétique.

    IV.6.2.3. Dépôt :

    On dépose, à l'aide d'une micropipette sur la ligne de dépôt une goutte de chaque extrait

    à analyser ainsi que celles de référence (quercétine et acide gallique). Les dépôts sont espacer régulièrement afin d'éviter leur chevauchement lors de la migration. On peut concentrer les dépôts si nécessaire en répétant plusieurs fois les dépôts.

    IV.6.2.4. Elution :

    Plusieurs systèmes solvants, tirées à partir de la bibliographie, ont été utilisées pour mieux séparer les différents composées polyphénoliques éventuellement présents dans l'extrait méthanolique (Tableau 09).

    L'éluant (système solvant) remonte par capillarité le long de la plaque. Lorsqu'il arrive à environ 1 cm du bord supérieur (front du solvant), on fait sortir la plaque de la cuve et on la sèche.

    Après ces étapes, on procède à la révélation des chromatogrammes sous chambre UV (Camag) à 254nm et à 366nm

    Tableau 09: Les différents systèmes solvants utilisées pour la CCM.

    Systémes Solvants Rapport (v/v)

    Chloroform. 10

    01 Methanol 2

    Dichloromethane. 5

    02 Methanol 1

    Acétate d'éthyle. 8

    03 Acide acétique. 1

    Eau. 1

    Acétate d'éthyle. 8

    04 Acide formique. 1

    Eau. 1

    Acétate d'éthyle. 2

    05 Ether diethylique. 8

    Dichlorométhane. 9

    06 Acétate d'ethyle. 1

    Acétate d'éthyle. 7

    07 Methanol. 1,5

    Eau. 1,5

    Acétate 9

    08 n- butanol 1

    IV.7. Spectrophotométrie UV-visible :

    IV.7.1. Principe :

    La spectrophotométrie est une méthode analytique qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution, par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier.

    Lorsque le soluté absorbe la lumière visible (longueurs d'onde comprises entre 400 et 800 nm) on parle de spectrophotométrie visible. Si les solutions absorbent dans l'ultraviolet (longueurs d'onde inférieures à 380 nm), on parle alors de spectrophotométrie UV.

    IV.7.2. Mode opératoire :

    Dans une cuve en Quartz de 1 cm de largueur, on introduit l'extrait brute méthanolique à analyser, environ 1ml, après quelques minutes l'absorbance est lue au spectrophotométre UV-visible (Shiladzu UV-2401 PC).

    Avant cette procédure on étalonne d'abord l'appareil par le témoin, qui est dans notre cas le méthanol pure (Biochem).

    Résultats et

    interprétations

    V. Résultats et interprétations :

    V.1. THAIG'HXP IGIAé eA sécHOTe :

    Les résultats du test d'humidité (tableau 10) montrent que les parties aériennes de Centaurea microcarpa Coss et Dur. possèdent un taux moyen d'humidité de 47,91334 % confirmant sa richesse relative en eau, en effet, le poids de l'eau représente presque la moitié de la masse de la plante (figure17). Ce paramètre à une grande importance pour l'extraction des PP, car sa présence (présence d'eau) est un élément grnant du rendement de l'extraction.

    Le test d'humidité (2 g de poudre de plante a 104 °C pendant 4 heurs) a été réalisé trois fois pour calculer avec précision le taux d'humidité de la plante. Les variations obtenues entres les trois valeurs ne sont pas vraiment significatives.

    Tableau 10: Teneur en eau de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    Poids de l'échantillon avant le séchage Mf (g)

    02

    02

    02

    Poids de l'échantillon après le séchage Mf (g)

    1,0593

    1,0682

    0,9977

    Poids de l'échantillon en % après le séchage

    52,966

    53,41

    49,885

    Poids de l'eau évaporée en g après séchage

    0,9407

    0,9318

    1,0023

    Poids de l'eau évaporée (%d'humidité)

    47,034

    46,59

    50,115

     

    eau

    matiére organique

    52%

    48%

    Figure 17: Pourcentage en eau de la partie aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    V.2. Extractions :

    V.2.1. Méthode d'extraction de Akowuah et al., 2005 :

    Les résultats, en extraits brutes polyphénoliques (EBP) exprimés en pourcentage de la matière sèche, sont résumé dans le tableau 11.

    Tableau 11: Ensemble des résultats de l'extraction des EBP :

    Solvants :

    Rendements d'extractions (% ms)

     

    8h :

    Chloroforme

    3,411

    3,696

    Methanol pure

    8,04

    9,804

    Acétone 70%

    9,751

    11,65

    Methanol 50%

    11,776

    14,33

    Eau

    15,804

    18,744

     

    V.2.1.1.Influence du temps d'extraction :

    Il apparait clair, après une simple lecture du tableau, que les meilleurs rendements ont été obtenus pour l'ensemble des échantillons incubés pour une durée de 8h et ceci quelque soit la nature du solvant utilisé.

    Les rendements obtenus pour les échantillons incubés pendant 4h varient de 3,411% à 15,804%, alors que ceux ayant subi une extraction qui a durée 8h, ils varient de 3,696 % à 18,744% (figure18) V.2.1.2.Influence du type de solvant :

    Les PP sont une famille de composé très vaste, regroupant de substances de solubilité très hétérogène. En se référant à la méthode d'Akowauh et al., 2005, on a utilisé dans notre expérimentation cinq solvants de polarité décroissante: l'Eau, le Méthanol 50%, l'Acétone 70%, le Méthanol pure et le Chloroforme.

    Il ressort de l'étude du tableau10 que les meilleurs rendements sont obtenus respectivement pour les trois solvants; Eau (18,744%), Méthanol 50% (14,33) et l'Acétone 70% (11,65%).

    Les plus faibles rendements sont observés pour le méthanol pur (9,804 %) et le chloroforme (3,696%).

    Ces résultats (figure18) peuvent êtres expliquées par la solubilité différentielle des différents composées phénoliques ou les PP polaires sont solubles dans les solvants polaires et les PP apolaires sont solubles dans les solvants apolaires.

    La lecture des rendements d'extraction permet de constater que les plus grands rendements ont été obtenus avec les solvants polaires (Eau, Méthanol 50% et l'Acétone 70%).

    De ces résultats, on peu en conclure que notre plante d'étude Centaurea microcarpa Coss et Dur. contient beaucoup plus de PP polaires qu'apolaires, ceci peut ~tre confirmé par des dosages dosages ultérieurs.

    20

    18

    16

    14

    12

    10

    8

    4

    0

    6

    2

    3,411

    chloroforme methanol pure acétone 70% methanol 50% eau

    3,696

    8,04

    9,804

    9,751

    4h 8h

    11,65

    11,776

    14,33

    15,804

    18,744

    Figure18 : Rendements d'extraction en fonction du type de solvant et du temps d'extraction des

    parties aériennes de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    V.2.2. Méthode d'extraction d'Owen et Johns (1999) :

    Le tableau12 donne le rendement EPB, exprimé en pourcentage de la matière sèche (%ms), obtenu avec la méthode d'Owen et Johns (1999).

    Tableau 12 : Rendement de l'extrait méthanolique.

    Partie de la plante Solvant Temps d'extraction Température Rendement (% ms)

    (h)

    Partie aérienne Méthanol pur 168 Ambiante 21

    L'extraction solide-liquide utilisée et l'état physique de la plante, réduite en poudre, à permis au solvant, méthanol pure de franchir la barrière de l'interface solide-liquide, dissoudre le principe actif a l'intérieur du solide (matière végétale) et ressortir le soluté

    (Matière organique) du solide. La plupart des auteurs suggèrent que l'entrée du solvant se fait par un mécanisme osmotique et la sortie du soluté par dialyse ou par diffusion.

    Le solvant utilisé, le méthanol pur (99%), donne généralement de meilleurs rendements d'extraction et de ce fait il est très utilisées par rapport aux solvants, et le plus efficace (CastanedaOvando et al., 2009).

    On peut dire que les résultats des deux méthodes montrent que le rendement de l'extraction de la deuxième méthode, celle d'Owens et Johns (1999), avec le méthanol pure (21%) est plus élevé que celui obtenus avec la première méthode, celle d'Akowuah et al., 2005, utilisant plusieurs solvants (cinq solvants de polarités différentes), pour une durée d'extraction de 8h, ou le plus grand rendement n'a pas dépassé les 18,744%.

    Ceci peut être expliqué par :

    · Nature du solvant d'extraction : méthanol pur.

    · Temps d'extraction : 1 semaine (168 heures).

    · Le rapport masse/solvant : 200 mg / 500 ml de solvant.

    · Condition d'extraction : agitation continue qui permet une meilleure infiltration du solvant.

    En terme général, l'extraction des composés phénoliques à partir de la matière végétale dépend de leur structure chimique, du type de solvant utilisé, de la méthode d'extraction de la granulométrie et du temps de macération. Les extraits phénoliques des plantes sont généralement des mélanges des différentes classes de composés phénoliques qui sont solubles dans le solvant utilisé. La solubilité de ces derniers dépend du type de solvant utilisé (polarité) et de leur degré de polymérisation.

    V.3. Extraction des flavonoïdes :

    Les méthodes d'extraction des flavonoïdes dépendent aussi bien du matériel végétal que du type de flavonoïde à extraire. L'extraction proprement dite est réalisée par des solvants de polarité croissante. Un traitement préalable de la plante par un solvant apolaire (hexane ou éther de pétrole) la débarrasse des graisses, des stérols et des pigments (chlorophylle et caroténoïdes).un solvant chloré, le benzène, l'acétate d'éthyle ou l'éther diéthylique permet de récupérer les aglycones libres peu moyennement polaires. L'acétone, le méthanol, l'eau ou leur mélanges permet d'extraire les aglycones polyhydroxylés et la plupart des glycosides.

    Les rendements d'extraction dans toutes les fractions flavonoidiques à partir de Centaurea microcarpa Coss et Dur. sont exprimées en pourcentage de matière sèche (%Ms) dans le tableau 13

    Tableau 13: Rendement en flavonoïdes totaux de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    1 ENuU- 43I l'exNrEIN 7 IP S1prENu11143'1pIESRrENiRn Rendement (%)

    Extrait choloroformique 45° C 6,5925

    Extrait d'acétate d'éthyle 45° C 7,0475

    Extrait aqueux 45° C 14,536

    Les résultats de l'extraction (figure19), selon la méthode de Makbary et Makhram (1982), montrent que Centaurea microcarpa Coss et Dur. contient différentes fractions de flavonoïdes. Les rendements obtenus varient entre et 14,536%

    dont le meilleur est celui de l'extrait aqueux avec 14,536%, puis de l'extrait d'acétae d'éthyle avec 7,0475%, quant au plus faible est celui obtenu par l'extrait chloroformique avec un pourcentage de (6,5925%).

    On remarque que les flavonoïdes extraits de l'espèce Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    sont beaucoup plus polaires qu'apolaires, ce qui explique le rendement élevées de l'extrait aqueux (14,536%) par rapport aux deux autres extraits, choloroformique et d'acétate d'éthyle, alors que les flavonoïdes apolaires sont mois présents, deux fois moins abondants que les flavonoïdes polaires, du fait du faible pourcentage obtenus avec l'extrait choloroformique.

    L'ajout du chloroforme provoque la séparation des flavonoïdes en fractions glycosylées et aglycones, on constate que les flavonoïdes glycolysés sont plus abondants que les flavonoïdes aglycones car l'extraits cholorformique, dont le quels ils sont solubles, possède le plus faible rendement.

    Rendement en flavonoides

    16

    14 12 10 8 6 4 2 0

     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     
     

    Rendemant

     
     
     
     
     
     
     
     
     
     

    Extrait chloroformiqueExtrait d'acétate d'éthyleExtrait aqueux

    Figure 19: Rendement en flavonoïdes totaux chez Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    D'autre part, l'ajout de l'acétate d'éthyle, pour extraire les flavonoïdes mono et di -glycolysés, donne un rendement de (7,047%) inférieur à celui de l'extrait aqueux (14,536%) contient le reste des flavonoïdes, à savoir les di, tri et tétra glycosylés. Ce dernier montre la richesse de Centaurea microcarpa Coss et Dur. en flavonoïdes di, tri et tétra glycosylées par rapport au flavonoïdes mono et di glycosylés, ceci peut être expliqué par la grande solubilité des hétérosides, augmentant ainsi la polarité dans l'eau ce qui permet d'entrainer les flavonoïdes qui sont entrainés dans la phase aqueuse d'où leur présence dans l'extrait aqueux (figure20).

    En outre, on observe la présence des flavonoïdes di glycosylées dans les deux extraits aqueux et l'acétate d'éthyle , du peu itre aux différences de masse molaires entre la partie hétérosidique et le reste du flavonoïdes (partie aglycone) ; si la partie hétérosidique du flavonoïde diglycosylées domine (son poids moléculaire est plus élevé par rapport a la partie aglycone) ce dernier sera plus soluble dans l'eau ,en l'occurrence, retrouvé dans l'extrait aqueux , alors que si la partie aglycone prédomine sur l'hétéroside, donnant ainsi une solubilité moins marqué au flavonoïde di glycosylée, ce dernier se retrouvera dans l'extrait d'acétate d'éthyle. On peu dire que la solubilité des flavonoïdes dépend aussi de la la fraction hétérosidique.

    D'une manière générale, le protocole d'extraction des flavonoïdes de Centaurea microcarpa Coss et Dur. suivi montre que cette espèce est riche en flavonoïdes, dont ceux glycosylées (polaires) sont plus abondants que ceux non glycosylées (apolaires), possédant des degrés de solubilités très hétérogènes résultant de leurs différences de structure. En effet, les travaux de Mishiso et son équipe (2006), sur 80 espèces Centaurea démontre que ce genre botanique renferme des flavonoïdes, flavones et flavonols en grande majorités, et leurs dérivées glycosidiques.

    25%

    22%

    53%

    flavonoides di,tri et tetra glycosylées flavonoides mono et di glycosylées flavonoides aglycones

    Figure 20: Répartition des différentes fractions flavonoides de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    V.4. Extraction des HE :

    Le rendement en HE est défini comme étant le rapport de la masse en HE sur la masse de la matière sèche végétale (partie aérienne), exprimé en % (P /P).

    Les résultats de l'extraction par hydrodistilation, montrent que la plante d'étude posséde un pourcentage en HE, estimé à 1,213%(figure21).

    La teneur en HE chez la nigelle (Nigella sativa L.) est de 0,03-0,04%, et celle de l'origan (Origannum glandulosum Desf.) atteint les 2,62% (Bousbia, 2004). On remaque que la teneur en HE de notre espèce se situe entre les deux pourcentages (1,213%) et prend une valeur moyenne.

    En se référent aux études précédentes et en comparent le rendement obtenu chez Centaurea microcarpa Coss et Dur. avec d'autre espèces, on peu dire que cette espèce présente une teneur en HE moyenne.

    1,213%

    98,787%

    matiére végétale séche HE

    Figure21: Pourcentage en HE de Centaurea microcarpa Coss et Dur.

    V.5. Caractérisation des extraits bruts polyphénoliques :

    V.5.1. Recherche de quelques substances actives :

    Les résultats des tests phytochimiques sont regroupés dans le tableau 14.

    Les extraits de la partie aérienne de Centaurea microcarpa Coss et Dur. contient des PP, la phase aqueuse ayant viré au rouge après ajout du HCl.

    L'anneau bleu ou bande bleu formé après ajout d'ammoniaque à l'infus, indique la présence d'anthocyanes.

    D'après la coloration noire obtenue avec FeCl3, la partie aérienne de Centaurea microcarpa et Dur. contient des tanins galliques et catéchiques.

    La formation de mousse après agitation de l'infus et l'eau distillé, et sa persistance après 15min de repos est due à la présence de saponosides dans la plante mais à un faible degré du car la hauteur de la mousse obtenus n'a pas dépassé les 0,3cm.

    Après exposition aux vapeurs de NH3 et visualisation sous UV, les fluorescences jaunâtres observées, indique l'existence de coumarines.

    Tableau 14: Résultats des tests phytochimiques.

    Composée

    PP

    Anthocyanes

    Tanins

    Saponoside

    Coumarine

    Réactifs

    HCl

    NH4

    Fe2Cl3

    Eau distillé

    NaOH

    Présence

    +

    +

    +

    +

    +

    Coloration

    Rouge

    Bande bleu

    Bleu nuit

    0,3 cm

    Jaune fluo

    Photo :

    Témoin Extrait

     

    Témoin

     

    Extrait

     
     

    Témoin

    Extrait

    Témoin Extrait

     
     

    V.6. Chromatographie sur couche mince (CCM) :

    La chromatographie sur couche mince de silice qui est à la fois une méthode de séparation et d'identification de divers constituants d'un mélange. Pour ce qui est de notre analyse, on se sert de la CCM pour mettre en évidence les différentes familles de PP, en fonction de leur façon de migrer dans les conditions données. On à utilisées huit systèmes solvants de polarités différentes, en présence de deux substances standards ; la quercitine et l'acide gallique.

    Les plaques CCM observées, après élution par les différents systèmes solvants, montrent des taches de nombres, de couleurs et de distances de migrations différents (figure15).

    Chapitre V : Résultats et interprétations.

    Tableau : Résultats de la CCM :

    En se basant sur la comparaison des RF des standards et des taches de l'extrait méthanolique, la présence de GAE et de QER en même temps est confirmée dans les systèmes: SII, SIV, SVI, SVII et SVIII, dont les RF sont respectivement: 0,479, 0,875, 0,051, 0,82 et 0,76 pour GAE et sont 0,683, 0,927, 0,091, 0,87 et 0,853 pour QER.

    En revanche, la présence de la quercétine seule est observée dans les systèmes SI, SIII et SV dont les RF sont respectivement: 0,466, 0,906 et 0,091. Ces trois systèmes n'ont pas permis l'élution de GAE cela est du à sa faible solubilité dans les solvants apolaires a cause de sa structure complexe et son poids moléculaire élevé (tableau 16).

    Tableau 16: Propriétés physicochimiques des étalons utilisées en CCM.

    Composés

    Structure

    Masse molaire(gmol-1 )

    Famille

     

    Quercétine

     

    170,1195

    flavonoïde

    L'acide gallique

     

    302,2357

    Tanin

    Les polyphénols sont une famille de composés très hétérogène 9000 composés, classés en 12 classes, dont la classe majeure est celle des flavonoïdes. Les tableaux 17 et 18 donnent les caractéristiques des composés phénoliques et des flavonoïdes observés sous UV après séparation par CCM.

    Tableau 17: composés phénoliques identifiés par CCM (Markham, 1982).

    Couleurs sous UV Composés probables

    Rouge Anthocyanidine 3 glucoside

    Rose Anthocyanidine 3,5 di glucoside

    Orange Anthocyanidine 3 glucoside

    Orange pale Anthocyanidine 3glucoside

    Jaune Flavonols

    Jaune pale Flavonols

    Vert Rutine

    Bleu sombre Flavonols, flavonones, aurones

    Bleu vif Hydroquinones

    Bleu pale Acide phénol

    Bleu blanc fluo Acide phénol

    Mauve Flavonols, flavonones, isoflavonones, flavones

    Flavones

    Violet Flavonols, flavonones, isoflavonones, flavone

    Pourpre sombre chalcones.

    Tableau 18: Révélation des flavonoïdes après séparation CCM (Markham, 1982).

    UV 366 nm AlCl3/UV 366 nm Type de phénols ou flavonoïdes

    Couleur Couleur

    possibles.

    Rouge
    Jaune
    Jaune pale
    Bleu blanc fluo
    Bleu blanc fluo

    Pourpre sombre

    Orange Orange Jaune pale orange Bleu clair

    jaune

    Anthocyanidine 3 glucoside
    Flavonols
    Falvonols
    Acide phénolique
    Flavonols, flavonones, flavones
    Isoflavonones.

    Flavonols, isoflavonones, flavones,
    chalcones.

    Après observation des plaques dans une chambre noire d'une CCM à haute performance (HPTLC, Camag) et en s'appuyant sur les données de la bibliographie quant à la séparation des composés phénoliques par CCM et leur observation sous UV (tableau 17 et 18) on peut éventuellement prédire les composés ou les familles de composés les plus probables qui peuvent entrer dans la composition de l'extrait méthanolique de Centaurea microcarpa Cross et Dur., l'ensemble des observations et des résultats sont regroupés dans le tableau 19.

    Tableau 19: Composés phénoliques probables identifiés par CCM .

    UV

    Système 254nm spot 366nm Composés probables

    SI 07 taches sombres S1 Marron foncé Pigments

    S2 Marron foncé Pigments

    S3 Rouge Anthocyanidine 3,5 di glucoside

    Q Sombre

    SII 04 taches sombres S1

    S2

    S3 Q

    AG

    Claire

    Marron claire

    Rouge

    Orange

    Vert bleu fluorescent

    -

    Pigments

    Anthocyanidines 3,5 di glucosides

    SIII 05 taches sombres S1 Bleu fluorescent Flavonols, flavonones, isoflavonone

    Marron sombre flavones

    S2 Pigments

    S3 Orange foncé

    S4 Orange foncé Anthocyanidine3 glucoside

    S5 Orange foncé

    Q Orange foncé

    SIV 04 taches sombres S1

    S2

    S3

    S4

    S5

    S6

    S7

    Q AG

    Violet

    Vert clair

    Marron

    Bleu fluorescent

    Rouge

    Violet

    Vert clair

    Rouge fluorescent
    Violet fluorescent

    Anthocyanidine3 glucoside Flavonols, flavones, aurones Pigments

    Flavonols, flavonones, isoflavonone flavones

    Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine3 glucoside Flavonols, flavones, aurones

    SV S1

    S2

    S3 Q

    AG

    Marron foncé Orange

    Clair

    Orange clair
    Orange clair

    Pigments

    Anthocyanidine 3 glucoside

    -

    SVI Une seule tache sombre S1

    S2

    S3

    S4

    S5 Q

    Orange clair Rose

    Bleu

    Orange

    Orange clair Rose fluorescent

    Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine 3,5 di glucoside Acide phénol

    Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine3 glucoside Anthocyanidine 3,5 di glucoside

    SVII 04 taches sombres S1

    S2

    S3

    S4

    S5

    Vert jaunâtre Sombre

    Vert jaunâtre Rouge

    Clair

    Flavonols, flavones, aurones Pigments

    Flavonols, flavones, aurones Anthocyanidine3 glucoside -

    Q Vert clair

    AG Rose clair

    SVIII 02 taches sombres S1

    S2

    S3

    S4

    S5

    S6 Q

    AG

    Marron foncé Vert fluorescent Rose orangé Gris foncé

    Clair

    Clair

    Orange foncé orange

    Pigment

    Flavonols, flavones, aurones

    Anthocyanidine3, 5 di glucoside

    -
    -
    -

    D'après les résultats de ce tableau, le système qui a donné la meilleure séparation est celui de l'acétate d'éthyle/acide formique/eau (8/1/1, v/v/v), par ce qu'il a permis la séparation de 09 taches y compris les étalons, ce qui explique la solubilité différentielle des composés phénoliques dans le système IV.

    .Observation sous UV à 254 nm:

    A 254nm, le système SI a permis de séparer 07 taches sombres de taille moyenne et de forme plus ou moins circulaire, tan disque le système SIII n'a pu séparer que 05 taches sombres, par contre les systèmes SII, SIV, SVI et SVII ont permis la séparation de 04 taches de grandes tailles et de formes plus ou moins fusitives et les systèmes SII et SVIII n'ont permis que l'apparition d'une et de deux taches respectivement.

    .Observation sous UV à 366 nm:

    A 366nm, le système SI a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 03 taches, présentant les couleurs: marron et rouge pouvant indiquer respectivement la présence des pigments et des anthocyanidines 3,5 di glucosides.

    De même le système SII n'a permis que la séparation de 03 taches dont les couleurs sont: le marron clair, le clair et le rouge, correspondant respectivement à des pigments et à des anthocyanidines 3,5 di glucosides.

    Après une simple comparaison entre le premier et le deuxième système, il apparaît clair et évident que la tache rouge, qui correspond aux anthocyanidines 3,5 di glucosides, est commune, et vue la présence du méthanol dans ces deux systèmes, on constate que le méthanol est le responsable de son élution.

    Le système SIII a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 05 taches de couleurs: bleu fluorescent, marron et orange foncé, pouvant indiquer respectivement la présence des flavonols et/ou des flavonones et/ou des isoflavonones et/ou des flavones, des pigments et des anthocyanidine3 glucoside.

    Pour ce qui est du système SIV qui a donné 07 taches de couleurs : vert clair, marron, bleu fluorescent et rouge, le violet indiquant respectivement des Flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones, des Pigments et des anthocyanidines 3 glucosides.Ce dernier système présente 02 taches communes avec le système précédent (bleu, marron), ce qui explique que l'acétate d'éthyle, présent dans les 02 systèmes SIII et SIV, est responsable de leur séparation.

    Le système SV a permis le fractionnement de l'extrait méthanolique en 03 taches de couleurs: marron foncé, orange et clair correspondant respectivement à des pigments et des anthocyanidines3 glucosides.

    Le tableau 14 montre que le système SVI a permis la séparation de 06 taches dont les couleurs sont : l'orange clair; le rose, le bleu, l'orange et le rose fluorescent, pouvant indiquer la présence des anthocyanidines 3 glucosides pour les couleurs orange et orange clair, les anthocyanidines pour le rose et le rose fluorescent et l'acide phénol pour le bleu.

    La tache orange est commune dans les plaques éluées par les systèmes solvants SV et SVI, ce qui prouve que l'acétate d'éthyle est le responsable de sa séparation, tan disque, la tache marron est spécifique à l'éther di éthylique et les taches: rose, rose fluorescent, bleue sont spécifiques au dichlorométhane.

    En outre, le système SVII a permis l'apparition de 05 taches, dont les couleurs sont: le vert jaunâtre, le sombre, le rouge et le clair pouvant indiquer respectivement la présence des flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones, des pigments et anthocyanidine3 glucoside.

    En fin, le système SVIII a permis la séparation de 06 taches dont les couleurs sont: le marron foncé, le vert fluorescent, le rose orangé et le gris foncé, correspondant respectivement à des pigments, des flavonols et/ou des flavones et/ou des aurones et des anthocyanidine3, 5 di glucoside.

    Aprés l'analyse des résultats obtenus, la CCM confirme la présence et la richesse de la plante en poly phénols, en tanins et en flavonoïdes déjà mis en évidence préalablement par des tests phytochimiques. La bonne séparation apparaît dans les systèmes polaires prouve que les polypheols, les tanins et les flavonoïdes existants sont de nature beaucoup plus polaire.

    V.7. Spéctrophotométrie UV-visible :

    L'analyse spectrophopotométrique UV-visible de l'extrait brut méthanolique (figure22) indique la présence de quatre pics, de longueurs d'ondes et d'absorbances différentes, avec trois pics qui absorbent dans l'UV (pics 2,3 et 4) dont le plus élevé est le pic 4 (ëmax=203nm, Abs=1,0021) ; enfin, une faible valeur de l'absorbance est observé (0,0035) à 663nm.

    L'absorption à des longueurs d'ondes différentes (de 203nm à 663nm) (figure21) indique la présence de familles de composées très variées, du point de vue structure chimique, présence de fonctions ou double liaisons.

    Figure 22: Spectre d'absorption de l'extrait méthanolique obtenu par la méthode d'Owen et Johns, 19

    L'analyse du spectre d'absorption de l'extrait brute méthanolique (tableau20) à permis de constater la différence de composition de l'extrait et le pouvoir d'absorption de ces composées, soit dans l'UV soit dans le visible.

    Tableau 20: Résultats de l'analyse spectrale.

    Les pics :

    1

    2

    3

    4

    Longueurs d'ondes

    663,00

    341,00

    268,50

    203,00

    Absorbance :

    0,0035

    0,1234

    0,1997

    1,0021

    Une simple lecture du spectre montre que (Silverstein et al., 1998) :

    · Le pic1 (663 nm) correspond à l'absorption des pigments chlorophylliens (a et b).

    · Une absorbance à 341nm montre la présence de tryptophane et d'acides aromatiques.

    · L'absorption à une longueur d'onde de 268,5 nm est due à la présence d'acides gras insaturées, d'ethylebenzéne et de certaines huiles.

    · Le pic 4 indique la présence de benzène qui absorbe à 203nm.

    Conclusion

    Les métabolites secondaires, tel que les polyphénols, les huiles essentiels et leurs différentes classes, on attiré l'attention des scientifiques qui focalisent leur études sur leurs modes d'extractions, leurs propriétés, leur applications et leur valorisation.

    La richesse de la région d'El hourane en plantes d'intérêt phytothérapeutique nous a permis de choisir une espèce de cette région Centaurea microcarpa Coss et dur. comme plante d'étude afin d'en extraire des composés bioactifs.

    Quartes méthodes d'extractions ont été suivies, deux d'entres elles pour l'extraction des poly phénols, selon la méthode d'Akowah et al., (2004) et d'Owen et Johens (1999), une pour l'extraction des flavonoïdes et la dernière pour l'extraction des huiles essentielles.

    Deux paramètres ont été étudiés pour leur influence sur l'extraction par solubilisation des poly phénols et des flavonoïdes de la plante:

    · Le temps d'extraction: - 4heurs et 8 heurs pour la méthode d'Akowah et al.,.

    - 168 heurs pour celle d'Owen et Johns.

    - 24 heurs pour les flavonoïdes.

    · Le type de solvant: Eau, méthanol 50%, acétone 70%, méthanol pur, chloroforme et acétate d'éthyle.

    La méthode d'Owen et Johens (1999) donne le meilleur rendement d'extraction en polyphénols (21%), exprimé en pourcentage de matière sèche, par rapport à celle d'Akowah et al., (2005) ou le meilleur rendement n'a pas dépassé les 18,799% avec le solvant Eau pour une durée de 8heures.

    De même l'extraction des flavonoïdes basée sur la solubilité différentielle de ces composés, dans plusieurs solvants de polarités différentes afin d'extraire les différentes fractions flavonoïdiques. Le rendement le plus élevé est observé pour la fraction aqueuse (14,536%)qui contient des flavonoïdes di, tri et tetraflavonoides glycolsyés.

    En outre l'extraction des HE montre un rendement relativement élevé soit 1,231% (P/P).

    Les tests de mise en évidence de quelques métabolites secondaires, ont montrés l'existence de polyphénols, de coumarines, de tanins et de saponosides.

    D'autre part, la séparation et l'essai de la caractérisation des extraits méthanoliques, par CCM, en utilisant plusieurs systèmes solvants, à permis d'avoir une multitude de taches ce qui prouve la richesse des extraits en substances actives essentiellement les polyphénols, ces resultats ont été confirmés par analyse spéctrale' dans l'UV-visible de l'extrait.

    Ce travail n'est qu'une première étape d'étude phytochimique de Centaurea microcarpa Coss et Dur. et ces résultats doivent être appuyés par des études ultérieures pour:

    · Le dosage, des polyphénols, des flavonoïdes totaux et des HE et estimer leur teneur dans Centaurea microcarpa Coss. et Dur.

    · Une étude qualitative des extraits par chromatographie liquide à haute performance(M CPG) combinée à la spectroscopie de masse (HPLC-SM) et RMN, afin d'établir la composition exacte de l'espèce végétale.

    · En fin l'étude des activités biologiques des extraits et des HE et plus particulièrement leurs activités antioxydante et antibactériennedes HE.

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