4.2.2. Evaluation
de l'activité antifalcémiante
La falciformation des GR est induite par l'état
d'hypoxie créé par l'addition de métabisulfite de sodium
(Na2S2O5 2% préparée
extemporanément) sur les échantillons de sang de patients
drépanocytaires selon le test d'Emmel. La méthode pour
l'évaluation de l'activité antifalcémiante des
différents extraits sur un échantillon de sang peut être
brièvement décrite comme suit :
Un volume déterminé de l'échantillon de
sang d'un patient drépanocytaire a été
mélangé avec un volume équivalent de métabisulfite
de sodium (2%). Le mélange a été incubé pendant 1 h
à température ambiante pour compléter la falciformation.
Les observations au microscope ont confirmé que la falciformation des GR
commencent à se produire au moins 30 min après l'addition de
métabisulfite de sodium, ainsi la durée de 1 h d'incubation
était suffisante pour une falciformation complète pour la
majorité des GR1.
Après 1 h d'incubation du sang avec du
métabisulfite de sodium, un volume équivalent de chaque extrait
à différentes concentrations a été ajouté
à celui du mélange précédent (Sang de patient SS +
Métabisulfite de sodium) et incubé de nouveau pendant 30 ou 120
min de plus à température ambiante. Un échantillon a
été prélevé pour l'examen microscopique. Les GR ont
été comptés afin de déterminer le nombre de GR
falciformes (déformés et allongés) et de GR normaux
(arrondis). Le nombre de GR totaux a été déduit par la
somme des GR falciformes et GR normaux. Le pourcentage de GR normaux a
été obtenu par calcul et il représente le rapport des GR
normaux sur le total des GR comptés1.
Les concentrations utilisées étaient de 100, 200
et 400 ìg/mL par rapport à la poudre initiale de BEAT-SS®,
ce qui a déterminé l'introduction d'un facteur de
proportionnalité pour la préparation des différents
extraits afin que cette concentration soit la même pour toutes.
Deux témoins ont été utilisés pour
le contrôle de l'échantillon de sang du patient SS : un
Témoin positif dans lequel le sang est en hypoxie (Sang SS +
Na2S2O5 2%) et un Témoin négatif
dans lequel le sang est en milieu oxygéné (Sang SS + NaCl
0,9%).
a) Préparation des
échantillons témoins
o Témoin positif :
A 50 ìL de l'échantillon de sang, on a
ajouté 50 ìL de Na2S2O5 2% puis
on a laissé reposer 1 h avant de prélever 5 ìL pour
l'observation au microscope électronique.
o Témoin négatif :
A 50 ìL de l'échantillon de sang, on a
ajouté 50 ìL de NaCl 0,9% puis on a laissé reposer 1 h
avant de prélever 5 ìL pour l'observation au microscope
électronique.
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